TECHNIKI WYKRYWANIA WIRUSÓW GÓRNYCH DRÓG
ODDECHOWYCH
DETECTION METHODS FOR UPPER RESPIRATORY TRACT VIRUSES
STRESZCZENIE: W pracy omówiono znaczenie diagnostyki wirusologicznej w zakażeniach górnych dróg oddechowych. Wskazano na jej znaczenie zwłaszcza w niektórych grupach pa-cjentów, takich jak: biorcy przeszczepów, chorzy z upośledzonym układem odpornościowym oraz osoby hospitalizowane. Przedstawiono możliwości i ograniczenia wykorzystania techniki izolacji, metod serologicznych oraz biologii molekularnej, a także omówiono możliwe trudno-ści przy interpretacji wyników.
SŁOWA KLUCZOWE: diagnostyka laboratoryjna, górne drogi oddechowe, wirusologia labora-toryjna, zakażenia wirusowe
ABSTRACT: It was presented the significance of diagnosis of viral upper respiratory tract infec-tions. We have pointed out its importance, especially in some groups of patients, such as: trans-plant recipients, immunocompromised and hospitalized patients. The opportunities and limi-tations of the isolation, serological and molecular techniques were shown, as well as the possi-ble difficulties in results interpretation were discussed.
KEY WORDS: laboratory medicine, upper respiratory tract, viral infections, virology
1 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego Samodzielnego Publicznego Dziecięcego Szpitala Klinicznego w Warszawie 2 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej
i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego
} SZYMON KIERAT
Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego,
Samodzielny Publiczny Dziecięcy Szpital Kliniczny,
ul. Żwirki i Wigury 63A, 02-091 Warszawa, Tel.: (22) 317 95 11, e-mail: szymon.kierat@spdsk.edu.pl Wpłynęło: 16.11.2015 Zaakceptowano: 29.11.2015 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2015066
WSTĘP
Ostre infekcje górnych dróg oddechowych należą do naj-powszechniejszych i najczęstszych zakażeń u ludzi. Infekcje tego typu w populacji dorosłych występują średnio 2–3 razy w roku, a u młodszych dzieci – dwukrotnie częściej. Same rynowirusy – główna przyczyna przeziębień – prawdopo-dobnie powodują więcej zakażeń u ludzi niż jakikolwiek inny patogen, chociaż tylko połowa z nich ma charakter ob-jawowy [1–3].
Pomimo że infekcje te mają zazwyczaj łagodny prze-bieg, ich powszechność i częstość generuje istotne kosz-ty społeczne, wynikające m.in. z absencji chorobowej pra-cowników. W 2013 roku ostre zakażenia górnych dróg od-dechowych o umiejscowieniu mnogim lub nieokreślonym (ICD-10: J06), wraz z ostrym zapaleniem nosa i gardła
(przeziębieniem, J00), były powodem prawie 12,5 miliona dni nieobecności w pracy z powodu choroby własnej ubez-pieczonych [4].
Zakażenia górnych dróg oddechowych objawiają się za-paleniem: gardła, nagłośni, krtani, migdałków podniebien-nych, jam nosowych i zatok przynosowych [5]. Infekcje te mogą być wywoływane zarówno przez bakterie, grzyby, jak i przez wirusy, jednak to właśnie wirusy są czynnikiem etio-logicznym większości tego typu chorób. Może się zdarzyć, że zapalenia górnych dróg oddechowych mają przyczynę nieinfekcyjną i wynikają z działania czynników drażniących lub alergenów. Ponadto niektórym uogólnionym patolo-giom mogą towarzyszyć objawy grypopodobne.
