Over de structuur van bongkrekzuur

OVER DE STRUCTUUR VAN

BONGKREKZUUR

PROEFSCHRIFT

TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE TECHNISCHE WETENSCHAP AAN DE TECHNISCHE HOGESCHOOL TE DELFT, OP

GEZAG VAN DE RECTOR MAGNIFICUS

DR. O . B O T T E M A , HOOGLERAAR IN DE FACULTEIT DER ALGEMENE WETENSCHAPPEN, VOOR EEN COMMISSIE UIT DE SENAAT TE VERDEDIGEN OP

WOENSDAG 31 OKTOBER 1956 DES NAMIDDAGS TE 2 UUR

DOOR

DIEDERIK HENDRIK NUGTEREN

SCHEIKUNDIG INGENIEUR GEBOREN TE HENDRIK IDO AMBACHT

/anS^i^

Dit proefschrift is goedgekeurd door de promotor: Prof. W. Berends

I N H O U D

I. B o n g k r e k z u u r , het toxine van Pseudomonas cocovenenans 9 1. B e r e i d i n g , e i g e n s c h a p p e n en s t r u c t u u r van toxoflavine 11 2. B e r e i d i n g en e i g e n s c h a p p e n van b o n g k r e k z u u r 11 II. B e r e i d i n g van b o n g k r e k z u u r . B e p a l i n g s m e t h o d e n . P a p i e r -c h r o m a t o g r a f i e 15 1. B e r e i d i n g van b o n g k r e k z u u r 15 a. De i i b o n g k r e k - b a c t e r i e " 16 b . C u l t i v e r i n g s m e t h o d e 17 c. I s o l e r i n g van b o n g k r e k z u u r 18 2. B e p a l i n g s m e t h o d e n van b o n g k r e k z u u r 19 a. Optische a c t i v i t e i t 19 b. A b s o r b t i e in het u l t r a v i o l e t 20 c. A n t i b i o t i s c h e a c t i v i t e i t 21 3. P a p i e r c h r o m a t o g r a f i e 24 a. W e r k w i j z e 24 b. Ontwikkelvloeistoffen 24

c. Het aantonen van de z u r e n 25

d. U i t k o m s t e n 25 III. C h r o m a t o g r a f i s c h e z u i v e r i n g van b o n g k r e k z u u r 28

1. A d s o r b t i e van b o n g k r e k z u u r aan n A m b e r l i t e I R - 4 B " 29

2. Z u i v e r i n g m e t een p a p i e r k o l o m 30 IV. Voorlopig o n d e r z o e k van b o n g k r e k z u u r en d e r i v a t e n 35

1. Stabiliteit van b o n g k r e k z u u r 35 2. E l e m e n t a i r a n a l y s e 35 3. Specifieke optische r o t a t i e 36 4. D e r i v a t e n en zouten van b o n g k r e k z u u r 37 a. p - P h e n y l - p h e n a c y l - e s t e r 37 b. S - b e n z y l - i s o t h i u r o n i u m - z o u t 38 c. Z i l v e r z o u t 38 V. K a t a l y t i s c h e h y d r o g e n e r i n g van b o n g k r e k z u u r . Enkele e i g e n s c h a p p e n en d e r i v a t e n van h y d r o b o n g k r e k z u u r 40 1. B e r e i d i n g van h y d r o b o n g k r e k z u u r 40 2. Kwantitatieve bepaling van de w a t e r s t o f o p n a m e 41

3. Enige e i g e n s c h a p p e n van h y d r o b o n g k r e k z u u r 42 4. D e r i v a t e n en zouten van h y d r o b o n g k r e k z u u r 43 a. p - P h e n y l - p h e n a c y l - e s t e r 43 b. N, N'-di-(p-dim.ethylam.inophenyl)-urelde 43 c. Z i l v e r z o u t 44 d. Natriunazout 45 VI. Bepaling van het m o l e c u l a i r ge wicht. A n a l y s e van enige

functionele g r o e p e n 46 1. M o l e c u l a i r g e w i c h t s b e p a l i n g e n 47

a. M o l e c u l a i r g e w i c h t s b e p a l i n g e n volgens R a s t 48 b . M o l e c u l a i r g e w i c h t s b e p a l i n g e n volgens B a r g e r 49

nntuKx^'^^nf^^^^^

2. A e q u i v a l e n t g e w i c h t s b e p a l i n g e n 52 3. Bepaling van de a c t i e v e waterstof 53 4. Bepaling van de C - m e t h y l g r o e p e n 54 VII. N a d e r e o n d e r z o e k i n g e n o v e r de s t r u c t u u r van b o n g k r e k -z u u r 56 1. A b s o r b t i e in h e t u l t r a v i o l e t 56 2. I n f r a r o o d s p e c t r u m 59 3. E n k e l e r e a c t i e s m e t b o n g k r e k z u u r 60 a. H y d r o g e n e r i n g 60 b . B r o o m a d d i t i e 63 c. R e d u c t i e m e t lithiumalunainiumhydride 63 4. Oxydatie van b o n g k r e k z u u r 64 a. Oxydatie m e t k a l i u m p e r m a n g a n a a t 66 b. O z o n i s a t i e 69 VIII. O n d e r z o e k van h y d r o b o n g k r e k z u u r 72 1. I n f r a r o o d s p e c t r u m 72 2. O n d e r z o e k i n g e n over de de a a r d van de z u u r s t o f b e -vattende g r o e p 73 a. R e a c t i e s op een e v e n t u e e l aanwezige h y d r o x y l g r o e p 73 b . R e a c t i e s op de a e t h e r g r o e p 75 3. Pogingen uit h y d r o b o n g k r e k z u u r anhydriden of c y c l i

-s c h e ketonen te b e r e i d e n 77 a. A n h y d r i d e v o r m i n g 77 b. R e a c t i e van B l a n c 78 IX. Splitsing van de m e t h o x y l g r o e p van h y d r o b o n g k r e k z u u r .

E i g e n s c h a p p e n van het g e d e m e t h y l e e r d e zuur 80 1. P r o e v e n o v e r de s p l i t s i n g van de a e t h e r g r o e p in h y -d r o b o n g k r e k z u u r 80 a. Inwerking van b r o o m w a t e r s t o f z u u r 80 b. Splitsing m e t s t e r k zwavelzuur 81 2. L a c t o n v o r m i n g van g e d e m e t h y l e e r d h y d r o b o n g k r e k -z u u r 82 3. Oxydatie van g e d e m e t h y l e e r d h y d r o b o n g k r e k z u u r 84 4. D e h y d r a t a t i e van de m e t h y l e s t e r van g e d e m e t h y l e e r d h y d r o b o n g k r e k z u u r 85 5. Bepaling van de onverzadigdheid van de g e d e h y d r a

-t e e r d e h y d r o b o n g k r e k z u r e - m e -t h y l e s -t e r 87 a. K a t a l y t i s c h e h y d r o g e n e r i n g 87 b. B r o o m a d d i t i e 88 X. Oxydatie van de g e d e h y d r a t e e r d e h y d r o b o n g k r e k z u r e -m e t h y l e s t e r 90 1 B e r e i d i n g van de g e d e h y d r a t e e r d e h y d r o b o n g k r e k z u -r e - m e t h y l e s t e -r 90 2. O z o n i s a t i e en oxydatie van de g e d e h y d r a t e e r d e h y d r o -b o n g k r e k z u r e - m e t h y l e s t e r 92 3. E i g e n s c h a p p e n van de n n e u t r a l e f r a c t i e " 93 4. E i g e n s c h a p p e n van de iizure f r a c t i e " 94 Samenvatting 98 S u m m a r y 100 L i t e r a t u u r l i j s t 102

G E B R U I K T E A F K O R T I N G E N

B . Z . = bongkrekzuur.

B.A. = bongkrekalcohol (met LiAlH4 gereduceerd B.Z.).

H . B . Z . = hydrobongkrekzuur.

H.B.A. = hydrobongkrekalcohol (met LiAlH4 gereduceerd H . B . Z . ) .

H. B. Z. -ester = trimethylester van H . B . Z .

oxy-H.B.Z. = gedemethyleerd H. B. Z. (= hydroxyzuur). dehydr.-H. B. Z. = achtereenvolgens gedemethyleerd en

H o o f d s t u k l

BONGKREKZUUR, HET TOXINE VAN PSEUDOMONAS COCOVENENANS

In de dichtbevolkte provincie Banjoenaas op Midden-Java kwa-men in het verleden onder de inheemse bevolking herhaaldelijk ernstige voedselvergiftigingen voor. Het aantal sterfgevallen ten gevolge van deze vergiftigingen was dikwijls bijzonder hoog; soms werden meer dan 100 slachtoffers per jaar gemeld. Het plotse-linge uitbreken van de intoxicaties, de grote afstanden in een naoeilijk toegankelijk gebied en de geringe mededeelzaamheid van de bevolking waren factoren, welke het opsporen van de oorzaak van deze gevaarlijke vergiftigingen bemoeilijkten. Omstreeks 1930 hebben M e r t e n s en V a n V e e n voor het eerst een s e -rieuze studie gewijd aan dit probleem. Na enkele jaren gelukte het genoemde onderzoekers aan te tonen dat bepaalde door de J a -vanen genuttigde kokosprodukten soms uitermate giftig kunnen zijn 71, 72, 73). Allereerst werd toen een nauwkeurig onderzoek in-gesteld naar de bereiding van de diverse, uit kokos verkregen, voedingsmiddelen.

Teneinde de waardevolle klapperolie te winnen, worden in Ban-joemas hoofdzakelijk twee methodes toegepast:

a) Het kokosvlees wordt geraspt en vervolgens met warm water behandeld, waarna de massa goed wordt uitgeknepen. De v e r k r e -gen waterige vetemulsie wordt usanten" -genoemd, het vetarme residu ,tampas klappa". Deze nampas" heeft weinig waarde en wordt grotendeels als veevoeder gebruikt, doch door de inheemse bevolking wordt het produkt nog wel gegeten, bijv. in geroosterde vorm (iisemaji").

