WYBRANE STRATEGIE ZWALCZANIA BIOFILMÓW W ZAKAŻENIACH.
CZĘŚĆ 2. TERAPIA FOTODYNAMICZNA
NEW STRATEGIES TO COMBAT BIOFILM-ASSOCIATED INFECTIONS. PART 2. PHOTODYNAMIC THERAPY
STRESZCZENIE: Stale rosnąca lekooporność drobnoustrojów, udział ich biofilmów w przebie-gu zmian patologicznych oraz wyczerpywanie się zasobów skutecznych terapeutyków prowa-dzą do rozwoju alternatywnych metod leczenia zakażeń. Obiecującym wydaje się zastosowa-nie do tego celu terapii fotodynamicznej (ang. photodynamic therapy – PDT), opartej na po-wstawaniu toksycznych reaktywnych form tlenu (RTF) po aktywacji światłem związków okre-ślanych mianem fotouczulaczy (ang. photosensitizers – PS). PDT jest od wielu lat wykorzysty-wana głównie w leczeniu zmian nowotworowych, ale w badaniach in vitro oraz in vivo wykaza-no skuteczwykaza-ność tej metody również w eliminacji wielu drobwykaza-noustrojów, w tym: bakterii, wiru-sów, grzybów i pasożytów (niezależnie od profilu ich lekooporności). Niezwykle istotnym jest fakt, iż fotodynamicznej inaktywacji przeprowadzanej w określonych warunkach poddają się zarówno formy planktonowe mikroorganizmów, jak i ich formy biofilmowe. Natomiast rozwi-jane modyfikacje fotouczulaczy lub systemów ich transportu pozwalają na dodatkową popra-wę efektywności PDT.
SŁOWA KLUCZOWE: biofilm drobnoustrojów, fotodynamiczna chemoterapia skierowana przeciwko drobnoustrojom, fotodynamiczna inaktywacja mikroorganizmów, fotouczulacz, te-rapia fotodynamiczna
ABSTRACT: In the light of the constantly increasing resistance of microorganisms to chemo-therapeutic agents, the involvement of their biofilms in the development of pathological le-sions and the depletion of effective therapeutics sources it seems necessary to design new strategies for infection treatment. The use for this purpose of photodynamic therapy (PDT) based on the formation of toxic reactive oxygen species after photoactivation of compounds known as photosensitizers (PS) seems to be promising. PDT is used for many years mainly in the therapy of neoplastic changes, but based on in vitro and in vivo study the efficiency of this method in the elimination of a number of microorganisms, including bacteria, viruses, fungi and parasites, regardless of their resistance profile, has also been demonstrated. Extremely im-portant is the fact that the photodynamic inactivation carried out under certain conditions is effective against both planktonic and biofilm microbial forms. The modifications of photosen-sitizers or their delivery systems allow improving of PDT efficiency.
KEY WORDS: microbial biofilm, photodynamic antimicrobial chemotherapy, photodynamic inactivation, photodynamic therapy, photosensitizer
Pracownia Biologii Zakażeń Katedry Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego } BARBARA RÓŻALSKA
Pracownia Biologii Zakażeń
Katedry Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź, Tel.: (42) 635 41 85, Fax: (42) 665 58 18, e-mail: rozab@biol.uni.lodz.pl Wpłynęło: 07.08.2014 Zaakceptowano: 30.08.2014 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2014045
WSTĘP
Wielokrotnie wyższa oporność biofilmów na czyn-niki środowiskowe, mechanizmy obronne układu
odpornościowego gospodarza czy środki biobójcze oraz sta-le rosnący udział biofilmów w rozwoju zmian patologicz-nych zmuszają do poszukiwania nowych strategii terapeu-tycznych, skutecznych wobec tych złożonych pod wzglę-dem struktury i fizjologii społeczności drobnoustrojów.
Zastosowanie terapii fotodynamicznej w oparciu o znane i nowo opracowywane fotouczulacze wydaje się dobrym – jednak nie pozbawionym ograniczeń – rozwiązaniem. Tym bardziej, iż nie stwierdzono do tej pory nabycia przez drobnoustroje oporności na działanie fotouczulaczy [1–2]. Jednakże wskazuje się na pompy efluksowe drobnoustro-jów związane z wielolekową opornością (pompy MDRs, ang. multi-drug resistance pumps), jak NorA u metycylino-opornych szczepów Staphylococcus aureus, jako na czynni-ki obniżające wrażliwość bakterii na fotodynamiczną inak-tywację [3].
ZASADA TERAPII FOTODYNAMICZNEJ
Terapia fotodynamiczna opiera się na działaniu nietok-sycznych barwników zwanych fotouczulaczami, które pod wpływem światła widzialnego generowanego przez nisko-energetyczne źródła w obecności tlenu prowadzą do po-wstawania związków o charakterze cytotoksycznym, głów-nie reaktywnych form tlenu. Rolę fotoutleniaczy mogą peł-nić porfiryny oraz ich prekursory i pochodne (np.: proto-porfiryna IX, kwas 5-aminolewulinowy (5-ALA), hemato-porfiryna, Photofrin (porfimer sodu, jedna z lepiej pozna-nych i szeroko stosowapozna-nych pochodpozna-nych hematoporfiry-ny), Verteporfin (BPD-MA, czyli benzoporfiryna stosowa-na w leczeniu zmian nowotworowych), Visudyn (prepa-rat werteporfiny stosowany powszechnie w leczeniu zwią-zanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej)), chloryny (np. Foscan – inaczej m-THPC, czyli meta-tetrahydroksy-fenylochloryn, NPe6 – mono-L-aspartylochloryn e6, SnET2 – etyloetiopurpuryna cyny), ftalocyjaniny (np. Pc4 – ftalo-cyjanina 4), ksanteny (np. erytrozyna) czy znane barwniki fenotiazynowe, takie jak błękit toluidynowy O i błękit mety-lenowy [1, 2, 4–7]. Fotouczulacze pod wpływem światła ule-gają ekscytacji najpierw zwykle do stanu singletowego, na-stępnie tripletowego, by po transferze elektronów przebiega-jącym na dwóch drogach doprowadzić do powstawania cy-totoksycznych reaktywnych form tlenu (Ryc. 1) [1, 2, 7–8].
