1 Lublin, 11 grudnia 2017 r.
OCENA
rozprawy doktorskiej mgr Kamili Osadnik
pt. „Badania możliwości otrzymania kopolimeru simwastatyny z L-laktydem oraz analiza procesu degradacji otrzymanego materiału polimerowego”
Przedstawiona mi do oceny praca doktorska mgr Kamili Osadnik (słuchaczki studiów doktoranckich ŚUM) została wykonana w Katedrze i Zakładzie Biofarmacji Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach pod kierunkiem Pana prof. dr hab. n. farmaceutycznych Janusza Kasperczyka. Zespół naukowy pod kierunkiem Pana Profesora od wielu lat z sukcesami zajmuje się syntezą polimerów oraz badaniami strukturalnymi, fizykochemicznymi i biologicznymi polimerów i kopolimerów w celu ich wykorzystania w medycynie. Z zaciekawieniem zapoznałam się więc z obecną dysertacją. Tematyka badawcza ocenianej pracy doktorskiej dotyczy otrzymania kopolimeru L-laktydu i simwastatyny, z przeznaczeniem na materiał do pokrywania stentów naczyniowych metalowych lub tworzenia stentów polimerowych.
Dysertacja doktorska jest bardzo obszerna – przedstawiony do recenzji wydruk rozprawy stanowi bowiem 140 stron (po odjęciu stron tytułowych). Zawiera ona typowy dla rozpraw doktorskich podział na części: Wstęp, Założenia i cele pracy, Materiał i metody, Wyniki, Dyskusję, Wnioski, Piśmiennictwo, Streszczenie w języku polskim i angielskim oraz Aneks zawierający zakres widm 1H NMR dla wszystkich materiałów i simwastatyny.
Zamieszczony w niej również został Wykaz skrótów stosowanych w dysertacji oraz Wykaz tabel i rycin. Bibliografia obejmuje znaczną ilość cytowań (199 pozycji) i uwzględnia najnowsze publikacje z obszaru badawczego Doktorantki.
W części wstępnej pracy Doktorantka dokonała szerokiego przeglądu piśmiennictwa naukowego dotyczącego problemu leczenia choroby niedokrwiennej serca, a w szczególności stosowania stentów, które ograniczają postęp zmian miażdżycowych w tętnicach.
Uwzględniła w tym opisie rodzaje stosowanych stentów oraz problem związany z restenozą w stentowanych naczyniach, jak również scharakteryzowała simwastatynę – lek należący do
2 statyn – wykorzystywany najczęściej praktycznie do redukcji poziomu cholesterolu we krwi.
Doktorantka wskazała inne możliwości terapeutyczne simwastatytny, a mianowicie jej korzystny wpływ na funkcje śródbłonka naczyń krwionośnych, w tym działania antyproliferacyjne na komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych, co jest pożądane przy zabiegach interwencji wieńcowej z założeniem stentu. W kontekście poruszonego problemu restenozy i ponownego zwężania naczyń Autorka przedstawiła rezultaty badań prowadzonych w wielu światowych laboratoriach nad ograniczaniem przerostu ścian naczyń poprzez modyfikacje materiałów polimerowych i wykonywania z nich stentów lub stosowanie polimerów do powlekania stentów metalicznych. Odkryciem okazały się stenty typu DES, czyli stenty uwalniające lek, ograniczający restenozy, których część wprowadzono do praktyki klinicznej. Jednak w dalszym ciągu na świecie trwają prace badawcze nad, z jednej strony dobraniem odpowiedniego degradowalnego polimeru na stent, a z drugiej nad odpowiednią substancją hamującą powstawanie neointimy w pewnym czasie po zabiegu. Tak więc praca Doktorantki znakomicie wpisuje się w nurt zagadnień związanych z tworzeniem nowej generacji stentów naczyniowych. Podkreślić w tym momencie należy właściwe dobranie treści we Wstępie pracy, które ułatwiają zrozumienie części eksperymentalnej pracy.
Część przeglądowa dysertacji wskazuje, że Doktorantka dysponuje aktualną wiedzą z interesującego Ją zakresu badawczego i oceniam to pozytywnie.
