A C T A U N I V E R S I T A T I S L O D Z I E U S I S FOLIA BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA 4 , 1986
Anna B a r tk o w ia k , K a n im iera S tu d a ia n
PORÓWNANIE DYSMUTAZY PONADTLENKOWEJ Z WĄTROBY DORSZA Z. WIEPRZA
Opisano warunki izolowania nie zbadanej do te j pory dysnutaty * wątroby dorsza (Gadus aorhua L .) . Określono je j »kład chemiczny i podano właściwości fizykochemiczne. Zbadano wpływ d iety lo d itio k ar b a- minianu (DDC), cyjanku i podwyższonej temperatury na aktywność i w la ś c * '« c i spektralne dysmutasy dorsza. Przeprowadzono analiz« po- równ<>w~M wyników otrzymanych d la dysmutazy dorsza * rezultatam i a- nalogicznych badań własnych nad dysnutae« wątroby wieprza. Stwierdzo-no, iż zasadnicze różnice dotycz« zmian aktywności pod wpływem tem-p eratury.
W sz y s tk ie p r z e b a d a n e do t e j p o ry ko m ó rk i m e t a b o li z u j ą c e t l e n z a w i e r a j ą enzym y, k t ó r e k a t a l i z u j ą r e a k c j ą d y s m u t a c j i:
Enzymy k a t a l i z u j ą c e t ę r e a k c j ę s ą m e t a l o p r o te i n a m i i nazw ano j e d ysm utazam i p o n ad tlen k o w y m i (SOD). S y s te m a ty c z n a nazwa - o k s y - d o r e d u k ta z a p o n a d t l e n e k ; p o n a d t le n e k (EC 1 . 1 5 . 1 . 1 ) .
USTęp
2 0 j + 2H+
A n ło n o ro d n ik p o n a d tle n k o w y 0^ j e s t p r o d u k tem końcowym lu b po -ś r e d n im w i e lu r e a k c j i en zy m a ty c zn y c h i p ro ce stiw a u t o o k s y d a c j i w i e l u g ru p zw iązków o r g a n ic z n y c h . P o w s ta ją c y w w yn ik u d y s m u t a c j i , n a d t l e n e k w o do ru o z n a c z n ie s ł a b s z e j r e a k t y w n o śc i n i ż a n i o n o r o d - n ik p o n a d tlen k o w y j e s t n a s t ę p n i e r o z k ła d a n y n a Oj i HjO p r z e z k a t a l a z y i p e r o k s y d a z y , c h r o n i ą c w t e n sp o só b kom órkę p r z e d j e
-go a k u m u la c ją .
D ysm utaza p o n a d tle n k o w a j e s t enzymem ro zp o w szech nion y m s z e r o -ko w p r z y r o d z i e . W y stę p u je w ¿ w ie c i e r o ś li n n y m , zw ierzęc ym o r a z w m ik r o o rg a n iz m a c h . Po r a z p ie r w s z y o p i s a l i j ą M o C o r d i F r i d o y i c h [ 9 , 1 6 ] . Od t e j p o ry enzym t e n b y ł b a r d z o i n -te n s y w n ie b ad a n y po d w zględem w y stę p o w a n ia , budowy c h e m i c z n e j , s t r u k t u r y , r ó ż n o r o d n o ś c i 1 sw o ic h o c h r o n n y c h f u n k c j i [ 6 , 8 ] .
D y sm utazy p o n a d tle n k o w e można p o d z i e l i ć n a 3 g ru p y z e w z g lę -du n a o b e c n o ś ć w i c h c z ą s t e c z k a c h ró ż n y ch jonów m e t a l i ł Cu, Zn-SOD, Mn-SOD i Fe-SOD. B ad acze g łó w n ie p o d e jm u ją b a d a n i a n ad d ysm utazam i m ied zio w o-cyn k ow y m i, po ch od zący m i z ró ż n o ro d n y c h tk a n e k ssa k ó w , gdyż t e n ty p enzym u od gryw a n a j i s t o t n i e j s z ą r o l ę w p rz e m ia n a c h m e ta b o l ic z n y c h t l e n u .
O s t a t n i o p o d j ę t o ró w n ie ż b a d a n i a n a d d ysm utazam i in n y c h k r ę -gowców m ięd zy inn ym i r y b .
R yby, ze w z g lę d u n a i n n e n i ż s s a k i w a ru n k i ż y c ia (ś r o d o w isk o wodne u b o żs z e w t l e n w p o ró w n a n iu z p o w ie trz e m , n i ż s z a te m p e r a -t u r a ) , s ą i n t e r e s u j ą c y m o b ie k te m p r z y b a d a n ia c h enzymów z w ią z a -ny ch z m etabo lizm em t l e n u . Badano" d y sm u taz ę z e r y tr o c y t ó w k i l k u gatunków r y b ; k a r p , s z c z u p a k , l i n [ l 5 , 2 2 ] , z w ą tro b y ryb y m iecz [ l ] i izoenzym y d y sm u tazy s z c z u p a k a [ 1 2 ] .
