E
NZYMY – KATALIZATORY ŻYCIA
Maciej Szaleniec, Agnieszka Rugor (Kraków) Streszczenie
Enzymy to białkowe katalizatory warunkujące zachodzenie niemal wszystkich ważniejszych procesów ży-ciowych. Dzięki ich niesamowitej, wciąż nie do końca wyjaśnionej katalitycznej skuteczności, skompliko-wane przemiany chemiczne w naszym organizmie mogą zachodzić w bardzo łagodnych warunkach (niskie temperatury, niewysokie ciśnienia) w porównaniu do tych, jakie stosowane są w procesach przemysłowych. Naukowy dowód, że mogą one działać również poza organizmami żywymi, ostatecznie pogrzebał teorię
pan-witalizmu i zapoczątkował bardzo burzliwy rozwój nowoczesnej enzymologii i biotechnologii. Dzięki zaś
roz-wojowi technik biologii molekularnej i inżynierii genetycznej enzymy znajdują coraz szersze zastosowanie. Niepostrzeżenie w ciągu ostatnich kilku dekad enzymy stały się niezbędnym narzędziem w przemyśle farma-ceutycznym, spożywczym, skórzanym, tekstylnym, papierniczym, a nawet w proszkach do prania. Ułatwiają pracę naszych komórek, sprawiają, że jemy smaczniejszy chleb i pijemy słodki sok pomarańczowy nawet w środku zimy, a nasze ubrania są czyste już po praniu w 30°C.
Abstract
Enzymes are protein catalysts that enable most of important processes in the living organisms. Thanks to their astonishing and not yet well understood catalytic robustness even the most complicated chemical trans-formations can proceed under mild conditions (i.e. low temperature and pressure), a feat hardly encountered in the chemical industry. The scientific proof that enzymes can work outside of the living cell turned out to be a final blow to the concept of panvitalism and a cornerstone for development of the modern enzymology and biotechnology. Meanwhile, due to more recent achievements of molecular biology and genetic engineering the enzymes gained wider application in the modern society. Inconspicuously, during the last few decades the enzymes became indispensable in the pharmaceutical, food, leather, textile and paper industries and even found their way into our daily laundry products. They constantly help our cells to live, make our daily bread tastier, deliver a sweet juice in the middle of the winter and make it possible to remove the vilest stains from our cloths after washing in just 30°C.
Enzym – biologiczny katalizator
Enzymy należą do substancji, które są przez che-mików nazywane katalizatorami. Każdy słyszał o katalizatorach zainstalowanych w samochodach, ale sam termin może czasem wydawać się niejasny. Jeżeli zapytamy chemika czym jest katalizator, od-powie, zgodnie z dość hermetyczną definicją, że jest to substancja, która przyspiesza reakcję chemiczną i skierowuje ją na wybraną ścieżkę, sama nie zużywa-jąc się w reakcji. Aby zrozumieć o co w tym wszyst-kim chodzi wyobraźmy sobie reakcję chemiczną, na przykład zachodzącą w komórkach czy w układzie wydechowym samochodu, jako zatłoczone rondo w środku dużego miasta. Samochody wjeżdżające drogą na rondo to substancje chemiczne, które będą ulegały przekształceniu (tzw. substraty), zaś każda
z dróg opuszczająca rondo to inna ścieżka reakcji. Z kolei samochody opuszczające rondo to produkty, różniące się pod względem budowy cząsteczki che-miczne. Ponieważ rondo jest zakorkowane, wszyst-kie reakcje postępują dość wolno i każdy samochód wjeżdżający na nie straci sporo czasu zanim je opu-ści (tj. przemieni się w produkt reakcji). Kataliza-tor możemy wyobrazić sobie jako wielką estakadę przerzuconą nad zatłoczonym rondem, która wiedzie w kierunku najbardziej potrzebnym dla naszej komór-ki czy środowiska. Teraz samochody bardzo szybko przemykają nad korkiem (przyspieszenie reakcji) i większość z nich wybierze właśnie tę drogę (skiero-wanie ruchu na wybraną ścieżkę). Dokładnie według tej prostej analogii działa zarówno katalizator w sa-mochodzie, odpowiednio utleniający resztki benzyny i redukujący tlenki azotu w spalinach, jak i enzym
w naszym jelicie ułatwiający trawienie pożywienia. Efekt estakady nad korkiem jest nazywany przez chemików „obniżeniem energii aktywacji” (Ryc. 1).