Wśród czynników wirusowych za infekcje górnych dróg oddechowych odpowiadają zarówno wirusy RNA (rynowi-rusy, enterowi(rynowi-rusy, koronawi(rynowi-rusy, wirusy paragrypy, wirus
RSV (ang. respiratory syncytial virus, wirus syncytialny oddechowy), wirusy grypy, ludzkie metapneumowirusy (ang. human pneumovirus – hMPV)), jak i DNA (adenowi-rusy, bokaparwowirusy). Wirusy te różnią się nie tylko bu-dową i przynależnością systematyczną, lecz także patogen-nością. Oprócz wspólnej cechy wywoływania zakażeń gór-nych dróg oddechowych, w niektórych przypadkach powo-dują również infekcje w innej lokalizacji, także o poważniej-szym przebiegu i rokowaniu, np.:
t adenowirusy – nieżyty żołądka i jelit;
t enterowirusy – zapalenia mózgu i opon mó-zgowo-rdzeniowych;
t koronawirusy, wirusy paragrypy i metapneumowi-rusy – zapalenia płuc;
t wirusy RSV – ostre martwicze zapalenie dróg odde-chowych.
Przedstawiona lista wirusów odpowiedzialnych za infek-cje górnych dróg oddechowych jest najprawdopodobniej niepełna. Stosując różne techniki – w tym biologii moleku-larnej – udaje się wykryć i zidentyfikować czynniki etiolo-giczne 42–73% zakażeń. Może to wynikać nie tylko z jakości pobranych próbek czy ograniczeń metod, lecz także z fak-tu, iż część infekcji wywołują nieznane jeszcze patogeny [2]. W rutynowej diagnostyce wirusowych zakażeń górnych dróg oddechowych rozpoznanie ustala się w oparciu o ba-danie przedmiotowe i podmiotowe, a diagnostyka laborato-ryjna nie jest wymagana [6]. W okresie epidemicznego wy-stępowania grypy dodatnia wartość predykcyjna dla roz-poznań ustalonych bez potwierdzenia laboratoryjnego się-ga aż 79–87%, zaś ujemna wartość predykcyjna – 39–75%. Dodatnia wartość predykcyjna rozpoznania grypy w opar-ciu o badanie lekarskie, niezależnie od aktywności wirusa, przyjmuje przedział 18–87% w stosunku do rozpoznań po-twierdzonych wirusologicznie [3].
Mimo że w przypadku wirusowych infekcji górnych dróg oddechowych badanie lekarskie – w przeciwieństwie do ba-dania laboratoryjnego – nie pozwala na ustalenie rozpo-znania etiologicznego, identyfikacja gatunkowa patogenu wirusowego nie jest najczęściej potrzebna. W zakażeniach tych powszechnie stosuje się terapie nieswoiste: pacjento-wi zaleca się leżenie w łóżku oraz przyjmowanie leków ła-godzących objawy. Leczenie swoiste jest dostępne dla grypy typu A (amantadyna, rybawiryna) oraz dla typów A i B (za-namiwir, oseltamwir). Zanamiwir oraz oseltamiwir są sku-teczne, jeśli terapię rozpocznie się do 24–48 godzin od po-czątku choroby. U dzieci w ciężkich przypadkach zakażeń RSV można stosować rybawirynę.
Badania wirusologiczne, o ile są szybko wykonane, mają znaczenie również w przypadku, gdy istnieje potrzeba izo-lacji chorych w szpitalach (w celu ograniczenia możliwości szerzenia się choroby wśród pacjentów i personelu). Dzie-ci zakażone RSV – patogenem wysoce zaraźliwym i zakaź-nym – są izolowane po przyjęciu do placówki szpitalnej,
ponieważ rozprzestrzenienie się tego wirusa na oddziale dziecięcym może przyczynić się do zachorowania niemal każdego pacjenta oddziału [7, 8]. Podobne ryzyko i sposób postępowania dotyczy zakażeń koronawirusem SARS-CoV i wirusami grypy w szpitalach oraz w placówkach opie-kuńczych.
DIAGNOSTYKA WIRUSOLOGICZNA
W diagnostyce wirusologicznej wykorzystuje się tech-niki pośredniego i bezpośredniego wykrywania zaka-żeń. Do pierwszej grupy należą metody serologiczne opar-te na deopar-tekcji przeciwciał. Techniki bezpośrednie polegają na: wykrywaniu wirusowych antygenów, izolacji wirusów na liniach komórkowych albo zwierzętach, wykrywaniu wi-rusowych kwasów nukleinowych lub obserwacji wirionów w mikroskopie elektronowym.