FOTODYNAMICZNA INAKTYWACJA
DROBNOUSTROJÓW
Terapia fotodynamiczna znalazła szerokie zastosowanie w leczeniu chorób niezakaźnych, głównie zmian nowotwo-rowych (np. raka podstawnokomórkowego, kolczystokomór-kowego, guzów przerzutowych skóry, mięsaka Kaposiego), a także schorzeń nienowotworowych, takich jak: zwyrodnie-nie plamki żółtej, łuszczyca, reumatoidalne zapalezwyrodnie-nie stawów, zapalenie kości i szpiku kostnego, brodawki, trądzik, liszaj płaski [9–13]. PDT może okazać się również dobrą alterna-tywą w terapii wybranych zakażeń bakteryjnych, grzybiczych,
pasożytniczych czy wirusowych. Zwłaszcza w sytuacji stale rosnącej liczby opornych mikroorganizmów na klasyczne an-tybiotyki i chemioterapeutyki oraz udziału wysoce opornych biofilmów drobnoustrojów w rozwoju zmian patologicznych. Technologię fotodynamicznej terapii skierowanej przeciwko drobnoustrojom określa się skrótowo PACT (ang. photody-namic antimicrobial chemotherapy) lub nazywa procesem fo-todynamicznej inaktywacji (ang. photodynamic inactivation – PDI) [2, 6, 7, 14–16]. Jako PS w PACT najczęściej stosowa-ne są pochodstosowa-ne porfirynowe (w tym występujące endogen-nie u drobnoustrojów metabolity pośredendogen-nie szlaku biosyntezy hemu, także Photofrin, Visudyn) oraz fenotiazynowe barw-niki kationowe (wymieniany wcześniej błękit toluidynowy O i błękit metylenowy) [2, 7, 17]. Zakłada się dwa podstawo-we mechanizmy działania powstających RFT, a tym samym fotodynamicznej inaktywacji drobnoustrojów: uszkodzenie błony cytoplazmatycznej komórek mikroorganizmów pro-wadzące do wycieku składników wewnątrzkomórkowych, za-hamowania transportu przezbłonowego i działania enzymów lub/i uszkodzenie (pęknięcie) pojedynczych lub podwójnych nici DNA, w których szczególnie łatwo utlenieniu ulega gu-anidyna [1, 7, 17, 18].
Fotodynamiczna inaktywacja drobnoustrojów przebiega efektywniej w stosunku do bakterii Gram-dodatnich, u któ-rych bardziej porowata struktura osłon komórkowych (pep-tydoglikanu i kwasów lipotejchojowych) pozwala na prze-nikanie fotouczulaczy w okolice błony cytoplazmatycznej. U bakterii Gram-ujemnych rolę ochronną pełni membrana zewnętrzna ściany komórkowej. Obecne w niej fosfolipidy, kompleksy lipoprotein oraz lipopolisacharyd hamują wiąza-nie fotouczulaczy o charakterze anionowym [2, 7]. Dlatego w eliminacji zakażeń z udziałem tych drobnustrojów zasto-sowanie znajdują głównie fotouczulacze obojętne (np. deu-teroporfiryna, protochlorofilid) lub posiadające dodatni ła-dunek powierzchni (np. czterokationowe podstawniki por-firynowe, kationowe ftalocyjaniny, błękit toluidyny O, błę-kit metylenowy), wykazujące zdolność destabilizacji mem-brany zewnętrznej i których dodatkową zaletą jest większe powinowactwo do komórek bakterii niż do komórek eu-kariotycznych [1–2, 15, 18]. Podejmuje się również próby uwrażliwiania bakterii Gram-ujemnych na PDI, przykłado-wo przez równoległe z PS stosowanie czynników zwiększa-jących przepuszczalność ich osłon komórkowych. Wykaza-no między innymi korzystny wpływ polimyksyny i kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) na aktywność foto-uczulaczy w stosunku do bakterii Gram-ujemnych, w tym:
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter baumannii [1, 7]. Biorąc pod uwagę ujemny ładunek
po-wierzchni większości drobnoustrojów, efektywność PACT dodatkowo można podnieść przez zastosowanie PS o natu-ralnym dodatnim ładunku lub specjalnie modyfikowanych w tym kierunku przez dołączanie łańcuchów poli-L-lizyny. Skuteczność działania takich polikationowych koniugatów
fotouczulaczy z L-lizyną wykazano w stosunku do wielu pa-togenów jamy ustnej, w tym Actinomyces viscosus czy
Po-rphyromonas gingivalis [15, 19].
Niezwykle istotnym zjawiskiem, które znalazło zasto-sowanie w PACT, jest zdolność niektórych drobnoustro-jów (zwłaszcza beztlenowych) do akumulacji w komórkach endogennych fotouczulaczy (np. protoporfiryn), będących najczęściej metabolitami pośrednimi w szlakach produk-cji hemu. Tym samym mikroorganizmy te mogą być bez-pośrednio (bez dostarczania egzogennych PS) eliminowa-ne pod wpływem światła [2, 7, 17]. Na tym zjawisku opiera się zastosowanie PDI w terapii zakażeń jamy ustnej przebie-gających z udziałem Porphyromonas spp. i Prevotella spp., które akumulują w komórkach protoporfirynę IX; trądziku o etiologii Propionibacterium acnes czy zakażeń błony ślu-zowej żołądka i dwunastnicy z udziałem Helicobacter pylori, wykazujących zdolność do akumulacji porfiryn (w tym ko-proporfiryny) [7, 17, 20, 21]. Natomiast wcześniejsza inku-bacja antybiotykoopornych szczepów P. aeruginosa w pod-łożu zawierającym kwas delta-aminolewulinowy (δ-ALA)
i glutation (GSH) nasila produkcję endogennych protopor-firyn i tym samym skuteczność fotodynamicznej inaktywa-cji zarówno w stosunku do form planktonowych, jak i bio-filmowych tych drobnoustrojów [22, 23].