N i n i e j s z a p r a c a p r z e d s t a w i a sp o só b w y iz o lo w a n ia d y sm u tazy z w ą tr o b y d o r s z a i j e j c h a r a k t e r y s t y k ę o r a z w y n ik i b ad a ń wpływu DDC, CN~ i te m p e r a t u r y n a ak ty w n o ść enzym u i w ł a ś c i w o ś c i sp e k -t r a l n e . Dane t e s ą z e s ta w io n e z id e n ty c z n y m i o z n a c z e n ia m i d l a d y sm u tazy w ą tr o b y w i e p r z a . MATERIAŁ I METODY
P r e p a r a t y k a 1 o c z y s z c z a n ie d ysm u tazy p o n a d tle n k o w e j z w ą tr o b y d o r s z a
Do p r e p a r a t y k i używano w ą tr o b ę d o r s z a po u p rz e d n im z a m r o ż e n iu . D ysm utazę iz o lo w a n o zm o dyfiko w aną m eto dą F r i e d a i Wsp«
[10] p o l e g a j ą c ą n a w y t r ą c e n i u b i a ł e k w n is k im pH i f r a k c j o n u ją c y m w y s a la n iu s i a r c z a n e m amonu. N a s tę p n ie c z ę ś ć b i a ł e k b a la s to w y c h u- suw ano p o p r z e z d z i a ł a n i e p o d w y ższo n e j te m p e r a tu r y (5 0 °C ) i e k s
-t r a k c j ę c h lo ro fo rm e m . O trzym any p r e p a r a t po z a g ę s z c z e n i u p r z y pomocy a ę u a c i t u b y ł poddawany o c z y s z c z a n i u w ł a s n ą t c c h n i k ą n a d ro d z e c h r o m a t o g r a f i i jo now ym iennej n a DE-32 c e l u l o z i e [ 3 ] i p r z e z s ą c z e n i e m o le k u la r n e n a E i o - g e l u P - 6 0 .
D ysm utazę w iep rzo w ą p re p aro w an o m eto dą w c z e ś n ie j o p i s a n ą p r z e z au to ró w [ 3 ] .
P r e p a r a t przechow yw ano zam rożony w r o z tw o r z e buforowym lu b w s t a n i e z l io f i l i z o w a n y m w t e m p e r a tu r z e - 2 0 ° c .
O z n a c za n ie a k ty w n o śc i dy sm u ta zy po n a d tle n k o w e j
A ktyw n ość d ysm u tazy p o n a d tle n k o w e j o k r e ś l a n o m etodą p o ś r e d n ią M i s r y i F r i d o v i c h a [18] o p a r t ą n a i n h i b i c j i a u t o o k s y d a c j i a d r e n a l i n y do ad re n oc h ro m u w ś ro d o w is k u zasadowym .
- 4 -4
M ie s z a n in a r e a k c y j n a z a w i e r a ł a 1 x 10 _M EDTA i 3 x 10 M a -d r e n a l i n y w b u f o r z e węglanowym o pH 1 0, 2 . P o m iary wykonywano n a s p e k t r o f o t o m e t r z e " S p e c o rd " p rz y 480 nm w t e m p e r a t u r z e 25 °C , wy-k o r z y s t u j ą c z a wy-k r e s t r a n s m i s j i 80-100% , a n a s t ę p n i e p r z e l i c z a n o t r a n s m i s j ę n a a b s o r b a n c j ę . A ktyw ność d ysm utazy o k r e ś l a n o w o d -po w ied nim p r z e d z i a l e czasowym n a p o d s ta w i e zm ian a b s o r b a n c j i w p r ó b i e z a w i e r a j ą c e j en zym , od n o szo n y c h do a n a lo g ic z n y c h czasow o zm ian p o c h ł a n i a n i a a d r e n a l i n y ( k o n t r o l i ) , k t ó r e w inn y w y n o s ić 0 ,0 2 5 j e d n o s t k i a b s o r b a n c j i w tym p r z e d z i a l e c z a s u . A n a li z a p r e p a r a tó w d ysm u tazy d o r s z a p r z y pomocy m etod e l e k t r o f o r e t y c z n y c h W c e l u z b a d a n ia s t o p n i a je d n o r o d n o ś c i o trz y m a n y c h p re p a r a tó w b i a ł k a e n z y m a ty cz n eg o o r a z o k r e ś l e n i a masy c z ą s te c z k o w e j p o d j e d - n o s t e k SOD z a sto s o w a n o t e c h n i k i e l e k t r o f o r e t y c z n e . Podstaw ow ą e l e k t r o f o r e z ę p rz ep ro w a d z o n o w 7,5% ż e l u p o l i a - k rylo am id ow ym . R o z d z ia ł p ro w adzon o p rz y n a t ę ż e n i u 3 ,5 mA n a k o -lu m ie n k ę ż e l u w c i ą g u 2 ,5 h w b u f o r z e w eronalow ym o pH 8 , 6 . F r a k c je b ia łk o w e w yb arw ian o p rz y u ż y c iu C o o m assie B lu e .
A ktyw ność e n z y m a ty cz n ą d y sm u tazy w ż e l u p o liak ry lo a m id o w y m lo k a liz o w a n o w o p a r c i u o m eto dę B e a u c h a m p a i F r i - d o v i c h a [ 7 ] ,
F r a k c j e b ia łk o w e z a w i e r a ją c e m iedź id e n t y f ik o w a n o wg m etody G o u l d i K a r o l u s [ l l ] . O z n a c z a n ie masy c z ą s te c z k o w e j p o d je d n o s te k d y sm u tazy p r z e p r o -w adzano t e c h n i k ą e l e k t r o f o r e z y w ż e l u poliakx'yloam id ow y m z s i a r -czanem d o d e c y lu so d u z g o d n ie z m eto dą W e b e r a i O s - b o r n [23] .
Wpływ cz y nnikó w f i z y k o - c h e m icznych
n a ak ty w n o ść i w ł a ś c i w o ści s p e k t r a l n e dysmu t a z y
P r ó b k i d ysm u tazy in k u b o w aro w z a k r e s i e t e m p e r a t u r 30-90°C w o d s tę p a c h co 10°C p rz y pH 7 ,8 w c i ą g u 90 min i o k r e ś l a n o ic h ak ty w n o ść w zględem k o n t r o l i (enzym u n ie in k u b o w a n e g o ) .
O k r e ś la n o wpływ 0 ,5 mM, 1 mM i 5 mM KCN) o r a z 0 , 2 5 mM, 1, 5 mM i 3 mM DDC n a ak tyw n o ść d y sm u ta zy .