De nampas" bleek sontis, na enkele dagen in de tropische atmo-sfeer te hebben gestaan, uiterst giftig te zijn.

b) Bij een ander winningsproces van de kokosolie wordt het ge-raspte kokosvlees gestoomd en daarna met enkele fijngestampte iijoejoe's" (sawahkrabbetjes) vermengd. Dit mengsel laat men dan enkele dagen broeien. De op deze wijze verkregen massa kan gemakkelijk worden uitgeperst waarbij een zuivere, glasheldere kokosolie ontwijkt. De achterblijvende perskoek (nboengkil") is als zodanig slecht verteerbaar; het produkt wordt daarom ge-woonlijk verder verwerkt tot het door de Javanen zeer gewaardeerde ribongkrek" of ntempé boengkil". Daartoe wordt de p e r s -koek goed fijn gemaakt, vervolgens enkele uren in de zon gedroogd en tenslotte gedurende ca. 1 uur gestoomd. Door enting met een hoeveelheid nbongkrek" van de vorige bereiding vindt een inten-sieve schimmeling en broeiing van het materiaal plaats. Evenals in andere ntempé's" treedt ook hier de schimrael Rhizopus oryzae op de voorgrond. Na enkele dagen is een door en door beschim-mield, grijsachtig-wit produkt ontstaan, dat met de naam nbong-krek" wordt aangeduid. Bij verdere rotting ontstaat ntenapé bosok', dat ook een smakelijk voedingsmiddel schijnt te zijn.

Daar de nbongkrek"-bereiding tamelijk ingewikkeld is, kunnen mislukkingen gemakkelijk voorkomen. Het bleek nu dat alleen produkten, waarop de schimmel slecht was gegroeid, tot vergifti-gingen aanleiding konden geven. De gif vorming moest dus wellicht aan een infectie met een ongewenst micro-organisme worden toe-geschreven.

Het was aanvankelijk geen eenvoudige opgave, vergiftige klap-perprodukten in handen te krijgen. Wanneer er namelijk weer vergiftigingsgevallen bekend waren geworden, was het betreffende voedsel meestal verdwenen, zodra de onderzoekers ter plaatse arriveerden. Ook veranderen deze kokosprodukten in de tropen uiterst snel van samenstelling, zodat het verdachte voedsel bij proefdieren dikwijls niet meer giftig bleek te zijn.

M e r t e n s en V a n V e e n '1) slaagden er tenslotte in, beslag te leggen op nbongkrek", nsemaji" en soortgelijke materialen, welke volgens dierproeven nog wèl giftig waren. Nadat talrijke, uit deze produkten geïsoleerde, bacteriën waren onderzocht, werd eindelijk het micro-organisme gevonden, dat verantwoordelijk moest zijn voor de vergiftiging van de ontvette kokos 72). De gif-vormer werd voorlopig nde bongkrekbacterie" genoemd. In het laboratorium voor microbiologie te Delft wordt deze bacterie thans als ,,Pseudomonns cocovenenans" aangeduid.

De nbongkrekbacterie" wordt beschreven als een klein, be-weeglijk, gram-negatief staafje met vier polaire ciliën. De vorm bleek overigens bij het kweken op verschillende media verander-lijk: soms geleken de bacteriën op micrococcen terwijl onder andere omstandigheden lange draden werden waargenomen. Het micro-organisme was facultatief anaëroob en groeide op allerlei media; gewoonlijk werd een gele kleurstof afgescheiden. Het on-derzoek werd bemoeilijkt doordat de nbongkrekbacterie" soms reeds na enkele malen overenten haar vermogen tot gifvorming had verloren.

E e r s t na uitgebreide en langdurige onderzoekingen slaagde men er in, een in het laboratorium bruikbare bereidingsmethode van de door de nbongkrekbacterie" geproduceerde giftige stoffen uit te werken. Steeds werd met behulp van dierproeven de vorming van de vergiften in de cultures vervolgd; als proefdieren werden o. a. ratten, aapjes (Macacus cynomolgus) en duiven gebruikt. De giftige stoffen bleken slechts te ontstaan bij het kweken van de bacterie op zéér bepaalde media en uitsluitend onder sterk aërobe omstandigheden. Ontvette kokos was juist een bijzonder geschikt voedingsmedium voor de gifvormende bacterie, vermoedelijk om-dat dit produkt een poreuze samenstelling heeft, waardoor veel zuurstof kan binnendringen.

Uit de cultures konden, in min of meer zuivere vorm, twee ver-giften worden geïsoleerd, namelijk een geel gekleurde, stikstof-houdende verbinding en een onverzadigde, vetzuurachtige stofl^^). De eerstgenoemde verbinding werd ntoxoflavine" genoemd, daar een zekere overeenkomst met lactoflavine en soortgelijke kleur-stoffen werd geconstateerd. Het kleurloze vergif bezat de

eigen-schappen van een onverzadigd vetzuur en werd als nbongkrekzuur" aangeduid. Later kwam aan het licht dat alleen bongkrekzuur voor de werkelijk optredende vergiftigingen aansprakelijk moest zijn, want toxoflavine was bij orale toediening slechts weinig toxisch.

1. B e r e i d i n g , e i g e n s c h a p p e n e n s t r u c t u u r v a n t o x o f l a v i n e

Voor de bereiding van toxoflavine was als cultuurmedium een waterige oplossing van 1% glycerol, 1% pepton en voedingszouten bijzonder geschikt. Deze vloeistof werd bij 28'-'C onder aërobe omstandigheden geïncubeerd met een werkzame nbongkrekbacte-rie". Na twee dagen was dan een intensief geel gekleurde oplos-sing ontstaan. P e r liter cultuurvloeistof werd tenslotte, na een ingewikkelde zuivering, 15 è. 20 mg toxoflavine geïsoleerd in de vorm van een gele, kristallijne stof met een smeltpunt van 1710C 72, 106).

De fysiologische werking van toxoflavine werd door D a r w i s A m a r en G r e v e n s t u k 23) onderzocht. Inspuiting van 0,4 mg van deze stof was dodelijk bij een konijn. Bij de door toxoflavine vergiftigde konijnen werd een sterke bloedstuwing in het hart waargenomen. Zoals reeds is opgemerkt, was het zuivere, k r i s -tallijne toxoflavine oraal toegediend echter nauwelijks giftig. Klaarblijkelijk was dus deze kleurstof niet het voornaamste werk-zame agens bij de bongkrekvergiftigingen op Midden-Java.

Voor het toxoflavine werd de empirische formule C6H5N4O2 afgeleid 107). Verder bleek uit verschillende chemische omzet-tingen, dat een methyl-dihydroxy-pyrimidine-ring aanwezig moest zijn 105, 101). Toxoflavine zou volgens V a n V e e n en B a a r s 105) onderstaande structuurformule bezitten:

H „ C - N — C

•^ I I

o = c

C

HN — C

2. Bereiding en eigenschappen van bongkrekzuur

Bij de bereiding van bongkrekzuur op het laboratorium, ge-bruikten V a n V e e n en M e r t e n s 106) „ampas klappa" als medium, dit is dus met warm water ontvet kokosvlees. De nampas" werd in grote flessen gedurende 8 tot 14 dagen met een a c -tieve nbongkrekbacterie" geïncubeerd. Na afloop werd het ver-kregen produkt met gekoelde alcohol geëxtraheerd. Het extract werd daarna in vacuüm ingedampt en het overgebleven vetrijke residu opgenomen in chloroform. Na verdunning van de oplossing met een gelijke hoeveelheid petroleumaether, konden de zuren uit de organische fase worden verwijderd door deze te schudden met een kleine overmaat 5%-ige natronloog. In de waterige

oplos-= 0 = N,

= N ' / -CH.

sing waren dan, behalve het bongkrekzuur, nog relatief grote hoeveelheden vetzuren aanwezig. Een gedeeltelijke zuivering was te bereiken door de alkalische oplossing bij verschillende pH-waarden met chloroform te extraheren.

Een isoleringsschema, dat direct tot minder verontreinigde preparaten leidt, was reeds bekend, toen wij met ons onderzoek begonnen; deze werkwijze is evenwel nog niet gepubliceerd (zie verder volgende hoofdstuk).

Over de fysiologische werkzaamheid van het bongkrekzuur wer-den vrij uitgebreide onderzoekingen verricht 24,109). in tegen-stelling tot toxoflavine bleek bongkrekzuur zowel bij orale toedie-ning als bij inspuiting uiterst giftig. Tijdens de eerste fase van de vergiftiging vindt men bij proefdieren een sterke hyperglycaemie, dus een verhoogd bloedsuikergehalte. Later daalt de suikerspiegel tot onder het normale niveau (hypoglycaemie). Melkzuur, amino-zuren en anorganische fosfaat komen dikwijls in abnormaal grote hoeveelheid in het bloed van vergiftigde dieren voor. Het proefdier sterft gewoonlijk, nadat eerst geruime tijd heftige krampen zijn opgetreden, in een coma. Bij sectie van met bongkrekzuur ge-dode proefdieren wordt gevonden dat het leverglycogeen geheel is verdwenen. De eilandjes van L a n g e r h a n s vertonen geen afwijkingen.

Een hypoglycaemie werd in 1934 ook bij menselijke slachtof-fers van bongkrekvergiftigingen geconstateerd 109) Door glucose in te spuiten tijdens het laatste stadium van de vergiftiging werd gedurende enige tijd wel een verbetering van de toestand van de patiënten verkregen, maar op den duur bleek dat vitale organen onherstelbaar naoesten zijn aangetast, want zelfs het op peil hou-den van de glucosespiegel vain het bloed kon de dodelijke afloop niet verhinderen.

De wijze waarop bongkrekzuur op het levende systeem inwerkt, is tot dusverre nog niet duidelijk. Bij vergiftiging van hogere die-ren wordt de gehele stofwisseling en in het bijzonder het koolhy-draatmetabolisme verstoord. Het is echter niet bekend, welke biochemische omzettingen in feite door het bongkrekzuur worden geremd. Tijdens recente onderzoekingen in vitro zijn enige aan-wijzingen gevonden dat de K r e b s -cyclus niet goed kan fimction-neren als bongkrekzuur aanwezig i s .

Over de structuur van bongkrekzuur (in het vervolg dikwijls af-gekort tot B Z . ) is slechts één voorlopige mededeling verschenen; A . G . v a n V e e n en W . K . M e r t e n s — Ree. trav. chim. 54» 373 (1935). In deze publikatie wordt opgemerkt, dat de structuurop-heldering uitermate werd bemoeilijkt door de snelle ontleding, welke het bongkrekzuur in vrije vorm vertoonde. Deze labiliteit werd toegeschreven aan de aanwezige dubbele bindingen. In de proeven van bovengenoemde onderzoekers was het vrije bongkrek-zuur gewoonlijk reeds na een half uur inactief geworden. De ver-kregen preparaten bleken nog lagere vetzuren, o. a. caprylzuur, te bevatten. Deze verontreinigingen zouden volgens V a n V e e n C S . stabiliserend op B Z . werken; men slaagde er namelijk niet in de vetzuren te verwijderen, zonder dat tegelijkertijd de

giftig-heid van de stof verdween. Slechts in alkalische oplossing was het onzuivere zuur redelijk houdbaar.