Co ważne, wykazano nie tylko bezpośrednią aktywność biobójczą PDT, lecz także zdolność inaktywacji wielu czyn-ników wirulencji wydzielanych przez drobnoustroje, co do-brze koreluje ze współczesnymi trendami w rozwoju nowych metod terapeutycznych [24]. Stosując błękit toluidyny O lub błękit metylenowy oraz naświetlania, dokonano inaktywa-cji LPS E. coli, proteaz P. aeruginosa i P. gingivalis czy pro-teazy V8, α-hemolizyny i sfingomielinazy (β-hemolizyny)
S. aureus [25–27].
LECZENIE ZAKAŻEŃ BIOFILMOWYCH
Z WYKORZYSTANIEM PDI
Zdolność drobnoustrojów do tworzenia jedno- i wielo-gatunkowych biofilmów, a także mniej złożonych struktur
nia fotodynamicznej inaktywacji drobnoustro-jów i możliwe jej modyfikacje w zwalczaniu biofilmu.
– mobilnych agregatów komórek – zalicza się do ważnych czynników ich patogenności. Powyższe formy strukturalne populacji drobnoustrojów w sposób istotny nasilają ryzyko utrwalenia się zakażenia. Ich udział wiązany jest obecnie już nie tylko z patogenezą infekcji towarzyszących zastosowaniu biomateriałów medycznych, lecz także z przewlekłymi za-każeniami ran (np. pooperacyjnych, odleżynowych, oparze-niowych, cukrzycowych), infekcjami otolaryngologicznymi, oskrzelowo-płucnymi, nawracającymi zakażeniami urolo-giczno-ginekologicznymi, infekcyjnym zapaleniem wsier-dzia, a nawet częścią infekcji ogólnoustrojowych o charak-terze septycznym [28–30]. Aktualna wiedza dostarcza do-wodów na to, iż trudności w terapii takich zakażeń wynikają z jednej strony z właściwości samych biofilmów, które wyka-zują podwyższoną oporność na antybiotyki stosowane w te-rapii oraz na działanie mechanizmów obronnych makroor-ganizmu. Z drugiej zaś strony spowodowane są upośledze-niem naturalnych procesów fizjologicznych przebiegających w obrębie uszkodzonych tkanek, wywołanym przez produk-ty drobnoustrojów oraz przez wydzielane z komórek gospo-darza czynniki prozapalne [28].
Leczenie zakażeń o podłożu biofilmowym jest zatem jed-nym z największych wyzwań współczesnej medycyny, wy-magającym aktywnego włączenia w ten proces naukowców z wielu dziedzin, w tym głównie mikrobiologii, immunolo-gii i biotechnoloimmunolo-gii. Nowe trendy w zakresie terapii tego typu zakażeń z zastosowaniem preparatów wspomagających kla-syczną antybiotykoterapię i/lub mechanizmy obronne go-spodarza zostały szeroko omówione w pierwszej części ni-niejszego opracowania oraz we wcześniejszych publikacjach Autorów [31–33]. Alternatywne opcje terapeutyczne w le-czeniu tzw. trudnych zakażeń zakładają również użycie bak-teriofagów, analogów cząsteczek sygnałowych w systemach komunikacji międzydrobnoustrojowej czy właśnie fotody-namicznej inaktywacji. Większość badań prowadzonych in
vitro wykazuje bowiem wyższą (choć nie 100%) skuteczność
PACT w eliminacji biofilmów drobnoustrojów w porówna-niu do działania klasycznych antybiotyków [2, 7, 34].
Pierwszym wykrytym naturalnym biofilmem drobno-ustrojów, rozwijającym się na powierzchni ludzkich tkanek, była płytka nazębna. Tworzy ją mieszana populacja drob-noustrojów z przewagą paciorkowców zieleniących
(Strep-tococcus oralis, S. gordonii, S. sanguinis, S. mitis), ale także
z obecnością Fusobacterium nucleatum, Actinomyces spp.,
Porphyromonas gingivalis czy Treponema denticola.
Nad-mierny rozwój płytki nazębnej (zwłaszcza w obrębie kieszo-nek przydziąsłowych) oraz zwiększenie udziału w niej bez-tlenowych Gram-ujemnych pałeczek (Porphyromonas
gingi-valis, Prevotella spp., Fusobacterium spp., Bacteroides spp.)