Badano zm iany widm a d y sm u tazy (w z a k r e s i e 350650 nm) w o b e c -n o ś c i 1 ,0 mM d i e t y l o d i t i o k a r b a m i -n i a -n u . B adano wpływ te m p e r a t u r y ( 2 0 ° , 3 0 ° , 40°C ) i pH ( 9 , 2 ; 7 , Oj 6 , 0 ; 5 , 4 ) n a sz y b k o ś ć r e a k c j i DDC z d y sm u ta zą . Pomiarów a b s o r - b a n c j i dokonywano n a s p e k t r o f o t o m e t r z e UV VIS p r z y 450 n a w z a -k r e s i e 1 -5 m in. O z n a c z a n ie m ie d z i w d y s m u ta z ie d o r s z a M iedź w p ró b k a c h d y sm u tazy (p o w y c z e r p u j ą c e j d i a l i z i e p r e - atów w obec wody p o d w ó jn ie d e s t y l o w a n e j ) o z n a c z a n o p r z y pomo-cy s p e k t r o f o to m e t r u a b s o r p c j i atom ow ej AAS-1 f ir m y K a r l - Z e i s s n a .
B ia łk o o z n a cz a n o m eto dą L o w ry 'eg o .
A n a l i za s k ła d u am inokwasowego d ysm u tazy z w ą tr o b y d o r s z a
O z n a c z e n ia s k ł a d u am inokw asow ego b ad an y ch p ró b e k d y sm u tazy wykonywano w autom atycz ny m a n a l i z a t o r z e aminokwastW f i r n y J e o l t y p JLC-GAH. P r ó b k i d ysm utazy poddaw ano h y d r o l i z i e za pomocą 6N HC1 w c i ą g u 24 h w t e m p e r a tu r z e 110°C w z a to p i o n y c h am p u łk ach .
WNIKI
P r z y k ł a d o c z y s z c z a n i a p r e p a r a tó w d y sm u tazy w t o k u p r e p a r a t y -k i o r a z a k ty w n o ść końcow ą enzymów z w ą tr o b y d o r s z a i w i e p r z a p r z e d s ta w i o n o w t a b . 1 1 2 . A ktyw ność d y sm u tazy o zn a c z a n o m eto-d ą M i a r y i P r i d o v i c h a [ 1 8 ] . A ktyw ność w ł a ś c i -wa SOD * w ą tr o b y d o r s z a w y n o s ił a 8000 U/mg, a z w ą tr o b y w i e p r z o -w ej ’ 5500 U/mg.
ę
T a b e l a 1 Przykładowe wyniki przebiegu oczyszczania dysmutazy
z wątroby dorsza
An example of dismutase p u rif ic a tio n progress in the course of i t s iso la tio n from cod liv e r
Btapy izolowania mg/mlBiałko AktywnośćU/ml
Aktywnośd właściwa
u/mg
P rep arat wysolony HH^ SO^ i rozpuszczony w 0,1 M
buforze fosforanowym 1,956 3 772 1 928
P reparat' pozbawiony b alastu wytrącanego przez
ogrze-wanie w 55°C 1,710 3 400 1 988
Surowy enzym uzyskany metodą
Frieda 1,159 3 792 3 272
Enzym oczyszczony na DE-32
ce lu lo zie 0,810 6 786 8 378
Na p o d s ta w ie u z y sk a n y c h wyników z a n a l i z e l e k t r o f o r e t y c z n y c h można s t w i e r d z i ć , że o trz y m a n e p r e p a r a t y d y sm u tazy z w ą tro b y w iep rzo w ej [ 3 ] i d o r s z a b y ły e l e k t r o f o r e t y c z n i e je d n o ro d n e i y k a zy w ały ak ty w n o ść d y sm u taz ow ą, k t ó r a z a n i k a ł a po i n k u b a c j i s i u w r o z tw o r z e c y ja n k u ( r y s , l ) .
T a b e l a 2 Przykładowe wyniki przebiegu oczyszczania dysmutazy
z wątroby wieprzowej
An example of dismutase p u rif ic a tio n progress in the course of i t s iso la tio n from porcine liv e r
Etapy izolowania Białko mg/ml Aktywność U/ml
Aktywność właściwa U/mg P reparat wysolony NH^ i rozpuszczony w 0,1 M buforze fosforanowym 2,750 3 256 1 184
P reparat pozbawiony b alastu wytrącanego przez
ogrze-wanie w 68°C 2,620 3 662 ł 397
Surowy enzym uzyskany metodą F ried a
J ■
1,620 3 642 2 248
Enzym oczyszczony na DE-32
celu lozie 0,625 3 524 5 622 .1 % % o Wj '■Ą V. Rys. 1
E lektro foreza w żelu poliakryloamidowym (schemat) : A - preparat dysmutazy z wątroby dorsza ze zlokalizowa-ną s t r e f ą aktywności dysmut azowej metod« Beauchampa i F ridovicha, B - że l po wybarvienlu na b iałk o przy po-mocy Cootnasie Blue, C - żel wybarwiony metodą
Beau-champ a i Fridovicha po inkubacji e 5 nM KCN The o rig in al p ic tu re of polyacrylamide gel e le c tr o
p ho resis: A dismutase frbm cod l i v e r , the gel s t a i -ned fo r dismutase a c ti v it y by Beauchamp and Fridovich method, B - the gel stain ed f o r p ro tein , C - the gel stain ed by Beauchamp and Fridovich method a f te r
Inaktywacja cieplna dysmutazy ponadtlenkowej z wątroby d o rsz a ---i wieprzo-wej --- -- w 0,05 M buforze fosforanowym pH 7,8
Changes of superoxide disnu tase a c tiv i ty fro« cod --- , porcine liv e r ---induced by increase of tenp erature at pH 7.8
KOn t o o l a
6 mM
I n h i b ic j a dysm utazy d o r s z a --- i w iep rz a --- p r z e z r ó żn e s t ę ż e n i a DDC. A ktyw ność enzymu o k r e ś la n o po in k u b a c j i z DDC w tem p er at ur ze 37°C i b u fo r z e
fosforanow ym o pH 7 ,4 36 45 T(n* n) I n h ib it o r y e f f e c t s o f d i f f e r e n t DDC c o n c e n t r a t io n s on c o d --- and p o r c in e S O D --- . A c t i v i t y o f enzyme was e s t im a t e d a f t e r in c u b a t io n w it h DDC a t 37°C in nhiianhot* h u f f e r a t nil 7 .4
Na e le k tr o f e r o g r a m a c h w ykazano m ie d z io p ro te in o w y c h a r a k t e r f r a k c j i b i a łk o w e j d y sm u taz y (d a n e n i e z a m ie s z c z o n e ). W w yn ik u a n a l i z y e l e k t r o f o r e t y c z n e j z SDS . s t w ie r d z o n o f r a k -c j e b i a łk o w e o m asie -c z ą s t e -c z k o w e j 14 700 d l a p r e p a r a t u z d o r -s z a i 16 000 - z w i e p r z a , w y s t ę p u ją c e po d z i a ł a n i u n a enzym SDS, 8 m s r k a p to e ta n o le m i p o d w y ż sz o n ej t e m p e r a t u r y , i d e n t y f i k o w a -n e ja k o p o d j e d -n o s t k i dy sm u taz p o -n a d tle -n k o w y c h .