Przekonywujące, co do wystawienia pozytywnej oceny problematyki badań, są też treści zawarte w rozdziale pt. „Założenia i cele pracy”. Autorka uzasadniła wagę problemu restenozy, czyli nawrotu zwężenia naczynia po zaimplantowaniu stentu, istnienia zależności między wymienionym zjawiskiem a rodzajem zastosowanego stentu oraz rodzajem zmiany i profilem klinicznym pacjenta. W kontekście powyższego, nadal w licznych ośrodkach naukowych prowadzone są badania nad nowymi technologiami służącymi do niwelowania ryzyka zakrzepicy naczyń, tak więc kontynuacja badań nad tworzeniem kopolimerów na materiały do pokrywania stentów wieńcowych, czy biodegradowalnych stentów polimerowych jest jak najbardziej słuszna.
W następnej części Doktorantka opisała metodykę badań własnych. Opisy procedur badawczych i warunków doświadczeń pod względem merytorycznym nie budzą zastrzeżeń.
Badania zostały wykonane z użyciem nowoczesnych technik (spektrometrii magnetycznego rezonansu jądrowego, spektroskopii oscylacyjnej w podczerwieni, chromatografii żelowej,
3 termograwimetrii, elektroprzędzenia, skaningowej mikroskopii elektronowej, spektrofotometrii). Wyniki badań własnych obejmują kilka części. Są to: analiza struktury chemicznej simwastatyny, synteza, charakterystyka i analiza materiałów polimerowych L- Laktyd-Simwastatyna otrzymanych metodą bezpośredniej polimeryzacji i metodą kopolimeryzacji ROP, poprzedzonej zabezpieczeniem II-rzędowej grupy karboksylowej simwastatyny, degradacja matryc polimerowych zawierających jednostki simwastatyny oraz matryc bez leku. Osobną częścią badań było pokrywanie techniką elektroprzędzenia stentów (metalowego oraz biodegradowalnego polimerowego) powłoką z kopolimeru PLA-SIM i wykonanie wizualizacji pokrycia techniką SEM.
Część badawczą pracy doktorskiej oceniam bardzo dobrze, a uzyskane rezultaty są interesujące aplikacyjnie. Autorka otrzymała nowe materiały na drodze koordynacyjnej ROP, czyli otwarcia pierścieni laktonowych monomerów (L-laktyd i Simwastatyna). Wykazała tu korzystne zastosowanie związku cyrkonu jako efektywnego inicjatora kopolimeryzacji w łagodnych warunkach temperaturowych. Zaproponowany przez Doktorantkę sposób wbudowania leku w łańcuch PLA warty jest podkreślenia, gdyż aktywność farmakologiczna simwastatyny wiąże się z jej konwersją do β-hydroksykwasu. Tak więc, dzięki uzyskanej w metodzie strukturze, lek będzie mógł być uwalniany w postaci aktywnej w miejscu implantacji, co podnosi wartość terapeutyczną zmodyfikowanego biomateriału. Autorka przeprowadziła kopolimeryzację SIM z LA dwiema metodami – metodą bezpośredniej kopolimeryzacji simwastatyny z L-laktydem (6 materiałów) oraz kopolimeryzację poprzedzoną zabezpieczeniem II-rzędowej grupy hydroksylowej simwastatyny za pomocą 3,4-dihydro-2H-pyranu (materiały L1, L2, L3). Wszystkie otrzymane kopolimery przy pomocy nowoczesnej metodyki zostały kompleksowo przebadane pod kątem ich przydatności aplikacyjnej. Okazało się, że zabezpieczenie II-rzędowej grupy OH simwastatyny za pomocą 3,4-dihydro-2H-pyranu zapobiega reakcji koniugacji użytych monomerów. Doktorantka tym sposobem uzyskała więc materiały o wyższym stężeniu jednostek simwastatynowych w łańcuchach poli-L-Laktydu i wyższych wartościach (średnio liczbowo) masy cząsteczkowej w porównaniu do materiałów otrzymanych metodą bezpośredniej kopolimeryzacji SIM z LA.