stanowi podstawę rozwoju próchnicy oraz chorób przyzę-bia, mogących prowadzić do parodontozy i całkowitej utraty zębów [18, 35, 36]. Stosowanie w praktyce stomatologicznej kompozytów światło-utwardzalnych nasunęło możliwość
równoczesnego zastosowania PACT do eliminacji drobno-ustrojów składających się na płytkę nazębną, leczenia zaka-żeń w obrębie jamy ustnej czy utrzymywania jałowości po-wierzchni/jam (głównie korzeni) zębów w trakcie i po wy-konywaniu zabiegów endodontycznych. W badaniach in
vi-tro udowodniono skuteczność radachlorynu
aktywowane-go światłem laserowym o dłuaktywowane-gości fali 662 nm oraz błęki-tu toluidyny O po naświetlaniu światłem LED w eliminacji
Streptococcus mutans [37]. Wykazano także aktywność
błę-kitu metylenowego, Photofrinu oraz erytrozyny (czerwo-ny barwnik spożywczy, stanowiący sól sodową tetrajodoflu-oresceiny) po 15-minutowym naświetlaniu światłem białym w zakresie długości fal 500–650 nm w stosunku do biofil-mu tych drobnoustrojów, ze wskazaniem na erytrozynę jako najbardziej skuteczną. Przy czym efektywność PDI, nieza-leżnie od rodzaju zastosowanego fotouczulacza, wzrastała wraz z wiekiem biofilmu, co – zdaniem autorów – wskazu-je na istotne znaczenie rozluźniania struktury biofilmu i tym samym nasilonego przenikania fotouczulaczy [36]. Stosując model ex vivo kanałów zębowych wykazano silną aktyw-ność bójczą w stosunku do Enterococcus faecalis błękitu me-tylenowego aktywowanego światłem widzialnym o długo-ści fali 664 nm. Warto nadmienić, iż niemal 98% skutecz-ności bakteriobójczej towarzyszył umiarkowany skutek cy-totoksyczny w stosunku do komórek eukariotycznych (30% badanych fibroblastów mysich linii L929 wykazywało dys-funkcje) [38]. Udowodniono również przydatność PDT z zastosowaniem chlorku fenotiazynowego i światła lasero-wego (λ=660 nm) w utrzymywaniu mikrobiologicznej jało-wości tkanek okołowierzchołkowych zębów w trakcie zabie-gów endodontycznych in vivo na modelu zwierzęcym eks-perymentalnego zapalenia tkanek okołowierzchołkowych, co sprzyjało prawidłowemu przebiegowi fizjologicznych procesów naprawczych [18].
Zakażenia uszkodzonej powierzchni skóry (np. ran po-oparzeniowych czy pooperacyjnych), głównie w środowi-sku szpitalnym, zwykle przebiegają z udziałem Pseudomonas
aeruginosa. Szczepy tych drobnoustrojów zdolne do
pro-dukcji alginianu (śluzu) – zewnątrzkomórkowego polisa-charydu stanowiącego główny składnik macierzy biofilmu – z łatwością formują agregaty i klasyczny biofilm na po-wierzchniach stałych. Drobnoustroje te charakteryzuje rów-nież wysoka zmienność fenotypowa zależna od warunków bytowania, a tym samym szybka możliwość zmiany feno-typu nieśluzowego na śluzowy i na odwrót [39, 40]. Zatem przy leczeniu zakażeń (zwłaszcza przewlekłych) z udziałem
P. aeruginosa zawsze należy wziąć pod uwagę rozwój
biofil-mu tych drobnoustrojów. Badania nad możliwością zasto-sowania PACT w eliminacji biofilmu tych bakterii były pro-wadzone między innymi przez Lee i wsp. w oparciu o wy-korzystanie omówionego wcześniej zjawiska nasilenia pro-dukcji protoporfiryny IX (pełniącej funkcję endogenne-go fotouczylacza) w obecności δ-ALA [23]. Stwierdzono,
iż jednokrotne zastosowanie PACT (120 J/cm) w obecno-ści 20 mMδ-ALA prowadzi do inaktywacji drobnoustro-jów pozostających w biofilmie i całkowitego zatrzymania ich wzrostu przez okres 12 godzin. Niemniej jednak obser-wowany po 24 godzinach inkubacji od momentu naświetla-nia ponowny wzrost P. aeruginosa wymusił kolejne użycie PDI i doprowadził do sformułowania wniosku, iż całkowita inaktywacja drobnoustrojów pozostających w biofilmie wy-maga dwukrotnego zastosowania antydrobnoustrojowej te-rapii fotodynamicznej w pewnym odstępie czasowym [23].
Drobnoustrojem, który mimo szczegółowo opisanych czynników wirulencji oraz dobrze poznanej fizjologii i pa-togenezy stanowi nadal jeden z podstawowych patoge-nów człowieka, jest S. aureus. Metycylinooporne szczepy gronkowca złocistego (ang. methicillin-resistant S. aureus – MRSA) należą do patogenów alarmowych w środowi-sku szpitalnym, stanowiąc nawet 60% klinicznych izolatów gronkowców złocistych na oddziałach intensywnej opieki medycznej, a w ostatnich latach coraz częściej są również izolowane z przypadków zakażeń pozaszpitalnych. Wyso-ka oporność MRSA na szeroki zakres stosowanych w kla-sycznej terapii antybiotyków oraz łatwość z jaką gronkow-ce formują biofilmy (zarówno na powierzchniach abiotycz-nych, jak i na/w tkankach gospodarza) czyni te drobno-ustroje szczególnie trudnymi do eliminacji [1, 30, 41]. Stąd stale podejmowane próby rozwinięcia alternatywnych me-tod terapeutycznych, w tym także z zastosowaniem PDI. Nakonechny i wsp. wykazali skuteczność II typu terapii fo-todynamicznej z zastosowaniem błękitu metylenowego wo-bec szczepów MRSA, niespodziewanie przewyższającą na-wet efekt fotodynamicznej inaktywacji w stosunku do szcze-pów wrażliwych na metycylinę (ang. methicillin-suscepti-ble S. aureus – MSSA) [2]. Podobnie dobre rezultaty w sto-sunku do klinicznych metycylinoopornych szczepów gron-kowca złocistego uzyskano, stosując jako fotouczulacz błę-kit toluidyny O [42]. Niemniej jednak nadal były to bada-nia prowadzone na hodowlach planktonowych gronkow-ców. Pierwsze próby zastosowania fotodynamicznej inakty-wacji w stosunku do biofilmu gronkowców wykazały przede wszystkim konieczność stosowania znacznie wyższych da-wek światła, by osiągnąć efekt terapeutyczny. Co więcej otrzymywano eliminację drobnoustrojów głównie z po-wierzchniowych warstw biofilmu, co wskazywało na ha-mowanie penetracji fotouczulaczy i/lub światła przez bio-film [43–45]. Stąd propozycja równoległego stosowania do-datkowych czynników „rozluźniających” strukturę biofilmu, jak wspominany wcześniej EDTA, którego skuteczność bio-bójczą udowodniono w stosunku do planktonowych i bio-filmowych form szerokiej grupy bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych [46–48]. Pozytywny, choć zależny od da-wek światła, efekt w eliminacji biofilmów gronkowców (za-równo S. epidermidis, jak i S. aureus, w tym MRSA), uzyska-no stosując błękit toluidyny O i naświetlania laserem przy
