FAGOCYTOZA PAŁECZEK ESCHERICHIA COLI
ESCHERICHIA COLI PHAGOCYTOSIS
STRESZCZENIE: Pałeczki Escherichia coli, odpowiedzialne za zakażenia przewodu pokarmo-wego, wykształciły liczne mechanizmy umożliwiające przeżywanie w makrofagach i wywo-ływanie przewlekłych infekcji. Długotrwałe utrzymywanie się tych drobnoustrojów wewnątrz komórek żernych powoduje uwalnianie cytokin prozapalnych stymulujących mechanizmy obronne gospodarza, a ostatecznie rozwój przewlekłego, podostrego stanu zapalnego błony śluzowej jelit. Sekrecja cytokin prozapalnych z czasem prowadzi do obniżenia bariery nabłon-ka jelita i sprzyja przedostawaniu się antygenów ze światła jelita do blaszki podstawnej, zasob-nej w komórki immunologiczne, co ostatecznie zaburza homeostazę jelit. W niniejszej pracy
przedstawiono najważniejsze czynniki umożliwiające pałeczkom E. coli przeżywanie wewnątrz
komórek żernych.
SŁOWA KLUCZOWE: Escherichia coli, fagocytoza, makrofagi
ABSTRACT: Escherichia coli strains causing gastrointestinal tract infections have evolved nu-merous mechanisms that enable them to survive within macrophages and thus producing persistent infections. E. coli persistence within macrophages induces secretion of proinflam-matory cytokines that stimulate host’s defense mechanisms and eventually the development of chronic, sub acute inflammation of intestinal mucosa. Moreover, the secretion of proinflam-matory cytokines decrease the intestinal barrier and favor passing of luminal antigens to the lamina propria, rich in immune cells that disrupts intestinal homeostasis. In the paper we pre-sent the most important E. coli factors that enable them to survive within phagocytic cells. KEY WORDS: Escherichia coli, macrophages, phagocytosis
Katedra i Zakład Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu
} MICHAŁ K. TURNIAK
Katedra i Zakład Mikrobiologii, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu,
ul. Chałubińskiego 4, 50-368 Wrocław, Tel.: (71) 784 12 78, Fax: (71) 784 01 17, e-mail: michal.turniak@wp.pl Wpłynęło: 25.05.2016 Zaakceptowano: 22.06.2016 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2016026
FAGOCYTOZA
Profesjonalne fagocyty – tj.: neutrofile, monocyty, ma-krofagi, komórki tuczne i komórki dendrytyczne – odgry-wają zasadniczą rolę w rozpoznawaniu drobnoustrojów pa-togennych na podstawie ich swoistych antygenów PAMP (ang. pathogen associated molecular pattern). Rozpoznawa-nie antygenów drobnoustrojów przez fagocyty odbywa się za pośrednictwem grupy receptorów PRR (ang. pathogen recognition receptor), do których należą liczne receptory:
t receptory TLR (ang. Toll-like receptors), tj. Toll-po-dobne;
t receptory NLR (ang. NOD-like receptors), tj. NOD- -podobne;
t receptory RIG-I-podobne, z rodziny receptorów
RLR, tj. wewnątrzkomórkowych receptorów rozpo-znających wirusy;
t receptory lektynowe;
t receptor AiM2 (ang. absent in melanoma 2), tj. cy-tozolowy receptor DNA, aktywujący kaspazę-1 [1]. Połączenie PAMP z receptorami fagocytów pobudza od-powiedź immunologiczną na zakażenie, fagocytozę drobno-ustrojów i degradację wewnątrz fagolizosomów.
Degradacja drobnoustroju wewnątrz komórki żernej za-chodzi po fuzji fagosomu z lizosomami i po napływie do po-wstałego fagolizosomu czynników antybakteryjnych, m. in. enzymów hydrolitycznych i peptydów antybakteryjnych. Aktywowane makrofagi posiadają kompleks oksydazy NADPH (Nox), generujący nadtlenek wodoru i inne rodni-ki tlenowe (ang. reactive oxygen species – ROS) oraz indu-kowalną syntazę tlenku azotu (iNOS), wytwarzającą tlenek azotu i inne rodniki azotowe (ang. reactive nitrogen species – RNS). ROS i RNS są odpowiedzialne za tzw. wybuch tle-nowy w fagolizosomach, będący fundamentalnym aspek-tem wrodzonych mechanizmów obronnych [2–4].