W yniki i n a k t y w a c j i c i e p l n e j d ysm utazy z w ą tr o b y w ie p r z o w e j i d o r s z a w ró ż n y c h o d s t ę p a c h c z a s u p r z e d s t a w i a r y s . 2 . D ysm utaza d o r s z a j e s t b a r d z i e j w r a ż li w a n a d z i a ł a n i e p od w y ższo n ej te m p e r a -t u r y i ju ż w t e m p e r a t u r z e 70°C u l e g a c a ł k o w i t e j i n a k t y w a c j i po 90 m in , n a t o m i a s t SOD w ie p r z o w a t r a c i ł a ak ty w n o ść d o p i e r o p r z y 90°C po 60 min i n k u b a c j i . 400 450 WO «tyś- ^
Upływ DDC na widmo ab sorb cji dysmutazy z wątroby dorsza. Enzym (0,1 mM w bu-forze fosforanowym, pH 7 ,4 , tem peratura pokojowa) był poddany d ziała n iu 1,0mM DDC i widmo zapisywano w odstępach czasu: 1 - l i n i a podstawowa; 2 - enzym; 3 - enzym + DDC, 1 min po zmieszaniu; 4 - widmo po 30 min i dłuższym okresie czasu. Krzywe pomiędzy 3 i 4 l in ią były rysowane w okresie krótszym niż 30 min E ffect DDC upon the absorption spectrum of cod dism utase. Enzyme (0.1 mM in phosphate b u ff er , pH 7 .4 , room temperature) was tre a ted with 1.0 nM DDC and sp ectra were recorded at in te r v a ls: 1 - base lin e ; 2 - enzyme alone; 3 - en-zyme + DDC, 1 min a f t e r mixing; 4 - sp ec tr al scans a f te r 30 min and longer in te r v a ls. Curves between 3 and 4 lin e s were drawn for in te rv a ls sh o rte r than
Rysunek 3 w y k a z u je , że i n h i b u j ą c y e f e k t ró żn y c h s t ę ż e ń DDC n a enzym z w ątro b y w ie p r z o w ej i d o r s z a b y ł z a l e ż n y od c z a su i n -k u b a c j i . P r e i n k u b a c j a d y siru ta z y d o r s z a z 0 , 02 5 mM DDC p r z e z 30 min powodowała c a ł k o w i t ą i n h i b i c j ę enzym u. Dodatkow o ob serw ow a-no n i e w i e l k i e f e k t DDC n a enzym w c z a s i e zerowym , mimo że sam d i e t y l o d i t l o k a r b a m i n i a n (w s t ę ż e n i a c h 0 ,2 5 - 3 mM) n i e ma wpływu na o k s y d a c ję a d r e n a l i n y . N a to m ia s t SOD w iep rzo w a j e s t b a r d z i e j o p or-n a or-n a d z i a ł a or-n i e t e g o c z y or-n or-n ik a c h e l a t u j ą c e g o .
O d d z ia ły w a n ie 1 ,0 mM DDC w t e m p e r a t u r z e p o k o jo w ej p r z y pH 7 ,4 n a 0 ,1 mM SOD z d o r s z a i w i e p r z a w y w ołuje zm iany o p ty c z n e g o w i-dma SOD w z a k r e s i e w i d z ia ln y m , p r z e d s t a w i o n e na r y s . 4 1 5 .
R y s. 5
Wpływ DDC aa widmo a b s o r b c j i dysm utazy z w ątro by w ie p r z o w e j . S z c ze g ó ło w y o p is warunków p r zy r y s . 4
E f f e c t DDC upon t h e a b s o r p t io n spe ctrum o f p o r c in e d i sm utase from l i v e r
Maksimum a b s o r p c j i p r z y 450 nm b y ł o p r o p o r c j o n a l n e do s t ę -ż e n i a enzym u. Wpływ t e m p e r a t u r y n a s z y b k o ś ć r e a k c j i DDC z d y s - m u ta zą , w b u f o r z e fosfo ran ow ym o pH 7 ,8 p r z e d s t a w i a r y s . 6 . Re-a k c j Re-a DDC z enzymem j e s t t a k ż e z a l e ż n a od pH.
