Określanie zasiedlenia podłoża grzybami mikoryzowymi metodą oznaczania chityny

R O C Z N IK I G L E B O Z N A W C Z E T. X L N R 2 W A R S Z A W A 1989 S . 119—140

M A R IA TR ZC IŃ SK A

OK REŚLENIE ZASIEDLENIA PODŁOŻA GRZYBAM I MIKORYZOW YMI METODĄ OZNACZANIA CHITYNY

Z akład G leb ozn aw stw a i N aw ożen ia In sty tu tu B ad aw czego L eśn ictw a, S ęk ocin

W STĘP

W ystępujące w ostatn ich latach głębokie i niekorzy stne zm iany w środow isku, pow odujące w konsekw encji zam ieranie drzew ostanów , stw a rz a ją potrzebę prow adzenia w ielu badań, m .in. w zakresie diagno­ sty ki m ikoryzow ej korzeni drzew oraz szczepień m ikoryzow ych w szkół­ kach leśnych. W m ikroflorze glebow ej g rzy b y m ikoryzow e są bow iem jednym z najczulszych w skaźników zm ian zachodzących w środow isku glebow ym . Od praw idłow ego rozw oju m ikoryzy sadzonek w dużym stop­ n iu zależy ich zdolność przeżycia po p rzen iesien iu do u p raw leśnych, szczególnie w glebach skażonych. W obu w spom nianych k ieru n k ach ba­ d ań konieczne je st posługiw anie się m ożliw ie p rostą i p recy zy jn ą m etodą oznaczania stopnia infekcji m ikoryzow ej. K lasyczne sposoby tak ich ozna­ czeń, w k tó ry ch w y k o rzystyw an e są głów nie m etody optyczne, są czaso­ chłonne, obarczone dużym błędem indyw idualnym , a ponadto nie pozw a­ la ją określić biom asy strzępek tw orzących m ikoryzę.

J e d n ą z m etod określania biom asy grzybów w różnych podłożach jest oznaczanie w nich chityny. W m etodzie tej w y k o rzystuje się fakt, że ch ity n a — n a tu ra ln y polim er N -acetylo-D -glukozoam iny — je st s tru k tu ­ raln y m składnikiem ściany kom órkow ej większości grzybów . M etodą oznaczania c h ity n y określano infekcję tk an k i roślinnej przez grzy b y p a ­ togeniczne [21, 31]. Stosow ano ją rów nież w badaniach m edycznych p rzy w y k ry w a n iu i o k reślan iu ilościow ym g rzybni w tk an k ach zakażonych zw ierząt dośw iadczalnych [32], a także w bad an iu gnijącego d rew na [3, 28] i zainfekow anych p ro d uk tó w spożyw czych [12, 24]. W 1977 roku H ep p er zaproponow ał, aby do szacow ania infekcji endom ikoryzow ej sto­ sować oznaczanie ch ity n y [7].

M etoda określania infekcji grzybow ej n a podstaw ie zaw artości ch ity ­ n y jest czuła i stosunkow o prosta, w ym aga jed n ak znajom ości zaw artości

c h ity n y w grzybni poszczególnych grzybów oraz zm ian tego p a ra m e tru w zależności od w aru nkó w środow iska. Szczegółowe badania w ykazały, że zaw artość ch ity n y w ścianach kom órkow ych różnych grzybów jest bardzo zróżnicow ana. Na p rzy kład ściana kom órkow a A llo m yces m acro- g yn u s aż w 60% zbudow ana jest z ch ity n y [9], w hubie drzew nej (H etero-

basidion annosus) ch ity n a stanow i 16% ściany kom órkow ej [6], a w p ato­

genicznym grzybie V en tu ria inaequalis zaledw ie 7,3% [8]. P rzy tak znacznych różnicach w udziale ch ity n y w stru k tu rz e ściany kom órkow ej różnych grzybów , rów nież w yniki oznaczeń stężenia tego w ielocukru w całej biom asie m uszą zm ieniać się w szerokich granicach. W cześniejsze nasze b ad ania w ykazały, że zaw artość c h ity n y w 6-tygodniow ej grzybni w egetaty w n ej w y b ra n y c h grzybów m ikoryzow ych w ah a się od 1,9 do 8,9% s.m. [29]. Stw ierdzono też, że zaw artość c h ity n y w grzybni zm ie­ n ia się w raz z jej w iekiem [25, 29, 30], a także zależy od źródła azotu w podłożu [11, 16, 29].

N iniejsza p raca m iała na celu zbadanie w pływ u w aru n k ó w hodowli w y b ran y ch grzybów m ikoryzow ych na zaw artość c h ity n y w grzybni w e­ g etaty w n ej. B adano w pływ , jak i n a zaw artość ch ity n y w y w iera zm iana stężenia cukru, stosunek С : N w podłożu, a także dostęp tle n u i obniże­ nie pH, spow odow ane nagrom adzeniem się kw asow ych m etabolitów w czasie hodowli. N astępnie b adano m etodą oznaczania ch ity n y korzenie m ikoryzow e sosny. Oceniono p rzydatność om aw ianej m etody do szaco­ w an ia infekcji m ikoryzow ej korzeni. Zastosow ano rów nież oznaczanie ch ity n y do określania biom asy grzyba w szczepionkach m ikoryzow ych i oceniono możliwości w y k o rzy sty w an ia tej m etody w p racach n ad o trzy ­ m aniem inokulum m ikoryzow ego i sztuczną m ikoryzacją sadzonek w szkółkach leśnych.

M A TER IAŁY I M ETODY

Do b adań u żyto n astęp u jący ch szczepów grzybów ektom ikoryzow ych : Cenococcum graniform e (Sow.) Ferde. W inge, n r 3543, H ebelom a m eso- ph a eu m (Pers. ex Fr.) Quel, n r 3037, S u illu s bovinus (L. ex Fr.) O. K untze, n r 1941, 5382, T uber rapaeodorum Tul., n r 5266, 5268, M orchella conica Pers., n r 5390.

Poniew aż analizy m ikotrofizm u sadzonek w szkółkach, szczególnie w ieloletnich, w y k azują m asow ą ek spansję grzybów ektendom ikoryzo- w ych [10, 14, 19], p rzeto do b ad ań w łączono też izolow any z m ikoryzy sosny grzyb ektendom ikoryzow y, oznaczony sym bolem M rgX I.

W szystkie użyte w niniejszej p racy szczepy pochodziły z kolekcji P ra ­ cowni Biologii Gleb Leśnych, Z akładu G leboznaw stw a i N aw ożenia In sty ­ tu tu Badaw czego Leśnictw a. Liczby podaw ane p rzy nazw ach grzybów oznaczają n u m ery katalogow e kolekcji.

