Index of /rozprawy2/11712

Pełen tekst

(1)Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki Katedra Biomateriałów i Kompozytów. Rozprawa doktorska Inżynieria Materiałowa. Nanokompozyty na bazie chitozanu modyfikowane różnymi formami grafenu do zastosowań biomedycznych. Mgr inż. Karolina Kosowska Promotor: prof. dr hab. inż. Jan Chłopek Promotor pomocniczy: dr inż. Patrycja Domalik-Pyzik. Kraków 2020.

(2) Praca realizowana w ramach projektu „Przygotowanie i modyfikacja kompozytów polimerowych jako rusztowań do hodowli komórek hMSCs w warunkach in vitro wspomagających ich różnicowanie w kierunku tkanki chrzęstnej i kostnej”. Praca współfinansowana ze środków Narodowego Centrum Badań i Rozwoju w ramach programu STRATEGMED - Profilaktyka i leczenie chorób cywilizacyjnych (STRATEGMED3/303570/7/NCBR/201 (STRATEGMED3/303570/7/NCBR/2017). Oraz w ramach Grantu Dziekańskiego nr 15.11.160.019 Wydziału Inżynierii Materiałowej i Ceramiki.

(3) Składam serdeczne podziękowania mojemu promotorowi: Panu Profesorowi dr hab. inż. Janowi Chłopkowi oraz promotor pomocniczej: dr inż. Patrycji Domalik-Pyzik za możliwość wykonywania pracy w Zespole, opiekę oraz gotowość do służenia radą i poświęcony czas.

(4) Dziękuję: dr inż. Piotrowi Szatkowskiemu za przyjaźń, wsparcie i dobrą radę, doktorantkom z pokoju 507 za miłą atmosferę.

(5) Moim Najbliższym.

(6) Streszczenie W niniejszej rozprawie podjęto się zadania opracowania biomimetycznych nanokompozytów opartych na polimerze pochodzenia naturalnego – chitozanie, przeznaczonych do leczenia ubytków tkanki kostnej i chrzęstnej. Zakres badań obejmował dobór materiałów, metod otrzymywania nanokompozytów grafenowych oraz analizę fizykochemiczną i biologiczną opracowanych układów. W części teoretycznej przedstawiono przegląd literatury dotyczącej chitozanu jako materiału stosowanego w inżynierii tkanki kostnej i chrzęstnej, metod sieciowania polimeru oraz otrzymywania na jego bazie biomimetycznych rusztowań. Kolejny podrozdział dotyczył budowy oraz metod otrzymywania porowatych poliuretanosacharydów, w których jednym z komponentów jest chitozan. Ostatni podrozdział tej części został poświęcony materiałom z rodziny grafenu (GFM) w inżynierii tkankowej. Ze względu na doskonałe właściwości mechaniczne oraz efekt stymulacji wzrostu i różnicowania się komórek macierzystych grafen i jego pochodne są intensywnie testowane jako materiały do regeneracji tkanki chrzęstnej i kostnej. Opisano metody otrzymywania różnych pochodnych grafenu, w tym redukowanego tlenku grafenu (rGO) przy zastosowaniu nietoksycznych, chemicznych środków redukujących. Następnie uwagę skupiono na nanokompozytach. –. w. tym. rodzajach. oddziaływań. nanonapełniacz/polimer. oraz wpływie na właściwości fizykochemiczne matrycy. Kolejnym krokiem było sformułowanie celu i tezy pracy: możliwe jest poprzez dobór odpowiednich sieciowników oraz warunków syntezy otrzymanie nanokompozytów na bazie chitozanu i pochodnych grafenu o takich właściwościach fizykochemicznych i biologicznych, które pozwolą na zastosowanie ich jako podłoża do zastosowań biomedycznych. W części doświadczalnej opisano użyte materiały, metody syntezy pochodnych tlenku grafenu z zastosowaniem nietoksycznych reduktorów, metody otrzymywania różnych form podłoży oraz metody charakteryzowania ich właściwości. Następnie przedstawiono rezultaty badań i ich dyskusję. Po zbadaniu wpływu na matrycę polimerową GO i różnych rodzajów rGO zaproponowano metodę otrzymywania porowatego podłoża z jednoczesną redukcją GO oraz samoorganizacją składników nanokompozytów. Metodę liofilizacji zastosowano w celu otrzymania podłoży o dużej średnicy porów. W kolejnym układzie elektroprzędzona włóknina z poliaktydu została wprowadzona do hydrożelu, tworząc hierarchiczne podłoże. Do wytworzenia hydrożeli o cylindrycznym kształcie opracowano metodę polegającą na zamrażaniu materiału, a następnie stopniowym jego.

(7) rozpuszczeniu w kąpieli sieciującej. Wysokowytrzymałe, porowate podłoża przeznaczone do regeneracji ubytków w stawach na granicy chrząstka/kość otrzymano poprzez wprowadzenie. do. struktury. chitozanu. syntetycznych. jednostek,. tworząc. poliuretanosacharydy. Cylindryczne podłoża o średnicy 5 mm składały się z dwóch warstw. Pierwszą warstwę z dużymi porami, które miały umożliwiać angioi osteogenezę, zmodyfikowano ceramiką bioaktywną, a drugą, z drobnymi porami, dedykowaną dla tkanki chrzęstnej, tlenkiem grafenu..

(8) Abstract This thesis aimed at the development of presents biomimetic nanocomposites scaffolds for tissue engineering of cartilage and bone tissues defects. The scope of research included selection of materials and manufacturing methods, as well as physicochemical and biological analysis of the developed systems. In the literature background, structure, properties and cross-linkers of chitosan were discussed. Next, the most popular methods of chitosan-based scaffold were presented. Next subchapter of this part, gives insight into synthesis methods of chitosan-based polyurethanes. Also, the use of graphene family materials (GFM) in tissue engineering was discussed. In the experimental parts, materials, manufacturing and characterization methods were described in details. Next, research resulted were given. Plant extracts and ascorbic acid were used to obtain different form of reduced graphene oxide (rGO) and the effect of GO and rGO on the chitosan matrix was studied. Three types of porous scaffolds were manufactured: hybrid nanocomposite (simultaneous reduction of GO by ascorbic acid and self-organization of nanocomposite components), hierarchical, hydrogels with PLA/HAp woven. (novel. freezing-thawing-gelling. method). and. high-strength. scaffolds. for regeneration of cartilage-subchondral bone defects in knee-joint. The properties of chitosan were modified by incorporating synthetic units into the structure to form chitosan-based polyurethanes. Cylindrical, two-layer scaffolds with a diameter of 5 mm were obtained. The first layer with large pores, imitating bone tissue, allowing angio- and osteogenesis was made of material modified with bioactive ceramics, and the second layer, with small pores, dedicated for cartilage tissue, from an analogous biomaterial reinforced with graphene oxide..

(9) Spis treści I. Wprowadzenie ...........................................................................................................1 II. Część literaturowa....................................................................................................3 2.1. Rusztowania chitozanowe .................................................................................3 2.1.1. Chitozan – otrzymywanie, właściwości fizykochemiczne i biologiczne .........3 2.1.2. Sieciowniki fizyczne i chemiczne chitozanu ....................................................7 2.1.3. Rusztowania chitozanowe w inżynierii tkankowej .........................................13 2.2. Chitozan w poliuretanosacharydach..............................................................20 2.2.1. Metody syntezy poliuretanów.........................................................................20 2.2.2. Poliuretany modyfikowane polisacharydami (poliuretanosacharydy) ...........25 2.2.3. Rusztowania poliuretanowe w inżynierii tkankowej ......................................30 2.3. Materiały z rodziny grafenu (GFM) w inżynierii tkankowej ......................34 2.3.1. Synteza i właściwości tlenku grafenu i redukowanego tlenku grafenu ..........34 2.3.2. Oddziaływanie nanomateriału na komórkę ‒ aktualny stan wiedzy ..............41 2.3.3. Nanokompozyty polimer ‒ GFM....................................................................45 III. Cel i teza pracy......................................................................................................49 IV. Część eksperymentalna ........................................................................................51 4. Materiały i metody badawcze ............................................................................51 4.1. Odczynniki........................................................................................................51 4.1.1. Składniki podłoży na bazie hydrożeli .............................................................51 4.1.2. Składniki podłoży na bazie poliuretanosacharydów.......................................52 4.2. Metody badawcze.............................................................................................53 4.2.1. Badania strukturalne .......................................................................................53 4.2.2. Badania termiczne ..........................................................................................54 4.2.3. Badania mikroskopowe ..................................................................................55 4.2.4. Badania mechaniczne .....................................................................................55.

(10) 4.2.5. Badania reologiczne........................................................................................55 4.2.6. Wyznaczenie stopnia deacetylacji chitozanu..................................................55 4.2.7. Wyznaczenie stopnia usieciowania chitozanu ................................................56 4.2.8. Zwilżalność .....................................................................................................56 4.2.9. Nasiąkliwość i degradacja hydrolityczna .......................................................57 4.2.10. Bioaktywność ...............................................................................................57 4.2.11. Badania odpowiedzi komórkowej w warunkach in vitro .............................58 4.3.. Synteza. chitozanowych. hydrożeli. i. gąbek. kompozytowych. z jednoczesną redukcją tlenku grafenu i samoorganizacją składników kompozytu....60 4.3.1. Redukcja tlenku grafenu substancjami pochodzenia naturalnego ..................62 4.3.2. Synteza hydrożeli i gąbek ...............................................................................63 4.4.. Synteza. chitozanowych. hydrożeli. z. gradientem. usieciowania. i modyfikowanych mikrowłóknami ..................................................................................64 4.4.1. Elektroprzędzenie mikrowłókien polilaktydowych ........................................65 4.4.2. Synteza hydrożeli wzmacnianych mikrowłóknami ........................................66 4.5. Synteza poliuretanosacharydów .....................................................................67 4.5.1. Synteza gradientowych poliuretanosacharydów.............................................68 V. Wyniki i dyskusja ...................................................................................................70 5.1. Badania samoorganizujących się hydrożeli i gąbek chitozanowych ...........71 5.1.1. Analiza właściwości fizykochemicznych .......................................................71 5.1.2. Badania komórkowe in vitro ..........................................................................86 5.2. Badania hydrożeli z gradientem usieciowania i modyfikowanych mikrowłóknami ...................................................................................................................87 5.2.1. Analiza właściwości fizykochemicznych .......................................................87 5.2.2. Badania komórkowe in vitro ........................................................................104 5.3. Badania poliuretanosacharydów ..................................................................110 5.3.1. Analiza właściwości fizykochemicznych .....................................................110 5.3.2. Badania komórkowe in vitro ........................................................................129.