Rys. 6
Wpływ różnych tem peratur na szybkorfć rea k cji DDC z dysmutazą dorsza --- i wieprzów« ---.0 ,2 5 mH SOD inkubówano z 0,25 mM DDC w buforze fosforanowym
o pH 7,8
E ffect of varied tem perature on the ra te reaction of DDC with cod ---— and porcine — dism utases. Enzyme a t 0.25 aM was incubated w ith 0.25 nM DDC
in phosphate b uffer a t pH 7.8
W y nik i p r z e d s t a w io n e n a r y s . ' 7 w s k a z u j ą , że r e a k c j a , m ie-r z o n a ja k o zm iany a b s o r p c j i p r z y 450 run, b y ł a s z y b s z a p r z y n i ż -szym pH. N ie ob serw ow ano z n a c zn y c h r ó ż n i c w r e a k c j a c h p r z e p r o -w adzon ych z d y sm u ta z ą p o n a d tle n k o w ą z w ą tro b y w ie p rz o w e j i d o
Wiadomo, że c y ja n e k d z i a ł a ja k o i n h i b i t o r n a SOD i m echanizm r e a k c j i p o l e g a n a p r z y ł ą c z e n i u CN~ do C u ( I I ) [ 1 3 ] .
E ffect of pH on the ra te of reactio n of DOC with the cod SOD --- — and por-cine SOD — — Enzyme a t 0.25 ail was incubated with 0.25 tcM DDC. The buf-fer* used were: pH 9.2 - sodium carbonate; pH 7.0 and 6.0 potassium
phos-phate; pH 5.4 - sodium ace tate
Wpływ CN~ n a ak ty w n o ść SOD p r z e d s t a w i a r y s . 8 . P o niew aż * tw ie r d z a m y , że DDC t a k ż e p r z y ł ą c z a s i ę do C u ( I I ) , p o ż y te c z n e *>yło z b a d a n ie e f e k t u k o m p e t y c ji CN~ i DDC w r e a k c j i z SOD.
8.4
Rys. 7
Wpływ pH na ssybkoćć re ak cji DDC z dysmutaz« dorsza ---- ---- i wieprzów«---Enzym o stężeniu 0,25 mM był inkubowany z 0,25 mM DDC. Stosowano bufory o pH 9,2 - węglan sodowy; pH 7,0 i 6,0 - fosforan potasowy; pH 5,4 - octan
sodowy
Rys. 8
Wpływ cyjanku na aktywność dysrautazy d o r sz a --- i w ieprzow ej--- . E ffect of waried cyanide concentrations on cod --- and porcine
distnu-tase a c tiv it y
T a b e l a 3
Skład aminokwasowy dysmutaz z wątroby wieprzowej, ryby miecz i dorsza
Amino acid composition
o f po rcine, swordfish and cod dismutases
Aminokwasy Wątroba wieprzowa [5] Wątroba ryby miecz l i i Wątroba dorsza Kwas asparaginowy 30,0 37,4 4 0,4 Treonina 15,0 23,1 18,7 Sery na 17,2 8,6 11,7 Kwas glutaminowy 29,8 27 ,3 23,0 P ro lina 8.9 11,1 -Glicyna 47,8 45,4 48 ,0
Tabela 3 (cd.) Aminokwasy Wątroba wieprzowa m W«troba ryby miecz [ ’ ] Wątroba dorsza Alanina 20,2 27,2 31,1 Halina 27.4 26,0 30,6 Metionina • 1.3 2.2 3,3 Izoleucyna 12,8 19,9 17,1 Leucyna 14,3 17,2 26,2 Tyrozyna ».7 4,6 -Fenyloalanina 5.8 8,8 9,4 Lizyna 19,6 20,3 23,1 Hi • tydyna 17.3 16,2 10,4 h h3 25,3 31,5 39,8 Arginina 8.2 13,7 7,3
Dane p r z e d s t a w i o n e n a r y s . 9 w s k a z u ją , że c y ja n e k po w o d uje i n h i b i c j ę r e a k c j i DDC z d y t,m u taz ą. Wyznaczony s k ł a d am inokwasowy d l a d y sm u ta zy z w ą tr o b y d o r s z a ( t a b . 3) p r z e d s t a w io n o ja k o i l o ś ć r e s z t p o s z c z e g ó ln y c h airlnokw asćw p r z e l ic z o n y c h n a c z ą s t e c z k ę b i a ł k a e n z y m a ty c z n e g o , p r z y j m u j ą c j e j masę j a k o równą 30 0 0 0 . P o ró w n u jąc s k ł a d aminokwasowy dy sm u tazy z w ą tr o b y d o r s z a z d y s - m u tazą z w ą tro b y ry b y m iecz i w ie p r z a można zauw aży ć d uże p o do -b i e ń s t w o .
O zn aczone s t ę ż e n i e m ie d z i w p ró b c e r o z tw o r u d ysm utazy d o r s z a w y n o s ił o 7 ,6 9 + 0 ,0 4 4 m g /m l, co s ta n o w i 0, 32%. DYSKUSJA N asze b a d a n ia n a d d y sm u ta zą p o n a d tle n k o w ą ry b [ 4 , 2 2 ] , ja k ró w n ież in n y c h b a d a c z y [ l , 1 2 , 1 5 ] , w s k a z u ją , że i s t n i e } ą s t r u k -t u r a l n e i f u n k c j o n a l n e -t ó ż n i c e p om iędzy c y to s o lo w ą SOD ry b i ssa k ó w .