O znaczanie c h ity n y w grzybach m ik oryzow ych 1 2 1

B A D A N I E W P Ł Y W U Z M IA N Y pH P O D Ł O Ż A S P O W O D O W A N E J N A G R O M A D Z E N IE M S IĘ K W A S O W Y C H M E T A B O L IT Ó W N A Z A W A R T O ŚĆ C H IT Y N Y W G R Z Y B N I

Hodowle prow adzono na p ły n nej pożywce podstaw ow ej (Pp) zaw iera­ jącej w 1000 m l: 20 g glukozy, 2,5 g w yciągu słodowego, 0,5 g w in ian u am onu, 0,5 g M g S 04-7H20 , 1 g K H2P 0 4, 0,5 ml 0,2% roztw oru Z n S 04

i 50 |ig tiam in y ; pH pożyw ki doprow adzano do 5,6 dla M. conica 5390 i T. rapaeodorum 5268, a dla M rgX I do 6,5. Szczep M rgX I hodow ano także na zm odyfikow anej pożywce Pp, do któ rej nie dodano w yciągu sło­ dowego, a w in ian am onu zastąpiono (NH4)2S 0 4. Hodowle prow adzono w 50 m l porcjach pożywki. Po 2, 4 lub 6 tygodniach inkubacji w tem p e­ ra tu rz e 27°C grzybnie z poszczególnych hodowli zbierano, suszono przez 18 godzin w tem p e ra tu rz e 80°C i ważono. N astępnie w g rzybni określano zaw artość chityny. W pły n ach pohodow lanych oznaczano pH m etodą po- tencjom etryczną. K ażdy w a ria n t w y k o ny w an y był w 9 - 1 2 pow tórze­ niach.

B A D A N IE W P Ł Y W U S T Ę Ż E N IA G L U K O Z Y I S T O S U N K U С : N W PO Ż Y W C E N A Z A W A R T O ŚĆ C H IT Y N Y W G R Z Y B N I

Hodowle prow adzono n a zm odyfikow anej pożywce Pp, do której nie dodaw ano w yciągu słodowego, n ato m iast stężenie glukozy wynosiło 1,25, 2,5 lub 5,0%. Na pożywce um ieszczano siatkę plastykow ą w celu u trz y ­ m ania inokulum n a pow ierzchni. Do dośw iadczeń użyto szczepu T. rapa­

eodorum 5266. Po 2 i 6 tygodniach hodowli w te m p e ra tu rz e 27°C g rzy b ­

nie zbierano z pow ierzchni siatek, przem yw ano w odą destylow aną i su ­ szono w tem p e ra tu rz e 80°C. W każdym term in ie analizow ano 10 rów no­ ległych hodowli.

W ykonano też dw a dośw iadczenia, k tó ry ch celem było u stalen ie w p ły ­ w u stosunku С : N w podłożu n a zaw artość ch ity n y w grzybni. W p ierw ­ szym dośw iadczeniu szczep S. bovinus 1941 hodow ano przez 2 tygodnie w tem p e ra tu rz e 27°C na pow ierzchni płyn n ej pożyw ki Pp oraz na po­ żyw kach zaw ierających podw ójną (1 g/l) i zm niejszoną do połowy (0,25 g/l) daw kę w in ian u am onu. D rugie dośw iadczenie przeprow adzono hodując szczep H. m esop h aeum 3037 w pożywce płyn nej, łagodnie w y trząsan ej. Obok pożyw ki zaw ierającej 2,5% glukozy i 0,5 g/l w in ian u am onu, p rzy ­ gotow ano pożyw ki o zaw artości w in ian u am onu w ynoszącej 0,25 g/l lub 1 g/l oraz pożywki, w k tó ry ch było 1,25% glukozy, a w in ian u am onu 0,25 lub 1 g/l. Po 7 dniach hodow li całą g rzybnię zbierano n a sitku i przygotow ano do analizy tak, jak w poprzednich dośw iadczeniach. K aż­ da kom binacja w yko n yw an a była w 4 - 6 pow tórzeniach, a istotność róż­ nic pom iędzy śred nim i w eryfikow ano za pom ocą testu S tu d enta.

B A D A N IE Z A W A R T O Ś C I C H IT Y N Y W G R Z Y B N I S U B S T R A T O W E J I P O W IE T R Z N E J

Do analizy użyto k u ltu r rosnących n a pożywce agarow ej Pp. Z każ­ dej p ły tk i zbierano osobno g rzybnię po w ietrzn ą i su b stra to w ą w raz z agarem . A gar usu w an o przez ogrzew anie próbki zalanej w odą destylo­

w a n ą do te m p e ra tu ry około 90°C, a n a stę p n ie przez odsączanie rozpusz­ czonego ag aru na sitku. W celu u jednolicenia postępow ania, grzybnię po­ w ie trz n ą rów nież ogrzew ano w wodzie destylow anej. Po odsączeniu i przem yciu w odą destylow aną, grzybnie suszono 18 godzin w te m p e ra ­ tu rz e 80°C.

B A D A N IE Z A W A R T O Ś C I C H IT Y N Y W K O R Z E N IA C H M IK O R Y Z O W Y C H

B adano korzenie siew ek sosny z syntez m ikoryzow ych in vitro ze szczepem S. bovinus 1941 i C. graniform e 3543 oraz korzenie dw uletnich sadzonek sosny p ob ran y ch ze szkółki leśnej.

S y ntezy m ikoryzow e zakładano m etodą opisaną przez P achlew ską [13]. Ja k o podłoże stosow ano 2% agar w łó k nisty z dodatkiem tiam in y w ilości 100 jig/1. S tery lizację pow ierzchniow ą nasion sosny w ykonyw ano zanu­ rzając w 0,2°/o sublim acie zwilżone w odą nasiona na 3 m inu ty, a n a stę p ­ nie płucząc je przez 10 m in kolejno w trzech porcjach stery ln ej w ody destylow anej. Inokulum badanego g rzyba m ikoryzow ego w prow adzano do probów ek z roślinam i po m iesiącu od chw ili w prow adzenia skiełkow ane­ go nasienia. Po w prow adzeniu grzyba dodaw ano do podłoża agarow ego dw ie krople płynn ej pożyw ki P p, aby zapoczątkow ać w zrost grzyba. Tak przygotow ane hodow le um ieszczano w hali w egetacy jnej n a okres 14 (synteza sosny z S. bovinus) lub 19 m iesięcy (synteza z C. graniform e). Po ty m okresie korzenie roślin dośw iadczalnych w yjm ow ano, oczyszczano z ag aru i n a każdym określano liczbę m ikoryz.