(11) Podsumowanie i wnioski ...........................................................................................132 Spis najczęściej stosowanych skrótów .....................................................................134 Spis tabel ....................................................................................................................135 Spis rysunków ............................................................................................................136 Bibliografia ................................................................................................................141 Dorobek naukowy .....................................................................................................151.

(12) I. Wprowadzenie „Chitozan” to określenie zbiorcze, opisujące szeroką grupę polimerów różniących się między innymi masą cząsteczkową, stopniem deacetylacji oraz rozłożeniem jednostek, z których zbudowany jest chitozan, w obrębie łańcucha. Ponieważ chitozan pozyskuje się z chityny, polimeru budującego szkielety zewnętrzne stawonogów, określa się go jako „polimer pochodzenia naturalnego”. Liczne badania naukowe potwierdziły jego biodegradowalność i biokompatybilność. Ponadto obecność grup funkcyjnych – aminowych i hydroksylowych daje możliwość różnych modyfikacji polimeru, co można wykorzystać przy projektowaniu i otrzymywaniu rusztowań (ang. scaffolds) w inżynierii tkankowej. Pomimo wielu pozytywnych cech aplikacyjność chitozanu w inżynierii tkankowej wciąż podlega dużym ograniczeniom. Zastosowanie sieciowników chemicznych i fizycznych daje możliwość otrzymania podłoży o różnej specyfice – pianek, mikrosfer, włókien oraz hydrożeli. Często jest to jednak rozwiązanie niewystarczające, które nie pozwala na całkowitą neutralizację innych ograniczeń – słabej stabilności chitozanu w warunkach ludzkiego ciała, hydrofobowego charakteru jego powierzchni oraz słabych właściwości mechanicznych. Poprawę funkcjonalności podłoży na bazie chitozanu można uzyskać na kilka sposobów.. Jednym. z. nich. jest. wprowadzenie. do. matrycy. nanomateriałów,. takich jak grafen, uzyskując tym samym nanokompozyt. Innym jest modyfikacja z zastosowaniem syntetycznych polimerów charakteryzujących się relatywnie długim czasem degradacji oraz dobrymi właściwościami mechanicznymi. Układy skonstruowane z biozgodnych poliestrów alifatycznych, na przykład o budowie włóknistej, mogą stanowić szkielet hierarchicznego podłoża hydrożelowego. Obecność grup funkcyjnych w chitozanie daje również możliwość modyfikacji jego struktury poprzez wprowadzenie do niej jednostek pozwalających na polepszenie właściwości mechanicznych oraz czasu degradacji. Do taki polimerów należą między innymi poliuretany. Używane do ich syntezy diizocyjaniany reagują zarówno z grupami hydroksylowymi, jak i aminowymi, które obecne są również w chitozanie. Sztuczne podłoże komórkowe ma za zadanie tymczasowo zastąpić naturalną macierz zewnątrzkomórkową (ECM) aż do jej odbudowy i zapewnić komórkom warunki do prawidłowego wzrostu, proliferacji i migracji. Macierz zewnątrzkomórkowa jest 1.

(13) wielopoziomowym, hierarchicznym tworem, który spaja komórki w tkankę, odpowiada za jej organizację przestrzenną i stabilność mechaniczną, jest podporą dla komórek. Macierz zewnątrzkomórkowa zbudowana jest z formy bezpostaciowej i postaciowej. Pierwsza. składa. się. głównie. z. proteoglikanów. oraz. glikozaminoglikanów,. które odpowiadają za jej zdolność do wiązania i utrzymywania wody. Forma postaciowa składa się z włókien zbudowanych głównie z kolagenu i glikoprotein [1]. Podłoża powinny wykazywać tak zwany biomimetyzm, czyli naśladować cechy naturalnego ECM i częściowo spełniać jego funkcje. Jednym z kierunków w inżynierii tkankowej jest otrzymywanie porowatych, trójwymiarowych podłoży. Architektura materiału ma wpływ na zachowanie się komórek oraz właściwości mechaniczne. Od podłoża wymaga się wysokiego stopnia porowatości otwartej – pory powinny budować swoistą sieć. Porowatość w skali mikro determinuje migrację komórek w miejsce regeneracji oraz transport składników odżywczych, a budowa nanometryczna ich adhezję. Do regeneracji tkanki kostnej średnica porów powinna zawierać się w przedziale 100 – 350 μm. Mniejsze wymiary nie pozwalają na penetrację tkanki [2]. Przy dużych ubytkach w tkance podłoże częściowo przejmuje jej właściwości. W przypadku tkanki kostnej i chrzęstnej implant musi charakteryzować się wysokimi właściwościami mechanicznymi i zdolnością do przenoszenia części naprężeń, aż nowa tkanka nie osiągnie odpowiedniej wytrzymałości.. 2.

(14) II. Część literaturowa 2.1. Rusztowania chitozanowe 2.1.1. Chitozan – otrzymywanie, właściwości fizykochemiczne i biologiczne Chitozan to polimer pochodzenia naturalnego, otrzymywany poprzez częściową deacetylację chityny, którą pozys pozyskuje się głównie z egzoszkieletów skorupiaków. Jest liniowym polisacharydem zbudowa zbudowanym nym z losowo rozłożonych jednostek, jednostek czyli (1→4)-2amino-2-deoksy-β-D-glukan glukanu (D-glukozamina) oraz (1→4)-2-acetamido acetamido-2-deoksy-β-Dglukanu (N-acetylo-D-glukozamina glukozamina), połączonych wiązaniami β (1→4) (rys. (r 1) [3].. Rys. 1. Chemiczna struktura chityny i chitozanu otrzymanego w procesie jej częściowej deacetylacji [4]. Stopień deacetylacji chitozanu reprezentuje stosunek tosunek molowy D-glukozaminy D do sumy obu jednostek, zarówno D D-glukozaminy, jak i N-acetylo-D D-glukozaminy [5]. Głównym źródłem do komercyjnego pozyskiwania chityny są kraby oraz krewetki. Chityna jest ekstrahowana z pancerzy poprzez obróbkę kwasem (w celu usunięcia węglanu wapnia), a następnie zasadą (w celu usunięcia białek). Często kolejnym etapem komercyjnej obróbki óbki jest odbarwianie, aby uzyskany produkt miał kolor biały. Chityna jest trudno rozpuszczalna, co znacząco ogranicza możliwości jej wykorzystania, wykorzystania dlatego poddawana. jest. dalszej. obróbce,. mianowicie. częściowej. deacetylacji, 3.

(15) co prowadzi do otrzymania chitozanu, który dobrze rozpuszcza się w rozpuszczalnikach o lekko kwasowym pH. Podczas standardowej, alkalicznej deacetylacji usunięta zostaje część grup acetylowych, ale także zmianie ulega masa cząsteczkowa polimeru w wyniku jego częściowej depolimeryzacji [6]. Procesy deacetylacji chityny można podzielić na dwa podstawowe rodzaje: alkaliczną [7] i enzymatyczną [8]. Ogólnie mówiąc, w metodzie alkalicznej chityna traktowana jest przez kilka godzin stężonym roztworem wodorotlenku sodu lub potasu w wysokiej temperaturze. Powstałe substancje stałe są odsączane, przemywane do neutralnego pH, a następnie suszone. Na stopień deacetylacji uzyskanego produktu mają wpływ czynniki tj. forma i rozdrobnienie chityny, stężenie zasady, temperatura oraz czas procesu. Pires i inni w swoim eksperymencie zastosowali dwa stężenia NaOH (2 i 10 mol/dm3), proces prowadzili przez 3 lub 24 godziny, w temperaturze 363 lub 393 K. Uzyskali w ten sposób dwanaście różnych chitozanów o stopniu deacetylacji od 59.2 do 84.4%, co jest wynikiem bardzo zbliżonym do komercyjnie dostępnych chitozanów [9]. Deacetylacja alkaliczna jest częściej komercyjnie stosowana od enzymatycznej ze względu na niższe koszty, ale posiada także wady, są to m.in. powstawanie dużych ilości odpadów w postaci stężonej zasady, co może wpływać na zanieczyszczenie środowiska, zużycie energii oraz obecność rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych produktów ubocznych w finalnym produkcie. W związku z tym zaczęto eksplorować drugą, konkurencyjną metodę, w której do uzyskania chitozanu wykorzystuje się enzymy zdolne do deacetylacji chityny. Ten proces nie jest tak agresywny, więc polimer nie ulega w niej częściowej degradacji, co pozwala na uzyskanie bardziej homogenicznego i lepiej zdefiniowanego materiału. Obecność. enzymów. zdolnych. do. katalizowania. hydrolizy. wiązań. N-. acetomidowych w chitynie potwierdzono u kilku gatunków grzybów [10,11]. Pareek i inni użyli szczepu Penicilliumoxalicum SAEM-51 do otrzymania enzymu deacetylazy chityny, a następnie w dwuetapowym procesie, łączącym obróbkę chemiczną i enzymatyczną, poddali komercyjnie dostępną chitynę deacetylacji [12]. Obróbka chemiczna miała na celu zmniejszenie stopnia krystaliczności chityny, który obniża jej podatność na deacetylację enzymatyczną. Deacetylację przeprowadzono poprzez inkubację kilku otrzymanych produktów o obniżonym stopniu krystaliczności w obecności enzymu przez 24 godziny. Maksymalny stopień deacetylacji osiągnięto po 10 godzinach (po. tym czasie wzrost był już minimalny). Dla chityny 4.