De in de literatuur beschreven proeven, welke hieronder wor-den vermeld, zijn dus alle uitgevoerd met onzuivere preparaten.

Bongkrekzuur bleek optisch actief te zijn; als specifieke ing in alcohol werd gevonden [ a ] | f = 110-115°. De optische draai-ing correleerde steeds met de giitigheid. Als maat voor de acti-viteit van de oplossingen werd gewoonlijk het aantal nduivendoses" per ml gebruikt; één duivendosis (D.D.) is de hoeveelheid B. Z. welke bij orale toediening voor een duif dodelijk is na verloop van 8 tot 20 uur. Opgegeven wordt, dat voor zuiver bongkrekzuur

1 D.D. = 0,5 mg vaste stof zou zijn.

Het onderzochte zuur bevatte geen stikstof of zwavel. Reacties op carbonylgroepen gaven negatieve uitkomsten. Het zuur was sterk onverzadigd: broom werd vlot geaddeerd, terwijl bij kata-lytische hydrogenering per mol B . Z . 3 mol waterstof werden op-genomen. Verestering met p-phenyl-phenacyl-bromide leverde alleen amorfe produkten. Bij methylering met methylsulfaat en natronloog of met diazomethaan ontstonden uitsluitend inactieve stoffen. Ook na reactie met maleüiezuuranhydride, evenals met dinitrobenzoyl-chloride, verkreeg men onhanteerbare, amorfe mengsels. Een poging, bepaalde alkaloïdzouten van B.Z. tot kristallisatie te brengen, had evenmin succes.

Het aequivalentgewicht van het (onzuivere) B.Z. zou volgens V a n V e e n c. s. 1 9 0 ^ 2 0 0 bedragen. Een bepaling van het mo-leculairgewicht volgens R a s t gaf eveneens een uitkomst van ca 200. Bij de elementairanalyse werd gevonden 67,3% C en 8,2% H. Door deze resultaten werd verondersteld dat de empiri-sche formule van B . Z . ongeveer CixHigOs naoest zijn (berekend 67,4% C en 8,2% H; M = 196). In overeenstemming hiermee werd het bongkrekzuur als een o n v e r z a d i g d h y d r o x y m o n o -c a r b o n z u u r m e t d r i e d u b b e l e b i n d i n g e n bes-chreven.

Het gehydrogeneerde bongkrekzuur was niet optisch actief en evenmin giftig. Uit de elementairanalyses en andere bepalingen werd voor dit zuur de formule CiiH22C)3 afgeleid.

Teneinde een inzicht te krijgen in het mechanisme van de ont-leding van bongkrekzuur, werden relatief grote hoeveelheden van het actieve zuur in vrije toestand aan de lucht bewaard. Aller-eerst bleek daarbij de giftigheid en de optische activiteit te ver-dwijnen, terwijl dan de moleculairgewichtsbepalingen en elemen-tairanalyses nog onveranderde uitkomsten gaven. Bij langer staan van het vrije zuur aan de lucht vond oxydatie en polymeri-satie plaats. De geheel verharste stof gaf bij de elementair ana-lyses aanzienlijk lagere koolstofpercentages (ca 64%); bovendien was het moleculairgewicht veel groter geworden (400 of naeer). Het aequivalentge wicht daarentegen bleef vrijwel constant (onge-veer 195).

In een latere publikatie (1950) vermeldt V a n V e e n HO) plot-seling voor bongkrekzuur de formule (C]^iH]^503)jj, waarin n waarschijnlijk de waarde 2 zou bezitten. Bij de oudere onderzoe-kingen schijnt echter steeds een moleculairgewicht gevonden te zijn, dat alleen met de enkelvoudige formule in overeenstemming was. Het is zonder meer niet duidelijk op welke gronden later toch de dubbele formule werd aangenomen.

In het reeds genoemde artikel HO) (1950) werd aangetoond, dat B . Z . de groei remt van diverse bacteriën, gisten en schinamels. Bongkrekzuur moet dus tot de a n t i b i o t i c a worden gerekend. Het is nu in dit verband wel opmerkelijk, dat de laatste jaren

ver-schillende antibiotica zijn ontdekt, welke gekenmerkt zijn door een onverzadigde, vetzuurachtige structuur.

De merkwaardige eigenschappen van bongkrekzuur deden het wenselijk voorkomen, zowel het onderzoek naar de chemische con-stitutie als naar de werking op het levende systeem van deze stof te hervatten. Dit proefschrift is vrijwel uitsluitend aan het eerste onderwerp gewijd.

Het feit dat bij de aanvang van ons onderzoek slechts weinig ge-gevens met betrekking tot de structuur van bongkrekzuur werke-lijk betrouwbaar bleken te zijn, heeft ons genoodzaakt, de ophel-dering van de constitutie van dit zuur geheel opnieuw aan te vat-ten, zonder met het reeds verrichte werk veel rekening te houden.

H o o f d s t u k I I

BEREIDING VAN BONGKREKZUUR. BEPALINGSMETHODEN. PAPIERCHROMATOGRAFIE

Alvorens tot het eigenlijke structuuronderzoek over te gaan, dienden we een goede bereidingsmethode voor bongkrekzuur uit te werken. E e r s t nadat enige routine was opgedaan, konden we met de in dit laboratorium reeds bekende werkwijze bevredigende resultaten verkrijgen. Later werden nog versdiillende verbete-ringen in de bereiding aangebracht, waardoor de opbrengst aan-zienlijk werd verhoogd.

De methoden voor de bepaling van bongkrekzuur, welke het b e s -te bruikbaar bleken, waren respectievelijk op de ultravioletab-sorbtie, de optische activiteit en de antibiotische werkzaamheid gebaseerd.

Met behulp van de papierchromatografie werd aangetoond, dat het toegepaste isoleringsschema tot bongkrekzuur concentraten leidt, die als verontreiniging alleen enkele lagere vetzuren be-vatten.

1. B e r e i d i n g v a n b o n g k r e k z u u r

De eerste pogingen tot isolering vaui bongkrekzuur werden om-streeks 1930 door M e r t e n s en V a n V e e n 71, 72) in het voor-malige Nederlands-Indië ondernomen. Deze onderzoekers gingen aanvankelijk uit van bedorven en vergiftig geworden kokos. Later werd in het laboratorium een bereidingsmethode ontwikkeld, die de natuurlijke (fenstandigheden, waaronder bongkrekzuur ontstaat, min of meer nabootst.

De door genoemde onderzoekers aangegeven wijze van cultivering werd door ons op enkele punten gewijzigd; het principe e r -van, een aërobe cultuur van de nbongkrekbacterie" op ontvette kokos, bleef gehandhaafd. Door het aanbrengen van enkele ver-beteringen kunnen thans behoorlijke hoeveelheden, bijv. 2 g B . Z . per 2,5 kg kopra, worden geïsoleerd. Een uitgebreider onderzoek om de maxinaale produktievoorwaarden te vinden, werd niet opge-zet, daar de verkregen hoeveelheden reeds in de behoefte konden voorzien.

In het beginstadium van ons onderzoek hebben we de activiteit van onze preparaten uitgedrukt in nduivendosis" per ml (D.D. per ml). Deze eenheid van activiteit is door V a n V e e n en M e r -t e n s 108) ingevoerd. Bij la-tere proeven vonden we da-t 1 D.D. gelijk moet zijn aan ca 2,0 mg zuiver bongkrekzuur. In het ver-volg zullen we steeds direct de concentratie opgeven in mg B. Z. per ml. De activiteitseenheid (nduivendosis") is nl. in de litera-tuur onnauwkeurig gedefinieerd en daardoor niet goed bruikbaar.

a. D e n b o n g k r e k b a c t e r i e "

De voor de produktie van bongkrekzuur gebruikte bacterie,

Pseudomonas cocovenenans, is oorspronkelijk uit vergiftige kokos

geïsoleerd 72).

Bij de aanvang van dit onderzoek beschikte ons laboratorium nog over 2 cultures van P. cocovenenans op z. g. glycerine-agar. De samenstelling van de glycerine-agar is: 106)

1% glycerol; 1% pepton Witte; 2% agar; 0,25% K2HPO4; 0,25% MgS04; 0,1% CaClg en 0,1% NaCl.

Bij de bongkrekzuurbereiding was geen verschil tussen de twee aanwezige stammen te bemerken. Beide cultures gaven per keer (uitgaande van 2,5 kg kokos) gewoonlijk 400 tot 600 mg bongkrek-zuur. Daar de reeds geciteerde onderzoekers hogere opbrengsten bereikten, kregen we de indruk dat de stammen, wat betreft het vermogen tot B. Z.-produktie, waren achteruitgegaan. Na verloop van een half jaar bleken de opbrengsten zelfs nog geleidelijk klei-ner te worden.

Het was een gelukkige omstandigheid dat, naast de genoemde cultures, ook nog ampullen met in hoogvacuüm, boven P2O5, ge-droogde bacteriën aanwezig waren. Deze preparaten waren gedu-rende de jaren '36-'38 in Indië bereid en na de oorlog (in 1950) naar Delft gezonden. Een viertal stammen, 4 of 5 ampullen van elke stam, was beschikbaar. Het lag voor de hand, te onder-zoeken of de gedroogde bacteriën nog in leven waren en na te gaan of deze eventueel tot een betere bongkrekzuurproduktie in staat zouden zijn.