K orzenie 2 -letnich siew ek sosny pobierano w szkółce leśnej IBL z n aj­ dującej się n a tere n ie N adleśnictw a Chojców, Leśnictw o Sękocin, oddz. 41f. Szkółka ta, o pow ierzchni 2,0 ha, założona została w 1970 r. n a siedlisku BM św; w ierzch nią w arstw ę u p raw n ą stanow iły piaski luźne i piaski słabogliniaste, pH gleby w ynosiło 5,7 - 6,0. K orzenie przed poddaniem hydrolizie oczyszczano z gleby, płucząc je w wodzie w odociągowej.

P rz y szacow aniu zaw artości c h ity n y na podstaw ie ilości glukozoam iny w h y d ro lizatach z korzeni n ależy uw zględnić obecność am inocukrów w hy dro lizatach z tk an e k roślin y gospodarza. W kom órkach roślin w yż­ szych nie w y stęp u je w praw dzie chityna, ale z n a jd u ją się drobne ilości am inocukrów , głów nie w postaci glikoproteidów [20, 2 2, 23]. Dlatego ko­ nieczne je s t ustalen ie poziom u glukozoam iny w hydro lizatach czystych nie zainfekow anych korzeni. O dpow iedni m a te ria ł do tak iej k on tro li łatw o uzyskać p rzy prow adzeniu hodow li in vitro w w a ru n k a ch ste ry l­ nych. Jed n akże w śród roślin rosnących w w aru n k ach n a tu ra ln y c h nie sposób znaleźć osobnika, którego korzenie nie b y łyb y zainfekow ane g rzy ­ bem m ikoryzow ym lub innym . Ponadto w ykazano, że poziom am inocu­ krów , dających reakcję b a rw n ą z odczynnikiem Erlicha, w hyd rolizatach z korzeni sosny hodow anej w w aru n k ach stery ln y ch n a pożyw kach aga­ row ych zm ienia się w zależności od składu podłoża. Na przyk ład w

ko-O znaczanie c h ity n y w grzybach m ik oryzow ych _{1 2 3}

rżeniach siew ek rosnących n a pożywce agarow ej bez azotu w y k ry w an o średn io 0,83 jag glukozoam iny w 1 mg s.m., a gdy rośliny rosły n a tak im sam ym podłożu, ale w zbogaconym siarczanem am onu lub m ocznikiem (50 mg N n a 1) h y d ro liz aty ich korzeni zaw ierały średnio 1,40 jig glukozo­ am iny w 1 mg s.m. P lassard i in. [17] proponują, aby jako kontroli uży­ w ać korzenia głównego rośliny, w k tó ry m z reg u ły nie w y k ry w a się strzęp ek grzyba. A utorzy ci w ykazali, że tak w yko nan a kon tro la nie różni się isto tnie od k o n troli przy go to w anej z korzeni roślin hodow anych w w a ru n k a ch stery lnych . O pierając się n a ty ch badaniach, w niniejszych dośw iadczeniach p rzy ję to jako k ontrolę korzeń głów ny badanej rośliny. S topień infekcji ustalan o więc n a podstaw ie różnicy w poziom ie am ino- cu krów w h yd ro lizatach z korzeni bocznych i z korzenia głównego.

B A D A N I E Z A W A R T O Ś C I C H IT Y N Y W H O D O W L A C H N A P O D Ł O Ż U Z P E R L IT U

W słoikach o pojem ności 150 ml z korkam i gum ow ym i um ieszczano po 5 g p e rlitu i dodaw ano 20 ml pły n nej pożyw ki Pp. Podłoża po ste ry ­ lizacji w te m p e ra tu rz e 117°C przez pół godziny w autoklaw ie szczepiono grzybem *S. bovinus 1941 lub H. m esophaeum 3037. Po 2-, 4-, 6- lub

8-tygodniow ej hodow li w tem p e ra tu rz e 27°C analizow ano po trz y ho­ dow le każdego grzyba. Z aw artość słoika płu k ano n a sitk u w odą destylo­ w an ą w celu odm ycia pożywki, a n astęp n ie suszono przez noc w tem p e­ ra tu rz e 80°C i hom ogenizow ano rozcierając w m oździerzu porcelanow ym . Z każdej hodowli do hydrolizy naw ażano dw ie 0,5 g 'próbki. P rzygoto­ w ano także podłoża, składające się z p e rlitu i to rfu w stosunku 9 : 1 z do­ d atk iem pożyw ki Pp. Podłoże to szczepiono grzybem S. bovinus 5382. Hodowle prow adzono w 1-litrow ych kolbach E rlen m ay era zam kniętych korkam i z w aty, poniew aż stw ierdzono, że przy dłuższej inkubacji szczel­ ne zam knięcie hodow li korkiem gum ow ym , uniem ożliw iającym w ym ianę gazow ą z otoczeniem , h am u je w zrost grzyba. Po półrocznej ink u bacji w tem p e ra tu rz e 23°C z hodow lam i postępow ano analogicznie jak z ho­ dow lam i n a sam ym perlicie. P rzedłużenie w stosunku do innych dośw iad­ czeń czasu in k ubacji m iało na celu uzyskanie obfitego nam nożenia g rzy ­ ba. W obu om aw ianych dośw iadczeniach kontrolę stanow iły nie szcze­ pione podłoża.

O Z N A C Z A N IE C H IT Y N Y

C hitynę oznaczano n a podstaw ie zaw artości glukozoam iny w h y d ro ­ lizatach badanego m ateriału . W ty m celu grzybnię lub korzenie h y d ro ­ lizo w ano przez 50 godzin w stężonym HC1 w te m p e ra tu rz e pokojow ej. N astępnie próbki rozcieńczano w stosunku 1 : 1 i um ieszczano n a 9 go­ dzin we w rzącej łaźni w odnej. H yd ro lizaty odparow yw ano do sucha w stru m ie n iu gorącego pow ietrza w celu usunięcia n a d m ia ru kw asu. N a­

stępnie próbki rozpuszczano w wodzie redestylow anej i przesączano iloś­ ciowo przez sączek z bibuły. Glukozę z a w a rtą w próbce oddzielano na kolum nie w ypełnionej Z erolitem 225. G lukozoam inę eluow ano z kolum ny IM HC1. Z przesączów u suw ano HC1, odparow ując go w stru m ie n iu go­ rącego pow ietrza. Pozostały osad rozpuszczano w znanej objętości wody destylow anej i w otrzy m an ych roztw orach glukozoam inę oznaczano kolo­ rym etry czn ie m etodą M organa-Elsona [26].