długości fali 640 nm. Badania prowadzono bez oraz w obec-ności pochodnej EDTA. Wykazano, iż minimalna dawka światła, przy której widoczny już jest efekt bójczy błękitu to-luidyny O w stosunku do biofilmów gronkowców, wynosi 25 J/cm2, ale za optymalną przyjęto dawkę 100 J/cm2. Zaś
wcześniejsze traktowanie biofilmu gronkowców pochodną EDTA dodatkowo uwrażliwia go na działanie PDI. Przed-stawione obrazy z mikroskopu konfokalno-skaningowe-go i elektronowekonfokalno-skaningowe-go bezpośrednio dowodzą uszkodzenia nie tylko błon komórkowych drobnoustrojów, lecz także struk-tury biofilmu, co jak przypuszczają autorzy jest efektem wpływu PDI/EDTA na interakcje międzykomórkowe [48]. Na szczególną uwagę zasługują badania prowadzone przez Biel i wsp., którzy symulując warunki przewlekłego zapale-nia zatok przynosowych utworzyli biofilm mieszany MRSA i P. aeruginosa wewnątrz jam trójwymiarowego silikonowego modelu ludzkiej zatoki szczękowej [49]. Drobnoustroje pozo-stające w tak izolowanych warunkach poddawano jednokrot-nemu (przez 3,5 minuty) płukaniu błękitem metylenowym w obecności lub nie EDTA oraz etanolu, a następnie naświe-tlano przez 8 minut światłem laserowym o długości fali 670 nm z zastosowaniem specjalnego cewnika balonowego. Wy-kazano skuteczność działania PDI w stosunku do mieszane-go biofilmu MRSA i P. aeruginosa, uzyskując niemal całkowi-tą eliminację drobnoustrojów (99,9%) po zastosowaniu mie-szaniny fotouczulacza z EDTA (1,25 mM) i etanolem (5%). Warto dodać, iż w warunkach kontrolnych żaden ze składni-ków mieszaniny bez naświetlania nie wywołał takiego efek-tu [49]. W badaniach prowadzonych in vitro niezwykle istot-ne jest jak najlepsze odtworzenie warunków naturalistot-nego za-każenia, dlatego symulując gronkowcowe infekcje powłok skórnych, przebiegające najczęściej z tworzeniem biofilmu tych drobnoustrojów, najpierw stosowano modele substytu-tów skóry, by ostatecznie wprowadzić modele zwierzęce zaka-żeń ran powierzchniowych. Dowiedziono skuteczności dzia-łania PACT po zastosowaniu odpowiednich fotouczulaczy (np. czterokationowej ftalocyjaniny cynkowej, błękitu mety-lenowego, RLP068/Cl) i dobranego sposobu naświetlań w eli-minacji drobnoustrojów. Zwrócono przy tym uwagę na rów-noczesne przyspieszenie (średnio o około 8 dni) fizjologicz-nych procesów gojenia ran (w tym reepitelializacji) u zwierząt poddawanych terapii fotodynamicznej [50–52].
OGRANICZENIA ZASTOSOWANIA PACT
I NOWE MOŻLIWOŚCI
Efektywność PDI w stosunku do drobnoustrojów i ich biofilmów jest limitowana przede wszystkim ograniczoną penetracją fotouczulaczy (podobnie jak antybiotyków) przez barierę osłon komórkowych i zewnątrzkomórkowej sub-stancji polimerowej (ang. extracellular polimeric substances – EPS), stanowiącej macierz biofilmu. Rozwiązaniem może
być zastosowanie alternatywnych metod dostarczania PS (podobnie jak innych substancji czynnych) przy użyciu li-posomów, olejowych układów zdyspergowanych czy biode-gradowalnych cząsteczek polimerowych. Możliwe jest rów-nież równoległe stosowanie substancji chelatujących (przy-kładowo wspomnianego wcześniej EDTA) destabilizujących struktury zawierające jony Mg2+ i Ca2+ (np. membrany
ze-wnętrzne bakterii Gram-ujemnych) i tym samym ułatwiają-cych dyfuzję PS [1, 7, 8, 53, 54]. Jak podkreślano w pierwszej części niniejszego opracowania, w ostatnich latach prowadzi się intensywne badania nad wykorzystaniem liposomów/ nanoliposomów jako systemów transportowych dla szero-koro zumianych chemioterapeutyków, włączając w to foto-uczulacze (Ryc. 1). Łatwa integracja tych struktur z błona-mi komórkowyz błona-mi, w tym membraną zewnętrzną bakterii Gram-ujemnych, pozwala dostarczać zawarte w nich sub-stancje bezpośrednio do cytoplazmy komórek. W przypad-ku drobnoustrojów Gram-dodatnich wykazano natomiast interakcję liposomów z zewnętrzną warstwą peptydogli-kanu, co umożliwia uwalnianie zawartych w nich substan-cji (np. fotouczulaczy) i ich dyfuzję przez ścianę komórko-wą bakterii [54, 55]. Udowodniono nie tylko skuteczność li-posomów w dostarczaniu błękitu metylenowego do komó-rek szerokiej grupy bakterii (w tym: Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Shigella flexne-ri), lecz także wyższą aktywność jego formy liposomalnej
w porównaniu do wolnej [56]. Podobne wyniki otrzyma-no, stosując liposomalną oraz micelarną formę hematopor-firyny i chloryny e6 wobec drobnoustrojów Gram-dodat-nich, w tym MRSA [55]. Jednak obserwowany efekt biobój-czy zależy od budowy chemicznej fotouczulacza, co deter-minuje jego interakcje z komponentami liposomów, w tym rozmieszczenie w pęcherzykach liposomalnych oraz uwal-nianie [57, 58]. Podkreśla się, iż wykorzystanie liposomów jako systemu transportowego pozwala na stopniową dyfu-zję substancji czynnych w obrębie zakażonych tkanek, za-tem przedłuża czasookres ich działania. Co więcej, liposomy na swojej powierzchni mogą zawierać tzw. cząsteczki trans-portowe specyficzne dla komórek docelowych (w PACT dla drobnoustrojów czy składników macierzy biofilmu), stano-wiące system precyzyjnie nakierowujący je na określony cel. Pierwsze próby znakowania bezpośrednio cząsteczek foto-uczulaczy i ich wykorzystania zarówno w warunkach labo-ratoryjnych, jak i na modelach zwierzęcych podjęto już po-nad 20 lat temu, stosując PS kowalencyjnie związane ze swo-istymi dla powierzchniowych antygenów drobnoustrojów przeciwciałami monoklonalnymi [59, 60]. Obecnie znako-waniu za pomocą przeciwciał, bakteriofagów czy białek ad-hezyjnych poddaje się zarówno bezpośrednio fotouczulacze, jak i liposomy je transportujące, co pozwala uniknąć aku-mulacji PS w komórkach eukariotycznych gospodarza i tym samym możliwych niepożądanych efektów ubocznych, ta-kich jak nadwrażliwość skórna na światło [1, 2, 61, 62].