De eerste twee ampullen van de stam, die was aangeduid als MTI. 3C1 (1938)", gaven géén groei meer, doch uit het derde buisje met dezelfde stam kon een werkzame Pseudomonas

coco-venenans worden geïsoleerd. We gingen daarbij als volgt te werk:

De ampul werd opengebroken en met behulpvan een injectie spuitje gevuld met 1 ml vleesbouillon waarin 2% glycerol was opgelost. Het buisje werd nu direct afgesloten met een steriel wattenpropje en vervolgens gedurende 4 dagen bij 25° C bebroeii. Daarna werd een druppel van de cultuur op een Petrischaal met glycerine-agar uitgestreken. De plaat was na enkele dagen incuberen bij 30o c geheel bedekt met een bacterie, die een gele kleurstof produceer-de. Onder het microscoop waren korte, beweeglijke staafjes te zien, die dikwijls aan elkaar waren vastgegroeid. Dit waren aan-wijzingen dat inderdaad de gewenste bacterie aanwezig was. Een verdunde suspensie van deze bacterie werd opnieuw op een glyce-rine-agarplaat uitgestreken. Na 3 dagen cultiveren bij 30° C werd een goedgevormde, losliggende kolonie, die snel groeide en veel gele kleurstof produceerde, in een cultuurbuis met glycerine-agar afgestreken. Vervolgens werd weer 3 dagen bij 30o c geïncubeerd. De aldus verkregen bacteriestam werd verder elke 14 dagen over-geënt.

Gecultiveerd op 0,5 kg nampas" leverde de nieuw geïsoleerde bacterie 550 mg bongkrekzuur; de oude stam, onder precies de-zelfde omstandigheden op evenveel nampas" gekweekt, gaf slechts 200 mg. We kregen dus bijna drie maal grotere opbrengst dan voorheen'.

werden door vriesdroging geconserveerd: Een suspensie van de bacteriën in een gesteriliseerde melkpoederoplossing werd snel bevroren, waarna het ijs in hoogvacuüm werd verwijderd. We hebben nu, zodra de stam door het herhaaldelijke overenten itt

activiteit is verminderd, steeds weer de beschikking over een werkzame bacteriestam. Deze methodiek van vriesdroging (nlyo-philization") wordt in de microbiologie tegenwoordig veel toegepast om mutaties of verouderingsverschijnselen van m i c r o o r g a -nismen te voorkomen.

b. C u l t i v e r i n g s m e t h o d e

De bereidingsmethode van bongkrekzuur werd door ons in en-kele opzichten nog verbeterd.

Het uitgangsprodukt is, in de handel verkrijgbare, geraspte ko-pra. Gewoonlijk wordt een portie van 2,5 kg van dit produkt ge-bruikt. Het materiaal moet eerst gedeeltelijk worden ontvet (ko-pra bevat gemiddeld 66% vet). Hiertoe wordt de kokos enkele uren met leidingwater bij 60° C geweekt. Vervolgens wordt de brij, in ongeveer 10 porties, in een handdoek goed uitgeknepen; er ont-wijkt dan een melkachtige vetemulsie (nsanten"). Het uitgeperste produkt (nampas") wordt nog een tweede maal op dezelfde wijze met warm water behandeld. E r dient voor gezorgd te worden dat de achterblijvende nampas" precies de juiste vochtigheid krijgt. Is ze te droog, dan zal de bacterie niet willen groeien; te veel water is evenmin gewenst daar de cultuur dan spoedig in een natte brij verandert welke nauwelijks bongkrekzuur bevat. De ervaring heeft geleerd, dat de nampas" een rulle constitutie behoort 4e hebben en dat het watergehalte zodanig moet zijn dat uit een hoe-veelheid nampas", tussen de twee handen genomen, bij krachtig persen juist nog enkele druppels water vrijkomen.

Uit 2,5 kg kokos (kopra) krijgen we ongeveer 1,5 kg nampas". De nampas" werd in het begin van ons onderzoek eerst zo goed mogelijk gedurende 1 uur bij 100° c gesteriliseerd. Later bleek echter dat ook niet gesteriliseerde nampas", mits beent met een flinke hoeveelheid van een P. cocovenenans-cnlinwr, een uitste-kend resultaat geeft. Bongkrekzuur bezit antibiotische eigen-schappen zodat een sterke enting blijkbaar hinderlijke infecties onderdrukt.

De nampas" kan dus direct na de tweede persing over 15 glazen schalen (diameter 18 cm, hoogte 10 cm) worden verdeeld. Het ma-teriaal is nu in een dunne laag van 1 tot 2 cm, dus goed aëroob, uitgespreid. De kokos wordt dan geënt met 500 ml van een cultuur van de nbongkrekbacterie" in peptonwater — 2% glycerol (1 dag bij 30° C bebroed). Na goed omschudden worden de schalen met ge-sloten deksel bij 30° C gezet. De volgende dag is de nampas" meestal reeds duidelijk geel gekleurd door het gevormde toxofla-vine. De totale cultivering duurt 4 tot 5 dagen. Het materiaal in de schalen moet elke dag goed worden omgeschud en gelucht. Als de culture heldergeel is gekleurd, gewoonlijk is dit na 2 dagen het geval, wordt het deksel op een kiertje opengezet. Hierdoor wordt een goede luchttoetreding bevorderd, terwijl tevens een te nat worden van de nampas" wordt vermeden. Na ongeveer 4 dagen begint het produkt zich lichtbruin te kleuren. De deksels kunnen

nu geheel worden verwijderd. Door nog enkele dagen bij 30° C te laten staan, droogt de cultuur geheel uit. Dit droge materiaal kan gemakkelijker en met een hogere opbrengst worden opgewerkt dan een vochtiger produkt.

Men heeft wel enige ervaring nodig om met deze werkwijze een mooie cultuur te bereiden; doch wanneer voldoende routine is verkregen in het beoordelen van het uiterlijk en de kleur Vcin de kokos, dan treden slechts zelden mislukkingen op. De belangrijk-ste factoren schijnen wel de vochtigheid en de hoeveelheid be-schikbare zuurstof te zijn. Beide milieufactoren zouden bij voor-keur maximaal moeten zijn, maar bij de aanwezigheid van relatief veel water krijgen we een natte brij en dus weinig mogelijkheid tot zuurstoftoetreding, terwijl daarentegen bij een te droge cul-tuur de bacterie nauwelijks wil groeien.

c. I s o l e r i n g v a n b o n g k r e k z u u r

Het opwerken van de cultuur gaat vrij gemakkelijk: het mate-riaal wordt geëxtraheerd naet petroleumaether en de hierin opge-loste zuren worden vervolgens overgevoerd in een bicarbonaat-oplossing. Verdere concentratie en zuivering wordt bereikt door de waterige oplossing aan te zuren en dan met aether uit te schud-den. Door de aether nu opnieuw met porties bicarbonaatoplossing te schudden, wordt het bongkrekzuur weer als zout in waterige oplossing gebracht; in deze zwak alkalische oplossing is B.Z. vrijwel stabiel.

Met de volgende werkwijze worden de beste resultaten v e r k r e -gen: De uitgewerkte kokos cultuur (ca 1 kg) wordt in 2 wijdmondse E^Jopflessen van 5 1 gebracht. Daarna wordt zoveel petroleum-aether (k.p. 60-80° C) toegevoegd, dat het produkt geheel onder het extractiemiddel staat. Men laat deze flessen gedurende een dag staan, waarna een filtratie met een grote Büchnertrechter wordt uitgevoerd. Het petroleumaether-extract wordt 3 of 4 maal goed uitgeschud met porties van 50 ml 2%-ige bicarbonaatoplos-sing. Wanneer een waterig extract alkalisch blijft, is het bong-krekzuur geheel uit de petroleumaether verwijderd.

Het na de extractie overgebleven kokosmateriaal wordt opnieuw een dag onder verse petroleumaether weggezet. Vervolgens wordt weer gefiltreerd en het filtraat twee maal goed uitgeschud met 2%-ige bicarbonaatoplossing (porties van 50 ml).

De verschillende extracten v/orden verzameld (ca 250 ml) en aangezuurd met 2 N zwavelzuur; hierdoor ontstaat een dichte troebeling. De verkregen emulsie wordt direct met 250 ml p e r -oxydevrije aether geschud. Vervolgens wordt de aether oplossing 2 maal met water gewassen en nu op haar beurt grondig uitge-trokken met 25 ml-porties 2%-ige bicarbonaatoplossing. De con-centratie van het bongkrekzuur in de extracten wordt door meting van de optische draaiing bepaald. Vinden we géén optische activi-teit meer in een bepaalde portie, dan is dus ook de extractie vol-ledig.

De eerste portie van 25 ml, die bij het uitschudden van het bongkrekzuur uit de aether wordt verkregen, is meestal intensief geel gekleurd. Het zuiverste zijn gewoonlijk het 2e, 3e en 4e ex-tract.

De zwak a l k a l i s c h e B . Z . - o p l o s s i n g e n worden gewoonlijk bij 4 ° C in een i j s k a s t b e w a a r d . De a c t i v i t e i t blijft onder deze o m s t a n d i g -heden g e d u r e n d e e e n v r i j w e l o n b e p e r k t e tijd o n v e r a n d e r d .

E e n b a c t e r i e m e t een gunstige p r o d u k t i e geeft een o p b r e n g s t van c i r c a 2 g B . Z . p e r k e e r (dus p e r 2,5 kg k o p r a ) .

We k r e g e n bijv. bij een goed g e s l a a g d e c u l t u u r de volgende b i c a r b o n a a t e x t r a c t e n ( p o r t i e s van 50 ml) uit de twee p e t r o l e u m -a e t h e r o p l o s s i n g e n : Ie o p l o s s i n g I e 2e 3e e x t r a c t e x t r a c t e x t r a c t mg B . Z . / m l 20 11 2 t o t a a l mg B . Z . 1000 550 100 2e oplossing I e 2e e x t r a c t e x t r a c t 6 3 300 150 De 25 m l - p o r t i e s b i c a r b o n a a t o p l o s s i n g , die bij de e x t r a c t i e van de a e t h e r w e r d e n v e r k r e g e n , b e z a t e n bij deze proef de volgende c o n c e n t r a t i e s : e x t r a c t no mg B . Z . / m l t o t a a l mg B. Z . 1 14 350 2 2 1 52 5 3 2 1 5 2 5 4 13 3 2 5 5 10 2 5 0 6 3 75 7 0 0

De t o t a l e o p b r e n g s t was in dit geval dus 2050 mg B. Z .

2. B e p a l i n g s m e t h o d e n van bongkrekzuur

I n d e e e r s t e o n d e r z o e k i n g e n van V a n V e e n en M e r t e n s ^06) w e r d de a c t i v i t e i t van de p r e p a r a t e n alleen door d i e r p r o e v e n b e p a a l d . L a t e r werd ook wel van de o p t i s c h e activiteit gebruik g e m a a k t .