Nieco inaczej postępow ano z hodow lam i n a perlicie, poniew aż stw ie r­ dzono, że p e rlit silnie sorbuje glukozoam inę; w odą m ożna było w ypłukać zaledw ie 40% tego zw iązku. S tw ierdzono natom iast, że z nakroplonego n a p e rlit roztw oru glukozoam iny 90% m ożna w ypłukać IM HC1. Dlatego po hydrolizie, próbki z hodowli n a perlicie nanoszono n a sączek i p rze ­ m yw ano IM HC1, a dopiero po oddzieleniu p e rlitu usuw ano n ad m iar kw asu i oczyszczano h yd ro lizaty na Zerolicie 225.

S taran o się także ustalić precyzyjność stosow anej m etody oznaczania chityny. W tym celu oznaczano niezależnie od siebie dw ie naw ażki chi- ty n y firm y Sigm a oraz dw ie części grzybni &. bovinus 1941 pobranej z tej sam ej hodowli. O trzym ane oznaczenia zaw artości glukozoam iny róż­ n iły się w pierw szym p rzy p ad k u o 1% , a w d rugim o 3,5% .

W YNIKI I D Y SK U SJA

W PŁ Y W Z M IA N Y pH P O D Ł O Ż A W Y W O Ł A N E G O N A G R O M A D Z A N IE M SIĘ W C Z A S IE H O D O W L I K W A S O W Y C H M E T A B O L IT Ó W N A Z A W A R T O ŚĆ C H IT Y N Y W G R Z Y B N I

G rzyby m ikoryzow e należą do m ikroorganizm ów bardzo tru d n y c h do hodow li i rosną wolno. Tem po w zrostu k u ltu r szczepionych w ty m sa­ m ym czasie, m im o m aksym alnej stan d ary zacji tech nik i szczepienia, jest często różne. W czasie hodowli grzybów n a skutek nagrom adzenia się kw asow ych m etabolitów zm ienia się pH podłoża. K u ltu ry szybciej ro sn ą­ ce w y tw a rz ają w ięcej m etabolitów zakw aszających środow isko niż k u l­ tu ry tego sam ego szczepu rosnące w olniej. Pom im o jednakow ego pH pod­ łoża p rzy szczepieniu, odczyn środow isk, w k tó ry ch om aw iane k u ltu ry rosną, już po k ró tk im czasie in k u b acji staje się różny. W ykazano др., że pH w hodow lach szczepu M. conica 5390, w ynoszące w m om encie rozpo­ częcia dośw iadczenia 5,6, już po dwóch tygodniach in k ub acji w ahało się w granicach 4,5 do 3,4. W dw utygodniow ych hodow lach szczepu T. ra-

paeodorum 5268 odczyny pożyw ek w ah ały się od 4,6 do 3,8 (tab. 1). Po­

dobnie zróżnicow ane było pH w 4-tygodniow ych hodow lach M rgX I (tab. 2).

We w szystkich om aw ianych dośw iadczeniach uzyskano różne plony grzybni. W ykazano, że stopień zakw aszenia podłoża hodow lanego jest w y raźn ie skorelow any z m asą grzy bn i zebranej z danej hodowli. W spół­ czynniki korelacji dla w spom nianych w ielkości w e w szystkich dośw

iad-T a b e la 1 Plon grzybni, zawartość chityny i pH płynów pohodowlanych w 2- i 6-tygodniowych hodowlach MorcheUa conica oraz w 2-tygodniowych hodowlach ТиЬгг

rapaeodorum na pożywce Pp

Mycelium yield, chitin content in mycelium and pH of post-culture liquids in 2- and 6-week cultures of Morc/iella conica and in 2-week cultures o f Tuber rapaeo­ dorum on the Pp substrate

Morchella conica 5390 | Tuber rapaeodorum 5268

2 tygodnie hodowli — 2-week culture 6 tygodni hodowli — 6-week culture 2 tygodnie hodowli — 2-week culture

zawartość chityny , zawartość chityny plon grzybni pH zawartość chityny

plon grzybni pH (jLg glukozoaminy plon grzybni pH (i.g glukozoaminy mg s.m. podłoża pig glukozoaminy

mg s.m. podłoża na mg s.m. mg s.m. podłoża na mg s.m. mycelium pH of na mg s.m.

mycelium yield pH of chitin content mycelium pH of chitin content yield substrate chitin content

mg of d.m. substrate (xg of glucosamine yield substrate (jig of glucosamine mg of d.m. (xg o f glucosamine

per 1 mg o f d.m. mg of d.m. per 1 mg of d.m. per 1 mg o f d.m.

4,0 5,3 ! 150 7,5 4,5 228 8,0 4.6 27 6,4 5,0 119 8,2 4,5 256 6,5 4,5 20 6,7 5,0 116 6,3 4,4 214 6,4 4,4 29 7,3 5,0 93 8,2 4,4 201 5,7 4,3 31 11,9 4,9 87 6,8 4,3 211 9,2 4,3 26 10,7 4,7 145 6,9 4,3 248 11,2 4,3 25 9,7 4,6 95 7,9 4,3 214 10,4 4,2 23 11,9 4,6 121 12,0 4,0 154 9,2 4,1 22 21,2 4,4 103 6,4 3,9 207 12,7 4,0 27 13,6 3,9 169 21,5 3,8 20 26,3 3.5 230 25,0 3,4 154 A -0 ,8 6 0 7 -0 ,8 7 9 3 -0 ,8 2 2 7 В 0,3239 0,5419 0,3412

A — współczynnik korelacji między plonem a pH podłoża — correlation coefficient between the yield and pH value o f substrate

T a b e la 2 Plon grzybni, zawartość chityny i pH płynów pohodowlanych w 4-tygodniowych hodowlach

izolatu MrgX I na standardowej i zmodyfikowanej pożywce Pp

Mycelium yield, chitin content and pH o f post-culture liquids in 4-week cultures o f MrgX I isolate in standard and modified Pp substrate

Standardowa pożywka Pp Standard substrate Pp plon grzybni mg s.m. mycelium yield mg o f d.m pH podłoża pH of substrate zawartość chityny (xg glukozoaminy na mg s.m. chitin content, (j.g o f glucosamine per 1 mg o f d.m. Zmodyfikowana pożywka Pp Modified Pp substrate plon grzybni mg s.m. mycelium yield mg o f d.m. pH podłoża pH of substrate zawartość chityny ^.g glukozoaminy na mg s.m. chitin content, [xg o f glucosamine per 1 mg o f d.m. 21.7 31.0 34,5 35.7 37.0 32.0 40.9 45.8 64.0 81,7 5.9 5.9 5.8 5.8 5,7 5.6 5.6 5.6 5,0 4.7 45 44 32 35 33 36 34 39 37 36 7.5 9.5 11.4 14.4 15.4 15.5 18,3 19.6 6,0 5,9 5,8 5.6 5.6 5.5 5.5 5,2 A -0 ,9 6 7 7 В 0,2320 47 57 48 51 52 50 40 46 -0,9667 0,3860 A — współczynnik korelacji między plonem a pH podłoża

correlation coefficient between the yield and pH value o f substrate В — współczynnik korelacji między zawartością chityny a pH podłoża

correlation coefficient betweeen the chitin content and pH value o f substrate

czeniach są wysokie. Na podstaw ie tabeli w artości k ry ty czn y ch [33] po­ tw ierdzono, że om aw iane w spółczynniki korelacji są istotnie różne od zera na poziom ie ufności a = 0,01 dla 2-tygodniow ej hodowli M. conica

5390 i 4-tygodniow ej hodowli T. rapaeodorum 5268, dla pozostałych ho­

dowli zaś n a poziom ie ufności a = 0,0 0 1.