Materiałem do badań wirusów górnych dróg oddecho-wych w przypadku wykorzystania metod izolacji i technik molekularnych jest wymaz z miejsca chorobowo zmienio-nego (najczęściej gardła lub nosogardła) lub popłuczyny no-sowo-gardłowe. Materiał pobiera się w czasie występowania objawów chorobowych, ponieważ okres zakaźności (wyda-lania zarazka) może być ograniczony do kilku dni. Wyma-zówkę z materiałem transportuje się zawieszoną w jałowym płynie Hanksa lub buforowanej soli fizjologicznej (PBS-ie). Jeśli materiał jest przeznaczony do badań molekularnych, probówka i płyn transportowy muszą być wolne od DNA-az i RNA-az, zaś wymazówka musi być wolna od inhibitorów polimeraz (wykorzystuje się wymazówki z tworzyw sztucz-nych, a nie z waty). Próbki transportuje się w temperaturze 2–8°C.
Jeśli zakażeniu towarzyszy wiremia, technikami biolo-gii molekularnej można wykrywać wirusy również we krwi. Stan ten dotyczy jednak głównie pacjentów z obniżoną od-pornością, jest przejściowy i nie występuje zawsze.
Do badania przeciwciał pobiera się krew „na skrzep”, z której uzyskuje się surowicę.
IZOLACJA
Wykorzystanie izolacji na liniach komórkowych, hodow-lach narządowych lub historycznie na oseskach ssaczych albo zalężonych jajach jest możliwe, jednak jest to badanie kosztochłonne, realizowane tylko w niektórych, dobrze wy-posażonych laboratoriach. Ponadto w przypadku izolacji niektórych wirusów, takich jak SARS-CoV, wymagana jest pracownia o 3. poziomie bezpieczeństwa biologicznego [9].
W przypadku zastosowania metody izolacyjnej ko-nieczne jest wykorzystanie różnorodnych linii komórko-wych, gdyż nie istnieje jedna uniwersalna linia dla wszyst-kich wirusów górnych dróg oddechowych (Tabela 1). Jest
to technika bardzo wrażliwa na nieprawidłowości – za-równo przy pobraniu oraz podczas transportu materiału, jak i w procedurze laboratoryjnej – dlatego wyniki ujemne nie wykluczają zakażenia. Ponadto nie znaleziono dotąd li-nii komórkowych dla bokaparwowirusów, opisywano tak-że trudności i niepowodzenia w hodowli niektórych seroty-pów enterowirusów oraz ludzkiego metapneumowirusa [2, 3, 10]. Podobnie namnażaniu wirusa w hodowli nie zawsze towarzyszy efekt cytopatyczny, a nawet jeśli – niekoniecz-nie ma on swoisty charakter. Z tego względu często izolacja jest pierwszym etapem diagnostyki, który dostarcza mate-riału do badań serologicznych lub molekularnych. Izolacja jest metodą czasochłonną, wymagającą nawet 14-dniowego prowadzenia. W niektórych przypadkach – np. przy małej zawartości wirusa w materiale – w celu uzyskania dodatnie-go wyniku hodowlę taką należałoby prowadzić kilka tydodatnie-go- tygo-dni dłużej [3, 10–12].
Wykorzystanie mieszanych linii R-Mix i R-Mix Too do diagnostyki zakażeń wirusami grypy A i B, RSV, para-grypy 1–3, adenowirusami i metapneumowirusami pozwa-la znacznie skrócić czas trwania badania – do 24 godzin w przypadku grypy i do 48 godzin w pozostałych infekcjach. Metoda ta w końcowym etapie wymaga również wykorzy-stania swoistych surowic w celu wykazania obecności i/lub identyfikacji wirusów [11, 12].