P r z y j ę t a do i z o lo w a n i a d y sm u tazy z w ą tro b y d o r s z a m eto da F r i e d a i w sp . [10] , sto s o w a n a p o w sz e ch n ie d l a tk a n e k s s a -ków , o k a z a ła s i ę w p e ł n i z a d o w a l a j ą c a w o d n i e s i e n i u do t a k s p e
-c y f i-c z n e g o m a t e r i a ł u , ja k im j e s t w ą tr o b a r y b y . M usiano zm o d y fi-kować j ą o b n i ż a j ą c te m p e r a t u r ę i s k r a c a j ą c c z a s t r w a n ia e ta p u d e n a t u r a c j i t e r m i c z n e j p r z e d ł u ż a j ą c n a t o m i a s t c z a s w iro w a n ia (d o 1 h ) po w y s o le n iu enzymu p r z y pomocy (NH4}2S0 4* T(min) Rys. 9
cyjanku na reakcję DDC z dysmutazą z wątroby dorsza --- i wieprza --- .Enzym o stężen iu 0,1 mM w buforze fosforanowym o pH 7,8
preinkubo-wany z cyjankiem był poddany działan iu 1,0 nM DDC
E ffec t of cyanide on the reaction of DDC with the cod ---and porcine SOD - ---.Enzyme a t 0.1 mM in phosphate b u ffer a t pH 7.8 preincubated with
cyanide was exposed to 1.0 nM DDC
M o d y f ik a c ja w y j śc i o w e j m etody p o l e g a ł a r t o n i e ż .n a z a sto s o w a -n i u d od atko w ego o c z y s z c z a -n i a n a d ro d z e c h r o m a t o g r a f i i jonow ym ien-n e j ien-n a DE-32 c e l u l o z i e , a n a s t ę p n i e n a f i l t r a c j i m o le k u la r n e j n a B i o - g e l u P -6 0 . O s t a t e c z n i e w ię c p r e p a r a t y k a d ysm utazy z
wą-t r o b y d o r s z a z n a c z n ie r ó ż n i ł a s i ę od p r e p a r a t y k i d y sira ta z y z wą-t r o b y w ie p r z o w e j. W ątro b a d o r s z a z a w i e r a bow ieir d uże i l o ś c i l i -pidów i w ła ś n i e one w znacznym s t o p n i u zm uszały, do zm iany w aru n -ków p r e p a r a t y k i i u t r u d n i a ł y j ą .
P o ró w n u jąc ak ty w n o ść ob u dy sm utaz n a l e ż y s t w i e r d z i ć , że d y s -m u taza p o n a d tle n k o w a z w ą tr o b y d o r s z a w y kazyw ała w ię k s z ą ak ty w -n o ść w p r z e l i c z e -n i u -n a mg b i a ł k a w p o ró w -n a -n iu z d y sm u tazą z wą-t r o b y w i e p r z o w e j . W yższa a k ty w n o ść d y sm u tazy z w ą tr o b y d o r s z a może b yć uwarunkow ana te m p e r a t u r ą ś r o d o w is k a , w ja k im ż y j e d o r s z . Wykazano ju ż w c z e ś n i e j , że m etab o liz m w ie l u enzymów ry b [20 ] n a-st a w io n y j e s t n a n i ż s z ą te m p e r a t u r ę w z a k r e s i e 1 0 -2 0 °C , d l a t e g o t e ż ak ty w n o ść b a d a n e j d y sm u ta zy , k t ó r a b y ł a m ie rz o n a w t e m p e r a -t u r z e 2 5 ° C, j e s t w y ższ a w p o ró w n a n iu z d y sm u tazą w iep rz o w ą .
O trzym aną w n i n i e j s z e j p r a c y w w yniku e l e k t r o f o r e z y z SDS f r a k c j ę b i a łk o w ą o m asie c z ą s t e c z k o w e j 14 7 0 0 , w y s tę p u j ą c ą po d z i a ł a n i u n a enzym c zy n n ik a m i d e n a tu r u ją c y m i (SDS, 8 - m e r k a p to - e t a n o l , c i e p ł o ) , z id e n ty f ik o w a n o ja k o pod j e d n o s t k ę d y s tr u t a z y . W p o ró w n a n iu z in ny m i masami p o d j e d n o s te k d y sm u ta z , n p . w iep r z o w e j [ 5 ] , w ołow ej [21] i l u d z k i e j [ 2 ] , m asa p o d j e d n o s t k i SOD d o r s z a j e s t n i e c o n i ż s z a .
O z naczo na i l o ś ć m ie d z i w p ró b c e b a d a n e j d y sm u tazy d o r s z a ( 0, 32%) n i e j e s t c a ł k o w i c i e z b ie ż n a z d o n i e s i e n i e m B a n n i - s t e r a i w sp. [ 1 ] , k t ó r y p o d a j e , że z a w a r to ś ć m ie d z i w d y s - m u ta z ie z w ą tr o b y ryb y m iecz sta n o w i 0, 38%.
B ard zo i n t e r e s u j ą c o p r z e d s t a w i a s i ę p o ró w n a n ie d e n a t u r a c j i t e r m ic z n e j d ysm u tazy w ie p r z o w e j i d o r s z a . W ykazano, że d e n a tu - r a c j a ( o k r e ś l o n a p<jprzez sp ad e k a k ty w n o śc i) SOD d o r s z a s z y b c i e j z a c h o d z i ł a w n i ż s z e j t e m p e r a t u r z e ( j u ż w 70 C w c i ą g u 90 min n a -s t ę p o w a ła c a łk o w i ta i n a k t y w a c j a ) w p o ró w n a n iu z SOD w ieprz ow ą ( k t ó r a b y ł a z d e n a tu r o w a n a d o p ie r o w te m p e r a tu r z e 90 C po 1 h in -k u b a c j i ) . Może t o św ia d c z y ć o m n i e j s z e j s t a b i l n o ś c i d ysm u tazy d o r s z a w p o ró w n a n iu z enzymam i in n y c h gatunków z w i e r z ą t .