Zgodnie z klasyczną teorią stanu przejściowego, każ-dą reakcję chemiczną charakteryzuje pewna okre-ślona energia aktywacji – im jest ona wyższa, tym dłużej musimy poczekać, aby reakcja miała miejsce. Zastanówmy się skąd bierze się wspomniana wyżej energia aktywacji. Otóż na co dzień w przeważają-cym stopniu cząsteczki chemiczne pozostają w ni-skich stanach energetycznych. Aby doszło do reakcji chemicznej pomiędzy cząsteczkami muszą one naj-pierw zbliżyć się do siebie, pokonując odpychające odziaływania elektrostatyczne i ulegając przy tym nie-korzystnym energetycznie odkształceniom związa-nym z reakcją chemiczną. Na przykład w czasie prze-niesienia atomu z jednej cząsteczki do drugiej w tak zwanym stanie przejściowym następuje rozciągnięcie wiązania, które ulega odkształceniu. Te zmiany geo-metrii i struktury elektronowej związane są właśnie z podniesieniem energii układu, którą nazywamy energią aktywacji. Jeżeli taka bariera energetycz-na jest wysoka, tylko niewielka ilość cząsteczek ma wystarczającą energię, aby ją pokonać. W rezultacie tylko nieliczne molekuły z olbrzymiej liczby czą-steczek, które potencjalnie mogłyby zareagować, są zdolne do chemicznej przemiany, a co za tym idzie sama reakcja (z naszego makroskopowego punktu widzenia) postępuje bardzo powoli (tzn. mało pro-duktu powstaje w czasie). Aby wpłynąć na szyb-kość reakcji możemy zwiększyć energię cząsteczek podnosząc ich temperaturę. Wraz ze wzrostem tem-peratury coraz więcej cząsteczek, zgodnie z roz-kładem Boltzmana (Ryc. 2), osiąga wyższe energie i tym samym będzie zdolnych osiągnąć i skutecz-nie przekroczyć barierę reakcji. W rezultacie więcej
cząsteczek w danym czasie jest w stanie przemienić się w produkt, co skutkuje eksponencjalnym wzrostem obserwowanej szybkości reakcji [1, 4]. Podgrzewanie reagentów jest jednak procesem bardzo kosztownym, a czasem, gdy mamy do czynienia z wrażliwymi ter-micznie związkami chemicznymi o skomplikowanej strukturze, nawet zupełnie niewykonalnym. W takiej sytuacji jedynym możliwym sposobem jest zastoso-wanie katalizatora.
Rolą katalizatora jest tak wpływać na cząsteczki w stanie przejściowym, aby ich energia nie musiała być aż tak wysoka, by reakcja zachodziła (tj. obni-żyć energię aktywacji). W rezultacie, podobnie jak w przypadku podniesienia temperatury, większa ilość cząsteczek chemicznych ma szansę pokonać barierę i reakcja przebiega szybciej. Takimi katalizatorami są właśnie enzymy, które do perfekcji realizują to wła-śnie zadanie. Wiążą one reagenty w swoim wnętrzu w taki sposób, aby maksymalnie obniżyć energię ich aktywacji [15] i przyspieszyć proces tworzenia produktu.
Bariery energetycznej, w metaforycznym sensie, doświadcza każdy z nas po niezbyt dobrze przespanej nocy, gdy stara się rano wstać do pracy – w tym przy-padku katalizator, na przykład w postaci zapachu do-brej mocnej kawy, pomaga znacząco obniżyć barierę energii aktywacji i pomóc nam wstać.
Precyzyjna regulacja
Enzymy są niezwykłymi katalizatorami. Dzięki swojej dość skomplikowanej i wyrafinowanej bu-dowie potrafią działać tylko w określonym miejscu
Ryc 1. Energia aktywacji (tj. różnica energii stanu przejściowego (S#)
i energii substratów) ulega zmniejszeniu na skutek katalitycznego działa-nia enzymu (różnica energii ES# i substratów). Obniżenie energii
aktywa-cji reakaktywa-cji katalizowanej w porównaniu do niekatalizowanej odpowiada za przyspieszenie reakcji przez katalizator.
Ryc. 2. Rozkład energii kinetycznej cząsteczek w zależności od tempera-tury układu wg. rozkładu Boltzmana. W miarę podnoszenia temperatempera-tury coraz większa populacja cząsteczek osiąga wymaganą granicę energii aktywacji, co jest warunkiem koniecznym do zajścia reakcji chemicznej. Na zielono zaznaczono część populacji cząsteczek, które w temperaturze 200K osiągają przynajmniej energię równą energii aktywacji.
naszego organizmu i w określonych warunkach tem-peratury i pH. Są w stanie również rozpoznawać cząsteczki chemiczne i spośród wielu obecnych w naszych komórkach wybierać tylko te, do których modyfikacji zostały przeznaczone. Zjawisko to, na-zywane specyficznością enzymów, może powodo-wać, że enzymy wybierają wyłącznie jeden rodzaj cząsteczki (np. absolutna specyficzność enzymu laktazy, który katalizuje rozkład wyłącznie laktozy) bądź też jakąś ich grupę (specyficzność grupowa – np. enzym trawienny trypsyna przecinający łańcuch peptydowy w pobliżu zasadowych aminokwasów) lub ograniczać się wyłącznie do rozpoznawania typu wiązania chemicznego (np. niektóre dehydrogenazy alkoholowe utleniają specyficznie alkohole pierw-szorzędowe do aldehydów). Enzymy potrafią rów-nież rozpoznawać przestrzenną strukturę cząsteczek chemicznych, dzięki czemu potrafią być specyficzne względem izomerów optycznych (enancjomerów) – czyli cząsteczek niemal identycznych, różniących się tylko przestrzenną organizacją podstawników wokół tzw. centrów stereogenicznych (np. chiralnych ato-mów węgla - chiralne cząsteczki, tak jak nasze ręce, które wyglądają jak swoje lustrzane odbicia). Dzięki enancjospecyficzności enzymy są niezwykle przydat-ne szczególnie w przemyśle farmaceutycznym, gdzie ich zdolność do produkcji chiralnych czystych enan-cjomerycznie leków może decydować o tym, czy pro-dukt będzie miał zbawienne działanie lecznicze, czy też stanie się zagrażającą życiu trucizną [7, 14]. Co więcej, zastosowanie enancjoselektywnych biokata-lizatorów w syntezie ma też duże znaczenie ekono-miczne, gdyż lek jest syntetyzowany tylko w aktyw-nej formie. Dla każdego centrum stereogenicznego zyskujemy więc dwa razy więcej substancji aktyw-nej, podczas gdy w przypadku syntezy nie-enancjose-lektywnej otrzymujemy tylko połowę możliwej ilości produktu. Mając czysty optycznie lek firma farma-ceutyczna nie musi też przeprowadzać kosztownych badań klinicznych skierowanych na wykrycie efek-tów ubocznych, potencjalnie powodowanych przez nieaktywny klinicznie enanjomer leku. Nie ma też potrzeby przeprowadzenia kosztownego oczyszcza-nia substancji aktywnej z niepotrzebnego enancjome-ru, jeżeli jego podanie powoduje niepożądane skutki.