Wij hebben bij ons w e r k de c o n c e n t r a t i e van de m e e r g e c o n c e n -t r e e r d e o p l o s s i n g e n e v e n e e n s ui-t de o p -t i s c h e d r a a i i n g afgeleid, doch deze m e t h o d e i s voor verdunde o p l o s s i n g e n ( m i n d e r dan 0,5%) z e e r onnauwkeurig. We vonden nu, dat B . Z . een i n t e n s i e v e a b s o r b t i e in het u l t r a v i o l e t v e r t o o n t . Deze e i g e n s c h a p m a a k t e een bepaling in s t e r k v e r d u n d e o p l o s s i n g e n (tot ca 0,0002%) mogelijk. Het i s een gelukkige o m s t a n d i g h e i d , dat zowel de optische r o t a t i e a l s de u l t r a v i o l e t a b s o r b t i e van de c o n c e n t r a t e n alleen aan B.. Z . t o e g e s c h r e v e n moet w o r d e n . D a a r wij aanvankelijk niet z e k e r w a -r e n of de a b s o -r b t i e en de d -r a a i i n g wel geheel p a -r a l l e l liepen m e t de b i o l o g i s c h e a c t i v i t e i t van B . Z . , w e r d bovendien a l s c o n t r o l e een a n t i b i o t i s c h e b e p a l i n g s m e t h o d e u i t g e w e r k t .

a. O p t i s c h e a c t i v i t e i t

De m e t i n g van de o p t i s c h e d r a a i i n g van een oplossing gaat vlug, t e r w i j l in ons geval de r o t a t i e specifiek i s v o o r B . Z . De g e v o e l i g -heid en de n a u w k e u r i g h e i d van de bepaling zijn e c h t e r niet g r o o t .

De o p t i s c h e d r a a i i n g van een B . Z . o p l o s s i n g kan als volgt w o r -den g e m e t e n : E e n p o l a r i m e t e r b u i s wordt m e t de oplossing gevuld. (De ruwe e x t r a c t e n zijn m e e s t a l t r o e b e l , ze dienen d a a r o m e e r s t

te worden gefiltreerd. Ook daarna is de oplossing dikwijls nog niet geheel helder, zodat we korte polarimeterbuizen (1 = 1,0 of 0,5 dm) moeten gebruiken om nog voldoende lichtdoorlaatbaarheid te krijgen). De draaiing a wordt bepaald met natriumlicht bij ka-mertemperatuur. De concentratie c, uitgedrukt in mg B . Z . per ml, is bij bicarbonaatoplossingen:

_ 6,0 .a

Deze formule was eerst af te leiden, toen we het B. Z. zuiver hadden verkregen (hfdst. III). Een afgewogen hoeveelheid gezui-verd B. Z. werd toen opgelost in 8 ml van een 2%-ige bicarbonaat-oplossing en vervolgens werd de draaiing nauwkeurig gemeten. b. A b s o r b t i e in h e t u l t r a v i o l e t

Bongkrekzuur vertoont een sterke absorbtie in het ultraviolet.

1.

E

0.

200 250 300 " " f 350 F i g . 1. Ultravioletspectrum van bongkrekzuur

In fig. 1 is de extinctie weergegeven van een verdunde oplossing van B Z . in bicarbonaat (concentratie ca 0,01 mg B.Z. per ml). Beneden 300 mp, vindt dus een uitermate sterke absorbtie plaats, de naaxima liggen bij 263 en 239 raix.

Omdat we weten, met een onverzadigd zuur te maken te hebben, ligt het voor de hand deze absorbties toe te schrijven aan gecon-jugeerde dubbele bindingen; deze veroorzaken i m m e r s sterke ab-sorbties in het doorgemeten golflengtegebied (zie ook hfdst. VII.l).

De maxima bij 263 en 239 mu moeten beide door B . Z . worden veroorzaakt, daar de onderlinge verhouding van de extincties bij verdere zuivering steeds onveranderd blijft. Alle onderzochte preparaten, zowel de zuivere als de nruwe", gaven namelijk de-zelfde absorbtiekromme.

De betrekkelijk sterke absorbtie in het ultraviolet maakte de uitwerking van een nieuwe, gevoelige, kwantitatieve bepaling van B.Z. mogelijk.

Volgens de wet van B e e r is bij een bepaalde golflengte de extinctie evenredig met de concentratie volgens de formule:

E = e . c l .

E = extinctie = log ^

e = molaire extinctiecoëfficiënt c = concentratie in mol per 1

1 = doorsnee van het cuvetje in cm.

Voor kwantitatief werk kiezen we bij voorkeur de golflengte waarbij de absorbtie maximaal is, omdat dan de bepaling het ge-voeligst i s . Wij hebben het maximum van 263 m^igebruikt, daar dit iets karakteristieker lijkt voor het bongkrekzuur dan het veel meer optredende maximuna in de buurt van 240 m^i.

Allereerst werd nagegaan of de bongkrekzuuroplossingen wer-kelijk aan de wet van B e e r voldoen, dus of inderdaad de ex-tinctie evenredig is met de concentratie. We gingen uit van een oplossing in bicarbonaat van bekende concentratie. In maatkolven werden verschillende verdunningen bereid waarvan de absorbtie bij 263 mp. werd gemeten:

conc. in mg B . Z . / m l : 0,0046

extinctie bij 263 m^: 0,37 0,0134 _1,12 0,0186 _{1,43 2,16} 0,028 0,035 2,6 0,0095

0,70

Uit het bovenstaande is af te leiden dat c = 0,013. E263; de wet van B e e r geldt dus inderdaad.

De bepaling van de concentratie verloopt nu als volgt: Een klei-ne hoeveelheid van de B.Z. -oplossing (in bicarbonaat) wordt met gedestilleerd water verdund; stel dat 1 volume tot V maal het oor-spronkelijke volume is aangevuld. Vervolgens wordt de extinctie bij 263 mp. van deze verdunde oplossing in een kwartscuvetje van 1 cm breedte gemeten (met de nUnicam-spectrofotometer S. P. 500"). De sterkte van het oorspronkelijke preparaat, uitgedrukt in mg B . Z . per ml, is dan;

c = 0,013. E263- V c. A n t i b i o t i s c h e a c t i v i t e i t

eigen-schappen ten opzichte van verschillende micro-orgcinismen. Wij hebben daarom getracht een kwantitatieve bepaling van B . Z . met behulp van de antibiotische activiteit uit te werken. Wij zouden namelijk op deze wijze kunnen controleren of de biologische werk-zaamheid van B.Z. steeds correleert met de ultravioletabsorbtie en de optische draaiing.

De laatste tijd zijn verschillende methoden ter bepaling van de antibiotische activiteit uitgewerkt. Men kan bijvoorbeeld nagaan bij welke concentratie van het antibioticum in het agarmedium de afgestreken micro-organismen niet meer opkomen. Bij een ande-re test worden de monsters onderzocht in cilindertjes, welke op de tevoren geënte agar zijn geplaatst. Op de agarplaat kunnen ook kleine filtreerpapiertjes worden gelegd, die bevochtigd zijn met een bepaald volume van het te onderzoeken preparaat. Om de plaatsen, waar het antibioticum zich bevindt, verschijnen dan na de incubatie heldere zones. De grootte van deze ringen is afhan-kelijk van de concentratie en de diffusiesnelheid van het antibioti-cum, de gevoeligheid van het micro-organisme, de dikte van de agar, etc.

Laatstgenoemde zg. papiertjes-plaattest werd door ons nader onderzocht. In de eerste plaats werd nagegaan welke micro-orga-nismen gevoeligheid t . o . v . B . Z . bezitten. Hierbij werden de vol-gende uitkomsten verkregen:

Cladosporium cucumerinum = zeer gevoelig. Saccharom.yces cerevisiae = zeer gevoelig Bacillus subtilis = zeer gevoelig

Escherichia coli - weinig gevoelig Micrococcus pyogenes (var. aureus) = weinig gevoelig

Gist en B. subtilis zijn dus zeer gevoelig voor bongkrekzuur, doch bij de komkommerschimmel Cladosporium cucum.erinum komen nog verreweg de grootste heldere ringen voor onder de ge-kozen voorwaarden. In het vervolg is daarom uitsluitend deze schimmel als testorganisme gebruikt.

Cladosporium kan gemakkelijk bij 2 5° C worden gekweekt op

moutagarbuizen. Voor de testplaten gebruiken we evenwel een rijk voedingsmedium, waarop een snelle groei van de schimmel plaats vindt. Samenstelling: 2% ncorn steep liquor", 2% glucose; 3% nmatex" (rietmelasse); 2% agar en 0,1% MgS04. De ingrediën-ten oplossen in leidingwater, de pH zo nodig op 6,0 brengen en ge-durende 1 uur bij 110° C steriliseren.

Op de volgende manier kan de antibiotische activiteit van de B. Z.oplossingen worden onderzocht: 10 ml van het b o v e n b e -schreven medium wordt opgesmolten in kokend water. Daarna laat men 1 uur in een waterbad van 45° C afkoelen. De sporensus-pensie wordt bereid door 2 ml steriel water in een cultuurbuis met goed gesporuleerde Cladosporium te brengen en de sporen door krabben en schudden van het mycelium los te maken. De ver-kregen suspensie wordt vervolgens met het vloeibare agarmedium vermengd; het laatste mag beslist niet warmer dan 45° C zijn, daar de sporen tegen hogere temperaturen niet bestand zijn. Het mengsel wordt snel in een Petrischaal uitgegoten, waarna men de plaat in zuiver horizontale stand laat stollen. Inmiddels worden

op k l e i n e f i l t r e e r p a p i e r t j e s (0 5 m m ) , m e t een c a p i l l a i r p i p e t , g e lijke h o e v e e l h e d e n (0,0030,004 ml) van de te o n d e r z o e k e n o p -l o s s i n g g e b r a c h t . De p a p i e r t j e s worden v e r v o -l g e n s v o o r z i c h t i g op de afgekoelde a g a r p l a a t gelegd. Na 1 nacht incubatie bij 26° C zijn dan h e l d e r e zones op de licht t r o e b e l g e w o r d e n plaat te o n -d e r s c h e i -d e n . De -d i a m e t e r s van -de h e l -d e r e r i n g e n kunnen wor-den v e r g e l e k e n m e t die welke s t a n d a a r d o p l o s s i n g e n , op dezelfde plaat a a n g e b r a c h t , geven. Het gelukt m i n of m e e r r e p r o d u c e e r b a r e en k w a n t i t a t i e v e u i t k o m s t e n te v e r k r i j g e n , indien e r in het b i j z o n -d e r op wor-dt gelet -dat:

a) s t e e d s evenveel van hetzelfde a g a r m e d i u m wordt g e n o m e n , b) de a g a r volkomen h o r i z o n t a a l i s gestold in s c h a l e n met gladde b o d e m en m e t p r e c i e s dezelfde d i a m e t e r ,

c) gelijke volumina van de a n t i b i o t i s c h e o p l o s s i n g e n worden o p g e -b r a c h t .