Ważną c e c h ą c h a r a k t e r y z u j ą c ą w s z y s t k i e d y sm u tazy z a w ie r a j ą c e m iedź i cynk j e s t i n h i b i c j a i c h p r z e z c y j a n k i , k t ó r e b l o k u j ą Cu u n ie m o ż l i w i a j ą c k a t a l i z o w a n i e r e a k c j i d y s m u t a c j i . W p r a c y wyka-z a n o , że p r z y w y so k ich s t ę ż e n i a c h KCN (5 rcM) n a s t ę p u j e ró w n ież s z y b k a in a k t y w a c ja ob u b ad a n y ch d y sm u ta z. N a to m i a s t p r z y m n i e j-sz y c h s t ę ż e n i a c h KCN ( l e c z zaw j-sze w n a d m i a r z e ) i n a k ty w a c j a dysmu-t a z y d o r s z a z a c h o d z i ł a s z y b c i e j n i ż w p r z y p a d k u d y sm utazy w ą tr o
-by w i e p r z o w e j . P r z y c zy n ą te g o z j a w i s k a może b y ć w ię k s z a d o s t ę p -n o ś ć c e -n t r u m aktyw -nego e-nzymu d o r s z a d l a CN .
Innyns i n h i b i t o r e m stosow anym c z ę s t o w o s t a t n i c h l a t a c h j e s t DDC [ 1 3 , 14 , 1 7, 1 9 ) , k t ó r y ró w n ie ż tw o rz y k om p lek s z Cu c e n tru m a k ty w n e g o , a l e w p r z e c i w i e ń s tw ie do cy jank ów może b y ć sto so w an y w b a d a n i a c h i n v i v o . W p rze p ro w ad zo n y c h p r z e z n a s b a d a n ia c h s t w i e r
-d z o n o , że i n h i b i c j a SOD d o r s z a z a c h o d z i s z y b c i e j ( p r z y n iż s z y c h s t ę ż e n i a c h DDC) w p o ró w n a n iu z SOD w iep rz o w ą . R ó żn ice w p r ę d k o -ś c i i n h i b i c j i s ą t u t a j z n a c z n ie b a r d z i e j w y raźn e n i ż w p r z y p a d k u b lo k o w a n ia obu d y sm u taz c y ja n k a m i. Są o ne p ra w d o p o d o b n ie spow odo-wane ( j a k t o s t w i e r d z o n o ju ż p o w y ż ej) w ię k s z ą d o s t ę p n o ś c i ą c en -tru m aktyw n eg o d y s n u ta z y p o n a d tle n k o w e j z w ą tr o b y d o r s z a . C z ą s t e -c zk a DDC, z n a c z n i e w ię k s z a n i ż a n io n CN~, ma w p r z y p a d k u dysmu- t a z y w ie p rz o w e j j e s z c z e b a r d z i e j , n i ż c y ja n e k u tr u d n i o n y k o n f o r - m a c y jn ie d o s t ę p do c en tru m ak ty w n eg o , d l a t e g o t e ż d o p i e r o w wyż-sz y c h s t ę ż e n i a c h i w z n a c z n ie d łu ż sz y m o k r e s i e c z a su zw ią ze k t e n p o t r a f i c h e la to w a ć Cu, co p ro w a d zi do i n h i b i c j i enzym u. C z ęści ow e p o t w i e r d z e n i e t e j h i p o t e z y s u g e r u j ą w y n ik i in n eg o e k s p e r y m e n t u z d y sm u ta zą i DDC. P o d c za s i n k u b a c j i enzymu z DDC p o j a w i a s i ę pasmo p o c h ł a n i a n i a p r z y 450 nm. Za w z r o s t a b s o r p c j i p r z y t e j d ł u g o ś c i f a l i o d p o w ie d z ia ln y j e s t p r z y r o s t i l o ś c i tw o-r z ą c e g o s i ę p o d c z a s r e a k c j i k om p lek su DDC-Cu (e n z y m u ). Porównu-ją":- p r z y r o s t y a b s o r p c j i p r z y 450 nm d l a d ysm utazy d o r s z a i w ie -p r z a z DDC (w r e a k c j i z n a d m ia r e m ) , n a le ż y s t w i e r d z i ć , że r ó ż n ią s i ę o ne k i n e t y k ą w z r o s t u a b s o r p c j i t u ż po d o d a n iu DDC, n a t o m i a s t w m i a r ę upływ u c z a s u (30 m in ) m aksym alne a b s o r p c j e o s i ą g a n e p r z y 450 nir. ( p r z e l i c z o n e n a s t ę ż e n i e enzy m u) d l a ob u d y sm u ta z s ą z b li-żo n e . O d d z ia ły w a n i e DDC-SOD p r z e d s ta w io n e p r z e z n a s j e s t zgod-n e z w yzgod-nikam i M i s r y [17 ] d o ty cz ą cy m i d y sm u tazy w o ło w ej.
P o r ó w n u j ąc o b i e a n a liz o w a n e d y sm u taz y , n i e s tw ie r d z o n o i s t o t * n y ch r ó ż n i c w e f e k t a c h wpływu czyn nik ów z m i e n i a j ą c y c h o d d z iały -» w a n ie DDC-SOD, t a k i c h ja k : t e m p e r a t u r a , pH i w a r u n k i i n t e r a k c j i k o m p e ty c y jn e j z CN- . Spowodowane j e s t t o zapew ne f a k te m , że z a -s to -s o w a n e c z y n n ik i m o d y f ik u ją c e s t r u k t u r ę b i a ł k a e n z y m aty c zn eg o w y w ie r a j ą wpływ t e g o r z ę d u , i ż n i e w i e l k i e w g r u n c i e r z e c z y r ó ż n i
-ce k o n f o r m a c y j n e obu d y sm utaz n i e u w i d a c z n ia ją s i ę w w a ru nk ach p row a dz on eg o e k s p e r y m e n tu .
P owy ższa o b s e r w a c j a , s u g e r u j ą c a d uże a n a l o g i e ob u d y sm u taz p o d w zg lę dem zarów no s t r u k t u r y , j a k 1 mechanizmów d z i a ł a n i a , z n a j
-d u j e -d a l s z e u z a s a -d n i e n i e w a n a l i z i e s k ł a -d u am inokwasow ego. O k r e ś-l e n i e s k ł a d u aminokwasowego d ysm u tazy d o r s z a w y k az a ło je g o duże p o d o b ie ń stw o do s k ł a d u aminokwasowego d ysm u tazy z w ątro b y w ie p -r z a o -r a z dy sm u taz z in n y ch z w i e -r z ą t [ l , 5 , 2 1 ] .