Szukano n astęp n ie zależności m iędzy odczynem pożyw ki w m om encie zakończenia dośw iadczenia a poziom em ch ity n y w grzybni zebranej z tej pożywki. Zależność ta pow inna w ystąp ić g dyby zm iany pH, pow stałe n a sku tek nagro m ad zen ia się kw asow ych m etabolitów w granicach obser­ w ow anych w tych dośw iadczeniach, w p ły w ały n a stężenie ch ity n y w strzępk ach b adan ych grzybów m ikoryzow ych. Obliczone w artości w spółczynników korelacji m iędzy poziom em c h ity n y w grzybni a w a r­ tością pH podłoża na końcu ink u bacji są niższe od staty sty czn y ch w a r­ tości k ry ty czn y ch [33]. W skazuje to na b rak zależności m iędzy om aw ia­

O znaczanie c h ity n y w grzybach m ik oryzow ych 1 2 7

nym i p aram etram i. M ożna więc sądzić, że n a zaw artość ch ity n y w g rzy b ­ ni grzybów m ikoryzow ych nie w p ły w a obniżenie pH, spow odow ane n a ­ grom adzaniem kw asow ych m etabolitów .

W PŁ Y W S T Ę Ż E N IA C U K R U O R A Z S T O S U N K U С : N W P O D Ł O Ż U N A Z A W A R T O ŚĆ C H IT Y N Y W G R Z Y B N I

W tab eli 3 p rzedstaw iono śred n ią zaw artość ch ity n y w grzybni szcze­ pu T. rapaeodorum 5266 hodow anego na pożyw kach o różnym stężen iu cukru. Stw ierdzono, że w zakresie b ad an ych stężeń glukozy ilość ch ity n y

T a b e la 3 Zawartość chityny 2- i 6-tygodniowej grzybni Tuber rapaeodorum 5266 hodowanej na zmodyfikowa­

nej pożywce Pp o różnym stężeniu glukozy

Chitin content in 2- and 6-week mycelium o f Tuber rapaeodorum 5266 cultured on modified Pp substrate at different glucose concentration

Poziom glukozy w pożywce Glucose level in substrate

%

i Zawartość chityny

[xg glukozoaminy na mg s.m. grzybni Chitin content

(xg o f glucosamine per 1 mg o f mycelium d.m. Hodowla 2-tygodniowa — 2-week culture

1,25 24

2,50 19

5,00 11

Hodowla 6-tygodniowa -- 6-week culture

1,25 48

2,50 34

5,00 22

jest ty m wyższa, im niższy jest poziom glukozy w pożywce. W eryfikacja staty sty czn a potw ierdziła istotność (na poziom ie ufności a = 0,01) różnic m iędzy zaw artością ch ity n y w grzybni rosnącej n a podłożach o różnym stężeniu glukozy. Jeżeli zaw artość ch ity n y w grzy bn i zebranej z pożyw ki z 1,25% glukozy p rzyjąć za 100%, to zaw artość ta na pożywce z 2,5% glukozy w ynosiła 70 - 80%, a p rzy poziom ie glukozy 5% — tylko 45%. A nalogiczną zależność m iędzy zaw artością ch ity n y w grzybni a stężeniem cu k ru zauw ażyli S ak u ari i in. [24], bad ając różne szczepy z g a tu n k u Aspergillus. N atom iast Sw ift [28], badając ro zk ład ający drew no grzyb Coriolus versicolor w ykazał, że w raz ze w zrostem stosunku С : N w pod­ łożu rosła zaw artość ch ity n y w grzybni, chociaż rów nocześnie obniżała się w grzybni zaw artość azotu ogółem.

A by stw ierdzić, czy zm iany zaw artości ch ity n y w strzępkach bad a­ nych grzybów m ikoryzow ych n a stę p u ją w sku tek różnego stężenia

gluko-zy, czy też są spow odow ane zm ianą stosunku С : N w podłożu, w ykonano dodatkow o dw a dośw iadczenia (tab. 4, 5). W ykazano, że jed y n ie zm iana stężenia cu kru w podłożu pow oduje isto tn ą zm ianę (na poziomie ufności a = 0,01) zaw artości ch ity n y w grzybni z 7-dniow ej hodowli g rzyba H. m esophaeum 3037 (tab. 4). N atom iast czterokrotn e zw iększenie lub zm niejszenie daw ki azotu w pożywce nie w pływ ało n a zaw artość c h ity n y

T a b e la 4 Zawartość chityny w 7-dniowej grzybni Hebelo/na rnesophaeum 3037 hodowanej na zmodyfikowanej

pożywce płynnej Pp o różnym stosunku C: N

Chitin content in 7-week mycelium o f Hebeloma mesophaeum 3037 cultured on modified liquid Pp substrate at different C: N ratio

1 1

Poziom glukozy Poziom winianu amonu Glucose level Amonium tartrate level

% g/l

!

С: N

Zawartość chityny w grzybni (jig glukozoaminy na mg s.m. Chitin content in mycelium, fxg o f glucosamine per 1 mg o f d.m. 1,25 ! 0,25 132 18 1,25 1,00 33 16 2,50 0,50 132 12 5,00 I 1,00 132 9 5,00 0,25 528 _{_ 8...}

w grzybni tego grzyba. Jeżeli, podobnie jak w poprzednim dośw iadcze­ niu, p rzy jąć za 100% zaw artość ch ity n y w grzybni rosnącej n a pożywce z 1,25% glukozy, to p rzy stężeniu glukozy 2,5 i 5,0% zaw artość c h ity n y w ynosiła odpow iednio 68 i 51%. Tak w ięc m im o różnego w ieku hodowli n a stę p u jąc y w raz ze w zrostem stężenia cu k ru w podłożu (w yrażony

T a b e la 5 Zawartość chityny w 13-dniowej grzybni Suillus bovinus 1941 hodowanej na zmodyfikowanej pożywce płynnej Pp o różnym stężeniu winianu amonu i stężeniu cukru 2,5% Chitin content in 13-day Suillus bovinus 1941 mycelium cultured on modified Pp substrate at different ammonium tartrate concentration and at the sugar concentration o f 2.5%

Poziom winianu amonu Ammonium tartrate level

g/1

1

1 C: N

1_________

Zawartość chityny w grzybni [i.g glukozoaminy na mg s.m. Chitin content in mycelium, k

ug o f glucosamine per 1 mg of d.m. j

1,00 67 24

0,50 I 132 26

O znaczanie ch ity n y w grzybach m ik oryzow ych 1 2 9

w procentach) spadek poziom u c h ity n y w grzybni T. rapaeodorum 5266 i H. m eso ph aeu m 3037 jest bardzo podobny.