(16) niemodyfikowanej chemicznie wyniósł on około 50%, najlepszy wynik dla jednego z produktów obróbki chemicznej to 79.52%. Autorzy powyższego badania podkreśli, że w celu efektywnego pozyskiwania chitozanu o określonym stopniu deacetylacji konieczne jest opracowanie skutecznej strategii wstępnej obróbki chityny oraz dodatkowe badania nad mechanizmem enzymatycznej deacetylacji. Z tych powodów oraz niższych kosztów procesu deacetylacja alkaiczna wciąż jest powszechnie stosowaną metodą pozyskiwania chitozanu na skalę komercyjną. Źródło oraz warunki procesu otrzymywania wpływają na fizykochemiczne właściwości chitozanu. Na większość właściwości chitozanu, w tym na jego rozpuszczalność oraz reaktywność, decydujący wpływ ma stopień deacetylacji, masa cząsteczkowa oraz rozłożenie w łańcuchu polimeru grup aminowych, które w środowisku kwasowym ulegają protonowaniu, oraz grup hydroksylowych. Stopień deacetylacji ma więc wpływ na większość kluczowych właściwości chitozanu, czyli rozpuszczalność, pęcznienie. w. wodzie,. reaktywność,. biodegradowalność,. biozgodność. i bioaktywność [13]. Chitozan. nie. posiada. właściwości. termoplastycznych. (ulega. degradacji. przed osiągnięciem temperatury topnienia), dlatego do otrzymywania materiałów na jego bazie najczęściej stosuje się roztwory polimeru. Rysunek 2 przedstawia podstawowe metody otrzymywania stałych form chitozanu z roztworu. Pierwszą metodą jest zneutralizowanie kwasu, co doprowadza do wytworzenia się nierozpuszczalnego chitozanu. Kolejną metodą jest usunięcie wody z roztworu, jednak ten sposób prowadzi do otrzymania rozpuszczalnej w wodzie soli chitozanu z kwasem. Ostatnią metodą jest połączenie. łańcuchów. polimerowych. za. pomocą. wiązań. o. naturze. jonowej. lub kowalencyjnej z użyciem sieciowników. Zagadnienie to będzie szerzej omówione w kolejnym podrozdziale. Obecność aminowej grupy w pozycji C-2 oraz hydroksylowych grup w pozycjach C-3 i C-6 (rys. 1) determinuje reaktywność chitozanu i podatność na modyfikacje mające na celu poprawienie właściwości polimeru m.in. rozpuszczalności, hydrofilowości, czy powinowactwa do cząstek bioaktywnych [14].. 5.

(17) Rys. 2. Otrzymywanie stałych form chitozanu z roztworu o kwasowym ppH: H: A) neutralizacja, B) usunięcie wody, C) sieciowanie (R – anion, polianion lub chemiczny sieciownik) [13] 13]. Chitozan jest uznawany za polimer nietoksyczny. W Japonii i we Włoszech jest dopuszczony jako suplement diety, w Finlandii może być stosowany w opatrunkach. Jego toksyczność mocno zależy jednak od stopnia deacetylacji, ylacji, masy cząsteczkowej, czy rodzaju modyfikacji, której został poddany [15]. Rao i inni przygotowali cienkie filmy chitozanu poprzez rozpuszczenie polimeru w 2% kwasie octowym, wylanie roztworu na szalki, lki, odparowanie i neutralizację 1M NaOH. Test toksyczności ostrej przeprowadzono na myszach, którym wstrzyknięto ekstrakt. Potencjał właściwości drażniących zbadano na królikach (oko) i świnkach morski morskich ch (skóra). Chitozan nie spowodował żadnych toksycznyc toksycznych efektów [16]. Liczne czne badania wykazały także, że chitozan i jego pochodne posiadają właściwości antybakteryjne antybakteryjne,, zarówno przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, tnim, jak i Gram Gram-ujemnym [17,18].. Jednocześnie działanie chitozanu wydaje się być jeszcze silniejsze przeciwko grzybom [19]. Podsumowanie Wyjątkowaa budowa strukturalna chitozanu chitozanu,, czyli obecność aminowej grupy w pozycji C-22 oraz hydroksylowych grup w pozycjach C C-3 i C-6, przekłada się na zestaw interesujących właściwości, takich jak rozpuszczalność w lekko kwasowych roztworach wodnych, reaktywność, coo daje możliwość zastosowania sieciowników sieciownikó zarówno kowalencyjnych, jak i jonowych oraz podatność na liczne modyfikacje m.in. szczepienie s z innymi polimerami. Ze względu na niską toksyczność, ść, a przy tym antybakteryjność chitozan wydaje się mieć duży potencjał w zastosowaniach owaniach biomedycznych, biomedyczn w tym w inżynierii tkankowej. 6.

(18) 2.1.2. Sieciowniki fizyczne i chemiczne chitozanu Uzyskanie stabilnej, trójwymiarowej postaci chitozanu, której można nadać określoną formę np. membran, bloków, mikrosfer, czy pianek po liofilizacji, wymaga jego usieciowania. Chitozan może tworzyć hydrożele, czyli sieć zdolną do pochłonięcia dużej ilości wody lub płynów ustrojowych [20], dzięki fizycznym interakcjom (wiązania wodorowe, siły van der Waalsa, oddziaływania hydrofobowe, wiązania jonowe) między łańcuchami lub chemicznym (kowalencyjnym) wiązaniom. Najprostszą metodą otrzymywania fizycznych hydrożeli chitozanu jest koagulacja w środowisku alkaicznym z użyciem roztworu NaOH albo NaOH/Na2CO3, co prowadzi do osłabienia odpychania elektrostatycznego między zjonizowanymi grupami –NH3+ w wodzie, jednak taki hydrożel jest odwracalny (ulegnie rozpuszczeniu w kwasowym roztworze po zneutralizowaniu zasady) i ma słabe właściwości mechaniczne. W celu ich poprawienia stosuje się sieciowniki jonowe m.in. trójpolifosforan sodu (TPP), cytrynian sodu (SC) lub β-glicerofosforan di-sodu (β-GP) [21]. Budowę i typ oddziaływań powyższych środków sieciujących z chitozanem przedstawiono w tabeli 1. Tabela 1. Fizyczne sieciowniki chitozanu [21]. Nazwa. Budowa. Rodzaj oddziaływania. Trójpolifosforan sodu. Oddziaływania elektrostatyczne. Cytrynian sodu. Oddziaływania elektrostatyczne. β-glicerofosforan di-sodu. Oddziaływania hydrofobowe. W sieciowaniu chitozanu za pomocą TPP udział biorą aniony -P3O105oraz zjonizowane dodatnio grupy –NH3+. W środowisku wodnym TPP ulega dysocjacji, a dostępne stają się zarówno aniony wodorotlenowe, jak i fosforanowe. Mechanizm sieciowania silnie zależy od pH. Wolne jony amonowe chitozanu w roztworze kwasu octowego (pH = 3.05) ulegają hydratacji. Gdy do roztworu dodawany jest TPP, kationy oddziałują z anionami fosforanowymi, a przewodność roztworu spada. Po wysyceniu wszystkich grup aminowych przewodność znów wzrasta, co związane jest z pojawieniem 7.

(19) się jonów wodorowych. Dochodzi do jonowego sieciowania chitozanu. Gdy pH roztworu TPP jest wyższe (pH = 9), jony fosforanowe i wodorotlenowe konkurują o dostęp do jonów –NH3+ pochodzących od chitozanu [22]. Jony wodorotlenowe oddziałują z jonami amonowymi przez deprotonację, a więc w zależności od pH mechanizm sieciowania chitozanu przez TPP może być różny (rys. 3).. Rys. 3. Mechanizmy oddziaływania TPP z chitozanem: A) deprotonacja, B) sieciowanie jonowe [22]. β-glicerofosforan. di-sodu. jest. wykorzystywany. do. otrzymywania. wstrzykiwalnych, termoczułych hydrożeli chitozanowych, które sieciują w temperaturze ludzkiego ciała. Mechanizm sieciowania jest inny niż przy użyciu TPP lub SC. W tworzeniu żelu biorą udział oddziaływania hydrofobowe. Wraz ze wzrostem temperatury rośnie siła jonowa w układzie chitozan/kwas octowy/β-GP, co sprzyja powstaniu hydrożelu z udziałem trzech mechanizmów: zmniejszenie rozpuszczalności chitozanu,. zmniejszenie. sił. odpychania. elektrostatycznego. oraz. wzmocnienie. oddziaływań polimer-polimer (dzięki oddziaływaniom hydrofobowym) [23]. Do. uzyskania. stabilnych. hydrożeli. o. polepszonych. właściwościach. mechanicznych konieczne jest wytworzenie między łańcuchami polimerowymi silnych wiązań kowalencyjnych, co najczęściej osiągane jest przez użycie chemicznych sieciowników. W przypadku chitozanu stosowane są małe molekuły o dwóch lub większej liczbie grup funkcyjnych. W tworzeniu wiązania biorą udział grupy aminowe z łańcucha chitozanu. Jedna molekuła sieciownika reaguje z dwoma jednostkami. chitozanu.. Najpowszechniejsze. sieciowniki. wraz. z. ich. budową. oraz rodzajem wiązania, jakie powstaje podczas sieciowania, zebrano w tabeli 2. 8.

(20) Tabela 2. Chemiczne hemiczne sieciowniki chitozanu [21]. Nazwa. Budowa. Rodzaj wiązania. Aldehyd glutarowy. -C=N-. Aldehyd malonowy. -C-N-. Genipina. W przypadku stosowania dialdehydów dialdehydów, którymi ymi są aldehyd glutarowy (GA) i aldehyd malonowy (MDA) w reakcji,, w której biorą udział grupy aminowe chitozanu, powstają wiązania iminowe. Reakcja z GA przebiega z dużą szybkością, ale jej wydajność jest zależna od pH. Zwiększenie pH roz roztworu tworu chitozanu z 4.1 do 5.6 za pomocą wodorotlenku sodu zwiększa o 50% ilość deprotonowanych onowanych grup aminowych, które mogą brać udział w reakcji addycj addycji nukleofilowej [24]. Produkt reakcji chitozanu z aldehydem dehydem glutarowym przedstawiono na rysunku 4.. Rys. 4. Struktura produktu sieciowania chitozanu aldehydem glutarowym [24]. Dialdehydy rzadko stosowane są jednak w med medycynie ycynie i farmacji ze względu na swoją toksyczność [25] [25].. Materiały chitozanowe sieciowane GA częściej są za to wykorzystywane jako ako materiały sorpcyjne [26]. W inżynierii tkankowej jako chemiczny sieciownik chitozanu w ostatnich latach intensywnie badana jest gen genipina (GNP) [27]. Jest to naturalny związek pozyskiwany z owoców Gardenia jasminoides. jasminoides 9.