METODY SEROLOGICZNE
Wykrycie wirusowych antygenów oraz swoistych przeciw-ciał w surowicy może dostarczyć dowodów zakażenia i ziden-tyfikować czynnik etiologiczny. Zwłaszcza wykrywanie anty-genów ma duże znaczenie w diagnostyce, gdyż diagnostyka poziomu przeciwciał w surowicy wymaga wykrycia przeciw-ciał klasy M (IgM), obecnych po około 9 dniach od zakażenia lub potwierdzenia serokonwersji, porównując miana prze-ciwciał klasy G (IgG) w ostrym okresie choroby i w czasie re-konwalescencji [10]. Ograniczeniem dla stosowania tych me-tod jest czas 1–2 tygodni. Znamienny wzrost miana przeciw-ciał jest mocnym dowodem związku przyczynowo-skutkowe-go między patogenem a występującymi objawami.
Wykrycie wirusowych antygenów stanowi dowód obec-ności patogenu i zakażenia. W tym celu wykorzystuje się testy: immunochromatograficzne, immunoenzymatyczne oraz immunofluorescencyjne. Cechują się one zróżnicowa-ną czułością i swoistością, zależnie od metodyki oraz gatun-ku wirusa. Zaletą testów immunochromatograficznych jest krótki czas analizy, wynik uzyskuje się nawet w ciągu 15 mi-nut [3, 10].
Ograniczeniem w metodach serologicznych są potencjal-ne reakcje nieswoiste, efekt wysokiej dawki i możliwa degra-dacja antygenów. W celu uniknięcia zniszczenia antygenów, badania należy prowadzić niezwłocznie po pobraniu ma-teriału. Dodatkowo należy pamiętać o: powszechnym wy-stępowaniu wielu serotypów u większości gatunków wiru-sów górnych dróg oddechowych, ich zmienności antygeno-wej oraz o tym, że większość dorosłych osób posiada prze-ciwciała przeciwko wielu gatunkom i serotypom wirusów górnych dróg oddechowych. Dodatkowo u chorych z czę-stymi, nawracającymi infekcjami problematyczne może być uchwycenie znamiennego wzrostu miana przeciwciał [10].
Dla niektórych wirusów (grypy A i B, paragrypy 1–3, RSV, metapneumowirusów, adenowirusów) dostępne są ko-mercyjne zestawy testowe, oparte na wykrywaniu antyge-nów. Dla rynowirusów brak jest takich testów z powodu braku wspólnego antygenu w obrębie gatunku.
Dostępne są również zautomatyzowane analizatory i de-dykowane im zestawy testowe, które jednocześnie wykry-wają antygeny wyżej wymienionych wirusów oraz pacior-kowca Streptococcus pneumoniae [13]. Łatwość ich stoso-wania, podobnie jak i testów immunochromatograficznych, daje szansę wykorzystania tych testów poza laboratorium, np. w miejscu opieki nad pacjentem (ang. point of care te-sting – POCT), przy czym w Polsce wprowadzenie takiej praktyki wymagałoby zmiany prawa [14, 15].
METODY MOLEKULARNE
Badania oparte na metodach molekularnych cechują się wysoką czułością i swoistością, a także potencjalną możli-wością prowadzenia jednocześnie pogłębionej diagnostyki,
Wirus Linia komórkowa
Adenowirusy HeLa, linie ludzkich komórek zarodkowych, A549, HEp2, KB, HEK Rynowirusy WI-38, MRC-5
Enterowirusy (niepoliomielityczne) MRC-5, MK, BGM, HEK Koronawirusy: 229E NL63 SARS-CoV MRC-5 LLC-MK2, Vero-B4 Vero E6
Wirusy paragrypy LLC-MK2, BGMK, A549, MRC-5 Wirus syncytialny oddechowy (RSV) Hep-2, HeLa, A549
Wirusy grypy Pierwotne linie nerek małpich, Madin-Darby (MDCK), LLC-MK2 Ludzki metapneumowirus Trzeciorzędowa linia nerek małpich, LLC-MK2
Tabela 1. Wybrane linie komórkowe stosowa-ne w izolacji wirusów górnych dróg oddecho-wych.