Innym istotnym ograniczeniem stosowania PACT w przy-padku zakażeń ogólnoustrojowych czy infekcji głębokich tka-nek jest limitowana przepuszczalność promieni świetlnych przez materiał biologiczny. Zależy ona od długości fal, i tak naj-niższym stopniem przenikalności tkanek charakteryzuje się światło ultrafioletowe, które przeciętnie dociera na głębokość nie przekraczającą kilku mikrometrów, podczas gdy promie-niowanie podczerwone może przenikać nawet na głębokość 1–3 cm. Tym samym prowadzi się badania nad zastąpieniem zewnętrznego źródła światła widzialnego światłem chemilumi-nescencji, emitowanym jako efekt przeprowadzanych reakcji chemicznych, np. utleniania luminolu. Początkowo udowod-niono skuteczność wewnątrzkomórkowej chemiluminescen-cji na mysich komórkach nowotworowych szpiczaka, a następ-nie na komórkach bakterii, określając tę formę fotodynamicz-nej inaktywacji mianem CPAT (ang. chemiluminescent pho-todynamic antimicrobial therapy) [56, 63, 64]. Stosując wolne i liposomalne formy luminolu oraz błękitu metylenowego udo-wodniono, iż CPAT w skuteczności eliminacji S. aureus (zarów-no MSSA, jak i MRSA) oraz E. coli niemal dorównuje klasycz-nej metodzie fotodynamiczklasycz-nej inaktywacji [2, 56]. Szczegóło-wy mechanizm działania przeciwnowotworowego i przeciw-drobnoustrojowego fototerapii opartej na chemiluminescencji nie jest do końca wyjaśniony, choć przypuszcza się, iż wykazuje podobieństwo do mechanizmu PDT i w oparciu o przemiany biochemiczne prowadzi do utleniania lipidów błonowych i bia-łek w komórkach docelowych [2].
KONFLIKT INTERESÓW: Nie zgłoszono.
DEKLARACJA PRZEJRZYSTOŚCI: Praca częściowo finansowana z projektu NCN Nr 2012/05/N/NZ7/01216 (dla M.P.).
PIŚMIENNICTWO
1. Fu XJ, Fang Y, Yao M. Antimicrobial photodynamic therapy for methicillin-re-sistant Staphylococcus aureus infection. Biomed Res Int 2013;2013:159157. 2. Nakonechny F, Nisnevitch M, Nitzan Y, Firer MA. New techniques in
antimi-crobial photodynamic therapy: scope of application and overcoming drug resistance in nosocomial infections. In: Méndez-Vilas A (ed.). Science Aga-inst Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technolo-gical Advances. Formatex Research Center, Madrid, Spain, 2011, p. 684– 691. 3. Tegos GP, Hamblin MR. Phenothiazinium antimicrobial photosensitizers are
substrates of bacterial multidrug resistance pumps. Antimicrob Agents Che-mother 2006;50(1):196– 203.
4. Chen J, Keltner L, Christophersen J et al. New technology for deep light distri-bution in tissue for phototherapy. Cancer J 2002;8(2):154– 163.
5. Fornalski J. Terapia fotodynamiczna – jej oddziaływanie i zastosowanie w dermatologii. Nowa Med 2006;4:71– 74.
6. Gośliński T, Konopka K, Piskorz J, Kryjewski M, Wierzchowski M, Sobiak S. Per-spektywy zastosowania fotodynamicznej terapii skierowanej przeciw mikro-organizmom – PACT. Post Mikrobiol 2008;47(4):447– 456.
7. Hamblin MR, Hasan T. Photodynamic therapy: a new antimicrobial approach to infectious disease? Photochem Photobiol Sci 2004;3(5):436– 450. 8. Nowak-Stępniowska A, Pergoł P, Padzik-Graczyk A. Metoda fotodynamiczna
diagnostyki i leczenia nowotworów – mechanizmy i zastosowania. Post Bio-chem 2013;59(1):53– 63.
9. Al-Mutairi N, Al-Haddad A. Targeted phototherapy using 308 nm Xecl mono-chromatic excimer laser for psoriasis at difficult to treat sites. Lasers Med Sci 2013;28(4):1119– 1124.
mechanizm, aplikacje kliniczne. Nowa Med 2013;1:26– 30.
11. Neupane J, Ghimire S, Shakya S, Chaudhary L, Shrivastava VP. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Pho-todiagnosis Photodyn Ther 2010;7(1):44– 49.