Oznaczono także zaw artość c h ity n y w grzybni 2-tygodniow ej hodowli S. bovinus 1941 n a pożyw kach o jednak o w ym (2.5%) stężeniu cu k ru i trzech różnych stężeniach w in ian u am onu (tab. 5). W raz ze zm niejsza­ niem ilości azotu w pożywce, co spowodow ało w zrost stosun ku С : N, za­ w artość ch ity n y w g rzybni S. bovinus 1941 podnosiła się. Po obniżeniu daw ki w in ian u am onu z 1 g/l do 0,25 g/l, a więc po cztero krotn ym pod­ n iesien iu stosun ku С : N w podłoża, zaw artość c h ity n y w grzyb ni w zrosła o około 25%.

W eryfik acja sta ty sty c z n a potw ierdziła istotność tej różnicy na pozio­ m ie ufności a = 0,01. Różnica w stężeniu ch ity n y w grzybni po dw u­ k ro tn y m obniżeniu daw ki w in ian u am onu była zby t m ała i p rzy w e ry ­ fikacji staty sty czn ej m etodą te s tu S tu d e n ta okazała się nieistotn a. C ztero­ k ro tn e obniżenie poziom u glukozy, a w ięc czterok rotne obniżenie sto su n­ k u С : N w pożywce, powodow ało w zrost poziom u c h ity n y u T. rapaeodo­ r u m (tab. 3) i u Я. m eso pha eu m (tab. 4) o około 100%. T aka sam a zm iana sto sunk u С : N w podłożu w sk u te k podniesienia stężenia azotu powodo­ w ała, jak już w spom niano, w zrost zaw artości ch ity n y w g rzyb ni S. bo­ v in u s ty lk o o 25% . M ożna zatem sądzić, że podniesienie stosu nku С : N w podłożu w praw dzie może spowodow ać w zrost zaw artości ch ity n y w grzybni, ale rea k c ja ta jest znacznie słabsza niż w p rzy p ad k u obniże­ nia stężenia cu k ru w podłożu.

W P Ł Y W A E R A C J I K U L T U R N A Z A W A R T O ŚĆ C H IT Y N Y W G R Z Y B N I

B adając zaw artość ch ity n y w g rzybni S. bovinus 1941 po 6-tygodnio- w ej hodow li na pożywce płyn n ej Pp, zauważono, że kolonie rosnące p rzy ­ n ajm n iej częściowo n a pow ierzchni pożyw ki zaw ierają w ięcej c h ity n y niż kolonie rozw ijające się całkow icie w pożywce. P ierw szy ty p hodow li zaw ierał po hydrolizie średnio 34 jag glukozoam iny, drugi zaś ty lko 26 |ig/m g s.m. W ykonano więc bad an ia zaw artości ch ity n y w grzybni p ow ietrznej i su b stratow ej w y b ra n y c h k u ltu r M rgX I i S. bovinus 1941. W yniki dośw iadczenia w y k a z u ją (tab. 6, 7), że w grzy bn i sub strato w ej z reguły jest m niej chityny. Różnica ta w ynosi śred nio w obu b adan ych przypad k ach około 30%. Z obserw acji m ikroskopow ych wiadom o, że strzępk i grzy bn i su b stratow ej posiadają zw ykle grubsze ściany kom ór­ kowe niż strzęp ki grzybn i pow ietrznej. Poniew aż z przeprow adzonych tu ek spery m entów w ynika, że g rzy bn ia ro zw ijająca się w podłożu zaw iera m niej chityny, należy przypuszczać, że s tru k tu ra chem iczna ścian strz ę ­ pek tej g rzybni jest in n a niż grzybni p ow ietrznej. M niejszą zaw artość ch ity n y w g rzybni rozw ijającej się w podłożu n ależy praw dopodobnie tłum aczyć m niejszą ilością tle n u w środow isku. S h arm a i in. [25] w swoich

badaniach w ykazali, że zaw artość ch ity n y w grzybni grzybów z g ru p y M oniliales m alała w raz z obniżeniem ciśnienia p arcjalnego tle n u w śro­ dowisku.

T a b e la 6 Zawartość chityny w grzybni powietrznej i substratowej izolatu IVlrgX I hodowanego przez 4 tygodnie na stałej pożywce Pp Chitin content in aerial and substrate mycelium of the MrgX I

isolate cultured for 4 w'eeks on a solid Pp substrate

Nr kultury Culture No. Grzybnia powietrzna Aerial mycelium Grzybnia substratowa Substrate mycelium zawartość chityny, (xg glukozoaminy ,

na mg s.m.

chitin content, [xg o f glucosamine per 1 mg o f d.m. 1 42 27 2 43 27 3 44 33 4 34 30 X 41 29 T a b e la 7 Zawartość chityny w grzybni powietrznej i substratowej Suillus

bovinus 1941 hodowanej 6 tygodni na pożywce stałej Pp Chitin content in aerial and substrate mycelium o f Suillus

bovinus 1941 cultured for 6 weeks on a solid Pp substrate

Nr kultury Culture N o. Grzybnia powietrzna Aerial mycelium Grzybnia substratowa Substrate mycelium zawartość chityny, fj.g glukozoaminy

na mg s.m.

chitin content, pig o f glucosamine per 1 mg o f d.m. 1 49 33 2 43 32 3 48 29 4 46 29 5 50 38 6 42 33 X 47 j 32

O znaczanie ch ity n y w grzybach m ik oryzow ych 1 3 1

Z b ad ań czystych k u ltu r grzybów m ikoryzow ych w ynika, że zaw ar­ tość ch ity n y w g rzyb n i zależy od w aru n k ó w hodow lanych, tj. od stężenia cu kru, sto sun k u С : N, a także od dostępu tlenu. W arunki te m uszą być b ran e pod uw agę p rzy oznaczaniu zasiedlenia podłoża grzybam i m iko- ryzow ym i n a podstaw ie zaw artości chityny.