np. typowania lub wykrywania czynników wirulencji. Tech-niki te opierają się na wykrywaniu wirusowego DNA lub RNA najczęściej dzięki wcześniejszej amplifikacji poszu-kiwanego genu. Do najpowszechniejszych metod nale-ży łańcuchowa reakcja polimerazy (ang. polymerase cha-in reaction – PCR) oraz – dla wirusów RNA – łańcucho-wa reakcja polimerazy z odwrotną transkrypcją (ang. re-verse transcriptase PCR – RT-PCR). Istnieje wiele modyfi-kacji PCR i RT-PCR, między innymi: PCR w czasie rzeczy-wistym (ang. real-time PCR), gniazdowa PCR (ang. nested PCR), multipleks PCR (ang. multiplex PCR). RT-PCR jest o 5–10% czulszą metodą niż izolacja [3]. Spośród nowszych metod wykorzystanie znalazły metoda izotermicznej ampli-fikacji DNA (ang. loop-mediated isothermal amplification – LAMP), LAMP z odwrotną transkrypcją oraz testy dia-gnostyczne wykorzystujące wzmocnienie oparte na sekwen-cji kwasu nukleinowego (ang. nucleic acid sequence-based amplification – NASBA, izotermiczna replikacja RNA przy udziale fagowej polimerazy RNA, rewertazy i RNA-azy H z zastosowaniem sond lub z detekcją, np. chemilumine-scencyjną). NASBA jest używana w zintegrowanych anali-zatorach prowadzących samodzielnie cały proces po nanie-sieniu próbki, co ogranicza trudności typowe dla PCR, ta-kie jak konieczność wydzielenia oddzielnych pomieszczeń na poszczególne etapy badania oraz ryzyko kontaminacji próbek [3, 16]. Ponadto w diagnostyce wirusowych zaka-żeń górnych dróg oddechowych zastosowanie znajdują tak-że mikromacierze oraz technika mikrokulek (ang. bead de-tection formats) [10].
Techniki molekularne wydają się być najbardziej obiecu-jącymi metodami diagnostyki zakażeń górnych dróg odde-chowych. Dzięki ich zastosowaniu można wykrywać rów-nież nowo poznane patogeny (SARS-CoV, MERS-CoV, ludzkie metapneumowirusy, bokaparwowirusy, wirusy gry-py A H5N1 i inne) z dobrą czułością i swoistością, a także w reakcjach multipleksowych poszukiwać jednocześnie ge-nów różnych patogege-nów, wedle potrzeb nie tylko wirusów, lecz także bakterii. Ograniczeniem tych metod jest wrażli-wość na przypadkowe kontaminacje poszukiwanymi kwa-sami nukleinowymi, wrażliwość na działanie proteaz oraz inhibitorów polimeraz.
PODSUMOWANIE
Diagnostyka wirusologiczna zakażeń górnych dróg od-dechowych jest możliwa, ale dedykowana głównie szcze-gólnym sytuacjom klinicznym, m.in. kwalifikacji do lecze-nia przeciwgrypowego pacjentów z obniżoną odpornością (takich jak biorcy przeszczepów) i w przypadku kwalifika-cji do izolakwalifika-cji (kohortakwalifika-cji) chorych na oddziałach szpital-nych. Przy ustalaniu rozpoznania etiologicznego obiecują-cą wydaje się być zwłaszcza multipleksowa PCR, w której
jednocześnie poszukuje się wielu patogenów. Podczas in-terpretacji wyników należy uwzględnić, że niektóre wirusy wykrywa się również u osób zdrowych, a niektórym infek-cjom RSV towarzyszy przedłużona obecność wirusa. Ważny jest również fakt, że w 5–23% zakażeń górnych dróg odde-chowych wykrywa się więcej niż jeden potencjalny czynnik sprawczy [2]. Z powodu znacznej liczby bezobjawowych in-fekcji wirusowych, uzasadnione wydaje się być łączenie dia-gnostyki wirusologicznej i bakteriologicznej (np. poprzez takie projektowanie reakcji multipleks PCR, aby uwzględ-niały nie tylko patogeny wirusowe, lecz także bakteryjne), dzięki czemu diagnostyka nie zakończy się na pierwszym wykrytym potencjalnym czynniku sprawczym zachorowa-nia i pozwoli uniknąć nierozpoznazachorowa-nia zakażezachorowa-nia bakteryj-nego przy jednoczesnej bezobjawowej koinfekcji wiruso-wej. Mimo że diagnostyka wirusologiczna jest kosztowna, może być ekonomicznie uzasadniona, jeśli wyniki uzysku-je się szybko (w ciągu 24 godzin), co pozwala wprowadzić właściwą terapię i ograniczyć nieuzasadnioną antybiotyko-terapię [10].
KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.
PIŚMIENNICTWO
1. Wat D. The common cold: a review of the literature. Eur J Intern Med 2004;15(2):79– 88.
2. Chonmaitree T, Revai K, Grady JJ et al. Viral upper respiratory tract in-fection and otitis media complication in young children. Clin Infect Dis 2008;46(6):815– 823.
3. Mahony JB. Detection of respiratory viruses by molecular methods. Clin Micro-biol Rev 2008;21(4):716– 747.
4. Zakład Ubezpieczeń Społecznych, Departament Statystyki i Prognoz Aktu-arialnych. Absencja chorobowa w 2013 roku. ZUS (online) 2014; http://www. zus.pl/files/Absencja_chorobowa_w_2013_roku.pdf
5. Mazur E. Diagnostyka ostrych zakażeń górnych dróg oddechowych (GDO) – dobór materiałów i problemy interpretacyjne związane z obecnością flory fizjologicznej i nosicielstwem. Post Mikrobiol 2012;51(3):213– 217.
6. Hryniewicz W, Ozorowski T, Radzikowski A et al. Rekomendacje postępowania w pozaszpitalnych zakażeniach układu oddechowego 2010. Narodowy Pro-gram Ochrony Antybiotyków (online) 2010; http://www.antybiotyki.edu.pl/ pdf/RekomendacjeA42009.pdf
7. Chrobak E, Machura E, Wrzask M, Krakowczyk H, Mielczarek M. Prze-bieg zakażeń RSV u hospitalizowanych niemowląt i małych dzieci. Prz Lek 2011;68(1):63– 67.
8. American Academy of Pediatrics Subcommittee on Diagnosis and Manage-ment of Bronchiolitis. Diagnosis and manageManage-ment of bronchiolitis. Pediatrics 2006;118(4):1174– 1793.
9. World Health Organization. WHO biosafety guidelines for handling of SARS specimens. WHO (online) 2003; http://www.who.int/csr/sars/biosafe-ty2003_04_25/en/
10. Jaguś P, Chorostowska-Wynimko J, Roży A. Diagnostyka wybranych zakażeń wirusowych układu oddechowego. Pneumonol Alergol Pol 2010;78(1):47– 53. 11. Barenfanger J, Drake C, Mueller T, Troutt T, O’Brien J, Guttman K. R-Mix cells are faster, at least as sensitive and marginally more costly than conventional cell lines for the detection of respiratory viruses. J Clin Virol 2001;22(1):101– 110. 12. St George K, Patel NM, Hartwig RA et al. Rapid and sensitive detection of
re-spiratory virus infections for directed antiviral treatment using R-Mix cultures. J Clin Virol 2002;24(1– 2):107– 115.
13. Tuuminen T, Suomala P, Koskinen JO. Evaluation of the automated multianaly-te point-of-care mariPOC® multianaly-test for the demultianaly-tection of influenza A virus and respi-ratory syncytial virus. J Med Virol 2013;85(9):1598– 1601.
sting for influenza diagnosis. WHO (online) 2005; http://www.who.int/influ-enza/resources/documents/RapidTestInfluenza_WebVersion.pdf
15. Mackie PL, McCormick EM, Williams C. Evaluation of Binax NOW RSV as an acu-te point-of-care screening acu-test in a paediatric accident and emergency unit. Commun Dis Public Health 2004;7(4):328– 330.
PCR assay in high-risk emergency department patients. J Clin Microbiol 2014;52(12):4353– 4355.