Podsum ow ując można s t w i e r d z i ć , że c h o c ia ż d y sm u ta za z w ą t r o -by d o r s z a w y k a zu je pewne r ó ż n ic e w p o ró w n an iu z d y sm u ta zą s s a -ków, t o je d n a k d z i a ł a n i e obydwu enzymów o p a r t e j e s t n a ta k iir. s a -mym m ec h an iz m ie . I s t o t n a j e s t o b s e r w a c j a , że pewne c z y n n i k i , ja k n p . DDC, k t ó r e m o d y f ik u ją ak ty w n o ść .dysm utazy ssa k ó w , mogą b yć ró w n ie ż sto so w a n e d l a p r z y s z ł y c h b ad a ń in v iv o nad f u n k c ją te g o enzymu u r y b .
LITERATURA
[1] B a n n i s t e r J. V. , A n a s t a s i A. , B a n n i s t e r W. H., 1977, Comp. Biochem- P h y sio l., 568, 235-238,
[2 ] B a r r a D ., M a r t i n i F. , B o s s a F. , R o t i l l i o 0. , B a n n i s t e r J. V. , B a n n i s t e r W. H ., 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1195-1200.
[3] B a r t k o w i a k A. , 1 9 7 9 , Zesz. Nauk. UŁ, S . I I , .23, 105—121. [4] B a r t k o w i a k A. , G r z e l i i l s k a E. , V a r g a I . Sz. , L e y k o W., 1981, I nt . J. Biochem., 13, 1039-1042. [5] B a r t k o w i a k A. , L e y k o W., F r i e d R., 1979, Comp. Biochem. P h y sio l., 62B, 61-66. [6 ] B a r t o s z C., L e y k o W., F r i e d R., 1979, E x p e r ie n t a , 35, 1194-1195. [ 7 ] B e a u c h a m p Ch., F r i d o v i c h I . , 1971, Anal. Biochem., 44, 276-287. [8 ] B r o c k Ch. , W a 1 k e r J. E. , 1980, Biochemistry, 19, 2873- -2875.
[9] F r i d o v i c h I . , 1975, Annu. Rev. Biochem., 44, 147-160.
[10] F r i e d R. , F r i e d L. W., B a b i n D. R., 1970. Eur. J . Biochem., 16, 399-406.
[ l l j o u l d E. , K a r o l u s J. J . , 1975, Anal. Biochem,, 67, 515--519.
[l2 ] H e a 1 y I . A ., M u 1 c a h y M. F . , 1979, Comp. Biochem. P hysiol., 62B, 563-565.
[1 3 ] H e i k k i l a R. E . , C a b b a t F . S . , C o h e n C . , 1976, .1
B i o l . Chem.. 2 51, 2182-2185.
[14 J L e n g f e l d e r E . , 1979, Z. N a t u r f . , 34C, 1292-1294.
[1 5 ] M a z e a u d F . , M a r a 1 J . , M i e h e l s o n A. M ., 1979, Biochem. B io ph y s. Res. Commun., 8 6 . 1161-1168.
[1 6 ] M c C o r d I . M. , F r i d o v i c h I . , 1969, J . B i o l . Chem., 244, 60 49-6055 . [ 1 7 ] M i s r a H ., 1979, J . B i o l . Chem., 2 54 , 11623-11628. [ i fi ] M i a r a H ., F r i d 0 v i c h I . , 1972, J . B io l. Chem., 2 *2 . 3 170 -31 75. « * [ l 9 ] M i u r a T. , O g a w a N . , 0 g i s 0 T . , 1978, Chem. Pharm. B u l l . Tokyo, 2 6 , 1261-1266. t ■ [2 0 ] S t e g e m a n J . , B i n d e r R . , O r r e n A ., 1979, Biochem. P h a r m ., 28 , 34 31-3439 . [ 2 l ] S t e i n m a n H. M., A b e r n a t h y J . L. , U i 1 1 R. L. , 1974, J . B i o l . Chem., 249. 7339 -73 47. [ 2 2 ] W d z i ę c z a k J . , Z a l e ś n a G., B a r t k o w i a k A . , W i t a s H. , L e y k 0 W ., 1981, Comp,. Biochem. P h y s i o l . , 68B. 357 -35 8. [2 3 ] W e b e r K. , O s b o r n M ., 1969, J . B i o l . Chem., 2 44 . 4406 -- 4 4 1 2 . Z ak ład B i o f iz y k i I n s t y t u t B io che m ii i B i o f iz y k i UŁ Anna B a rtk o w ia k , K a z im ie rz S tu d zia n
COMPARATIVE STUDIES ON SUPEROXIDE DISMUTASE FROM COD AND PORCINE LIVER
C y to s o l s u p e ro x id e d is m u ta s e was i s o l a t e d from cod l i v e r and some new con-d i t i o n s o f enzyws p r e p a r a t i o n and p u r i f i c a t i o n w ere e s t a b l i s h e d . Chemical c o m p o s iti o n and some p h y s ic o c h e m ic a l c h a r a c t e r i s t i c s o f cod SOD w ere d e s c r i b e d . E f f e c t s o f DDC, c y a n id e and h e a t on th e enzyme a c t i v i t y and i t s a b s o r p t i o n sp e c tru m w ere t e s t e d . The o b ta in e d r e s u l t s f o r cod l i v e r SOD w ere compared w ith p a r a l l e l a n a l y s i s 'o f p o r c i n e l i v e r d is m u ta s e . Some d i s t i n c t d i f f e r e n c e s -o n c e m e d w i th cha ng es o f SOD a c t i v i t y in d u c ed by te m p e ra t u r e w ere o b s e rv e d .