Bij een b e p a a l d e proef k r e g e n we het volgende r e s u l t a a t : conc. in mg B . Z . p e r m l 0,00010 0 h e l d e r e r i n g in m m O 0 0,00028 7 0,070 26 0,35 31 0,0014 7 1,2 35 0, 3,5 37 0028 7 14,0 40 conc. in mg B . Z . p e r m l 0,0114 0 h e l d e r e r i n g in m m 16

De h e l d e r e zone i s dus i n d e r d a a d , u i t g e z o n d e r d bij de e x t r e e m lage c o n c e n t r a t i e s , bij de s t e r k e r e p r e p a r a t e n ook g r o t e r , doch a l l e e n in het gebied t u s s e n 0,01 en 1 mg B. Z . p e r ml i s een e n i g s -z i n s n a u w k e u r i g e , kwantitatieve bepaling mogelijk. In fig. 2 i s het v e r b a n d t u s s e n r i n g d i a m e t e r en c o n c e n t r a t i e w e e r g e g e v e n . iO mm 30 20 10 - ^ mg B Z / ^ i Fig. 2. IJkkromme voor de bepaling van bongkrekzuur m e t behulp

van C l ad o s p o r i u m «testplaten

De gevoeligheid van de a n t i b i o t i s c h e b e p a l i n g s m e t h o d e i s dus op één lijn te s t e l l e n m e t die van de u l t r a v i o l e t a b s o r b t i e - m e t i n g ; d a a r e c h t e r de antibiotische t e s t in ons geval t a m e l i j k onnauw-k e u r i g en tijdrovend i s , hebben we bij het v e r d e r e o n d e r z o e onnauw-k de v o o r k e u r gegeven a a n de s p e c t r o f o t o m e t r i s c h e w e r k w i j z e . De a n

-tibiotische eigenschappen van bongkrekzuur werden slechts dan nagegaan, als een nieuwe zuivering of bereiding van een tot dus-v e r r e onbekend deridus-vaat dit wenselijk maakte.

3. P a p i e r c h r o m a t o g r a f i e

De papierchromatografie werd toegepast teneinde een indruk te krijgen van het aantal componenten in onze preparaten. Deze werkwijze wordt de laatste tijd dermate veel gebruikt en is lang-zamerhand zo algemeen bekend geraakt, dat een bespreking van de grondslagen van de methode wel achterwege mag blijven. We kunnen derhalve volstaan m.et naar enige boeken over dit onder-werp te verwijzen: 6, 10, 16, 21, 64).

a. W e r k w i j z e

Op het filtreerpapier (nWhatman no l") worden de zuren min-stens 5 cm van de bovenrand van het papier op de nStartlijn" aan-gebracht. Het papier wordt vervolgens zodanig in een grote cilin-dervormige chromatografiebak opgehangen, dat het bovenste einde van de strip zich in een trog bevindt. Zodra het papier is geaccomodeerd kan loopvloeistof in deze trog worden gebracht. Na één nacht (16 uur) ontwikkelen bij kamertemperatuur is het vloeistoffront gewoonlijk ongeveer 40 cm van de startlijn gelegen. Het papier wordt dan uit de chromatografiebak genomen; vervol-gens wordt de loopvloeistof verwijderd, waarna de vlekken zicht-baar worden gemaakt door te bespuiten met een geschikt reagens.

De plaats van de vlekken zal door ons steeds worden aangegeven door de Rf-waarde, d.i. de afstand van de startlijn tot de vlek, gedeeld door de afstand startlijn-vloeistoffront (retardatiefactor). De Rf is voor een bepaalde stof, bij gebruik van dezelfde loop-vloeistof, ongeveer constant; toch komen zulke grote afwijkingen voor, dat niet uitsluitend de grootte van de Rf als een criterium bij een identificatie mag worden gebruikt. Wij hebben daarom steeds de vlekken van de onbekende stoffen vergeleken met die van bekende verbindingen, welke op dezelfde strip waren aangebracht. De Rf-waarden, die in vervolg zullen worden opgegeven, zijn der-halve gemiddelden; de variatie bedraagt ca 0,05.

b. O n t w i k k e l v l o e i s t o f f e n

Bij de onderzoekingen over de papierchromatografie van organische zuren is gevonden, dat slechts goede resultaten te b e r e i -ken zijn, indien de loopvloeistof zuur of alkalisch i s . In neutraal milieu is i m m e r s slechts een deel van het zuur gedissocieerd, waardoor anionen en vrij zuur met verschillende Rf in dezelfde oplossing voorkomen. Het resultaat is dan, dat er diverse vlek-ken of staarten ontstaan.

Overeenkomstig de verwachtingen, blijkt papierchromatografie van B.Z. alleen mogelijk met alkalische ontwikkelvloeistoffen. Daar B. Z. in zuur milieu in water onoplosbaar is, zal nl., als een zure loopvloeistof wordt gebruikt, de verdeling geheel ten gunste van de organische fase liggen.

beschre-ven 17, 54, 52, 65, 53, 51)^ w e r d e n e r d r i e n a d e r o n d e r z o c h t en wel: 1) n - b u t a n o l , v e r z a d i g d m e t 2 N a m m o n i a 92).

2) 80 vol % aethanol — 16 vol % water— 4 vol % g e c o n c e n t r e e r d e a m m o n i a 65).

3) 70 vol % n - p r o p a n o l - 30 vol % g e c o n c e n t r e e r d e a m m o n i a ^1). c. A a n t o n e n v a n d e z u r e n

Voor h e t aantonen van de z u r e n op het p a p i e r wordt gewoonlijk een i n d i c a t o r o p l o s s i n g g e b r u i k t . Wij kozen het s p u i t r e a g e n s van R e i d en L e d e r e r 92); 40 mg b r o o m c r e s o l p u r p e r wordt o p g e -l o s t in 100 m -l van e e n a e t h a n o -l - f o r m o -l m e n g s e -l , b e s t a a n d e uit 5 vol a e t h a n o l en 1 vol 40%-ige f o r m a l d e h y d e oplossing. Spuit m e n m e t dit r e a g e n s , dan wordt het gehele p a p i e r g e e l g e k l e u r d . Indien nu de s t r i p in verdunde a m m o n i a k d a m p wordt gehangen, dan k l e u r t h e t p a p i e r zich l a n g z a a m blauw. Op de p l a a t s van de z u r e n blijft e c h t e r de gele k l e u r b e s t a a n . D e vlekken m o e t e n o p d a t m o m e n t w o r d e n g e m a r k e e r d , d a a r bij v e r d e r e inwerking van NH3 het p a p i e r geheel blauw k l e u r t . Na u i t v o e r i g e p r o e v e n i s ons gebleken dat de bovengenoemde methode de g e v o e l i g s t e i s voor het aantonen van o r g a n i s c h e z u r e n op de s t r i p .

N a a s t deze p l a a t s b e p a l i n g , welke u i t s l u i t e n d op de z u r e e i g e n -s c h a p p e n b e r u -s t , kunnen ook m e e r -specifieke r e a c t i e -s op B. Z . worden gebruikt:

1) O n d e r een u l t r a v i o l e t l a m p geeft B . Z . e e n d o n k e r e vlek op h e t zwak f l u o r e s c e r e n d e p a p i e r .

2) Bespuiting m e t 0,5% KMn04 in 2N s o d a o p l o s s i n g geeft hij een o n v e r z a d i g d z u u r e e n b r u i n e vlek op p a a r s e a c h t e r g r o n d . Het p a -p i e r wordt e c h t e r s n e l g e h e e l b r u i n g e k l e u r d . B e t e r kan men h e t , r e e d s m e t het b r o o m c r e s o l p u r p e r - r e a g e n s b e h a n d e l d e , p a p i e r o v e r s p u i t e n m e t de p e r m a n g a n a a t o p l o s s i n g . De s t r i p wordt dan door de a l k a l i s c h e r e a c t i e van l a a t s t g e n o e m d e oplossing g e h e e l blauw g e k l e u r d . Spoedig wordt e c h t e r de i n d i c a t o r weggeoxydeerd en k o m t de b r u i n e k l e u r van het b r u i n s t e e n te v o o r s c h i j n . Op de p l a a t s van het B . Z . blijft evenwel de blauwe k l e u r b e s t a a n ; de i n d i c a t o r i s h i e r n a m e l i j k niet a a n g e t a s t , d a a r het p e r m a n g a n a a t door het B . Z . i s weggenomen. We kunnen dus e e r s t , d o o r te s p u i ten m e t b r o o m c r e s o l p u r p e r r e a g e n s , alle aanwezige z u r e n a a n tonen en v e r v o l g e n s op dezelfde s t r i p nagaan, welke van de g e v o n -den vlekken d o o r o n v e r z a d i g d e z u r e n wor-den v e r o o r z a a k t , d o o r m e t een a l k a l i s c h e p e r m a n g a n a a t o p l o s s i n g o v e r te s p u i t e n .

3) De a n t i b i o t i s c h e werking van de z u r e n op de s t r i p kan worden n a g e g a a n d o o r kleine r o n d j e s p a p i e r uit te p o n s e n of een l a n g e , s m a l l e s t r o o k uit t e knippen. Deze worden dan op een a g a r p l a a t gelegd, w a a r i n Cladosporiumsporen zijn g e s u s p e n d e e r d . Na i n -cubatie wordt, indien B . Z . aanwezig i s , een h e l d e r e zone op de plaat gevonden.

d. U i t k o m s t e n

De volgende r e s u l t a t e n w e r d e n m e t de v e r s c h i l l e n d e ontwikkel-vloeistoffen v e r k r e g e n :

1) Loopvloeistof: n-butanol— 2 N a m m o n i a (nbut - NH3") ^2) B e r e i d i n g : n b u t a n o l wordt m e t 2 N a m m o n i a v e r z a d i g d . We h e b -ben s t e e d s v e r s g e m a a k t e o p l o s s i n g e n g e b r u i k t .

onzuiver bongkrekzuur azijnzuur boterzuur capronzuur caprylzuur caprinezuur

Ic

De bongkrekzuurpreparaten kunnen het beste worden onder-zocht in ammoniakale oplossing. Met bicarbonaat krijgen we nl. een alkalische vlek, waardoor op die plaats met een indicator geen zuren meer zijn aan te tonen.