Optymalne funkcjonowanie komórek żernych, podob-nie jak i całego układu immunologicznego, wymaga mi-kroelementów oraz pierwiastków śladowych, takich jak: że-lazo, miedź, selen i cynk. Miedź i cynk mają bezpośredni wpływ na aktywność antybakteryjną komórek fagocytar-nych, regulując w nich szlaki antybakteryjne. Pierwiastki te są także ważnym czynnikiem antybakteryjnym wydzie-lanym do fagosomów, zawierających pochłonięte drobno-ustroje. Co ciekawe, obydwa pierwiastki są niezbędne drob-noustrojom, jednak w wysokich stężeniach stają się dla nich toksyczne. Miedź jest składnikiem enzymu dysmutazy nad-tlenkowej (ang. superoxide dismutase – SOD) w makrofa-gach i neutrofilach, który katalizuje produkcję nadtlenku wodoru. W licznych badaniach wykazano, że u zwierząt la-boratoryjnych utrzymywanych na diecie pozbawionej mie-dzi zakażenia bakteryjne przebiegają ciężej i częściej prowa-dzą do śmierci (w porównaniu do zwierząt pozostających na diecie zawierającej te pierwiastki). Makrofagi zwierząt na diecie bez miedzi wykazywały osłabioną zdolność fago-cytozy, zaburzony wybuch tlenowy i znacznie zmniejszoną zdolność zabijania drobnoustrojów [5].
Jednakże komórki żerne mogą stanowić bezpieczną niszę dla wielu fagocytowanych drobnoustrojów, m.in.:
Legionel-la pneumophiLegionel-la, Mycobacterium tuberculosis, CoxielLegionel-la bur-netii, Brucella spp. oraz pałeczek Escherichia coli, które
wy-kształciły mechanizmy pozwalające modulować im funkcje komórek żernych w taki sposób, aby w nich przeżywać i na-mnażać się.
MAKROFAGI
Makrofagi obecne we wszystkich tkankach są najbar-dziej plastycznymi komórkami układu krwiotwórczego, stale zmieniającymi swój stan funkcjonalny – w zależności od zmian fizjologicznych tkanek oraz bodźców zewnętrz-nych. Do tkanek makrofagi rekrutowane są z rezerwuarów monocytów we krwi, śledzionie, szpiku kostnym oraz praw-dopodobnie z rezydentnych, progenitorowych makrofa-gów tkankowych na drodze proliferacji. Z jednej strony makrofagi uczestniczą niemal w każdym aspekcie biologii
organizmu gospodarza, począwszy od rozwoju, homeosta-zy i procesów naprawchomeosta-zych, a skońchomeosta-zywshomeosta-zy na odpowiedzi immunologicznej [6, 7]. Z drugiej strony chroniczne bodź-ce, np. stan zapalny i wydzielane cytokiny prozapalne – ta-kie jak: TNF-α (ang. tumor necrosis factor α), interleukina 1 beta (IL-1β), interleukina 8 (IL-8) – zmieniając fizjologicz-ne funkcje makrofagów, powodują, że komórki te przyczy-niają się do procesów chorobowych, np.: włóknienia, otyło-ści lub rozwoju nowotworów (Ryc. 1).
Makrofagi wydzielają rozmaite czynniki prozapalne – np. TNF-α, IL-1 i tlenek azotu (NO) – które aktywując antybakteryjne mechanizmy obronne (m.in. mechanizm zabijania zależny od tlenu), umożliwiają niszczenie pato-genów. Aktywowane makrofagi po sfagocytowaniu obcych antygenów ulegają apoptozie lub przekształcają się w ma-krofagi przeciwzapalne, wygaszające odpowiedź immuno-logiczną, co zapobiega uszkodzeniom tkanek i umożliwia ich zdrowienie [8, 9]. Komórki te pełnią także ważną rolę w homeostazie metabolicznej licznych narządów wewnętrz-nych, jednak zakażenia i stan zapalny (szczególnie chronicz-ny) przyczyniają się do aktywacji tkankowych makrofagów, co w konsekwencji może prowadzić do rozwoju choroby.
Makrofagi jelitowe pełnią zasadniczą rolę w utrzyma-niu lokalnej homeostazy i stanu równowagi pomiędzy ko-mensalną florą jelita a organizmem gospodarza. Pod wzglę-dem cech morfologicznych, komórki te wykazują cechy
rezydentnych makrofagów tkankowych, tj.: są jednojądrza-ste, zawierają liczne ziarnistości cytoplazmatyczne swoiste dla aktywnych fagocytarnie komórek, prezentują wysoki poziom antygenów zgodności tkankowej klasy II (ang. ma-jor histocompatibility complex II – MHC II) oraz recepto-ra CD36, umożliwiające wychwyt komórek apoptotycznych. Jednak w przeciwieństwie do makrofagów tkankowych, ma-krofagi jelitowe po indukcji receptora TLR nie odpowiadają syntezą i sekrecją cytokin prozapalnych oraz chemokin, nie produkują NO, a więc nie pełnią funkcji komórek prezentu-jących antygeny (ang. antigen presenting cells – APC) [10]. Ponadto w przeciwieństwie do tkankowych makrofagów, komórki zlokalizowane w jelitach produkują konstytutyw-nie lub po aktywacji receptora TLR interleukinę 10 (IL-10), wygaszającą stan zapalny (Ryc. 1) [7].