Z A W A R T O Ś Ć C H IT Y N Y W K O R Z E N IA C H I M IK O R Y Z A C H

O znaczanie ch ity n y w tkance objętej infekcją m ikoryzow ą p rzep ro ­ w adzono w korzeniach sosny z syntez m ikoryzow ych in vitro oraz w ko­ rzen iach d w u letn ich siew ek sosny w yhodow anych w szkółce leśnej. O zna­ czono także zaw artość ch ity n y w grzybach m ikoryzow ych w yselekcjono­ w an ych z roślin pochodzących ze szkółki leśnej (tab. 8).

T a b e la 8 Zawartość chityny w bocznych korzeniach siewek sosny hodowanej in vitro i w szkółce leśnej

Chitin content in lateral roots o f pine seedlings cultivated in vitro and in the forest nursery

Materiał — Material Wiek roślin w mie­ siącach Age o f plants Liczba powtó­ rzeń Number o f repli­ Zawartość chityny (jtg glukozoaminy na mg s.m. korzenia Chitin content txg of glucosamine per 1 mg o f root d.m. in months cations _wahania fluctuation *

Systemy korzeniowe z syntezy mikory­ zowej z S. bovinus 1941

Root systems from the mycorrhizal synthesis o f S. bovinus 1941

11 16 0,00-4,67 2,33

Systemy korzeniowe z syntezy mikory­ zowej z C. grani for me 3543

Root systems from the mycorrhizal synthesis o f C. granijorme 3543

20 10 ! 0,02-1,33 0,52

Systemy korzeniowe ze szkółki leśnej Root systems from the forest nursery

24 10 2,18-6,71 3,84

Mikoryzy ze szkółki leśnej

Mycorrhyzae from the forest nursery

24 2 8,22-9,58

I

8,49

Szacunkow a, optyczna ocena stan u m ikoryzow ego b ad any ch korzeni w ykazała, że in fek cja m ikoryzow ą je st w y raźnie silniejsza w korzeniach sosny ze szkółki leśnej niż u roślin hodow anych n a agarze. Z aw artość c h ity n y była także w iększa w korzeniach pochodzących ze szkółki niż w m ateriale uzyskanym w syntezie m ikoryzow ej in vitro. P rzedstaw ione dane (tab. 8) dowodzą rów nież, że zaw artość c h ity n y w izolow anych m

i-koryzach znacznie przekracza w yniki u zyskane w analizie całych korzeni bocznych.

O trzym ane w przed staw io ny ch tu bad an iach ilości glukozoam iny w h y ­ drolizatach korzeni są zbliżone do dan y ch u zyskanych przez in n y ch au to ­

rów w analogicznych dośw iadczeniach. W 8-m iesięcznych korzeniach sie­

w ek sosny, w spółżyjącej z S. bovinus, znajdow ano 3,75 fig glukozoam iny na 1 mg s.m. [31], a w sy ntezach sosny z H. cylindrosporum 0 - 2,9 |ig/m g s.m. korzenia [17]. W tej o statniej p rac y zwrócono także uw agę, że z re ­ guły w ięcej ch ity n y zn a jd u je się w korzeniach sosny rosnącej w szkółce leśnej niż w korzeniach roślin z dośw iadczeń prow adzonych in v itr o . J a k zaznaczono, tę sam ą praw idłow ość stw ierdzono w dośw iadczeniach w łas­ nych.

W m ateriale uzyskanym w syn tezach m ikoryzow ych in vitro p rzep ro ­ w adzono też badania, k tó ry ch celem było porów nanie dwóch różnych m etod ilościowej oceny m ikoryzy. W ty m celu określano stopień infek cji m ikoryzow ej korzeni poszczególnych roślin za pom ocą m etody liczenia na całym system ie korzeniow ym m ikoryz oraz m etodą oznaczania ch ity ­ ny. W obu seriach syntez m ikoryzow ych sosny — z S. bovinus 1941 i z С. graniform e 3543 — w yniki oznaczenia stopnia infekcji m ikoryzo­ wej uzyskane obiem a m etodam i w y k azu ją w y ra ź n ą zależność (rys. 1). W spółczynniki k orelacji obliczone dla po rów n yw an ych w yników w obu dośw iadczeniach są wysokie. Tak w ięc szacując stopień infekcji m ik ory ­ zowej m etodą liczenia m ikoryz i m etodą oznaczania chityny, uzyskano w obu dośw iadczeniach zbieżne w yniki.

A nalogiczne re z u lta ty z poró w nan ia dw óch różnych m etod oznacza­ n ia infek cji m ikoryzow ej uzysk an o także w badaniach korzeni P inus pin a ster, tw orzących m ikoryzę z P isolithus tinctorius. G rzyb ten p ro d u ­ k u je silnie zabarw ioną substancję. W ykazano, że zaw artość c h ity n y w badan y ch korzeniach m ikoryzow ych je st skorelow ana z ilością pigm en­ tu ekstrahow anego acetonem z ty ch korzeni [18]. W in nych dośw iadcze­ n iach stw ierdzono, że istn ieje ko relacja m iędzy ilością żółtego b arw n ik a ekstrahow anego z korzeni m ikoryzow ych cebuli a ilością w nich ch ity n y lub, w yrażoną w procentach, długością korzenia objętego in fek cją m iko- ryzow ą [1]. M etodą oznaczania c h ity n y m ożna w ięc p recyzyjnie określić intensyw ność infek cji m ikoryzow ej roślin w syntezach in vitro. Poniew aż w ty ch w a ru n k a ch w prow adzony jest do u k ład u znan y grzyb, w którego strzępk ach m ożna u stalić zaw artość chityny, m ożliw e jest rów nież osza­ cow anie biom asy g rzyba sym biotycznego biorącego udział w tw o rzen iu m ikoryzy.