De B. Z.-oplossingen, die volgens het reeds beschreven isole-ringsschema worden verkregen, geven steeds drie vlekken met de volgende Rf-waarden: 0,32, 0,63 en 0,78. De vlek met de laagste Rf is de grootste en is enigszins uitgerekt. Deze vlek vertoont nu de specifieke B.Z. -reacties zoals absorbtie in het ultraviolet, reductie van een permanganaatoplossing en antibiotische activi-teit. Overigens is het papier, ook op de plaats waar zich de twee zuren met hogere Rf-waarden bevinden, ten opzichte van deze reacties negatief.

Wanneer enkele vetzuren, opgelost in 2 N ammonia, en een B. Z.-preparaat op één strip worden gechromatografeerd, krijgen we het volgende resultaat: (zie ook fig. 3).

Rf 0,32 0,63 0,76 0,15 0,34 0,63 0,75 0,79

De twee inactieve zuren, die in de ruwe B. Z.-preparaten voorkomen, hebben dus dezelfde Rf-waarden als de vetzuren met 6, 8 en 10 koolstof atomen. Onze oplossingen bevatten dus als verontreiniging

capronzuur, caprylzuur en wellicht ook nog hogere vetzuren.

Het is bekend, dat kokosvet r e -latief veel lagere vetzuren bevat; daarom is het begrijpelijk dat deze stoffen in onze preparaten aanwe-zig zijn.

De bongkrekzuurvlek is, zoals ook uit de figuur blijkt, enigszins uitgerekt. Het leek dus niet onmo-gelijk dat we te maken hadden met een mengsel van nauw verwante stoffen. Teneinde dit na te gaan hebben we gedurende langere tijd (65 uur) ontwikkeld (de loopvloei-stof druipt daarbij van het papier af). Na afloop werd echter opnieuw slechts één vlek gevonden die alle reacties op B.Z. vertoonde; deze vlek was 40 cm vanaf de startlijn gelopen.

Fig. 3. Papierchromatogram

De enkelvoudigheid van de B . Z . v l e k werd nog w a a r s c h i j n l i j k e r , toen ook m e t a n d e r e loopvloeistoffen, die e e n h o g e r e Rf g a -ven, s t e e d s s l e c h t s één p l a a t s w e r d gevonden, welke de voor B. Z . k a r a k t e r i s t i e k e r e a c t i e s v e r t o o n d e .

2) Loopvloeistof: aethanol — w a t e r — a m m o n i a 65).

S a m e n s t e l l i n g : 20 vol a e t h a n o l , 4 vol w a t e r en 1 vol g e c o n c e n -t r e e r d e a m m o n i a .

Met d e z e ontwikkelvloeistof geven r u w e B . Z . - p r e p a r a t e n twee vlekken, n l . een g r o t e vlek m e t Rf = 0,56 en een k l e i n e r e Rf = 0,72. E e r s t g e n o e m d e vlek blijkt van B . Z , afkomstig. O v e r i g e n s i s deze loopvloeistof niet zo g e s c h i k t , d a a r de vlekken dikwijls s l e c h t afgetekend zijn. Bij deze ontwikkelvloeistof dient het p a -p i e r te worden voorbehandeld ( g e w a s s e n m e t z u u r ) , teneinde géén l a s t te k r i j g e n van a l k a l i s c h e banden, die het aantonen van de z u -r e n b e m o e i l i j k e n .

3) Loopvloeistof: n p r o p a n o l — g e c o n c e n t r e e r d e a m m o n i a (nprop -NH3") 51).

De verhouding t u s s e n n p r o p a n o l en a m m o n i a kan worden g e v a r i e e r d , zodat deze ontwikkelvloeistof geschikt is v o o r alle m o g e -lijke z u r e n .

B o n g k r e k z u u r heeft bij g e b r u i k van n p r o p a n o l m e t 30 vol% g e c o n c e n t r e e r d e a m m o n i a een Rf van 0,54, t e r w i j l de v e r o n t r e i n i -gingen dan een Rf = 0,80 b e z i t t e n . De B . Z . -vlek a b s o r b e e r t w e e r o n d e r de u l t r a v i o l e t l a m p , r e a g e e r t met a l k a l i s c h e p e r m a n g a n a a t -oplossing en i s a n t i b i o t i s c h actief. De vlek is in deze loopvloeistof bijna r o n d , h e t g e e n dus een s t e r k e aanwijzing i s , dat ze van s l e c h t s één stof afkomstig i s .

De p a p i e r c h r o m a t o g r a f i e van B . Z . heeft ons dus de volgende b e l a n g r i j k e g e g e v e n s v e r s t r e k t :

a) De o n d e r z o c h t e b o n g k r e k z u u r p r e p a r a t e n bevatten s l e c h t s één z u u r , dat in het u l t r a v i o l e t a b s o r b e e r t , onverzadigd is en a n t i -b i o t i s c h e w e r k z a a m h e i d v e r t o o n t .

b) A l s v e r o n t r e i n i g i n g e n zijn d a a r n a a s t alleen kleine h o e v e e l h e d e n van v e t z u r e n m e t 6 tot 10 koolstof a t o m e n aanwezig.

H o o f d s t u k I I I

CHROMATOGRAFISCHE ZUIVERING VAN BONGKREKZUUR

Bij de isolering van bongkrekzuur, zoals deze in hoofdstuk II is beschreven, krijgt men een preparaat in handen, dat ook nog en-kele vetzuren bevat. Deze vetzuren gedragen zich, bij extracties etc., op dezelfde wijze als bongkrekzuur, waardoor het niet ge-makkelijk is, hen op een eenvoudige manier te verwijderen. Het weinig stabiele karakter van bongkrekzuur levert nog extra moei-lijkheden op. Door deze gevoeligheid is het noodzakelijk tijdens de verdere zuivering van bongkrekzuur steeds de nodige voor-zichtigheid te betrachten.

Als we de zuiveringsmethoden van bongkrekzuur beschouwen, die in de literatuur of in bepaalde op ons laboratorium aanwezi-ge verslaaanwezi-gen zijn beschreven, krijaanwezi-gen we sterk het vermoeden dat de onderzoekers geen juist idee hadden welke verontreinigin-gen in hun preparaten aanwezig waren, noch goede methoden be-zaten deze stoffen aan te tonen. De volgende werkwijzen worden in de diverse artikelen vermeld:

a. Extracties met chloroform uit waterig-alcoholische oplossin-gen bij verschillende pH 106).

b. Zuivering via het zilverzout 108).

c Adsorbtie aan Al (OH)3 C^ en daaropvolgende elutie 106). d. nCountercurrent-distribution" tussen een buffer van pH = 7,00, waarin 25% KCl is opgelost, en diisopropylaether 38).

De beschrijvingen van bovengenoemde bewerkingen laten te wensen over, zodat ze voor ons werk nauwelijks een basis bete-kenden.

De enorme ontwikkeling der c h r o m a t o g r a f i s c h e s c h e i -d i n g s m e t h o -d e n stelt ons thans in staat zelfs nauw verwante componenten van een mengsel afzonderlijk te isoleren 64, 16, 102). Het is dus welhaast vanzelfsprekend dat ook wij de chromatogra-fie te hulp hebben geroepen.

We hebben eerst enige proeven met een basische ionenwisse-laar verricht. Deze experimenten leverden echter weinig succes op. Met een z . g . nchromatopile" werden veel betere resultaten verkregen. Het bleek mogelijk te ontwikkelen met een ammonia-kale vloeistof, waardoor dus de kans op ontleding minimaal i s . Bij de zuivering van bongkrekzuur wordt deze werkwijze, die we uitgebreid zullen beschrijven, nog steeds toegepast.

De lagere vetzuren in onze preparaten zijn, in tegenstelling tot bongkrekzuur, vluchtig met waterdamp. Deze zuren zouden dus kunnen worden verwijderd door een stoomdestillatie uit te voeren, doch dan moet worden verhit in zuur milieu. Onder deze onastan-digheden gaat de activiteit van bongkrekzuur echter snel verloren. Het gehydrogeneerde zuur bleek daarentegen veel resistenter te zijn, dit z. g. hydrobongkrekzuur kan daarom, door een eenvoudi-ge stoomdestillatie toe te passen, van de vetzuren worden bevrijd;

hierbij is dus een zuivering met de nchromatopile" overbodig (zie, verder hfdst. V, 1).

1. A d s o r b t i e v a n b o n g k r e k z u u r a a n n A m b e r l i t e . IR - 4 B "

Een ionenwisselaar is, zoals bekend mag worden verondersteld, een fijn verdeelde, onoplosbare, vaste stof met vele ionogene groepen, welke hun ionen met die van een elektrolytoplossing kunnen uitwisselen 62, 95, 79, 25)

De bereikte evenwichten kunnen dikwijls nog het beste worden beschreven met behulp van de wet van de massawerking 13). De ionenwisselaar reageert dan dus uitsluitend als een nvast elek-trolyt". In tal van gevallen spelen echter ook andersoortige ad-sorbties een rol, bijv. V a n d e r W a a l s e krachten. Het ge-drag van een bepaalde ionenwisselaar t . o . v . een elektrolyt is moeilijk te voorspellen, dit geldt in het bijzonder voor organische verbindingen.

Als zuur zal bongkrekzuur alleen door basische ionenwisselaars worden opgenomen. Daar bongkrekzuur, vergeleken met de aan-wezige vetzuren, een redelijk grote aciditeit bezit, werd een zwak basische ionenwisselaar gekozen. Wij hebben gebruik gemaakt van nAmberlite I R - 4 B"; deze zwak basische ionenwisselaar is uitvoerig beschreven door K u n i n en M y e r s 61)

Voor de conditionering werd de ionenwisselaar enkele malen opgeroerd met 1 N NaOH-oplossing en daarna uitgewassen met gedestilleerd water tot het waswater neutraal reageerde.