Ponadto makrofagi jelitowe nie posiadają: receptorów dla przeciwciał klas IgA i IgG, receptorów CR3, CR4 dla skła-dowych dopełniacza oraz integryny α2β1, które to aktywu-ją do odpowiedzi immunologicznej. Dzięki temu te komór-ki jelitowe nie ulegają aktywacji pod wpływem lipopolisa-charydu (ang. lipopolysaccharide – LPS) lub innych anty-genów drobnoustrojów, np. komensalnej flory jelit [11, 12]. Tym niemniej różnice te nie wpływają na aktywność fago-cytarną, która w przypadku makrofagów jelitowych jest wy-jątkowo silna [13].
SZCZEPY
ESCHERICHIA COLI
ODPOWIEDZIALNE ZA ZAKAŻENIA
PRZEWODU POKARMOWEGO CZŁOWIEKA
Gatunek Escherichia coli obejmuje szczepy komensal-ne, niepatogenne szczepy kolonizujące jelito zdrowych lu-dzi oraz grupę szczepów chorobotwórczych. Patogen-ne szczepy E. coli pod względem lokalizacji zakażeń dzie-li się na związane z zakażeniami przewodu pokarmowegooraz odpowiedzialne za zakażenia poza przewodem pokar-mowym (ang. extraintestinal pathogenic E. coli – ExPEC), a dokładnie:
t zakażenia układu moczowego – szczepy uropato-genne (ang. uropathogenic E. coli – UPEC);
t zakażenia krwi (bakteremia, sepsa);
t zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych
u noworod-ków (ang. neonatal meningitis E. coli – NMEC); t inne.
Szczepy ExPEC posiadają zróżnicowane czynniki wiru-lencji, jednak pomimo tego mogą utrzymywać się w jelicie człowieka bez wywoływania jakichkolwiek konsekwencji. Tym niemniej transfer ExPEC poza jelito prowadzi do roz-woju zakażenia [14].
Patogenne szczepy E. coli odpowiadające za zakażenia przewodu pokarmowego dzielone są na tzw. patotypy, któ-re różnią się któ-repertuaktó-rem pktó-rezentowanych czynników wiru-lencji. Wśród szczepów tych dotychczas wyróżniono 6 pa-totypów, tj.:
t enteropatogenne szczepy (ang. enteropathogenic
E. coli – EPEC);
t enterokrwotoczne szczepy (ang. enterohemorrhagic
E. coli – EHEC);
t enterotoksynogenne szczepy (ang. enterotoxigenic
E. coli – ETEC);
t enteroinwazyjne szczepy (ang. enteroinvasive E. coli – EIEC);
t enteroagregacyjne szczepy (ang. enteroaggregative
E. coli – EAEC);
t szczepy E. coli o rozsianym typie adhezji (ang. diffu-sely adhering E. coli – DAEC) (Ryc. 2).
EPEC przylegają do enterocytów za pośrednictwem cha-rakterystycznych dla tego patotypu adhezyn, tj. fimbrii rzących wiązki BFP (ang. bundle forming pilus), które two-rzą również połączenia między komórkami bakterii. Pro-wadzi to do utworzenia mikrokolonii oraz tzw. długich
Ryc. 2. Przykłady typów adhezji pałeczek E. coli do komórek nabłonka linii Hep-2. A. Rozsiany typ adhezji (ang. diffuse adherence – DA), w którym poje-dyncze bakterie w sposób rozproszony przylegają do komórek nabłonka. B. Agregacyjny typ adhezji (ang. aggregative adherence – AA), w której skupi-ska bakterii przylegają do komórek nabłonka oraz podłoża. Preparaty barwione barwnikiem Giemzy; powiększenie 100×.
fimbrii polarnych (ang. long polar fimbriae – LPF). Począt-kowa adhezja do enterocytów umożliwia EPEC wbudowa-nie do błony cytoplazmatycznej enterocytu białek efekto-rowych. W patomechanizmie zakażenia enteropatogenny-mi szczepaenteropatogenny-mi E. coli najważniejszą rolę pełnią dwa białka efektorowe, tj. intimina, swoista adhezyna, oraz jej receptor – Tir. Po połączeniu Tir i intiminy w komórkach nabłonka następuje kaskada reakcji, prowadząca do reorganizacji ich cytoszkieletu aktynowego. Efektem jest zniszczenie struktu-ry mikrokosmków i rozwój charaktestruktu-rystycznych zmian hi-stopatologicznych, określanych terminem „przylegania i za-cierania” (ang. attachment and effacement – AE). Zmiany histopatologiczne enterocytów powodują rozwój odczynu zapalnego, zaburzenia wchłaniania oraz rozwój biegunki. Zakażenia szczepami EPEC najczęściej dotyczą niemowląt i występują na całym świecie [15].