12. Nowak-Śliwinska P, van den Bergh H, Sickenberg M, Koh AH. Photody-namic therapy for polypoidal choroidal vasculopathy. Prog Retin Eye Res 2013;37:182– 199.
13. Tandon YK, Yang MF, Baron ED. Role of photodynamic therapy in psoriasis: a brief review. Photodermatol Photoimmunol Photomed 2008;24(5):222– 230. 14. Akilov OE, O’Riordan K, Kosaka S, Hasan T. Photodynamic therapy aga-inst intracellular pathogens: problems and potentials. Med Laser Appl 2006;21(4):251– 260.
15. Dai T, Huang YY, Hamblin MR. Photodynamic therapy for localized infections – state of the art. Photodiagnosis Photodyn Ther 2009;6(3– 4):170– 188. 16. Schastak S, Ziganshyna S, Gitter B, Wiedemann P, Claudepierre T. Efficient
photodynamic therapy against gram-positive and gram-negative bacteria using THPTS, a cationic photosensitizer excited by infrared wavelength. PLoS One 2010;5(7):e11674.
17. Lubart R, Lipovski A, Nitzan Y, Friedmann H. A possible mechanism for the bactericidal effect of visible light. Laser Ther 2011;20(1):17– 22.
18. Silva LA, Novaes AB Jr, de Oliveira RR, Nelson-Filho P, Santamaria M Jr, Silva RA. Antimicrobial photodynamic therapy for the treatment of teeth with apical periodontitis: a histopathological evaluation. J Endod 2012;38(3):360– 366. 19. Hamblin MR, O’Donnell DA, Murthy N et al. Polycationic photosensitizer
con-jugates: effects of chain length and Gram classification on the photodyna-mic inactivation of bacteria. J Antiphotodyna-microb Chemother 2002;49(6):941– 951. 20. Hongcharu W, Taylor CR, Chang Y, Aghassi D, Suthamjariya K, Anderson RR.
Topical ALA-photodynamic therapy for the treatment of acne vulgaris. J In-vest Dermatol 2000;115(2):183– 192.
21. Xia HH, Yu Wong BC, Talley NJ, Lam SK. Alternative and rescue treatment regimens for Helicobacter pylori eradication. Expert Opin Pharmacother 2002;3(9):1301– 1311.
22. Sharma M, Bansal H, Gupta PK. Photodynamic inactivation of antibiotic resi-stant strain of Pseudomonas aeruginosa by porphyrins induced by delta-ami-nolaevulinic acid. Indian J Med Res 2002;116:99– 105.
23. Lee CF, Lee CJ, Chen CT, Huang CT. δ-aminolaevulinic acid mediated pho-todynamic antimicrobial chemotherapy on Pseudomonas aeruginosa plank-tonic and biofilm cultures. J Photochem Photobiol B 2004;75(1– 2):21– 25. 24. Gauwerky K, Borelli C, Korting HC.Targeting virulence: a new paradigm for
antifungals. Drug Discov Today 2009;14(3– 4):214– 222.
25. Kömerik N, Wilson M, Poole S. The effect of photodynamic action on two virulence factors of gram-negative bacteria. Photochem Photobiol 2000;72(5):676– 680.
26. Packer S, Bhatti M, Burns T, Wilson M. Inactivation of proteolytic enzymes from Porphyromonas gingivalis using light-activated agents. Lasers Med Sci 2000;15(1):24– 30.
27. Tubby S, Wilson M, Nair SP. Inactivation of staphylococcal virulence factors using a light-activated antimicrobial agent. BMC Microbiol 2009;9:211. 28. Bjarnsholt T, Kirketerp-Møller K, Jensen PØ et al. Why chronic wounds will not
heal: a novel hypothesis. Wound Repair Regen 2008;16(1):2– 10.
29. Leid JG. Bacterial biofilms resist key host defenses. Microbe 2009;4(2):66– 70. 30. Różalska B, Budzyńska A, Paszkiewicz M, Sadowska B. Biofilmy mieszane bak-teryjno-grzybowe, czy należy się ich bać? Forum Zakażeń 2012;3(1):25– 29. 31. Budzyńska A, Sadowska B, Lipowczan G, Maciąg A, Kalemba D, Różalska B.
Activity of selected essential oils against Candida spp. strains. Evaluation a new aspects of their specific pharmacological properties, with special refe-rence to Lemon balm. Adv Microbiol 2013;3:317– 325.
32. Kuźma Ł, Wysokińska H, Różalski M et al. Antimicrobial and anti-biofilm pro-perties of new taxidione derivative from hairy roots of Salvia austriaca. Phy-tomedicine 2012;19(14):1285– 1287.
33. Sadowska B, Budzyńska A, Więckowska-Szakiel M et al. New pharmacologi-cal properties of Medicago sativa and Saponaria officinalis saponin-richfrac-tions addressed to Candida albicans. J Med Microbiol 2014;63(8):1076– 1086. 34. Taraszkiewicz A, Fila G, Grinholc M, Nakonieczna J. Innovative strategies
to overcome biofilm resistance. Biomed Res Int 2013;2013:150653. 35. Rickard AH, Gilbert P, High NJ, Kolenbrander PE, Handley PS. Bacterial
coag-gregation: an integral process in the development of multi-species biofilms. Trends Microbiol 2003;11(2):94– 100.
36. Wood S, Metcalf D, Devine D, Robinson C. Erythrosine is a potential photo-sensitizer for the photodynamic therapy of oral plaque biofilms. J Antimicrob Chemother 2006;57(4):680– 684.
cus mutans to antibacterial photodynamic therapy: a comparison of two
dif-ferent photosensitizers and light sources. J Appl Oral Sci 2014;22(2):80– 84. 38. George S, Kishen A. Advanced noninvasive light-activated disinfection:
as-sessment of cytotoxicity on fibroblast versus antimicrobial activity against
Enterococcus faecalis. J Endod 2007;33(5):599– 602.