Bardzo często aktywność katalityczna enzymów podlega ścisłej kontroli i regulacji. Dobrym przy-kładem takiego zachowania są enzymy trawienne, katalizujące rozkład białek. Enzymy te wytwarza-ne są m.in. w gruczołach ściany żołądka. Gruczoły ściany żołądka w dużej mierze zbudowane są z bia-łek, więc enzymy trawienne muszą być początkowo nieaktywne (wydzielane w formie tzw. proenzymu
pepsynogenu), żeby nie trawiły własnego macierzy-stego gruczołu. I dopiero wtedy, gdy już wydzielą się do żołądka, gdzie panuje niskie pH (obecny jest tam kwas żołądkowy), ulegają samoaktywacji (autoka-talitycznie same odcinają swój niewielki fragment) i stają się bardzo aktywnymi katalizatorami ułatwia-jącymi trawienie białek (pepsyna) [5]. Dodatkowo nasz żołądek wyścielony jest specjalnymi komórka-mi odpornykomórka-mi na działanie pepsyny – inaczej sakomórka-mi moglibyśmy siebie strawić po dobrym obiedzie! Co ciekawe, inne enzymy trawienne, wytwarzane w trzustce (np. chymotrypsyna), a działające w jeli-cie jeli-cienkim, gdzie panuje pH zasadowe, trawią biał-ka tylko i wyłącznie w warunbiał-kach wysokiego pH. Tym samym ich aktywność enzymatyczna jest precy-zyjnie przystosowana do miejsca, w którym mają za zadanie działać.
Aktywność enzymatyczna (czyli zdolność do przy-spieszania reakcji) podlega dynamicznej regulacji. Zanim zajdzie reakcja, najpierw musi powstać nieko-walencyjne połączenie między enzymem (E) i sub-stratem (S), czyli tzw. kompleks ES. Ponieważ sama reakcja chemiczna jest bardzo często wolniejsza od procesu powstawania i rozpadu kompleksu ES, szyb-kość katalizowanej przez enzym reakcji zależy nie-liniowo od stężenia substratu i ma kształt hiperboli. Oznacza to, że w miarę zwiększania się stężenia sub-stratu szybkość reakcji tylko początkowo gwałtownie rośnie, po czym przyrost szybkości stopniowo zwal-nia, aż osiąga wysycenie (Ryc. 3).
Zrozumienie tego efektu było możliwe dzięki bada-niom trójki uczonych: francuskiego chemika Victora Henriego, niemieckiego biochemika Leonora Micha-elisa i kanadyjskiej doktor medycyny Maud Men-ten. To oni sformułowali najsłynniejsze w biochemii
Ryc. 3. Wykres zależności szybkości reakcji enzymatycznej V od stężenia substratu [S], gdzie Vmax – maksymalna szybkość reakcji enzymatycznej,
osiągana dla nieskończenie wysokiego stężenia substratu. Km - stała
Mi-chaelisa oznaczająca stężenie substratu, przy jakim szybkość reakcji ka-talizowanej przez enzym osiąga połowę Vmax.
równanie Michaelisa-Menten, będące podstawowym prawem opisującym zachowanie enzymów [8].
Co ciekawe, wiele enzymów zmienia swoją aktyw-ność w zależności od stężenia substratu i innych sub-stancji w sposób jeszcze bardziej złożony. Częstym zjawiskiem jest spowolnienie reakcji, gdy powstaje dużo produktu. W ten sposób organizm zabezpiecza się przed akumulacją zbyt dużej ilości substancji che-micznych, które w wysokim stężeniu mógłby wy-wrzeć toksyczny efekt na komórkę. Efekt taki nazy-wany jest inhibicją produktową, jeżeli produkt wiąże się w centrum aktywnym, lub ujemnym efektem al-losterycznym, jeżeli miejsce wiązania się inhibitora--produktu znajduje się w innej części enzymu.
Aktywność enzymatyczna może podlegać jeszcze innej regulacji, najczęściej (choć nie jedynie) gdy en-zym składa się z kilku jednakowych pod względem składu aminokwasowego podjednostek białkowych, z których każda zawiera centrum aktywne. Mówimy
wtedy, że enzym ma budowę multimeryczną (np. je-żeli składa się z czterech identycznych podjednostek, jest homotetramerem – Ryc. 5).