EHEC – podobnie do EPEC – indukują w nabłonku jelita rozwój zmian histopatologicznych typu AE, choć w przeci-wieństwie do szczepów enteropatogennych Escherichia coli zmiany te są indukowane w jelicie grubym. Poza reorganiza-cją aktynowego cytoszkieletu, EHEC produkują cytotoksynę Shiga, która hamuje w komórkach docelowych biosyntezę białek. Wchłaniana z jelita do krwiobiegu toksyna wiąże się z receptorami na powierzchni komórek śródbłonka, szcze-gólnie w kłębuszkach nerkowych, powodując ich nieodwra-calne uszkodzenie i rozwój hemolitycznego zespołu mocz-nicowego (ang. hemolytic uremic syndrome – HUS), po-ważnego powikłania, które może prowadzić do śmierci [15]. ETEC za pośrednictwem swoistych dla tego patotypu fimbrialnych i afimbrialnych adhezyn – tzw. czynników ko-lonizacji (ang. colonization factor antigen – CFA) – kolo-nizują jelito cienkie, a następnie wydzielają enterotoksyny LT i ST bezpośrednio odpowiedzialne za biegunkę sekre-cyjną [14].
EIEC biochemicznie i genetycznie są spokrewnione z pa-łeczkami Shigella oraz dzielą z nimi patomechanizm zaka-żeń jelit. Podobnie jak Shigella spp., szczepy enteroinwazyj-ne mogą wywoływać inwazyjenteroinwazyj-ne zakażenie jelita grubego po-łączone z owrzodzeniem lub nawet czerwonkę bakteryjną, jednak najczęściej powodują biegunki sekrecyjne, nieodróż-nialne od biegunek wywoływanych przez inne patogeny je-litowe. EIEC dzielą z pałeczkami Shigella także czynniki wi-rulencji, odpowiedzialne za zdolność inwazji do kolonocy-tów i namnażania się wewnątrz makrofagów, które u obu grup pałeczek są zlokalizowane na dużym plazmidzie wiru-lencji pINV [15].
DAEC prezentują na swojej powierzchni adhezyny z ro-dziny Dr adhezyn fimbrialnych (np. fimbrie C1845) i nie-fimbrialnych, które umożliwiają tym szczepom kolonizację nabłonka jelita cienkiego, a które łączą się z glikozylofosfaty-dyloinozytolem DAF (ang. decay accelerating factor) na po-wierzchni komórek gospodarza. Adhezja szczepów E. coli o rozsianym typie adhezji indukuje w komórkach nabłonka
kaskadę sygnałów prowadzących do reorganizacji aktyno-wego cytoszkieletu i wydłużenia mikrokosmków lub utwo-rzenia wypustek na powierzchni komórek, które „obejmu-ją” przylegające bakterie (Ryc. 2A). W ten sposób DAEC nie tylko ciasno przylegają do komórek nabłonka i są niejako internalizowane, lecz także są chronione przed nieswoisty-mi mechanizmanieswoisty-mi obronnynieswoisty-mi gospodarza. Dlatego szczepy te często są przyczyną przewlekłej biegunki [16].
Patotyp EAEC obejmuje niezwykle zróżnicowaną grupę pałeczek E. coli, odpowiedzialnych za ostre oraz przewlekłe biegunki u dzieci i osób dorosłych na całym świecie, które łączy wspólna cecha – charakterystyczna adhezja do komó-rek nabłonka, a często także podłoża między komórkami, w zorganizowany agregacyjny sposób (Ryc. 2B). Adhezyna-mi swoistyAdhezyna-mi dla szczepów enteroagregacyjnych są fimbrie agregacyjne (ang. aggregative adherence fimbriae – AAF). Dotychczas opisano trzy różne grupy AAF, jednak nie wy-stępują one u wszystkich izolowanych EAEC. Ważnym po-wierzchniowym białkiem u tych szczepów jest dyspersyna, odpowiedzialna za rozsiew tych szczepów na błonie śluzo-wej jelit. EAEC mogą produkować różne egzotoksyny. Dwie z nich, tj. autotransportowa proteaza Pic o aktywności mu-cynazy oraz oligomeryczna enterotoksyna ShET1
(ang. gella enterotoxin 1) – swoista dla większości szczepów Shi-gella flexneri 2a, – kodowane są przez to samo
chromoso-malne locus na antysensownych niciach DNA. Inną ente-rotoksyną wytwarzaną przez EAEC jest EAST1 (ang. ente-roaggregative ST1), która prawdopodobnie przyczynia się do sekrecyjnej biegunki podczas zakażeń szczepami ente-roagragacyjnymi. Wiele szczepów EAEC produkuje auto-transportową toksynę Pet o aktywności enterotoksyny i cy-totoksyny, która jest kodowana na plazmidzie wirulencji u szczepów enteroagregacyjnych [17].