(21) Jest znacznie mniej toksyczna od wielu powszechnie stosowanych sieciowników chitozanu, białek, czy żelatyny, w tym od aldehydu glutarowego. Jej toksyczność ostra u myszy wynosi (LD50) 382 mg/kg [28]. Badania wskazują także, że genipina wykazuje między innymi właściwości przeciwnowotworowe, antybakteryjne i przeciwzapalne [29]. W wyniku reakcji genipiny z chitozanem powstaje zarówno wiązanie peptydowe, jak i trzeciorzędowa amina (rys. 5).. Rys. 5. Mechanizm oddziaływania genipiny z chitozanem [30]. Chitozan jako polielektrolit kationowy jest zdolny do reagowania z różnego rodzaju polielektrolitami anionowymi. i tworzenia kompleksów. Inne polisacharydy. np. alginian lub białka mogą posłużyć jako wielkocząsteczkowy środek sieciujący chitozanu. Innymi metodami sieciowania chitozanu są sieciowanie radiacyjne z użyciem promieniowania gamma lub strumienia elektronów oraz fotosieciowanie [31]. Kolejną z nowych metod sieciowania chitozanu jest użycie do tego celu nanocząstek, takich jak oksydowane nanorurki węglowe i tlenek grafenu, które posiadają grupy epoksydowe. Reakcja między nimi i grupami aminowymi chitozanu może przebiegać w sposób podobny do sieciowania żywicy epoksydowej. Pierwsze badania właściwości. fizykochemicznych. nanokompozytów. chitozanowych. usieciowanych. za pomocą GO przedstawili Shao i inni [32]. Otrzymali oni tlenek grafenu za pomocą zmodyfikowanej metody Hummersa, a następnie przez 4 godziny w temperaturze 60 ºC sonifikowali go w roztworze chitozanu (jako rozpuszczalnika użyto 1% kwasu octowego). Po odparowaniu otrzymane filmy nanokompozytowe były suszone przez noc w 120 ºC. Kompozyty z 1% udziałem GO miały o 141% lepszą wytrzymałość na rozciąganie w porównaniu do niemodyfikowanych filmów. Na podstawie badań spektroskopowych w podczerwieni (FTIR) zaproponowano mechanizm sieciowania chitozanu przez GO (rys. 6).. 10.

(22) Rys. 6. Mechanizm chanizm sieciowania chitozanu za pomocą tlenku grafenu [32]. Do tworzenia mocnych, kowale kowalencyjnych ncyjnych wiązań amidowych pomiędzy pom grupami karboksylowymi tlenku grafenu i aminowymi chitozanu tozanu zastosowano aktywatory w postaci NHS i EDC (mieszanina 11-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu dimetyloaminopropylo)karbodiimidu i NN hydroksybursztynyloimidu). Do rozpuszczenia chitozanu uużyto żyto w tym przypadku kwasu mlekowego, co uzasadniono mniejszą toksycznością dla komórek. Proszek chitozanu dodano do wodnej zawiesiny GO, a następnie powoli w wkraplano kraplano kwas mlekowy. Roztwór sonifikowano onifikowano przez 20 minut, a następnie dodano NHS, a po 30 minuta minutach EDC. Otrzymane filmy o zawartości GO od 0 do 3% ssuszono uszono w 50 ºC. Nanokompozyty z maksymalnym udziałem nanododatku miały o prawie 150% lepsz lepszą wytrzymałość na rozciąganie w porównaniu do filmu z chitozanu [33].. Zaproponowany mechanizm sieciowania, w którym oprócz GO bierze udział także kwas mlekowy, przedstawiono na rysunku 7.. 11.

(23) Rys. 7. Mechanizm sieciowania chitozanu za pomocą GO z użyciem aktywatorów NHS i EDC [33]. Podsumowanie Dzięki obecności grup aminowych chitozan może być sieciowany za pomocą szerokiego. spektrum. Dla zastosowań. sieciowników,. biomedycznych. zarówno proponuje. fiz fizycznych, ycznych, się. jak. zastąpienie. i. chemicznych. sieciowników. charakteryzujących się dużą toksycznością, ttakich akich jak aldehyd glutarowy na rzecz związków pochodzenia naturalnego, głównie genipiny. Kolejnym rozwiązaniem jest zastosowanie nanocząstek np. tlenku grafenu, co ppozwala ozwala na uzyskanie kompozytu o znacznie polepszonych właściwościach mechanicznych.. 12.

(24) 2.1.3. Rusztowania chitozanowe w inżynierii tkankowej Pojęcie inżynierii tkankowej po raz pierwszy zaproponował Fung w 1985 roku. Jej aktualnie używana definicja „zastosowanie inżynierii oraz nauk biologicznych i chemicznych w celu naprawy, odbudowy lub regeneracji żywej tkanki przy pomocy komórek,. biomateriałów. i czynników. indukujących. wzrost. tkanki,. pojedynczo. lub w kombinacji” została zaproponowana w 1999 roku [34]. W inżynierii tkankowej można wyróżnić trzy główne strategie [35]: a). zastosowanie. trójwymiarowych. materiałów,. nazywanych. rusztowaniami. (ang. scaffolds), w miejscu ubytku w celu wspomagania regeneracji tkanki. Właściwości fizykochemiczne i mikrostruktura takiego materiału powinny naśladować naturalną tkankę, aby zapewnić komórkom optymalne warunki do wzrostu i namnażania, b). wstrzyknięcie w miejsce ubytku komórek autologicznych, allogenicznych lub ksenogenicznych,. c). wyizolowanie komórek, osadzenie ich na rusztowaniu i umieszczenie go w ubytku. Implantacja rusztowania pozwala na migrację komórek gospodarza z otaczających. ubytek tkanek, ale nie zawsze jest to wystarczające rozwiązanie, wówczas na rusztowanie zaszczepia się wyhodowane poza organizmem komórki lub modyfikuje się je poprzez dodanie czynników indukujących wzrost tkanki. W przypadku kości mogą to być białka morfogenetyczne kości, takie jak BMP-2, BMP-6, BMP-7 i TGF-β. Rusztowania powinny zapewniać odpowiednią przestrzeń do wzrostu nowej tkanki, migracji komórek, transportu składników odżywczych, usuwania odpadów oraz neowaskularyzacji (tworzenia nowych naczyń krwionośnych). Chitozan. jest. liniowym. polisacharydem,. który. wykazuje. strukturalne. podobieństwo do glikozaminoglikanów (GAG) macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Wykazano również, że może inicjować proliferację komórek mezenchymalnych, szczególnie fibroblastów, osteoblastów i chondroblastów oraz różnicować komórki osteoprogenitorowe [36]. Z tego względu zastosowanie rusztowań na jego bazie, zwykle w postaci kompozytów i nanokompozytów, jest szczególnie intensywnie badane w inżynierii tkanki kostnej i chrzęstnej [37].. 13.

(25) Rusztowania chitozanowe można podzielić na ccztery ztery podstawowe rodzaje, które zebrano na rysunku 8.. Rusztowania. Porowate. Hydrożelowe. Włókniste. Mikrosfery. Rys. 8. Rodzaj Rodzaje rusztowań na bazie chitozanu [38–40]. Trójwymiarowe, porowate rusztowania (gąbki) chitozanowe w większości przypadków są uzyskiwane ane prostą metodą liofilizacji oraz drukowania 3D. 3D Rusztowanie musii spełniać kilka podstawowych warunków. W przypadku inżyni inżynierii erii tkanki kostnej materiał, z którego został wykonany, powinien być osteokonduktywny, powinien wspierać migrację komórek i być „szablonem” dl dlaa nowotworzącej się tkanki. Jak wspomniano wyżej, ruszt rusztowanie musi umożliwiać ożliwiać także neowaskularyzację i wrastanie nowej kości. Porowate rusztowan rusztowanie ie powinno więc być zbudowane z połączonej sieci porów, których średnica będzie oscylować wokół 200 do 600 μm. Oprócz tego powierzchnia powinna cechować się odpowiedn odpowiednią ią chropowatością, chrop ponieważ może ona ułatwić osadzanie się komórek na podłożu. Właściwości mechaniczne są ściślee powiązane z porowatością. Dla ludzkiej kości moduł ściskania wynosi od 100 – 500 MPa [41] [41]. Najpopularniejsze metody otrzymywania porowatych podłoży na bazie chitozanu to liofilizacja, drukowanie, spienianie gazem oraz interpolimeryzacja (polimeryzacja wewnątrzsieciowa) [42]. W rozdziale dokładniej omówiona zostanie pierwsza z metod.. 14.