Bardzo często takie enzymy działają kooperatyw-nie – tzn. związakooperatyw-nie w jednej z podjednostek substra-tu powoduje zmianę geometrii białka. Zmiana kształ-tu podjednostki zawierającej substrat pociąga za sobą przemieszczenie położenia aminokwasów na styku pomiędzy podjednostkami. W efekcie następuje rów-nież zmiana geometrii pozostałych podjednostek (tzw. zmiana konformacji), które niejako „czują”, że ich sąsiad związał pierwszą cząsteczkę substratu. W rezultacie ich zdolność do wiązania cząsteczek substratu w centrach aktywnych (a więc
termodyna-miczne prawdopodobieństwo powstania kompleksu ES) może wzrosnąć (dodatni efekt kooperatywny) lub zmaleć (ujemny efekt kooperatywny) [9, 12]. W ten sposób ewolucyjnie zaprogramowany efekt regu-lacji pozwala organizmowi dostosować efektywność
Ryc. 4. Schematyczne przedstawienie różnych sposobów regulacji aktywności enzymatycznej przeze inhibitory. A) Normalna reakcja enzymatyczna, w której enzym wiąże substrat i po reakcji uwalnia produkt, B) Inhibitor kompetycyjny wiąże się w centrum aktywnym uniemożliwiając związanie substratu i zajście reakcji, C) Związanie się z enzymem czynnika allosterycznego wpływa na zmianę struktury enzymu, co pośrednio oddziaływuje na geometrię centrum aktywnego. W rezultacie enzym nie wiąże skutecznie substratu i reakcja nie zachodzi.
katalizatorów do zmieniających się warunków ze-wnętrznych (np. zmiennego stężenia substancji odżywczych).
Białkowa budowa enzymów
Jak już wspomniano, enzymy mają bardzo skom-plikowaną budowę. Ponieważ są białkami, zbudowa-ne są z aminokwasów. Większość organizmów wyż-szych (do których i my się zaliczamy) wykorzystuje tylko 21 różnych aminokwasów, które niczym klocki lego połączone są w długie łańcuchy za pomocą tzw. wiązania peptydowego (Ryc. 6).
To, w jakiej kolejności poukładane są różne ami-nokwasy w danym białku jest zapisane w kodzie genetycznym (DNA) i w jeszcze nie do końca zro-zumiały dla nas sposób niesie informację nie tylko o kolejności (tak zwanej sekwencji) aminokwasów w łańcuchu, ale również o całkowitym trójwymiaro-wym kształcie białka. Okazuje się bowiem, że doj-rzałe białko (czyli np. enzym) przypomina bardziej kłębek włóczki, którym bawił się młody kociak, niż prostą wstążkę. Nić aminokwasowa przyjmuje skom-plikowaną i uporządkowaną strukturę spirali (zwaną
helisą) lub płaszczyzny (zwaną β-kartką) (Ryc, 7A, B). Helisy i β-kartki, będące strukturą II-rzędową białek, tworzą z kolei przestrzenne struktury
III-rzę-dowe, które w formie przypominają nie tylko kłębek włóczki, lecz także i fantazyjne pierścienie czy też beczki (Ryc. 7B, C).
Niektóre enzymy są naprawdę wielkimi cząsteczka-mi checząsteczka-micznycząsteczka-mi, składającycząsteczka-mi się z wielu splątanych ze sobą łańcuchów i dziesiątków tysięcy atomów. Tym bardziej jest dla nas niezrozumiałe, w jaki spo-sób białka za każdym razem, zazwyczaj bezbłędnie i w większości wypadków zupełnie samoistnie, zwi-jają się w te skomplikowane struktury. Pomimo wie-lu badań w tej dziedzinie oraz ogromnego postępu metod symulacji komputerowych zwijania się (tzw. fałdowania) białek wciąż nie jesteśmy w stanie prze-widzieć z wystarczająca dokładnością przestrzennej struktury białek bazując wyłącznie na sekwencji ami-nokwasowej. To właśnie z tego powodu co roku (od 1994) odbywa się swego rodzaju eksperyment: świa-towe mistrzostwa w przewidywaniu struktur białko-wych CASP (Critical Assessment of protein Structure Prediction) [13], w ramach których ponad 100 grup naukowców rywalizuje w przewidywaniu struktury białka o niedawno poznanej, ale wciąż nie opubliko-wanej strukturze.
Należy sobie jednak postawić pytanie, cze-mu ma służyć tak skomplikowana budowa białek i enzymów? Enzymolodzy byli bardzo zaskoczeni gdy odkryli, że niejednokrotnie w samym proce-sie przyspieszania reakcji bierze udział tylko kilka aminokwasów! Sama reakcja chemiczna zachodzi bowiem w tak zwanym „centrum aktywnym”, które jest najczęściej niewielkim wgłębieniem lub niszą w enzymie, do którego wiążą się cząsteczki chemiczne
Ryc. 5. Przykłady białek tetramerycznych: A) dehydrogenaza semialdehydu aspartaniowego z Trichophyton rubrum [10], B) Δ1-dehydrogenaza
3-keto-steroidowa z Rhodococcus erythropolis [16], C) dehydrogenaza (S)-1-fenyloetanolowa z Aromatoleum aromaticum [6].
Ryc. 6. Struktura wiązania peptydowego (szary romb) pomiędzy dwoma aminokwasami alaniny. Dzięki sprzężeniu elektronowemu wolnej pary elektronowej atomu azotu i układu π elektronów grupy karbonylowej wiązanie peptydowe jest płaskie. Ułożenie aminokwasów w łańcuchu po-lipeptydowym to struktura I-rzędowa.