Liczne geny wirulencji u enteroagregacyjnych szczepów
Escherichia coli pozostają pod kontrolą plazmidowego
ak-tywatora transkrypcyjnego AggR. Ponieważ w wielu bada-niach wykazano, iż AggR-dodatnie EAEC, posiadające liczne czynniki wirulencji, związane są z objawowymi zakażeniami, szczepy te określane są jako typowe EAEC. W przeciwień-stwie do typowych enteroagregacyjnych szczepów E. coli, szczepy atypowe nie posiadają regulonu aggR i są uważane przez wielu badaczy za niechorobotwórcze [15, 18].
FAGOCYTOZA PAŁECZEK
ESCHERICHIA COLI
Los pałeczek jelitowych pochłoniętych przez makrofagi w dużym stopniu zależy od tego, czy bakterie zostały uprzed-nio opsonizowane przeciwciałami. Pałeczki opłaszczone swoistymi przeciwciałami stymulują tworzenie wewnątrz makrofagów luźnych, obszernych fagosomów i są szybko (w ciągu 24 godzin) degradowane. Inaczej natomiast prze-biega proces degradacji bakterii nieopłaszczonych. Pałeczki
E. coli prezentują na swojej powierzchni fimbrie
manno-zo-wrażliwe typu 1, których szczytowy region adhezyjny za-wiera lektynę FimH, a które uczestniczą w procesie adhe-zji do komórek gospodarza. Lektyna ta jest rozpoznawana przez receptor CD48 makrofagów. Fagocytoza E. coli za po-średnictwem FimH prowadzi do utworzenia ciasnych fago-somów (ściśle przylegających do bakterii) oraz do ich za-burzonego zabijania i przeżywania wewnątrz makrofagów. W ten sposób makrofagi, które pochłonęły pałeczki
Esche-richia coli za pośrednictwem lektyny FimH, mogą stanowić
ich rezerwuar i sprzyjać przewlekłym zakażeniom lub na-wrotom infekcji [19]. Rollaq i wsp., badając fagocytozę nie-opsonizowanych E. coli przez mysie makrofagi, wykazali, że około 10% pałeczek – choć przylegało do makrofagów – nie ulegało fagocytozie [20]. Pozostałe sfagocytowane pa-łeczki, zlokalizowane w fagolizosomach, już po 90 minutach były w różnym stopniu zdegradowane. Ofek i wsp., bada-jąc fagocytozę E. coli, dokonali podobnej obserwacji, a mia-nowicie stwierdzili, że fagocytoza nieopłaszczonych prze-ciwciałami drobnoustrojów jest mniej efektywna niż fago-cytoza pałeczek opsonizowanych swoistymi przeciwciała-mi [21]. Ponadto badacze ci wykazali, że w procesie fago-cytozy Escherichia coli zachodzącej w nieobecności dopeł-niacza lub swoistych przeciwciał, dużą rolę w rozpoznawa-niu pobieranych przez komórki żerne bakterii pełnią ich an-tygeny powierzchniowe, np. fimbrie lub lipopolisacharyd. Szczepy prezentujące szorstki LPS, a więc o hydrofobowej powierzchni, są fagocytowane efektywniej niż szczepy pre-zentujące gładki, hydrofilowy lipopolisacharyd.