(26) W przypadku liofilizacji na porowatość, grubość ścianek oraz średnicę porów wpływa głównie ciśnienie liofilizacji, stężenie polimeru i stopień jego usieciowania. W pierwszym zym etapie procesu roztwór polimeru mrozi się, co prowadzi do krystalizacji rozpuszczalnika i utworzenia szkieletu rusztowania w wyniku gromadzenia się polimeru wokół. rosnących. kryształów.. Po. ich. usunięciu. otrzymywane. jest. porowate. rusztowanie [43]. Najprostszą metodą otrzymania por porowatego owatego rusztowania będzie więc rozpuszczenie chitozanu w rozcieńczonym kwasie oc octowym, towym, wprowadzenie roztworu do formy i jego zamrożenie, następnie liofilizacja i neutralizacja prz przy użyciu wodorotlenku sodu, jak przedstawio przedstawiono na rysunku 9. Średnicę porów można kontrolować poprzez. temperaturę. zamrażania.. Zastosowanie. niższej. temperatury. prowadzi. do zwiększenia szybkości zamarzania, a przez to do pow powstania stania mniejszych kryształów, a w konsekwencji mniejszych porów. Podobny efekt można uzyskać przez zwiększenie stężenia chitozanu.. Rys. 9. Schemat otrzymywania rusztowania na bazie chitozanu metodą separacji faz i liofilizacji [41]. Pawar awar i inni wytworzyli rusztowania poprzez rozpuszczenie odważki chitozanu w 0.5% 5% kwasie octowym, zamrożenie roztworu w -20 ºC i liofilizację przez 48 godzin. Otrzymano. także. trzy. serie. próbek. modyfikowanych. lekami:. wankomycyną,. cyprofloksacyną i cefuroksymem (15% wagowych). Chitozan nie był w żaden sposób sieciowany. owany.. Rusztowanie. niemodyfikowane. lekiem. po. 21. dniach. inkubacji. (PBS + 1.5 μg/mL lizozymu, 37 ºC, 75 rpm) uległo ło degradacji w 80 %. Wybrano dwa rodzaje. rusztowań. charakteryzujące. się. przedłużonym. uwalnianie uwalnianiem. leku. (z cyprofloksacyną i cefuroksymem) i wszcz wszczepiono epiono je podskórnie szczurom. Uległy one całkowitej degradacji po 42 dniach, a implantacja wywołała minimalny skutek ogólnoustrojowy. Autorzy sugerują, że ich rusztowania mogłyby znaleźć zastosowanie jako implanty ortopedyczne minimalizujące szanse zakaże zakażenia [44]. W celu zwiększenia właściwości mechanicznych i wydłużenia czasu degradacji chitozanowych rusztowań otrzymywanych metodą liofilizacji zazwyczaj stosowane są sieciowniki eciowniki oraz blendy z innymi polimerami polimerami. Cai i inni zbadali adali wpływ temperatury 15.

(27) zamrożenia (-20 i -80 80 ºC) oraz czas liofilizacji (1, 6 i 12 godzin) 0.6% roztworu chitozanu z 0.25% dodatkiem genipiny w roli sieciownika na morfologię gąbek. Analiza wykazała, że wydłużenie czasu liofilizacji może skutkować nawet czterokrotnym zwiększeniem średnicy porów (zz 40 do 160 μm) [45].. Zastosowanie genipiny jako środka sieciującego spowalnia także degradację rusztowania podczas inkubacji w PBS. Jednak usieciowane gąbki o porach średnicy 150 – 200 μm charakteryzowały y się modułem przy ściskaniu ≈7 kPa, co znacznie odbiega od wartości pod podawanych awanych w literaturze dla ludzkiej kości [46]. Bardziej zaawansowane ro rozwiązania ania wykorzystują napełniacze poprawiające właściwości mechaniczne np. tlenek grafenu oraz bioaktywność np. n bioszkło lub hydroksyapatyt, co prowadzi tym samym do uzyskania kompozytu. kompozyt Liu i inni otrzymali. porowate,,. anizotropowe. rusztowania. chitozanowe. wzmocnione. GO,. które swoją budową przypominały blaszki kostne dzięki zastosowaniu iu kierunkowego zamrażania, jak przedstawiono na rysunku 10 [47]. W tym przypadku jako sieciownika użyto aldehydu glutarowego. Moduł przy ściskaniu dla próbki z samego chitozanu wyniósł około 0.4 MPa i rósł wraz zze zwiększającym się udziałem GO aż do wartości 1.6 MPa. Badania wykazały także, że nanododatek poprawił zdol zdolność ność do absorpcji białka. Dodatkowo osadzone na rusztowaniach komórki (MC3T3 (MC3T3-E1, E1, mysie, prawidłowe preosteoblasty). wykazywały. tendencję. do. układ układania ania. się. wzdłuż. kanałów,. a więc rusztowania potencjalnie encjalnie mogłyby zostać użyte do kierunkowej regeneracji tkanki kostnej.. Rys. 10. Schemat otrzymywania oraz fotografie SEM porowatych ruszto rusztowań wań CS/GO: a) 1%, b) 3% i c) 5% GO [47]. 16.

(28) W przeciwieństwie do gąbek otrzymanych w wyniku liofilizacji hydrożele chitozanowe charakteryzują się wysoką zawartością wody, co upodabnia je do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) ludzkich tkanek. Szczególnym typem hydrożeli są materiały wstrzykiwalne,. które. sieciują. w. temperaturze. ludzkiego. ciała. już. po wprowadzeniu do ubytku. Hydrożel dostosowuje się do jego geometrii, a inwazyjność zabiegu jest wówczas minimalna. Dzięki dużej zawartości wody mogą być nośnikami komórek lub biocząsteczek i leków, jednak ze względu na niskie właściwości mechaniczne mogą być stosowane jedynie w miejscach, gdzie nie występują duże naprężenia [48]. Najpowszechniejszą. metodą. otrzymywania. termoczułych. hydrożeli. chitozanowych jest dodanie do układu β-glicerofosforanu di-sodu w roli fizycznego sieciownika. Neutralizacja roztworu chitozanu prowadzi do wytworzenia uwodnionego „żelowatego” osadu. Utrzymanie roztworu chitozanu w niskiej temperaturze przy pH w fizjologicznym zakresie 6.8 do 7.2 w obecności β-GP przekształca układ w termoczuły żel, który jest płynny w temperaturze pokojowej i przekształca się w hydrożel w temperaturze. ludzkiego. ciała.. Zależność. żelowania. od temperatury. wynika. z oddziaływań hydrofobowych łańcuchów chitozanu i β-GP. Agregacji łańcuchów polimeru zapobiegają interakcje chitozan-woda w niskich temperaturach, a po ogrzaniu cząsteczki wody są usuwane przez ugrupowania glicerolu, które promują asocjację łańcuchów chitozanu, co prowadzi do tworzenia żelu [49]. Jednak niskie właściwości mechaniczne i słaba kontrola nad kinetyką uwalniania leków wciąż jest dużym ograniczeniem. zastosowania. termoczułych. hydrożeli. chitozanowych. i. nadal. proponowane są nowe ulepszenia. Innym rozwiązaniem są kompozyty, w których hydrożel na bazie chitozanu jest jedynie matrycą. Fazę wzmacniającą stanowią nanocząstki albo włókniny z mikrolub nanowłókien otrzymane np. metodą elektroprzędzenia. Yu i inni przedstawili ciekawą metodę otrzymywania wysokowytrzymałych hydrożeli przeznaczonych do regeneracji tkanki kostnej, sieciowanych za pomocą genipiny [50]. Nanocząstki tlenku grafenu, nanocząstki hydroksyapatytu (HAp) i łańcuchy polimeru uległy samoorganizacji w trójwymiarowy hydrożel za pomocą genipiny i kwasu askorbinowego jako reduktora GO. Jednocześnie więc zostało przeprowadzone sieciowanie polimeru i redukcja GO. Mechanizm powstawania trójskładnikowego hydrożelu zaproponowany przez autorów wyglądał następująco: nanocząstki HAp zostały zdyspergowane w wodnej zawiesinie GO. Po dodaniu kwasu octowego i chitozanu, grupy aminowe i hydroksylowe polimeru 17.

(29) zaczęły zęły oddziaływać z grupami karboksylowymi na powierzchni GO, tworząc pomost pomiędzy arkuszami. Gdy chitozan został usieciowany za pomocą genipiny, zredukowany GO utworzył duże stosy, które oddziaływały między sob sobą za pomocą interakcji π-π, jak przedstawio przedstawiono na rysunku 11. Porowatość kompozytu zmierzona metodą porozymetrii rtęciowej wyniosła ponad 80%, a średnia średnica porów 122 μm, co autorzy określają lają jako warunki korzystne dla proliferacji osteoblastów. Badania komórkowe przeprowadzono na szczurzych mezenchymalnych ezenchymalnych. komórkach. macierzystych.. Żywotność. na. kompozycie. była. porównywalna do tej na hydroksyapatycie. Za dobre powinowactwo do komórek odpowiada. prawdopodobnie. porowata. i. chropowat chropowataa. powierzchnia. kompozytu,. która powstała w wyniku równoległego ułoże ułożenia nia się warstw grafenowych i obecności nanocząstek HAp.. Rys. 11. Hydrożel otrzymany metodą symultanicznego sieciowania chitozanu i redukcji GO: a) hydrożel, b) mikrostruktura po liofilizacji, c) schemat otrzymywania [50]. Zastosowanie. włóknin. jako. wzmocnienia. prowadzi. o. trzymania. trójwymiarowych, „wielopoziomowych” rusztowań, które charakteryzują się złożoną budową, podobnie jak tkanki ludzkie. Mirahmadi i inni wytworzyli kompozyt typu „sandwich” przeznaczony do tkanki chr chrzęstnej [51]. Włókniny z mikrowłókien włókien fibroiny jedwabiu, uzyskane metodą elektroprzędzenia, pokryto roztworem chitozanu z dodatkiem β-GP, GP, dociśnięto do siebie i pozwolono na usieciowanie hydrożelu. Kompozyty 18.

(30) charakteryzowały się ponad trzykrotnie lepszym modułem przy ściskaniu (6 kPa) niż sam hydrożel. Jiang i inni, stosując podobne podejście, stwo stworzyli rzyli kompozyty przeznaczone do regeneracji przyzębia [52] [52]. Maty z nanowłókien kopolimeru poli(glikolu etylenowego) i poli(ε-kaprolaktonu) kaprolaktonu) osadzono w roztworze chitozanu z dodatkiem genipiny, a następnie zliofilizowano. Rusztowania składały się z siedmiu warstw mat otrzymanych metodą elektroprzędzenia, a ich grubość wy wynosiła 4 mm (rys. 12).. Rys. 12. Schemat otrzymywania wielowarstwowego rusztowania kompozytowego typu „sandwich” z matrycą z liofilizowanego chitozanu [52]. Badania in vivo przeprowadzono na szczurach, którym rusztowania wszczepiono w sztucznie utworzone ubytki. Podczas badań in vitro na komórkach rBMSC widoczne było ukierunkowane namnażanie się komórek wzdłuż mat i ich migrację wewnątrz porów zliofilizowanej. matrycy. chito chitozanowej. zanowej.. Sugeruje. to,. że. poprzez. odpowiednie. zaprojektowanie nie budowy rusztowania w skali nnano ano i mikro można prowadzić ukierunkowaną regenerację tkanek. Podsumowanie Chitozan wykazuje znaczny potencjał w inżynierii tkanki chrzęstnej i kostnej. Dzięki obecności ości grup aminowych i hydrok hydroksylowych, które umożliwiają jego sieciowanie,. może. być. wykorzystany. do. wytwarzania. rusztowań usztowań. niezależnie. lub z napełniaczami w postaci nanocząstek czy włókien. Wciąż jednak nie powstało „idealne” rusztowanie,, a nowe rozwiązania są wciąż proponowane przez naukowców. Głównym ograniczeniem w zastosowaniu porowatych podłoży otrzy otrzymanych metodą liofilizacji oraz hydrożeli są ich niskie właściwości mechaniczne. e. Uwagę należy skupić także na chropowatości powierzchni podłoży, która może kkorzys orzystnie wpłynąć na odpowiedź komórkową. Nanokompozyty wydają się obiecującą ścieżką modyfikacji chitozanu. 19.