Przebadana została mikrostruktura łańcuchów kopolimerowych PLA-SIM oraz określony został sposób uwalniania z nich β-hydroksykwasu SIM. W kolejnym etapie zostały dokonane
4 analizy degradacji kopolimerów (w 36-tygodniowym okresie) i Doktorantka otrzymała pozytywne efekty – dzięki zwiększeniu hydrofilowości kopolimeru przez wbudowanie w łańcuch polimerowy simwastatyny uzyskano przyspieszenie degradacji materiału i uzyskanie dogodnej kinetyki uwalniania wymienionego leku. Na podkreślenie zasługuje końcowy etap badawczy prac Doktorantki, mianowicie uzyskanie z otrzymanego materiału kopolimerowego PLA-SIM (kopolimer L3) mikrowłókniny na biodegradowalnym stencie polimerowym i stencie metalowym.
Obszerny materiał eksperymentalny został poddany dyskusji w kolejnym rozdziale rozprawy doktorskiej. Dyskusja została przeprowadzona rzetelnie i dojrzale. Ta część dysertacji świadczy o umiejętności Doktorantki do krytycznego podejścia do własnych rezultatów i porównania ich do wyników dotyczących zakresu tematycznego badań uzyskanych przez innych autorów.
W ocenie ogólnej pracy niewątpliwie można podkreślić, że praca jest koncepcyjnie interesująca i wykonawczo dobra. Na podstawie uzyskanych przez Doktorantkę rezultatów można będzie prowadzić w przyszłości bardziej zaawansowane prace nad aplikacyjnością kopolimerów PLA-SIM. Przeprowadzone przez panią mgr Kamilę Osadnik badania, są istotne i ważne, zwłaszcza w zakresie wdrażania materiałów do modyfikacji produktów medycznych dla chirurgii naczyniowej i kardiochirurgii. Między innymi: niektóre z badanych kopolimerów będą mogły być wykorzystane do konstruowania powłok w stentach naczyniowych co może wpłynąć na otrzymanie korzystnych cech tych wyrobów medycznych takich jak: hamowanie procesu tworzenia neointimy i blokowanie restenozy po zabiegach naczyniowych. Konkludując, efektem przeprowadzonych badań w ramach doktoratu jest wyselekcjonowanie materiałów kopolimerowych PLA-SM – wartościowych dla zastosowań biomedycznych, a zwłaszcza przeznaczonych jako pokrycia dla stentów wieńcowych.
W trakcie czytania dysertacji nasunęły mi się uwagi związane z brakami lub nieścisłościami o charakterze merytorycznym i redakcyjno-edytorskim. Są one następujące:
- We Wstępie pkt 1.3.3 (Degradacja materiałów polilaktydowych) na str. 25 sformułowanie, cyt. „Eliminacja kwasu mlekowego zachodzi w mitochondriach, gdzie w cyklu Krebsa mleczan ulega przekształceniu do CO2 i wody” jest błędne. Kwas mlekowy powstaje w cytoplazmie komórek w warunkach glikolizy beztlenowej i nie ulega przemianie
5 w mitochondriach. Kwas mlekowy powstający w cytoplazmie komórek budujących tkanki, czy narządy musi być usuwany. Dostaje się on do krwi i dalej prowadzony jest do komórek wątrobowych (to tzw. cykl Cori), gdzie w ich cytoplazmie ulega utlenieniu do pirogronianu a ten dopiero wchodzi do macierzy mitochondrialnej i tam ulegając dehydrogenacji przechodzi w acetyloCoA, który włącza się w cykl Krebsa. Taka jest biochemia przemian kwasu mlekowego.
- W dysertacji często pojawia się sformułowanie – kopolimer w pełni biozgodny, ulegający resorpcji w organizmie – i jest ono używane w pracy, która nie obejmuje badań komórkowych ani in vivo, więc słowo biozgodność, nie jest akurat tu trafne. Biozgodność to znaczy zdolność prawidłowego zachowania materiału w kontakcie z tkanką. Ma to szczególne znaczenie dla wyrobów medycznych kontaktujących się z krwią, której składniki szczególnie reagują na wszelkie niekorzystne czynniki, a powstałe zaburzenia mogą wywoływać ogólnoustrojowe skutki. Również produkty biodegradacji materiału, same lub w kompleksach białkowych, mogą w różnych okresach po implantacji wywoływać wczesne i późne reakcje.