OBRONA
ESCHERICHIA COLI
PRZED DEGRADACJĄ WEWNĄTRZ
FAGOLIZOSOMÓW KOMÓREK ŻERNYCH
Podobnie do innych powszechnych patogenów przewo-du pokarmowego człowieka – takich jak Salmonella spp.,
Yersinia spp. lub Shigella spp. – szczepy E. coli związane
z zakażeniami jelit wykształciły szereg mechanizmów mo-dulujących proces fagocytozy. Zakażenie makrofagów bak-teriami najczęściej indukuje ich śmierć na drodze apopto-zy, pyroptozy lub nekrozy/lizy. Indukcja śmierci makrofa-gów zwykle następuje wtedy, gdy liczba wewnątrzkomórko-wych bakterii rośnie, a ekspozycja komórek żernych na pa-togen trwa długo. Pałeczki E. coli – podobnie jak
Salmonel-la spp., LegionelSalmonel-la spp., FranciselSalmonel-la tuSalmonel-larensis lub Mycobac-terium tuberculosis – najczęściej indukują
mitochondrial-ny lub prozapalmitochondrial-ny szlak apoptozy makrofagów, choć opisa-no również apoptozę komórek żernych w wyniki aktywa-cji kaspazy-1. Z jednej strony apoptoza makrofagów zakażo-nych bakteriami jest zjawiskiem korzystnym dla organizmu gospodarza, gdyż ułatwia jego oczyszczenie z drobnoustroju patogennego. Z drugiej strony, wiele patogenów – indukując
np. pyroptozę lub nekrozę makrofagów – unika śmierci i może rozsiewać się w organizmie gospodarza [22]. Z kolei jeszcze inne drobnoustroje namnażają się wewnątrz komó-rek żernych, dzięki wykształconym mechanizmom chronią-cym je przed wybuchem tlenowym wewnątrz fagolizosomu. Najczęściej spotykanym czynnikiem chroniącym drob-noustroje przed wybuchem tlenowym wewnątrz makrofa-gów są enzymy degradujące wolne rodniki tlenowe i azoto-we, takie jak: katalazy, peroksydazy lub dysmutazy nadtlen-kowe.
Pałeczki Escherichia coli wytwarzają co najmniej trzy róż-ne katalazy, tj. enzymy antyoksydacyjróż-ne, które degradu-ją H2O2 do tlenu i wody. Zarówno niepatogenne, jak i cho-robotwórcze szczepy E. coli produkują hydroksyperoksy-dazę HPI (kodowaną przez gen katG) i bifunkcjonalną pe-roksydazę-katalazę HPII (kodowaną przez gen katE). HPI jest wytwarzana pod wpływem niskich stężeń H2O2, na-tomiast ekspresja HPII nie jest związana z aktywacją nad-tlenkiem wodoru – jest indukowana zmianami metabo-licznymi zachodzącymi w stacjonarnej fazie wzrostu pałe-czek [23]. U E. coli, należących do patotypu EHEC, opisa-no katalazę KatP o aktywopisa-ności katalazy-peroksydazy, kodo-waną plazmidowym genem katP, która degraduje nadtlenek wodoru [24].
Escherichia coli produkują ponadto trzy różne
dysmuta-zy nadtlenkowe. Dwie z nich – tj. dysmutaza manganowa (MnSod) oraz dysmutaza żelazowa (FeSod) – są zlokalizo-wane w cytoplazmie i chronią bakterie przed rodnikami tle-nowymi powstającymi podczas przemian metabolicznych. Dysmutazy te nie odgrywają większej roli w ochronie bak-terii przed degradacją wewnątrz komórek fagocytarnych. Rolę tę pełni trzecia, opisana niedawno u bakterii dysmu-taza miedziowo-cynkowa (CuZnSod), kodowana przez gen
sodC, który u większości posiadających go drobnoustrojów
występuje w licznych kopiach. Enzym ten jest zlokalizowa-ny w przestrzeni periplazmatycznej i zakotwiczozlokalizowa-ny w bło-nie zewnętrznej pałeczek Gram-ujemnych. Rolę dysmuta-zy CuZnSod w ochronie bakterii przed toksycznymi rodni-kami tlenowymi w fagolizosomach potwierdziły liczne ba-dania, w których wykazano zmniejszoną wirulencję bakte-rii wewnątrzkomórkowych, pozbawionych na drodze muta-cji genu sodC [2, 3].
Poza opisanymi powyżej enzymami chroniącymi przed wybuchem tlenowym, pałeczki E. coli syntetyzują perok-sydazę BtuE, należącą do peroksydaz glutationu (ang. glu-tathione peroxidase – GPX), które katalizują rozkład nad-tlenków organicznych oraz nadtlenku wodoru. BtuE E. coli jest indukowana w warunkach stresu oksydacyjnego i chro-ni białka oraz błony bakteryjne przed oksydacją [25, 26]. Po-dobną funkcję spełnia u tych pałeczek inny enzym, NAD-PH-zależna peroksydaza Ahp (reduktaza wodoroku alkilu), kodowana przez gen ahpC, reduwodorokująca nadtlen-ki organiczne oraz nadtlenek wodoru. AhpC u Salmonella
typhimurium, podobnie jak u Mycobacterium tuberculosis
oraz Helicobacter pylori, katalizuje rozkład nadtlenoazoty-nu, zapobiegając jego mutagennemu wpływowi na DNA. Jednak wydaje się, że najważniejszą rolą obu bakteryjnych peroksydaz – tj. BtuE i AhpC – jest ochrona bakterii przed endogennymi rodnikami tlenowymi [27, 28].