(substraty) przetwarzane przez enzym. To właśnie w stronę przestrzeni centrum aktywnego zwrócone są w precyzyjnie określonych miejscach aminokwasy
zaangażowane w przyspieszenie reakcji chemicznej. Centrum aktywne można więc wyobrazić sobie jak najeżoną wyspecjalizowanymi ramionami robotów taśmę produkcyjną w wielkie fabryce. Od dziesię-cioleci próbujemy zrozumieć, jak enzymy osiągają te fenomenalne rezultaty za pomocą relatywnie nie-wielkich i uniwersalnych środków. Niestety wciąż poszukujemy pełnej odpowiedzi, bo czynników od-powiedzialnych za katalityczną perfekcję enzymów wydaje się być wiele. Rozumiemy, że kluczem do wszystkiego jest właśnie obniżanie energii aktywacji danej reakcji za pomocą tych kilku odpowiednio ulo-kowanych aminokwasów lub kofaktorów, czyli nie-wielkich cząsteczek organicznych lub kompleksów metali, które poszerzają spektrum dostępnych che-micznych procesów. Enzymów jest jednak tak wiele
i tak wiele różnych reakcji potrafią przyspieszać, że enzymolodzy mają wiele pracy na kolejne dziesiątki lat badań. W samym ludzkim organizmie ocenia się –
na podstawie analizy genomu – że biokatalizatorów, katalizujących prawie 900 różnych procesów, może być ponad 2 700 [17]. A większość organizmów ży-wych naszej planety nie została jeszcze scharaktery-zowana genetycznie!
Centrum aktywne
Należy sobie zadać pytanie, dlaczego Natura wy-tworzyła tak skomplikowane cząsteczki, by ostatecz-nie zbudować coś tak prostego, jak centrum aktyw-ne? Czy enzymy nie mogłyby składać się właściwe tylko z tych kilku kluczowych aminokwasów, które katalizują reakcję? Przecież tak właśnie budujemy nasze katalizatory my, chemicy – i jakoś to działa! Powodów, dla których Natura wybrała to pozornie
Ryc. 7 Hierarchiczna struktura białek tworzona przez sekwencję aminokwasową łańcucha polipeptydowego (struktura 1o-rzędowa), gdzie A) to sposób
zwinięcia (struktura 2o-rzędowa) w charakterystyczne helisy (czerwone), β-kartki (niebieskie) i spinki (zielone), B) i C) przestrzenna organizacja
struk-tur 2o-rzędowych w strukturę 3o-rzędową, zawierającą charakterystyczne motywy, takie jak pęki helis, zwijającą się β-kartkę, β-baryłkę, których funkcją
może być wytworzenie miejsca wiązania cząsteczki (ciemno- i jasnoszara kulkowa struktura substratu w B) oraz zapewnienie wyizolowanego
środowi-ska dla aktywnych aminokwasów katalizujących reakcję (aminokwasy w centrum baryłki w C). Na panelu D) przedstawiono 4o-rzędową organizację
tworzoną przez odrębne łańcuchy polipeptydowe (oznaczone różnymi kolorami); A) fragment struktury modelu homologicznego dehydrogenazy Δ1
-3-ketosteroidowej ze Sterolibacterium denitrificans [3], B) komórkowe białko wiążące retinol z Homo sapiens (kod PDB 5FAZ) C) i D) dehydrogenaza
bardziej skomplikowane rozwiązanie jest kilka. Po pierwsze, jak już wspomniałem, białka, a w szcze-gólności enzymy, produkują się poniekąd same. Po przetłumaczeniu kodu genetycznego na łańcuch biał-kowy sama struktura polimeru białkowego zwija się w docelowy kształt. Ten kształt jest tak zaprojektowa-ny przez ewolucję, aby umieścić katalitycznie aktyw-ne aminokwasy w odpowiedniej, optymalaktyw-nej pozycji. Pozostałe aminokwasy nie tylko stanowią rusztowa-nie, na którym katalitycznie aktywne aminokwasy są zamocowane, ale również budują kształt centrum ak-tywnego, które przypomina formę pod odlew rzeźby dla reagujących w reakcji cząsteczek. Innymi słowy cząsteczki reagentów „pasują” do centrum aktywne-go niczym ręka do dobrze dobranej rękawiczki i każ-dy fragment cząsteczki chemicznej wchodzi do odpo-wiedniego „palca” tej rękawiczki. Oczywiście dobre „dopasowanie” reagenta do centrum aktywnego wy-kracza poza czysto makroskopowe mechaniczne do-pasowanie kształtu, chociaż jest to również istotny czynnik (są to tak zwane efekty steryczne) (Ryc. 8).
Bardzo ważną rolę pełnią też oddziaływania elek-trostatyczne – aminokwasy o naładowanych (dodat-nio lub ujemnie) łańcuchach bocznych umieszczone są w takich miejscach, aby korzystnie oddziaływać z przeciwnie naładowanymi grupami substratu lub też umożliwić powstanie stabilizujących kompleks enzymu z substratem wiązań wodorowych. To wła-śnie dzięki tym doskonale zaprojektowanym oddzia-ływaniom centrum aktywnego z substratem enzymy uzyskują niezwykłą przewagę nad naszymi prostymi chemicznymi katalizatorami. Przewagą tą jest wspo-mniana wcześniej selektywność. Rozpoznając kształ-ty i właściwości cząsteczek chemicznych nasza „en-zymatyczna rękawica” dba nie tylko o to aby „kciuk” czy „palec wskazujący” cząsteczki trafił w odpowied-nie miejsce rękawicy, ale jest też w staodpowied-nie rozróżnić
chemiczną „malutką rączkę dziecka” od „wielkiej męskiej graby”, czy „kobiecej rączki o długich pal-cach i wypielęgnowanych paznokciach”. Innymi słowy enzym wybierze z wielu cząsteczek chemicz-nych pływających w komórkowej cytoplazmie tylko te związki, do których modyfikacji został zaprojek-towany. Dzięki tej niezwykłej zdolności w naszych komórkach potrafią biec obok siebie bardzo różne reakcje chemiczne, podczas gdy my, w chemicznej fabryce, musimy każdy z procesów chemicznych prowadzić w osobnym reaktorze, by nasze kataliza-tory „nie pomyliły się” i modyfikowały tylko jeden wybrany przez nas związek chemiczny.