39. Warren AE, Boulianne-Larsen CM, Chandler CB et al. Genotypic and pheno-typic variation in Pseudomonas aeruginosa reveals signatures of secondary infection and mutator activity in certain cystic fibrosis patients with chronic lung infections. Infect Immun 2011;79(12):4802– 4818.
40. Withers TR, Damron FH, YinY, Yu HD. Truncation of type IV pilin indu-ces mucoidy in Pseudomonas aeruginosa strain PAO579. Microbiol Open 2013;2(3):459– 470.
41. Sadowska B, Więckowska-Szakiel M, Paszkiewicz M, Różalska B. The immuno-modulatory activity of Staphylococcus aureus products derived from biofilm and planktonic cultures. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 2013;61(5):413– 420. 42. Hajim KI, Salih DS, Rassam YZ. Laser light combined with a photosensitizer
may eliminate methicillin resistant strains of Staphylococcus aureus. Lasers Med Sci 2010;25(5):743– 748.
43. Gad F, Zahra T, Hasan T, Hamblin MR. Effects of growth phase and extracellu-lar slime on photodynamic inactivation of gram-positive pathogenic bacte-ria. Antimicrob Agents Chemother 2004;48(6):2173– 2178.
44. Lin HY, Chen CT, Huang CT. Use of merocyanine 540 for photodynamic inac-tivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells. Appl Environ Microbiol 2004;70(11):6453– 6458.
45. Zanin IC, Lobo MM, Rodrigues LK, Pimenta LA, Höfling JF, Gonçalves RB. Pho-tosensitization of in vitro biofilms by toluidine blue O combined with light--emitting diode. Eur J Oral Sci 2006;114(1):64– 69.
46. Banin E, Brady KM, Greenberg EP. Chelator-induced dispersal and kil-ling of Pseudomonas aeruginosa cells in a biofilm. Appl Environ Microbiol 2006;72(3):2064– 2069.
47. Percival SL, Kite P, Eastwood K et al. Tetrasodium EDTA as a novel central ve-nous catheter lock solution against biofilm. Infect Control Hosp Epidemiol 2005;26(6):515– 519.
48. Sharma M, Visai L, Bragheri F, Cristiani I, Gupta PK, Speziale P. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilm. Antimicrob Agents Chemother 2008;52(1):299– 305.
49. Biel MA, Pedigo L, Gibbs A, Loebel N. Photodynamic therapy of antibio-tic resistant biofilms in a maxillary sinus model. Int Forum Allergy Rhinol 2013;3(6):468– 473.
50. Dai T, Tegos GP, Zhiyentayev T, Mylonakis E, Hamblin MR. Photodynamic the-rapy for methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection in a mouse skin abrasion model. Lasers Surg Med 2010;42(1):38– 44.
51. Maisch T, Bosl C, Szeimies RM, Love B, Abels C. Determination of the anti-bacterial efficacy of a new porphyrin-based photosensitizer against MRSA ex
vivo. Photochem Photobiol Sci 2007;6(5):545– 551.
52. Simonetti O, Cirioni O, Orlando F et al. Effectiveness of antimicrobial pho-todynamic therapy with a single treatment of RLP068/Cl in an experi-mental model of Staphylococcus aureus wound infection. Brit J Dermatol 2011;164(5):987– 995.
53. Cassidy CM, Tunney MM, McCarron PA, Donnelly RF. Drug delivery strategies for photodynamic antimicrobial chemotherapy: from benchtop to clinical practice. J Photochem Photobiol B 2009;95(2):71– 80.
54. Nisnevitch M, Nakonechny F, Nitzan Y. Photodynamic antimicrobial chemo-therapy by liposome-encapsulated water-soluble photosensitizers. Bioorg Khim 2010;36(3):396– 402.
55. Tsai T, Yang YT, Wang TH, Chien HF, Chen CT. Improved photodynamic inacti-vation of Gram-positive bacteria using hematoporphyrin encapsulated in li-posomes and micelles. Las Sur Med 2009;41(4):316– 322.
56. Nakonechny F, Firer MA, Nitzan Y, Nisnevitch M. Intracellular antimicrobial photodynamic therapy: a novel technique for efficient eradication of patho-genic bacteria. Photochem Photobiol 2010;86(6):1350– 1355.
57. Ferro S, Ricchelli F, Mancini G, Tognon G, Jori G. Inactivation of methicillin-re-sistant Staphylococcus aureus (MRSA) by liposome-delivered photosensiti-zing agents. J Photochem Photobiol B 2006;83(2):98– 104.
58. Ferro S, Ricchelli F, Monti D, Mancini G, Jori G. Efficient photoinactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by a novel porphyrin incorporated into a poly-cationic liposome. Int J Biochem Cell Biol 2007;39(5):1026– 1034. 59. Berthiaume F, Reiken SR, Toner M, Tompkins RG, Yarmush ML.
Antibody-tar-geted photolysis of bacteria in vivo. Biotechnol 1994;12(7):703– 706. 60. Strong L, Yarmush DM, Yarmush ML. Antibody-targeted photolysis.
Photo-physical, biochemical, and pharmacokinetic properties of antibacterial con-jugates. Ann N Y Acad Sci 1994;745:297– 320.
photodynamic therapy. Photochem Photobiol Sci 2011;10(5):721– 750. 62. Smith K, Malatesti N, Cauchon N et al. Mono- and tri-cationic
porphyrin-mo-noclonal antibody conjugates: photodynamic activity and mechanism of ac-tion. Immunology 2011;132(2):256– 265.
les for imaging hydrogen peroxide and self-therapy in photodynamic thera-py. J Biomed Biotech 2011;2011:679492.
64. Laptev R, Nisnevitch M, Siboni G, Malik Z, Firer MA. Intracellular chemilumi-nescence activates targeted photodynamic destruction of leukaemic cells. Br J Cancer 2006;95(2):189– 196.