Rozkład NO wewnątrz fagolizosomów makrofagów za-chodzi pod wpływem dioksygenazy NO i reduktazy, enzy-mów powszechnie występujących wśród drobnoustrojów. Pałeczki E. coli wytwarzają trzy enzymy neutralizujące tok-syczne działanie NO: reduktazę azotynu, enzym peripla-zmatyczny o słabo poznanej roli, flawohemoglobinę (Hmp) o niskiej aktywności oraz flaworubredoksynę (FIRd), ko-dowaną przez gen norV, która wydaje się specjalnie przy-stosowana do neutralizacji NO i powszechnie występu-je wśród niepatogennych oraz chorobotwórczych szcze-pów E. coli, m.in.: EPEC, EHEC, UPEC oraz wśród pałe-czek Shigella spp. i Salmonella spp. Baptista i wsp. wykaza-li, że w ciągu pierwszych 6–10 godzin – gdy stężenie ROS w fagolizosomach osiąga najwyższe wartości, natomiast stę-żenie RNS jest niskie – transkrypcja genu norV u E. coli jest zahamowana [4]. Niskie początkowe stężenie NO w fagoli-zosomach ma ochronny wpływ na drobnoustroje, aktywu-jąc u nich ekspresję regulonów koduaktywu-jących enzymy antyok-sydacyjne. W miarę upływu czasu, gdy stopniowo w fagoli-zosomach rośnie stężenie RNS, następuje aktywacja ekspre-sji FIRd, umożliwiając pałeczkom Escherichia coli przysto-sowanie się zmiennego napływu do fagolizosomu nadtlenku wodoru i tlenku azotu oraz możliwość przeżywania w ma-krofagach.
Innym czynnikiem umożliwiającym pałeczkom E. coli przeżywanie wewnątrz fagolizosomów jest siderofor yersi-niobaktyna, silny chelator jonów żelaza oraz miedzi. Yer-siniobaktyna jest sideroforem pierwotnie opisanym wśród pałeczek z rodzaju Yersinia spp. Geny kodujące yersiniobak-tynę znajdują się na wyspie patogenności HPI (ang. high pa-thogenicity island) i korelują z wirulencją pałeczek Yersinia spp. Badania Schuberta i wsp. wykazały, że geny kodujące yersiniobaktynę są szeroko rozpowszechnione wśród cho-robotwórczych pałeczek jelitowych, w tym szczepów E. coli, szczególnie ExPEC, i podobnie jak u pałeczek Yersinia wzmagają wirulencję tych drobnoustrojów [29]. Dotychczas uważano, że yersiniobaktyna pełni przede wszystkim rolę si-deroforu, tj. chelatora jonów żelaza. Tymczasem Chaturve-di i wsp. wykazali, że w fagolizosomach tworzy ona kom-pleks z jonami miedzi o aktywności podobnej do dysmutazy nadtlenkowej, która degraduje nadtlenek wodoru powstają-cy podczas wybuchu tlenowego. W ten sposób siderofor ten chroni swoich producentów przez zabijaniem wewnątrz ko-mórek żernych. Dodatkowo yersiniobaktyna, wiążąc jony miedzi, chroni bakterie przed ich toksycznym działaniem.
Powyższe przykłady wskazują, że chorobotwórcze pa-łeczki E. coli dzielą wiele mechanizmów oporności
na degradację wewnątrz makrofagów z innymi patogena-mi jelitowypatogena-mi. Wskazuje to, że szlaki unikania fagocytozy mogą stanowić uniwersalne mechanizmy obrony drobno-ustrojów patogennych dla człowieka przed nieswoistą od-powiedzią immunologiczną gospodarza, nabytą w trakcie ewolucji. Zdolność bakterii do przeżywania i namnażania się wewnątrz komórek żernych stanowi ważny czynnik wi-rulencji, stanowiący o zdolności patogenu do utrzymywania się w organizmie gospodarza i indukowania przewlekłych stanów zapalnych.
KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.
PIŚMIENNICTWO
1. Ashida H, Mimuro H, Ogawa M et al. Cell death and infection: a double-ed-ged sword for host and pathogen survival. J Cell Biol 2011;195(6):931– 942. 2. Battistoni A. Role of prokaryotic Cu, Zn superoxide dismutase in
pathogene-sis. Biochem Soc Trans 2003;31(6):1326– 1329.
3. Craig M, Slauch JM. Phagocytic superoxide specifically damages and extra-cytoplasmic target to inhibit or kill Salmonella. PLoS One 2009;4(3):e4975. 4. Baptista JM, Justino MC, Melo AM, Teixeira M, Saraiva LM. Oxidative stress
modulates the nitric oxide defense promoted by Escherichia coli flavorubre-doxin. J Bacteriol 2012;194(14):3611– 3617.