(31) 2.2. Chitozan w poliuretanosacharydach Polimery pochodzenia naturalnego, czyli omówiony wyżej chitozan oraz inne polisacharydy (alginiany, celuloza, skrobia), są intensywnie badanymi polimerami do zastosowań w inżynierii tkankowej jako składniki rusztowania. Wynika to z ich niskiej toksyczności, biodegradowalności, łatwości przetwarzania i niskiej ceny. Posiadają jednak także wady, które limitują możliwość ich aplikacji w tej dziedzinie. W związku z ich naturalnym pochodzeniem kolejne partie materiału mogą nie posiadać powtarzalnych właściwości fizykochemicznych. Ich użyteczność do syntezy podłoży przeznaczonych do tkanek nośnych jest ograniczona głównie przez niskie właściwości mechaniczne, znacznie odbiegające od parametrów tych tkanek, o czym wspomniano w poprzednim podrozdziale. Kolejną metodą polepszenia funkcjonalności chitozanu, po otrzymywaniu nanokompozytów, jest modyfikacja jego budowy strukturalnej poprzez wprowadzenie dodatkowych jednostek. Pozwala to na polepszenie właściwości mechanicznych oraz wydłużenie czasu degradacji podłoża. Do polimerów syntetycznych, które mogą pełnić taką rolę, należą poliuretany. Diizocyjaniany służące do ich syntezy mogą reagować zarówno a grupami hydroksylowymi, jak i aminowymi chitozanu.. 2.2.1. Metody syntezy poliuretanów Poliuretany mechanicznymi,. (PU) łatwością. charakteryzują modyfikacji. się ich. bardzo. dobrymi. właściwości. właściwościami. fizykochemicznych. oraz biologicznych poprzez wprowadzanie do ich struktury różnych modyfikatorów (polimerów, mikro- i nanocząstek). Jeśli ich synteza została przeprowadzona prawidłowo, nie powinny wykazywać właściwości toksycznych. Ich zastosowanie w inżynierii tkankowej, głównie jako porowate podłoża, jest przedmiotem wielu badań [53]. Poliuretany są otrzymywane w wyniku poliaddycji trzech podstawowych składników: polimerowych polioli, izocyjanianów oraz przedłużaczy łańcucha (małych cząsteczek z przynajmniej dwiema grupami hydroksylowymi lub aminowymi) [54]. Izocyjaniany stosowane do syntezy PU w każdej cząsteczce mają przynajmniej dwie grupy izocyjanianowe (–N=C=O). Pierwszym typem, powszechnie stosowanym w przemyśle, są izocyjaniany aromatyczne, czyli diizocyjanian difenylometanu (MDI) oraz 2,4-diizocyjanian toluenu (TDI). Drugą grupą są izocyjaniany alifatyczne. 20.

(32) oraz cykliczne,. ich. najpopularniejszym. przedstawicielem. jest. diizocyjanian. heksametylenu (HDI) [55] [55]. Ich budowę półstrukturalną uralną przedstawiono na rysunku 13.. Rys. 13. Budowa półstrukturalna strukturalna izocyjanianów stosowanych do syntezy poliuretanów [55]. Niektóre badania sugerują, że aromatyczne izocyjaniany mogą degradować do rakotwórczych i mutagennych związków, czyli 2,4 2,4-diaminotoluenu u w przypadku TDI i 4,4′-metylenodianiliny w przypadku MDI [54]. Stosowanie ie HDI często łączy się za to z koniecznością użycia katalizatorów, które w swojej bu budowie dowie zawierają atom metalu np. dilaurynian dibutylocyny (DBTDL) oraz 2-etyloheksanian etyloheksanian cyny (II) (Sn(Oct)2) [56,57]. Organiczne pochodne cyny są związkami toksycznymi, mogą przekraczać barierę krew krew-mózg mózg i wykazują właściwości neurotoksyczne [58]. Ich stosowanie w biomateriałach jest dopuszczalne. Stężenie cyny w materiałach polimerowych, które mają kontakt z krwią krwią, nie może przekraczać 20 ppm [59]. Poprawna synteza PU z całkowitym przereagowaniem odczynników jest warunkiem koniecznym do uzyskania materiałów, które można określić jako nietoksyczne. Biodegradowalne PU do zastosowań biomedycznych ch są najczęściej syntezowane z zastosowaniem biozgodnych biozgodnych, biodegradowanych poliestrów zawierających w swojej budowie grupy hydroksylowe:. diol polikaprolaktonu (PCL-diol), diol), polilaktyd (PLA),. poliglikolid liglikolid (PGA) oraz polieterów polieterów, głównie poli(tlenek lenek etylenu) (PEG). Poliole o większej masie cząsteczkowej eczkowej, od 2 do 10 tys. g/mol, sąą wykorzystywane do wytwarzania bardziej elastycznych PU, natomiast te o niższej masie służą do syntezy bardziej sztywnych materiałów [55]. PEG posiada wiele właściwości, ci, przez które jest polimerem najpowszechniej stosowanym do synt syntezy ezy biomedycznych poliuretanów. Jest nietoksyczny, rozpuszcza się w wodzie i rozpuszczalnikach organicznych. Nie indukuje immunogenności i antygenowości. Dodatkow Dodatkowo o zwiększa szybkość degradacji PU przez polepszenie absorpcji wody, a przez to dyfuzji do wn wnętrza ętrza materiału, co prowadzi do szybszej hydrolizy wiązań estrowych [54]. Ostatnim składnikiem PU jest przedłużacz łańcucha. Są to związki o niskiej masie cząsteczkowej (diole diole lub diaminy), które zwiększ zwiększają długość sztywnych sztywn segmentów 21.

(33) w poliuretanie. Podobnie bnie jak izocyjaniany mogą być aromatyczne lub alifatyczne. Zastosowanie dioli tj. glikol etylenowy oraz 1,4-butanodiol butanodiol (BDO) skutkuje powstaniem wiązania uretanowego. Przedłużacze aminowe np. etylenodiamina (ED) tworzą wiązanie mocznikowe [60]. Jeśli przedłużacz nie jest cząsteczką liniową, a rozgałęzioną (posiada przynajmniej trzyy grupy funkcyjne funkcyjne), ), będzie działać jako sieciownik albo spowoduje rozgałęzienie łańcucha PU. Syntezę poliuretanów z wyżej opisanych składników można przeprowadzić metodą jedno- lub dwuetapową. W pierwszej metodzie odpowied odpowiednie nie ilości polioli, polioli przedłużacza łańcucha i porogenu są ze sobą mieszane mieszane, a następnie wprowadzany jest izocyjanian.. Aby uzyskać porowaty materiał materiał, najczęściej ej do mieszaniny reakcyjnej zostaje dodana woda. a. Reaguje ona z grupami iizocyjanianowymi, zocyjanianowymi, co prowadzi do powstania pochodnej kwasu karbaminowego, a następnie następnie, po dekarboksylacji przekształca ekształca się w dwutlenek węgla, który działa jak spieniacz. Zaletą tej metody jest brak konieczności zastosowania kataliz katalizatora. atora. Drugim produktem obok CO2 jest amina, która reaguje z pozostałymi izocyjanianami. Reakcja tego rodzaju jest bardzo szybka (około 100 razy szybsza sza niż z diolami), dlatego nie niepotrzebny potrzebny jest katalizator [54]. Przebieg reakcji przedstawiono na rysunku 14.. Rys. 14. Reakcja izocyjanianu z wodą: a) powstanie CO2, b) reakcja z aminą [61]. Metoda dwuetapowa, inaczej nazywana prepolimerową, jest bardzie bardziej złożona, ale pozwala na lepszą kontrolę procesu syntezy i właściwości fizykochemicznych otrzymanych PU. W pierwszym etapie poliole oraz umiarkowany nadmiar ar diizocyjanianu są mieszane, szane, aby otrzymać prepolimer, który jest mieszaniną segmentów giętkich zakończonych grupami izocyjanianowymi oraz niepr nieprzereagowanego zereagowanego diizocyjanianu. W tym etapie ustalany jest udział segmentów giętkich i sztywnych. W kolejnym etap etapie do mieszaniny dodawany jest przedłużacz łańcucha i powstają owstają segmenty sztywne,. 22.

(34) które łączą się ze segmentami giętkimi. Schematy obu metod przedstawiono na rysunku 15.. Rys. 15. Schemat jedno jedno- i dwuetapowej syntezy poliuretanu. Poliuretany są więc polim polimerami erami o budowie segmentowej. Makrocząsteczki zbudowane są z naprzemiennie ułożonych dwóch rodzajów segmentów: sztywnych i giętkich. W skład segmentów sztywnych wchodzą grupy polarne zdolne do tworzenia wiązań wodorowych (w obrębie tej samej lub sąsiedniej cząsteczki). Polarne segmenty poprzez połączenie ze sobą tworzą domeny twarde i wyodrębniają się z fazy miękkiej. Prowadzi to do separacji fazowej (rys. 16). Właściwości ości fizyczne fiz PU zależą więc od budowy chemicznej segmentów giętkich i sztywnych, ich propo proporcji masowych oraz budowy struktur nadcząsteczkowych, które powstają w wyniku separacji fazowej.. 23.