Ze względu na uzyskane korzystne pod względem aplikacyjności rezultaty mniemam, że promotor pracy prof. J. Kasperczyk ma w planie kolejnego etapu badawczego przeprowadzenie kompleksowej biologicznej oceny biozgodności kopolimerów in vitro i in vivo w zakresie stosownych norm.
- W części Wnioski – wniosek 7, określający, że wyselekcjonowano materiały, których profil uwalniania β-hydroksykwasu SIM i jego stężenie pozwala na zastosowanie ich w hamowaniu aktywności miocytów i zapobieganiu restenozie jest za daleko idący, tym bardziej, że Doktorantka nie wykonywała stosownych badań dla potwierdzenia postawionego wniosku.
- W części Wyniki rozdz.4.4. na str. 97 została zamieszczona tabela XIV dotycząca profilu uwalniania β-hydroksykwasu SIM z badanych matryc, natomiast w tekście brak odniesienia Autorki do otrzymanych rezultatów zamieszczonych w tej tabeli. Jest to akurat zakres farmacji stosowanej i oczekiwałam dokładniejszego omówienia kinetyki uwalniania leku. Być może zmiana sposobu przedstawienia rezultatów z formy tabeli na graficzną byłaby korzystniejsza i łatwiejsza w interpretacji. Mam również niedosyt, co do skąpego odniesienia się autorki do wyników zamieszczonych w tabeli XIII, a dotyczących charakterystyki
6 mikrostruktury matryc i blendy. Próba omówienia kinetyki znalazła się na str. 109 Dyskusji, ale błędnie powołano się na tabelę XI (Charakterystyka materiałów L1-L3, str. 89).
Podczas zapoznawania się z pracą doktorską nasunęły mi się też drobne uwagi edytorskie. Uważam, że korzystniej dla czytelnika jest, gdy wykorzystane piśmiennictwo cytowane jest w tekście za pomocą nazwisk autorów, a nie numerów przypisanych zgodnie z kolejnością występowania. Również korzystniej jest, gdy w spisie piśmiennictwa prace podawane są w kolejności alfabetycznej wg. nazwiska pierwszego autora. Pod względem edytorskim praca jest przygotowana starannie, choć wkradły się błędy stylistyczne i literowe czy interpunkcyjne.
Wymienione przeze mnie uwagi nie zmieniają mojej bardzo dobrej opinii o pracy doktorskiej mgr Kamili Osadnik.
Podsumowując: stwierdzam, że Pani mgr Kamila Osadnik zrealizowała postawione cele badawcze, a praca wpisuje się w aktualny nurt badań dotyczących nowych technologii służących do niwelowania ryzyka zakrzepicy naczyń i zawiera istotne elementy nowości naukowej. Przedstawiona do oceny praca doktorska wykazuje, że Doktorantka posiada doświadczenie i umiejętności prowadzenia badań na warstwach polimerowych do zastosowań medycznych. Całość dysertacji doktorskiej prezentuje dobry poziom naukowy, ma wartości poznawcze i praktyczne. Obejmuje dobrze udokumentowane i rozległe badania dotyczące opracowania resorbowalnego materiału kopolimerowego. Dodatkowo uzyskanie przez Doktorantkę efektu korzystnego uwalniania β-HK SIM z materiału świadczy o nowatorskim charakterze badań.
Po analizie dokumentacji z przekonaniem stwierdzam, że Rozprawa doktorska Pani mgr Kamili Osadnik spełnia, według mojej opinii, wymogi ustawy z dnia 14 marca 2003 r (dz. U. Nr. 65, poz. 595 z 16 kwietnia 2003 r z późniejszymi zmianami) „O stopniach i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki” i w związku z tym wnioskuję do Rady Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach o dopuszczenie Doktorantki do dalszych etapów przewodu doktorskiego.