5. Stafford SL, Bokil NJ, Achard ME et al. Metal ions in macrophage antimicrobial pathways: emerging role for zinc and copper. Biosci Rep 2013;33(4). 6. Geissmann F, Manz MG, Jung S, Sieweke MH, Merad M, Ley K.
Deve-lopment of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science 2010;327(5966):656– 661.
7. Wynn TA, Chawla A, Pollard JW. Macrophage biology in development, home-ostasis and disease. Nature 2013;496(7446):445– 455.
8. Savill J, Dransfield I, Gregory C, Haslett C. A blast from the past: clearan-ce of apoptotic clearan-cells regulates immune responses. Nat Rev Immunol 2002;2(12):965– 975.
9. Murray PJ, Wynn TA. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol 2011;11(11):723– 737.
10. Rugtveit J, Bakka A, Brandtzaeg P. Differential distribution of B7.1 (CD80) and B7.2 (CD86) costimulatory molecules on mucosal macrophage sub-sets in human inflammatory bowel disease (IBD). Clin Exp Immunol 1997;110(1):104– 113.
11. Smith PD, Smythies LE, Shen R, Greenwell-Wild T, Gliozzi M, Wahl SM. Intesti-nal macrophages and response to microbial encroachment. Mucosal Immu-nol 2011;4(1):31– 42.
12. Hausmann M, Kiessling S, Mestermann S et al. Toll-like receptors 2 and 4 are up-regulated during intestinal inflammation. Gastroenterology 2002;122(7):1987– 2000.
13. Smythies LE, Sellers M, Clements RH et al. Human intestinal macrophages di-splay profound inflammatory anergy despite avid phagocytic and bacterio-cidal activity. J Clin Invest 2005;115(1):66– 75.
14. Croxen MA, Finlay BB. Molecular mechanism of Escherichia coli pathogenici-ty. Nat Rev Microbiol 2010;8(1):26– 38.
15. Kaper JB, Nataro JP, Mobley HL. Pathogenic Escherichia coli. Nat Rev Micro-biol 2004;2(2):123– 140.
16. Servin AL. Pathogenesis of Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli. Clin Mi-crobiol Rev 2005;18(2):264– 292.
17. Harrington SM, Dudley EG, Nataro JP. Pathogenesis of enteroaggregative
Escherichia coli infection. FEMS Microbiol Lett 2006;254(1):12– 18.
18. Nataro JP, Steiner T, Guerrant RL. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg In-fect Dis 1998;4(2):251– 261.
19. Baorto DM, Gao Z, Malaviya R et al. Survival of FimH-expressing enter obacteria in macropahges relies on glyc olipid traffic. Nature 1997;389(6651):636– 639. 20. Rollaq H, Hovig T. Phagocytosis of non-opsonized Escherichia coli by mouse
peritoneal macrophages. An electron microscopic study. Zentralbl Bakteriol Microbiol Hyg A 1984;257(1):93– 107.
21. Ofek I, Goldhar J, Keisari Y, Sharon N. Nonopsonic phagocytosis of microorga-nisms. Annu Rev Microbiol 1995;49:239– 276.
sms. Caister Academic Press, Norfolk, UK, 2012.
23. Loewen PC, Switala J, Triggs-Raine BL. Catalases HPI and HPII Escherichia coli are induced independently. Arch Biochem Biophys 1985;243(1):144– 149. 24. Uhlich GA. KatP contributes to OxyR-regulated hydrogen peroxide
resistan-ce in Escherichia coli serotype O157:H7. Microbiol 2009;155(11):3589– 3598. 25. Arenas FA, Covarrubias PC, Sandoval JM, Pérez-Donoso JM, Imlay JA,
Vásqu-ez CC. The Escherichia coli BtuE protein functions as a resistance determinant against reactive oxygen species. PLoS One 2011;6(1):e15979.
26. Arenas FA, Díaz WA, Leal CA, Pérez-Donoso JM, Imlay JA, Vásquez CC. The
Escherichia coli btuE gene, encodes a glutathione peroxidase that is
indu-ced under oxidative stress conditions. Biochem Biophys Res Commun 2010;398(4):690– 694.
redoxins. Nature 2000;407(6801):211– 215.
28. Seaver LC, Imlay JA. Alkyl hydroxiperoxide reductase is the primary sca-venger of endogenous hydrogen peroxide in Escherichia coli. J Bacteriol 2001;183(24):7173– 7181.
29. Schubert S, Picard B, Gouriou S, Heesemann J, Denamur E. Yersinia high-pa-thogenicity island contributes to virulence in Escherichia coli causing extrain-testinal infections. Infect Immun 2002;70(9):5335– 5337.
30. Chaturvedi KS, Hung CS, Giblin DE et al. Cupric yersiniabactin is a virulence- -associated superoxide dismutase mimic. ACS Chem Biol 2014;9(2):551– 561.