(35) Rys. 16. Schemat segmentowej budowy poliuretan poliuretanów ów (prawa część rysunku z [58]). Podsumowanie Poliuretany dzięki segmentowej budowie pozwalają na łatwą modyf modyfikację ich właściwości mechanicznych, co ma znaczące znaczenie w aplikacji tego typu materiałów w inżynierii tkankowej. Dodatkowo, dzięki wprowadzeniu podczas syntezy środków spieniających, którym w przypadku PU może być woda, otrzymanie materiałów porowatych ych jest proste i nie wymaga dodatkowej obróbki. Głównym celem badań nad biomedycznymi poliuretanami wydaje się modyfikacja już istniejących systemów, aby zwiększyć biozgodność ść i bioaktywność poliuretanów i otrzymać materiały wielofunkcyjne.. 24.

(36) 2.2.2. Poliuretany modyfikowane polisacharydami (poliuretanosacharydy) Jednym z nowych rozwiązań poprawy stabilności i właściwości mechanicznych chitozanu jest wprowadzenie do jego struktury jednostek pochodzących od syntetycznych polimerów, takich jak poliuretan [62]. Jest to możliwe dzięki obecności w łańcuchu polisacharydu grup funkcyjnych – hydroksylowych i aminowych. Dodatkowo, chityna i chitozan w swojej budowie zawierają grupy NHCOOCH3, NH2 i NHCOO. Usman i inni sugerują, że grupy te mogą nadać PU właściwości bioaktywne i zmniejszyć toksyczność, co jest ważne w zastosowaniach biomedycznych. Grupa NHCOO przypomina swoją budową wiązanie peptydowe obecne w białkach [62]. Zmodyfikowane materiały chitozanowe można otrzymać trzema podstawowymi metodami: przez kopolimeryzację, szczepienie oraz użycie sieciowników np. aldehydu glutarowego. Chitozan może być wprowadzony do łańcucha poliuretanowego, pełniąc funkcję przedłużacza łańcucha dzięki wolnym grupom funkcyjnym. Takie rozwiązanie zaproponowali Zia i inni [63]. Do syntezy poliuretanosacharydu zastosowano HDI jako diizocyjanian oraz polibutadien zakończony grupami hydroksylowymi (HTPB) jako poliol. Za przedłużacze łańcucha posłużyły BDO oraz chitozan. Syntezę przeprowadzono metodą dwustopniową. W pierwszym kroku otrzymano prepolimer, następnie wprowadzono przedłużacz łańcucha w postaci mieszaniny BDO i chitozanu. Ich stosunek molowy wyniósł 1:1. Jako katalizator reakcji zastosowano DBTDL. Schemat reakcji przedstawiono na rysunku 17. Badania spektroskopowe w podczerwieni potwierdziły skuteczne włącznie chitozanu do struktury poliuretanu. Autorzy jednak nie podjęli. próby. porównania. właściwości. fizycznych. oraz. antybakteryjnych. otrzymanych materiałów do właściwości niemodyfikowanego poliuretanu. Javaid i inni zbadali jak zmiana stosunku molowego BDO do chitozanu oraz całkowita eliminacji BDO na rzecz polisacharydu wpłynie na właściwości fizyczne poliuretanu [64]. W tym przypadku do syntezy użyto diolu polikaprolaktonu (PCL-diol) oraz TDI. Tak jak poprzednio zastosowano metodę dwustopniową. Stosunek molowy poliolu do diizocyjanianu wyniósł 1:3. Po otrzymaniu prepolimeru do mieszaniny wprowadzono 2 mole BDO. Oprócz próbki odniesienia przygotowano cztery kolejne PU, w których zmieniał się stosunek molowy BDO do CS, ale suma moli przedłużaczy łańcucha zawsze wynosiła dwa. W ostatniej, skrajnej próbce użyto jedynie chitozanu.. 25.

(37) Rys. 17. Schemat dwustopniowej syntezy poliuretanu, gdzie chitozan służy jako przedłużacz łańcucha [63]. Na rysunku 18 przedstawiono widma FTIR FTIR-ATR ATR otrzymanego w pierwszym etapie. prepolimeru, ru,. użytych. jako. przedłużacz przedłużaczy y. łańcucha. BDO. i. chitozanu. oraz końcowego wego produktu, czyli poliuretanosacharydu poliuretanosacharydu. Na widmie dmie prepolimeru zaznaczono piki odpowiadając odpowiadające nieprzereagowanym grupom –NCO NCO oraz grupom aminowym. Na widmie gotowego PU ni nie widać pasma od deformacyjnych ormacyjnych drgań –NH obecnych na widmie chitozanu chitozanu. Przekształciły się one w grupy NH, które tworzą wiązanie mocznikowe. Osłabł słabł także pik pochodzący od grupy hydroksylowej charakterystyczny zarówno dla chitozanu jak i BDO.. Pojawienie się na widmie PU pików 26.

(38) od –C=O C=O i NH (3393 cm-1) wskazuje na powstanie ugrupowań uretanowych. O zajściu reakcji świadczy także zanik wolnych grup –NCO NCO obecnych w prepolimerze.. Rys. 18. Widma FTIR-ATR ATR prepolimeru, BDO, chitozanu oraz poliuretanu po syntezie [64]. Badania termograwimetryczne grawimetryczne TGA wykazały, że PU, w któ którym rym jako przedłużacz łańcucha posłużył jedynie nie chitozan, charakteryzował się najlepszą szą stabilnością termiczną. Można to wytłumaczyć wprowadzeniem do segmentów sztywnych monomerów D Dglukozaminy.. Dzięki obecności polarnych grup amino aminowych i hydroksylowych doszło dos do powstania silniejszych oddziaływań wodorowych. Otrzymane ane w podobny sposób poliuretanosacharydy z różnymi ró rodzajami izocyjanianów i chitozanem częściowo zastępującym BDO w badaniach biologicznych wykazały mniejszą mutagenność i aktywność hem hemolitycznąą niż PU niemodyfikowany CS.. 27.

(39) Charakteryzowały się także większą biokompatybilnością z fibroblastami [65]. Poliuretanosacharydy wydają się więc mieć duży potencjał w biomedycynie. Kolejną. metodę. szczepienia. chitozanu. do. ppoliuretanu oliuretanu. zaproponowali. Kara i inni [66]. Powierzchnia otrzymanego wcześniej PU została aktywowana poprzez potraktowanie plazmą tlenową. Następnie materiał zanurzono w wodnym roztworze rozt akrylamidu. Po wysuszeniu PU został zanurzony w roztworze rze aldehydu glutarowego, czyli powszechnie stosowanego sie sieciownika chitozanu, u, a następnie w roztworze CS w rozcieńczonym kwasie octowym. Schemat procesu immobilizacji polisacharydu na powierzchni PU przedstawiono na rysunku 19.. Rys. 19. Schemat immobilizacji chitozanu na powierzchni poliuretanu [66]. Właściwości antybakteryjne dwóch zmodyfikowanych PU (różniły się stężeniami roztworu chitozanu, w którym zostały zamoczone podczas modyfikacji) zbadano z użyciem. Gram-dodatnich dodatnich. i. Gram Gram-ujemnych. bakterii. terii.. Modyfikacja. pozwoliła. na uzyskanie bardziej chropowat chropowatej powierzchni podłoża,, a przez to zwiększenie jej hydrofilowości. Dodatkowo wykazywały silne właściwości antybakteryjne. Rusztowania ia poliuretanowe przeznaczone dla inżynierii tkanki kostnej i chrzęstnej są. najczęściej. wytwarzane. w. postaci. porowatej. [53].. Stosowanie. układu. chitozan/poliuretan to dość nowe podejście.. W literaturze można głównie spotkać rozwiązania opierające się na hydrożelach i piankach uzyskanych na ich bazie poprzez liofilizację [67,68]. Mahanta i inni stworzyli hydrożel na bazie chitozanu poprzez kopolim kopolimeryzację z poliuretanem.. W pierwszym kkroku ku zsyntezowano prepolimer z HDI i poli(glikolu tetrametylenowego) w dimetyloformamidzie (DMF) jako rozpuszczalniku. Reakcję katalizowano DBTDL. Do prepolimeru dodano chitozan, który przez noc napęczniał 28.

(40) w mieszaninie kwasu octowego i DMF. Reakcje syntezy prepolimeru i kopolimeryzacji z CS. były. prowadzone. w. temperaturze. 80. ºC.. Produkt. odseparowano. od nieprzereagowanego PU przez przemywanie w kolejnych rozpuszczalnikach, a następnie wysuszono. Aby uzyskać porowate podłoże, kopolimer rozpuszczono w rozcieńczonym kwasie octowym, zamrożono, a następnie zliofilizowano. Uzyskane gąbki charakteryzowały się jednak małymi porami, ich średnica wynosiła 30-50 μm. Hydrożel nie wymagał za to zastosowania dodatkowego sieciownika. Kopolimer po wstrzyknięciu podskórnie (badania wykonane na szczurach) żelował w przeciągu 15 minut. Dodatkowo zarówno hydrożel jak i gąbka charakteryzowały się lepszą biokompatybilnością. do. fibroblastów. w. warunkach. in. vitro. w. porównaniu. do chitozanu [68]. Podsumowanie Poliuretany są materiałami powszechnie wykorzystywanymi w wielu dziedzinach, w tym w biomedycynie ze względu na mnogość kompozycji z jakich można je uzyskać, a także unikalną, segmentową budowę. Obie te cechy pozwalają na łatwe sterowanie, a w wyniku. dostosowanie. ich. właściwości. fizykochemicznych. do. wybranego. zastosowania. Chitozan jest aminowym polisacharydem, który dzięki obecności grup funkcyjnych, może być wprowadzony do łańcucha poliuretanu lub szczepiony do jego powierzchni. Oba rozwiązania prowadzą do zmiany właściwości poliuretanu, włączając w to zmniejszenie cytotoksyczności oraz pojawienie się właściwości antybakteryjnych. Połączenie dobrych właściwości mechanicznych, którymi charakteryzują się poliuretany oraz biologicznych właściwości chitozanu jest obiecującym podejściem do otrzymania materiałów użytecznych w biomedycynie, w tym w inżynierii tkanki kostnej i chrzęstnej.. 29.