Selektywność jest wielką zaletą enzymów i ma bardzo duże znaczenie dla ich zastosowania w prze-myśle. Co ciekawe – jest jednocześnie zaletą i wadą biokatalizatorów. Otóż tak długo, jak chcemy odtwo-rzyć w fabryce proces, który występuje w Naturze (na przykład chcemy syntetyzować antybiotyk wy-korzystując enzymy z grzybów, które naturalnie go wytwarzają), tak długo ta niezwykła selektywność
enzymów działa na naszą korzyść. Enzym wytworzy tylko jeden, pożądany przez nas produkt i kompletnie zignoruje zanieczyszczenia. W przemyśle jednak bar-dzo często chcemy stworzyć cząsteczki, których Na-tura nie używa albo które zawierają nietypowe ato-my. Wtedy ta wysoka specjalizacja biokatalizatorów działa na naszą niekorzyść, bo enzymy są zbyt wyso-ce wyspecjalizowane, by dobrze przyspieszać prze-mianę nietypowych cząsteczek. Nietypowe cząstecz-ki mające trochę inny chemiczny kształt oraz rozkład ładunków i nie pasują dobrze do centrum aktywnego. Aby poradzić sobie z tym problemem biotechnolodzy „przesiewają” wiele enzymów pochodzących z róż-nych organizmów, by znaleźć takie, które nie są aż tak bardzo wyspecjalizowane lub posiadają inną, bar-dziej pasująca do celów danej syntezy, specyficzność
Ryc. 8. Katalityczna podjednostka dehydrogenazy C25 steroidowej wraz z substratem w jej centrum aktywnym [18]. Na prawym panelu przedstawiono doskonałe dopasowanie substratu do powierzchni białka. Część aminokwasów przesłaniających substrat od strony czytelnika ukryto w celu lepszej wizualizacji kompleksu enzym-substrat (ES).
substratową. Czasem udaje się znaleźć enzym, któ-rego ewolucja nie doprowadziła jeszcze do skrajnej specjalizacji. Dzięki temu jest on w stanie rozpoznać i związać w centrum aktywnym szerszą gamę związ-ków chemicznych i może służyć naszym celom. Ta-kie poszukiwania przypominają jednak szukanie igły w stogu siana – nigdy nie mamy pewności, że odnaj-dziemy enzym o pożądanych cechach. Na szczęście dzięki postępom biologii molekularnej nie jesteśmy zdani tylko na łut częścią i Naturę – możemy liczyć na pomoc ze strony przyspieszonej i ukierunkowanej ewolucji enzymów w laboratorium.
Sztuczna ewolucja enzymów
Proces ewolucji polega na stopniowych, losowych zmianach w kodzie genetycznym kodującym se-kwencje białek. Enzymy odpowiedzialne za kopio-wanie DNA są zazwyczaj bardzo dokładne i bardzo rzadko popełniają błędy. Czasem jednak pojedyncze pomyłki „umkną ich uwadze” i w ten sposób następu-je mutacja punktowa w kodzie DNA. Niekiedy zmia-na pojedynczego elementu DNA nie prowadzi do po-ważnych zmian, czasem zmodyfikowane białko ma własności mniej przydatne niż jego pierwowzór, ale czasem jest ono lepsze. Ponieważ lepsze rozwiązania zwiększają szanse na przeżycie danego organizmu i wydanie na świat potomstwa (a wiec przekazanie nowego typu białka swoim dzieciom), dobre rozwią-zania się kumulują, a złe eliminują (bo często zmniej-szają szansę przeżycia i przekazania gorszego białka potomstwu).
W sztucznie kierowanej ewolucji to my decydu-jemy, jakie będą warunki „przeżycia” danej losowej mutacji. Są nimi zdolności enzymu do katalizowania wybranej przez nas reakcji chemicznej. Dzięki postę-pom w dziedzinie biologii molekularnej posiadamy specjalne narzędzia biotechnologiczne umożliwiają-ce częste wprowadzanie losowych, jak i umożliwiają-celowych zmian w DNA i następnie produkcji białek kodowa-nych przez zmienione DNA w bakteriach. Posiada-my też narzędzia umożliwiające mieszanie się kodu genetycznego pomiędzy podobnymi, homologiczny-mi genahomologiczny-mi, w podobny sposób jak w procesie płcio-wego rozmnażania [19]. Powtarzając proces mutacji i selekcji wielokrotnie dla dużej liczby wariantów en-zymu (niczym kolejne pokolenia w normalnej ewo-lucji) jesteśmy w stanie przekształcić enzym, który był słaby, w katalizowaniu nieznanej Naturze reakcji, w super katalizator, który nie tylko przyspieszy re-akcję nawet i 1000-krotnie, ale jeszcze zniesie kie stężenie rozpuszczalników organicznych, wyso-ką temperaturę czy jakże odmienne od przytulnego
wnętrza komórki warunki panujące w reaktorze che-micznym. Dzięki poszerzającej się wiedzy na temat zależności struktury białek i ich właściwości jeste-śmy coraz częściej w stanie przewidywać (za pomo-cą modelowania molekularnego), jakie modyfikacje należy wprowadzać, by skierować ewolucję w danym kierunku, i jakie rejony białka najlepiej jest podda-wać mutacjom. Dlatego nie musimy już poruszać się zupełnie na ślepo, co pozwala optymalizować właściwości katalityczne enzymów metodą ewolucji kierowanej dla mniejsze ilości białek [11]. Co wię-cej, dzięki technikom inżynierii genetycznej i mi-krobiologii jesteśmy w stanie wytwarzać te enzymy w sposób tani i bezpieczny dla środowiska. Stało się to możliwe dzięki zrozumieniu kodu genetycznego, stanowiącego instrukcję do produkcji poszczegól-nych enzymów oraz rozwojowi narzędzi molekular-nych pozwalających tę instrukcję kopiować, modyfi-kować i przenosić do innych organizmów. Za pomocą technik transformacji genetycznych wprowadzamy odpowiednio przygotowaną genetyczną instrukcję do pospolitych mikroorganizmów (np. bakterii