Bij de adsorbtieproeven werd gewerkt met een kleine chroma-tografiebuis (10 cm lang, diameter 0,8 cm), welke was gevuld met ongeveer 4 g nAmberlite IR - 4 B " . Het volume van de ionen-wisselaar was bijv. 3,0 ml; het nbedvolume" 8,5 ml. De door-voersnelheid bedroeg bij alle proeven 10 ml per uur.

Een neutrale, waterige oplossing van het natriumzout van bong-krekzuur werd door de kolom gevoerd, waarna werd nagewassen met water. Uit de bepalingen, verricht met behulp van de ultra-violetabsorbtie, bleek, dat het bongkrekzuur zich geheel in het eluaat bevond. In overeenstemming met de verwachtingen, bij pH = 7 is de capaciteit van zwak basische ionenwisselaars gering, vindt dus in neutraal milieu géén absorbtie van bongkrekzuur plaats.

Teneinde een betere binding te verkrijgen, moesten we dus bij een lagere pH gasin werken. Daar het vrije zuur in water onop-losbaar i s , waren we aangewezen op het gebruik van verdunde al-coholische oplossingen.

De kolom met de ionenwisselaar werd voorbereid door een b e -handeling met 70%-ige aethanol. Daarna werd 24 ml van een op-lossing van bongkrekzuur in 70%-ige alcohol (concentratie 1,55 mg per ml) doorgevoerd. De kolom werd nagewassen met 24 ml 70%-ige alcohol. De eluaten bleken bij deze proef praktisch géén bongkrekzuur (slechts 0,03 mg/ml) te bevatten, zodat nu waar-schijnlijk wel een goede adsorbtie had plaatsgevonden. Nadat ge-destilleerd water door de kolom was gevoerd om de alcohol te

verdringen, werd geëlueerd haet een serie buffers met opklim-mende pH (vanaf pH = 6,0 tot 13,0):

pH van de buffer 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11.0 12,0 13,0 13,0 13,0 m l eluaat 15 15 15 15 15 20 20 20 2 0 5 conc. in mg B. Z . / m l van het eluaat

0,00 0,00 0,00 0,01 0,05 0,18 0,56 0,69 0,30 0,09 t o t a a l mg B . Z . 0 0 0 0 , 1 0,7 3,6 11,2 13,8 6,0

0,4 1

Uit de tabel blijkt dat merkwaardigerwijs voor de elutie een on-verwachte hoge pH nodig is: eerst bij een pH van 12 è 13 wordt het bongkrekzuur vlot geëlueerd. Bij zwak basische ionenwisse-laars is evenwel bij een pH hoger dan 7 geen elektrostatische bin-ding meer mogelijk. In ons geval hebben we dus zeker niet met een ionenwisseling te maken, doch met een sterke adsorbtie.

We constateren dus een opmerkelijk verschijnsel: Bongkrek-zuur wordt in neutraal noilieu door nAmberlite I R - 4 B" niet op-genomen, doch is het zuur eenmaal geadsorbeerd, dan zijn sterk alkalische oplossingen nodig om de stof weer te kunnen elueren. Een analoog geval vindt men bij de adsorbtie van het (vrij grote) kininemolecule aan zwak zure ionenwisselaars 18).

De sterke adsorbtie van bongkrekzuur aan het skelet van de ionenwisselaar maakte een verder onderzoek in deze richting wei-nig aanlokkelijk.

2. Z u i v e r i n g m e t e e n p a p i e r k o l o m

Bij de verdelingschromatografie van organische zuren wordt dikwijls silicagel als drager gebruikt 78,50,89). Deze methode lijkt misschien erg aantrekkelijk, maar in de praktijk is gebleken dat de bereidingswijze van de silicagel een grote invloed heeft op haar eigenschappen; veelal komt men tot de onaangename v e r r a s -sing, dat het bereide produkt voor chromatografische scheidingen ongeschikt i s . Omdat de papierchromatografie goede resultaten had opgeleverd (zie hfdst. 11,3), hebben we getracht, een analoge scheiding op preparatieve schaal uit te voeren. Een kolom met cellulosepoeder bijv. zou wellicht goed kunnen voldoen 6). Enkele andere werkwijzen benaderen de echte papierchromatografie nog meer: zo kan een pak op elkaar geperste strips filtreerpapier worden gebruikt, een z. g. itchromatopack" 86) of een stapel s t e -vig op elkaar gedrukte kleine filtreerpapiertjes: een nchromato-pile" 75, 103, 117, 32). In het eerste geval loopt de vloeistof in het vlak van het papier; bij een nchromatopile" laat men daarentegen de vloeistof loodrecht op de papiertjes percoleren.

Laatstgenoemde methode werd door ons nader onderzocht. De-ze keuDe-ze is bijzonder gelukkig geweest, want niet alleen verkrij-gen we thans met de nchromatopile" uitstekende scheidinverkrij-gen, maar tevens kunnen betrekkelijk grote hoeveelheden stof in één zuive-ring worden verwerkt.

De door ons gebruikte filtreerpapiertjes (nSchleicher enSchOlL No 595") hebben een diameter van 5,5 cm. De papiertjes dienen van te voren achtereenvolgens goed te worden gewassen met de loopvloeistof en met 0,5 N ammonia; hierbij wordt o. a. een gele kleurstof verwijderd. Daarna worden ze aan de lucht gedroogd.

De papiertjes kunnen verschillende malen dienst doen. We nemen zelfs bij voorkeur enkele malen gebruikte papiertjes daar deze veel schoner en soepeler zijn.

De loopvloeistof is n-butanol, verzadigd met 2 N ammonia. De-ze oplossing dient steeds vers te worden bereid.

In de voorlopige proeven gebruikten we een eenvoudige opstel-ling, waarbij de stapel papier op een gladde, geperforeerde por-celeinen plaat was ondergebracht in een cilindervormige ruimte (zie fig. 4). De ontwikkelvloeistof werd aan de bovenzijde inge-voerd met een scheitrechter via een omgekeerde BOchner, waar-van de rand tot op de zeefplaat was afgeslepen.

Met dit apparaat konden alleen behoorlijke resultaten worden verkregen, indien op de scheitrechter nog een gewicht van 1 kg was geplaatst. De opstelling werd dan echter wel enigszins wan-kel, terwijl de stapel ook de neiging vertoonde, scheef te zakken.

Deze bezwaren brachten ons er toe, naar een steviger apparaat uit te zien. Een uitstekend bruikbaar toestel werd door ir J. IJlstra ontworpen. Dit toestel is in fig. 5 schematisch afgebeeld. De sta-pel papier (A) is hier ingeklemd tussen twee tot op de zeefplaat afgeslepen Büchnertrechters (B). De kolom bevindt zich in een glazen cilinder (C), die aan weerszijden is afgesloten door twee rubberplaatjes (D). De beide trechters zijn verbonden door een viertal stangen (E) met schroefdraad. Door de schroeven (F) aan te draaien wordt de stapel tussen de Büchners stevig samenge-drukt. De gebruikte papierkolom bestaat, van boven naar beneden, uit: 50 papiertjes (p 5,5 cm), vervolgens 50 stuks met diameter 4,5 cm waarop de stof is aangebracht en tenslotte opnieuw pa-piertjes van 5,5 cm (ongeveer 500 stuks). Het bovenste stapeltje dient om de stroom gelijkmatig te verdelen. De papiertjes, waar-in zich de stof bevwaar-indt, zijn iets klewaar-iner van diameter genomen teneinde de randeffecten te verzwakken.

De zuivering van de bongkrekzuuroplossingen verloopt als volgt: Het ruwe B.Z. -preparaat wordt aangezuurd met 2 N zwavelzuur, waarna de gevormde troebeling in aether wordt opgenomen. De aetherische oplossing wordt vervolgens, na twee maal met water gewassen te zijn, met 5 ml verdunde ammonia uitgeschud. De verkregen ammoniakale oplossing van bongkrekzuur wordt op een stapeltje van de kleine filtreerpapiertjes (0 4,5 cm) gedruppeld. Het natte stapeltje wordt enige uren aan de lucht bewaard; daarna worden de papiertjes uitgespreid om verder te drogen. Zodra de papiertjes uiterlijk goed droog lijken, kan de kolom worden s a-mengesteld en in het chromatografie-apparaat worden gebracht, E r moet hierbij vooral op worden gelet, dat de stapel keurig recht en met regelmatige verdeling van de druk tussen de beide Büch-nertrechters wordt ingeklemd. Dit is noodzakelijk teneinde rechte banden te verkrijgen. De scheitrechter van het apparaat wordt vervolgens met de ontwikkelvloeistof gevuld. Als zodanig wordt de organische fase van een goed geschud mengsel van 150 ml n-butanol en 50 ntil 2 N ammonia gebruikt. We laten nu voorzichtig en met een zo klein mogelijke snelheid de loopvloeistof toestro-men, die dan langzaam door de stapel papiertjes percoleert. Al-leen als het vloeistoffront horizontaal blijft, is de opstelling goed en mag een bevredigende uitkomst worden verwacht. De gehele

kolom is na verloop van 6 tot 8 uur geheel doordrenkt, daarbij is dan ongeveer 100 ml ontwikkelvloeistof gebruikt. Bij verdere suppletie druppelt dus de vloeistof onder uit het apparaat. In ons geval is het gunstig gebleken de toevoer af te sluiten nadat ca 150 ml loopvloeistof is toegediend.

Na de ontwikkeling wordt het apparaat geopend en de natte sta-pel papier er uit gehaald. Om de plaats van de bongkrekzuurband te vinden, worden nu op gelijke afstanden 16 papiertjes uit de fipile" genomen. Deze worden gedroogd, waarna op verscheidene manieren het gehalte aan B. Z. kan worden bepaald:

a) Het papiertje wordt in een reageerbuis geëxtraheerd met 5 ml 0,5 N ammonia. In het extract kan dan de ultravioletabsorbtie bij 263 m|i worden gemeten. De verdeling van B . Z . over de papier-kolom, bij de zuivering van ca 85 mg van het zuur, is in fig. 6 weergegeven.

stapeltje nö

F i g . 6. Verdeling van bongkrekzuur over e e n papierkolom (ontwikkelvloeistof: n - b u t a n o l - 2 N a m m o n i a ) ,

b) De plaats van de bongkrekzuurband kan ook worden vastgesteld door de naast elkaar opgeprikte papiertjes te bespuiten met ver-dunde, alkalische ksdiumpermanganaatoplossing.