(41) 2.2.3. Rusztowania poliuretanowe w inżynierii tkankowej Porowate gąbki uzyskiwane poprzez liofilizację roztworów chitozanowych zostały zaproponowane przez wielu naukowców jako podłoża do regeneracji tkanki chrzęstnej i kostnej, jak opisano w poprzednim rozdziale. Zwykle były one poddawane sieciowaniu, aby polepszyć ich właściwości mechaniczne oraz modyfikowane mikro i nanododatkami. Chociaż w większości opisanych poprzednio przypadkach udawało się otrzymać gąbki o wielkości porów przekraczających 100 μm, to jednak miały one słabe właściwości mechaniczne. Kolejną grupą są materiały poliuretanowe, których właściwości można łatwo modyfikować i dostosować do określonych zastosowań poprzez dobór rodzaju i masy cząsteczkowej poliolu, rodzaju diizocyjanianu, oraz stosunku segmentów sztywnych do giętkich. Jak opisano we wcześniejszym podrozdziale, wprowadzenie do struktury PU chitozanu wydaje się mieć pozytywny wpływ na biozgodność poliuretanów, jednak trudno jest znaleźć w literaturze przykład syntezy trójwymiarowych, porowatych podłoży takiego typu. Częściej można spotkać się z hydrożelami na bazie polisacharydu sieciowanego za pomocą PU. Bil i inni podjęli się próby sprawdzenia, jak stosunek segmentów sztywnych do giętkich wpływa na odpowiedź osadzonych na powierzchni PU ludzkich komórek wyizolowanych z tkanki kostnej (HBDC – ang. human bone-derived cells) [69]. Do syntezy PU posłużyły MDI, diol PCL, DBTDL jako katalizator reakcji oraz glikol etylenowy jako przedłużacz łańcucha. Syntezę przeprowadzono metodą dwustopniową. Teoretyczny udział segmentów sztywnych zawierał się w przedziale 22–70%. Kąt zwilżania wodą malał wraz ze wzrostem udziału fragmentów sztywnych. Właściwości mechaniczne (moduł Younga i wytrzymałość na rozciąganie) zwiększały się do 50% udziału segmentów sztywnych (Rm = 48.3 MPa). Przy większym udziale następował gwałtowny spadek (Rm = 1.6 MPa), a próbka była twarda i krucha. Po tygodniu inkubacji komórek zauważono silną zależność ich żywotności od zawartości segmentów sztywnych (największa dla próbek z 70% udziałem). Otrzymanie porowatych poliuretanów nie wymaga dodania do procesu syntezy skomplikowanych procedur. Za porogen może posłużyć woda, ale ta metoda nie pozwalana na kontrolę średnicy porów. Częściej stosowane jest wymywanie soli o określonej wielkości kryształów. Gorna i Gogolewski wytworzyli biodegradowalny, porowaty poliuretan na bazie HDI i PCL-diol (DBTDL jako katalizator), z 60% 30.

(42) zawartością. segmentów. sztywnych. [70].. PU. rozpuszczono. w. organicznym. rozpuszczalniku (DMF), następnie wkraplano ciecz koagulującą (THF) aż do pierwszych oznak zmętnienia. Po filtracji do roztworu dodano porogen podczas energicznego mieszania. Otrzymaną pastę wprowadzono do form na 7 dni, a po zestaleniu wymyto porogen wodą, a kształtki wysuszono w piecu próżniowym (60 ºC). Zastosowanie kryształów soli o szerokiej dystrybucji wielkości (od 90 do 400 μm) pozwoliło na uzyskanie mikrostruktury zbudowanej z sieci otwartych porów. Porowatość wyniosła około 90%, a średnia wielkość porów 200 μm. Podłoża o takiej mikrostrukturze wydają się być odpowiednie do zastosowania w inżynierii tkanki kostnej, jednak wraz ze wzrostem średnicy porów malały właściwości mechaniczne. Dla PU z porami o średnicy 80 μm wytrzymałość na ściskanie wyniosła 0.8 MPa, a przy 200 μm tylko 0.02 MPa. Podobną metodę zastosowali Asefnejad i inni [56]. Jako rozpuszczalnik zastosowano dioksan, a jako ciecz koagulującą wodę. Dodatkowo mieszaninę poliuretan/NaCl (kryształy 50 do 355 μm) zamrożono i zliofilizowano. Próbka o porowatości 71% (pory 50–300 μm). miała wytrzymałość na ściskanie 0.93 MPa. (stosunek segmentów sztywnych do giętkich wynosił 6:1). Najlepsze wyniki kompatybilności z ludzkimi fibroblastami wykazywał jednak PU ze stosunkiem 2:1, który charakteryzował się niższymi właściwościami mechanicznymi (0.58 MPa). Otrzymano więc tutaj zależność odwrotną niż w przypadku badań Bila i innych. Należy jednak zaznaczyć, że przeprowadzono je na różnych rodzajach komórek, a PU miały różną mikrostrukturę (w przypadku PU zsyntezowanych przez Bila były one lite). Gianittelli i inni stworzyli bardziej zaawansowane mikrostrukturalnie podłoże przeznaczone do regeneracji tkanki kostnej w szczęce [71]. Były to pianki o gradientowej budowie, z gęstą warstwą wierzchnią i porowatym rdzeniem. Taką mikrostrukturę PU zaproponowano, aby materiał spełniał jednocześnie dwie funkcje – był podłożem do regeneracji tkanki kostnej oraz barierą przeciwdziałającą wrastaniu tkanki dziąseł. Ocenę biozgodności przeprowadzono na szpikowych mezenchymalnych komórkach macierzystych (hBMSC). Syntezę przeprowadzono metodą dwuetapową, z użyciem diolu PCL i MDI (udział segmentów sztywnych: 19%). Gradientową mikrostrukturę uzyskano dzięki zastosowaniu zamkniętej formy w kształcie walca. Za porogen posłużyła woda. Po dodaniu izocyjanianu do mieszaniny reakcyjnej wstrzyknięto 200 μL (na 5.5 g próbki) 6% roztworu albuminy w wodzie. Prepolimer wprowadzono do polietylenowej formy. Reakcja z wodą, a w jej następstwie uwalnianie CO2 doprowadziło do spienienia PU. 31.

(43) Forma była zamknięta, więc doszło do powstania ggradientowej radientowej mikrostruktury, jak przedstawiono na rysunku 20.. Rys. 20. Budowa poliuretanu (makro i mikrofotografia) (a, b) oraz wykres naprężenie/odkształcenie próby ściskania (c) [71]. Mikrostruktura poliuretanu zbudowana była z siec siecii otwartych porów o średnicy od 161 do 341 μm (mediana: 251 μm). Mo Można żna przypuszczać, że zapewniałaby sprzyjające warunki. do. migracji. komórek. oraz. transpo transportu rtu. składników. odżywc odżywczych.. Przy zastosowaniu otwartej formy mediana wyni wyniosła 306 μm, co związane zwi jest z możliwością swobodnej ej ekspansji gazu. Moduł sprężystości przy ściskaniu wyniósł około 25 MPa,, co jest wynikiem jedynie czterokrotnie niższym niż graniczna wartość podawana w literaturze dla ludzkiej kości [41].. Badania komórkowe wykazały żywotność na poziomie 95%, ale maksymalny czas badania wyniósł jedynie 24 h i nie zastosowano materiału odniesienia. Bioaktywność poliuretanów można polepszyć poprzez wprowadzenie do nich mikro lub nanocząstek hydroksyapatytu (HA (HAp). Lin i inni przeprowadzili jednostopniową syntezę PU (glikol politetrametylenowy, diizocyjanian izotronu, BDO, DBTDL, woda jako. porogen). z. 20%. dodatkiem. nano nanohydroksyapatytu hydroksyapatytu. oraz. 1%. dodatkiem. cyprofoksacyny (CF, lek o działaniu bakteriobójczym) [72].. Testy wykonano z użyciem mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego szczura. Różnicowanie się komórek oceniono za pomocą pomiaru ilości osteokalcyny osteok (białko, 32.

(44) marker różnicowania osteoblastycznego). Na rysunku 21 przedstawiono m mikrostrukturę PU modyfikowanego HA HAp oraz ekspresję osteokalcyny dla różnych rodzajów PU. Dodatek nanocząstek HA HAp widocznie wpłynął na różnicowanie się komórek macierzystych w kierunku komórek kostnych.. Rys. 21. Mikrostruktura HA HAp/PU (a) oraz ekspresja osteokalcyny dla trzech rodzajów PU (niemodyfikowany, z dodatkiem HAp oraz dodatkiem HAp i CF) (b) [72]. Podsumowanie Porowate podłoża poliuretanowe można otrzymać rróżnymi óżnymi metodami. Pierwszą z nich jest wymywanie porogenu (cząsteczek soli). Poprzez dobór kształtu i ilości środka porotwórczego. można. kontrolować. porowatość. m materiału. ateriału.. Spienianie. gazowe. nie wymaga zastosowania rozpuszczalników, ale wielkość porów jest zna znacznie trudniejsza do kontroli. Zwiększanie śred średnicy nicy porów prowadzi do obniżenia właściwości mechanicznych pianek, ale możliwym wydaje się wytworzenie podłoża zdolnego do wytrzymania naprężeń w tkance kostnej, a jednocześnie posiadającego mikrostrukturę sprzyjającą zyjającą migracji komórek. Segmentowa budowa poliuretanów daje wiele możliwości modyfikacji właściwości fizycznych poprzez dobranie rodzaju i mas cząsteczkowych polioli i izocyjanianu oraz stosunku segmentów giętkich do sztywnych. sztywnych Właściwości biologiczne poliuretanów oliuretanów można poprawić poprzez ddodanie odanie cząstek bioaktywnych np. hydroksyapatytu. Kolejne badania powinny iść w kierunku wytworzenia materiału, który posiadałby odpowiednią dla zastosowań w inżynierii tkankowej mikrostrukturę (pory średnicy kilkuset mik mikrometrów) i właściwości mechaniczne oraz nie wykazywał cytotoksyczności, a może nawet wspierał proliferację komórek. Rozwiązaniem wydają się być materiały kompozytowe lub nanokompozyty.. 33.