Escheri-chii coli czy drożdży Pichia pastoris), namnażamy
je i wydajemy im „chemiczny rozkaz” nakazujący produkcję pożądanego enzymu w dużej ilości. Ten „chemiczny rozkaz”, nazywany fachowo „indukcją”, wydajemy za pomocą dodatku do hodowli chemicz-nych związków (takich jak np. laktoza czy ramnoza), które zmieniają właściwości białek regulujących eks-presję genetyczną w mikroorganizmach. W obecno-ści tych substancji białka regulatorowe odczepiają się od DNA mikroorganizmu (w szczególności zaś od DNA sztucznie wprowadzonego przez biolo-gów molekularnych do zmodyfikowanej bakterii) i umożliwiają transkrypcję zakodowanej instrukcji produkcji pożądanego enzymu. Dzięki takim osią-gnięciom genetycznie zmodyfikowane organizmy (czyli GMO) dostarczają nam m.in. tak zwanych re-kombinowanych enzymów. Jest to sposób produkcji podpuszczki do produkcji serów (nie musimy więc zabijać jagniąt by ekstrahować enzym z ich żołąd-ków), wytwarzania enzymów rozkładających skrobię do syropu glukozowego (soki słodkie nawet w zimie) czy produkujących lipazy usuwające tłuste plamy z pranej odzieży (tanie proszki zawierające enzy-my pozwalają na pranie w niskiej temperaturze, co oszczędza prąd i chroni środowisko). Na marginesie należy wspomnieć, że te same metody inżynierii ge-netycznej służą do produkcji bardzo cennych leków, takich jak insulina ludzka, ludzki hormon wzrostu czy też innowacyjne leki przeciw chorobom auto-immunologicznym, takim jak choroba Leśniowskie-go-Crohna, wrzodziejące zapalenie jelita grubego,
łuszczyca czy reumatoidalne zapalenie stawów [2]. Te biologiczne leki również zbudowane są z aminokwa-sów i wytwarzane są w zmodyfikowanych genetycz-nie komórkach eukariotycznych (tj. genetycz-nie bakteryjnych – najczęściej w komórkach jajnika chomika chińskie-go – CHO). Przeciwciała wytwarzane w GMO mają również zastosowanie w diagnostyce biomedycz-nej (jako molekularne czujniki wykrywają np. hCG w teście ciążowym), jak również jako sztuczne bio-katalizatory, czyli rodzaj wytworzonych przez che-mików enzymów [20]. Jak więc widać nie należy się ślepo obawiać GMO dla samej zasady – to, co modyfikowane genetycznie niejednokrotnie ratuje nasze życie i zdrowie, a przy tym wspiera ochronę środowiska.
Podsumowanie
Otaczający nas świat zmienia się czasem niepostrze-żenie. Jeszcze 20–30 lat temu enzymy wykorzystywali
tylko specjaliści w laboratoriach czy fabrykach far-maceutycznych. Dziś, czasem nieświadomie, wyko-rzystują je gospodynie domowe (lub samodzielnie robiący pranie mężczyźni) dolewając żelu do prania z formułą enzymatyczną usuwającą plamy z białek, tłuszczu i cukrów. Korzystają z nich piekarze, doda-jący enzymatycznych polepszaczy, które sprawiają, że chleb jest bardziej sprężysty i aromatyczny, czy ku-charze, wykorzystujący enzymatyczne marynaty, by mięso nabrało odpowiedniej miękkości i delikatności. Stosuje się enzymatyczne preparaty proteolityczne, by sklarować piwo produkowane w lokalnym mikro-bro-warze. No i oczywiście każdy z nas, w każdej sekun-dzie naszego istnienia, wykorzystuje tysiące enzymów – po to, by po prostu żyć.
Bibliografia
1. Arrhenius, S, Über die Dissociationswärme und den Einfluss der Temperatur auf den Dissociationsgrad der Elektrolyte. In Zeitschrift für Physikalische Chemie, 1889; Vol. 4, p 96.
2. Brekke, OH; Sandlie, I. (2003). Therapeutic antibodies for human diseases at the dawn of the twenty-first century. Nat. Rev. Drug Discov. 2: 52–62.
3. Chiang, YR; Ismail, W; Gallien, S; Heintz, D; Van Dorsselaer, A; Fuchs, G. (2008). Cholest-4-En-3-one--Delta(1)-dehydrogenase, a flavoprotein catalyzing the second step in anoxic cholesterol metabolism. Appl. Environ. Microbiol. 74: 107–113.
4. Glasstone, SLKJEH, The Theory of Rate Processes The Kinetics of Chemical Reactions, Viscosity,
Diffu-sion and Electrochemical Phenomena. Mcgraw-Hill Book Compagny: New York, N.Y., 1941.
5. Herriott, RM. (1938). Kinetics of the Formation of Pepsin from Swine Pepsinogen and Identification of an Intermediate Compound. J. Gen. Physiol. 22: 65–78.
6. Hoffken, HW; Duong, M; Friedrich, T; Breuer, M; Hauer, B; Reinhardt, R; Rabus, R; Heider, J. (2006). Crystal structure and enzyme kinetics of the (S)-specific 1-phenylethanol dehydrogenase of the denitrify-ing bacterium strain EbN1. Biochemistry 45: 82–93.
7. Izake, EL. (2007). Chiral discrimination and enantioselective analysis of drugs: an overview. J. Pharm. Sci. 96: 1659–76.
8. Johnson, KA; Goody, RS. (2011). The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis– Menten Paper. Biochemistry 50: 8264–8269.
9. Koshland, DE; Némethy, G; Filmer, D. (1966). Comparison of Experimental Binding Data and Theoreti-cal Models in Proteins Containing Subunits*. Biochemistry 5: 365–385.
10. Li, Q; Mu, Z; Zhao, R; Dahal, G; Viola, RE; Liu, T; Jin, Q; Cui, S. (2016). Structural Insights into the Tetrameric State of Aspartate-β-semialdehyde Dehydrogenases from Fungal Species. Scientific Reports 6: 21067.
11. Lutz, S. (2010). Beyond directed evolution—semi-rational protein engineering and design. Curr. Opin. Biotechnol. 21: 734–743.
12. Monod, J; Wyman, J; Changeux, JP. (1965). On the Nature of Allosteric Transitions: A Plausible Model. J. Mol. Biol. 12: 88–118.
Maciej Szaleniec, Agnieszka Rugor, Instytut Katalizy Fizykochemii Powierzchni im. Jerzego Habera, Polskiej Akademii Nauk.
E-mail: ncszalen@cyfronet.pl
prediction methods. Proteins: Struct. Funct. Bioinform. 23: ii–v.
14. Nguyen, LA; He, H; Pham-Huy, C. (2006). Chiral drugs: an overview. Int. J. Biomed. Sci. 2: 85–100. 15. Pauling, L. (1948). Chemical achievement and hope for the future. Am. Sci. 36: 51–8.
16. Rohman, A; van Oosterwijk, N; Thunnissen, A-MWH; Dijkstra, BW. (2013). Crystal Structure and Site--directed Mutagenesis of 3-Ketosteroid Δ1-Dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis SQ1 Explain Its Catalytic Mechanism. J. Biol. Chem. 288: 35559–35568.
17. Romero, P; Wagg, J; Green, ML; Kaiser, D; Krummenacker, M; Karp, PD. (2004). Computational predic-tion of human metabolic pathways from the complete human genome. Genome Biology 6: R2.
18. Rugor, A; Wójcik-Augustyn, A; Niedzialkowska, E; Mordalski, S; Staroń, J; Bojarski, A; Szaleniec, M. (2017). Reaction mechanism of sterol hydroxylation by steroid C25 dehydrogenase – Homology mo-del, reactivity and isoenzymatic diversity. J. Inorg. Biochem. 173 28–43
19. Stemmer, WPC. (1994). Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 370: 389-391. 20. Wentworth, P; Janda, KD. (2001). Catalytic antibodies. Cell. Biochem. Biophys. 35: 63–87.
K
URKUMA – ROŚLINNE PANACEUM
Joanna M. Wierońska (Kraków) Streszczenie
Kurkuma jest rośliną występującą dziko w krajach tropikalnych. Jest wykorzystywana jako przyprawa oraz jako barwnik spożywczy. Czynnikami biologicznie aktywnymi, którym kurkuma zawdzięcza swoje niezwykłe właściwości i kolor, są kurkuminoidy. Jest to grupa substancji, do których zaliczamy kurkuminę, demetok-sykurkuminę oraz bis-demetokdemetok-sykurkuminę. Dominująca procentowo jest kurkumina i jest ona też uznana za najcenniejszą spośród wszystkich kurkuminoidów. Substancje te wykazują działanie plejotropowe, czyli mają zdolność do wielokierunkowego działania na organizm. Do najważniejszych prozdrowotnych działań obserwowanych po podaniach kurkuminoidów zaliczamy działanie przeciwzapalne, przeciwnowotworowe i antyoksydacyjne. Wykazano również skuteczność kurkuminoidów w leczeniu zaburzeń metabolicznych, a także zaburzeń ze strony ośrodkowego układu nerwowego. Pozytywne rezultaty widoczne były zwłaszcza w modelach chorób neurodegeneracyjnych, jak np. choroby Alzheimera lub Parkinsona, jednakże odnotowy-wano także pozytywne działanie u pacjentów z depresją.
Ograniczeniem w stosowaniu kurkuminy jest przede wszystkim niska biodostępność kurkuminoidów oraz słaba rozpuszczalność w wodzie. Jednakże jest to substancja dość dobrze tolerowana i nie zaobserwowano poważnych skutków niepożądanych po podaniach doustnych.
Abstract
Turmeric is a wild plant found in tropical countries. It is known as popular spice and also as a natural yellow pig-ment. The biologically active agents that turmeric owes its unusual properties and color are curcuminoides. This is a group of substances that include curcumin, demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin. Curcumin is the most abundant and is considered to be the most valuable of all curcuminoids. These substances have pleiotropic effects, it means they have the capacity for multidirectional action in the body. The most important health effects observed after administration of curcuminoides are anti-inflammatory, anti-cancer and antioxidant effects. Cur-cuminoids have also been shown to be effective in the treatment of metabolic disorders as well as disorders of the central nervous system. Positive results were evident especially in models of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s or Parkinson’s disease, but positive effects have also been reported for patients with depression. The limitation of the use of curcuminoides is primarily it low bioavailability and water solubility. However, the substances are well tolerated and no serious adverse effects have been observed after their oral administration.