W toku dalszych badań porów nano w yn ik i analizy chem icznej korze­ n i z tą sam ą ilością m ikoryz, ale zainfekow anych różnym i g rzybam i (tab. 9). W ięcej c h ity n y zn ajd u je się z reg u ły w korzeniach w spółżyją­ cych z S. bovinus 1941 niż gdy sym biontem jest C. graniform e 3543. Różnica ta nie m usi św iadczyć o w iększej biom asie grzybni w ytw orzonej

a R e g r e s j a M1 dla Ch1 — Re g r e s s i o n o f Ml on Ch1 Ch1 Ws p ó ł c z y n n i k kore l acj i - 0 , 9 1 6 3 C o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t —0, 9163 M1 = - 1 , 7 0 9 + 1 , 0 0 6 6 Ch 1 b R e g r e s j a М2 dl a Ch2 — R e g r e s s i o n o f М2 on Ch2 Ws p ó ł c z y n n i k k o r e l a c j i —0, 9168 C o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t - 0 , 9 1 6 8 М2 — —Z, 7 0 5 + 1, 9552 Ch2

Rys. 1. F u n k cje regresji in fek cji m ik oryzow ej korzeni m ierzonej liczbą m ikoryz (M) w zględ em zaw artości ch ityn y (Ch) w k orzeniach siew ek z sy n tezy m ik oryzow ej

in v i t r o z: a — Suillu s b iv in u s 1941, b — z Cen ococcu m g ra n ifo rm e 3543 Fig. 1. R egression fu n ctio n s of m ycorrh izal in fectio n of roots m easured by th e num ber o f m ycorrihizas (M) in relation to th e ch itin (Ch) con ten t in roots o f seed lin g s from th e m ycorrih izal sy n th esis in v it r o w ith: a — Suillu s b o v in u s 1941,

przez S. bovinus 1941 w zainfekow anych korzeniach. Może ona rów nież w ynikać z w yższego poziom u c h ity n y w grzybni S. bovinus 1941 niż C. graniform e 3543. Z naszych bad ań w cześniejszych w ynika, że 6-tyg o

d-T a b e la 9 Liczba mikoryz i zawartość chityny w korzeniach bocznych wybranych siewek sosny

z syntez mikoryzowych in vitro

Number o f mycorrhizal rootlets and chitin content in lateral roots o f selected pine seedlings from mycorrhizal synthesis in vitro

Liczba mikoryz j Number of mycorrhizae i t Synteza z S. bovinus 1941 Synthesis with S. bovinus 1941 r Synteza z C. graniforme 3543 Synthesis with C. grani) or me 3543 zawartość chityny w (j.g glukozoaminy w korzeniu

chitin content \ig o f glucosamine of roots

20 22,3-27,3 11,8-15,0

30 25,1-28,4 14,7

40 38,5-47,2 17,8

niow a grzybnia S. bovinus 1941 zaw iera po hydrolizie 40 fxg glukozoam iny na 1 mg s.m., a grzybnia С. graniform e 3543 — 19 jig, a więc dw u kro tnie m niej [29j. Tak więc w ysoka k o relacja w yników oznaczenia stopnia in ­ fekcji m etodą liczenia m ikoryz i przez określanie ilości ch ity n y w y stę­ p u je tylk o w tedy, gdy b adane ro ślin y w spółżyją z ty m sam ym grzybem sym biotycznym .

W w a ru n k a ch n a tu ra ln y c h korzeniom drzew leśnych tow arzyszy bo­ g a ty zestaw grzybów m ikoryzow ych i korzeniow ych. Dlatego określanie stopnia infekcji m ikoryzow ej n a podstaw ie zaw artości ch ity n y w ym aga kry ty czn ej oceny. Na pew no celowe jest w yryw kow e spraw dzenie p ra ­ widłow ości uzyskan ych w yników in n ą m etodą. Ze szczegó]ną ostrożnością n ależy podchodzić do poró w n y w an ia intensyw ności infekcji m ikoryzo­ w ej, oznaczanej na podstaw ie zaw artości ch ity n y w roślinach rosnących w różnych w a ru n k a ch ekologicznych. W ty m bow iem p rzy p a d k u spek­ tru m grzybów sym biotycznych u b ad an y ch roślin może być zupełnie inne. Nieco łatw iejsza sy tu acja w y stęp u je w szkółkach. W tych środow iskach bowiem , jak w sk azu ją b ad an ia szczegółowe, dom inuje zw ykle jed en ga­ tu n e k sym bionta, a ilość grzybów m ikoryzow ych jest znacznie m niejsza niż w d rzew ostanach starszych [10, 14]. Ponadto jeżeli w szkółce stoso­ w ane są szczepienia m ikoryzow e, często poprzedzone częściową ste ry li­ zacją gleby, dom inacja w prow adzanego znanego grzyba jest p raw ie cał­ kow ita. W ydaje się zatem , że określanie stopnia infek cji m ikoryzow ej roślin w szkółce na podstaw ie zaw artości ch ity n y w korzeniach może być p rzy d a tn e i w iarygodne oraz posiadać znaczenie praktyczne.

O znaczanie ch ity n y w grzybach m ik oryzow ych 1 3 5

OZN AC ZAN IE B IO M A SY G R ZYBN I W SZ C ZEPIO N K A C H M IKORYZOW YCH

J a k ju ż w ykazano, istn ieje możliwość szybkiego i precyzy jneg o ozna­ czania biom asy grzy bni w układzie, w k tó ry m w y stę p u je ty lko jed en o kreślony szczep. D latego podjęto próbę zastosow ania om aw ianej m etody do b ad ania sztucznych szczepionek m ikoryzow ych. Są to bow iem układy, w k tó ry c h nam nożona zostaje grzy bn ia w ybranego, pożądanego w śro­ dow isku g rzyba sym biotycznego. W ielkość biom asy grzyba w podłożu szczepionki w dużym stopniu w a ru n k u je skuteczność infekcji sadzo­ n ek przez g rzy b y m ikoryzow e. O znaczanie ch ity n y może w ięc z powo­ dzeniem służyć w ocenie poszczególnych p a rtii produkow anej już se ry j­ nie szczepionki przez określenie w nich biom asy grzyba. Skuteczność szczepienia w dużym sto p niu zależy rów nież od w ieku w prow adzonej do gleby grzybni. O znaczając biom asę strzęp ek w podłożu w czasie in k u ­ bacji szczepionki, m ożna ustalić czas, w k tó ry m tem po p rzy ro stu je s t n a j­ w iększe. G rzybnia z n ajd u jąca się w n ajb ard ziej dynam icznej fazie w

zro-T a b e la 10 Zawartość chityny i biomasa Hebeloma mesophaeum 3037 i Suillus bovinus 1941 w l g

podłoża z perlitu

Chitin content and biomass o f Hebeloma mesophaeum 3037 and Suillus bovinus 1941 per 1 g o f perlite substrate Czas hodowli (tygodnie) Culture time (weeks) H. mesophaeum S. bovinus zawartość chityny w (xg glukozoaminy na g podłoża chitin content {xg o f glucosamine per 1 g o f substrate masa grzybni w mg/g podłoża mycelium mass in mg per 1 g o f substrate X zawartość chityny w (xg glukozoaminy na g podłoża chitin content (xg o f glucosamine per 1 g of substrate masa grzybni w mg/g podłoża mycelium mass in mg per l g of substrate X X л; 15 63 2 35 44 1,3 68 79 2.6 83 105 35 95 4 38 45 1,6 103 105 2,8 63 118 110 120 6 118 122 5,3 163 161 4,0 138 200 85 75 8 103 144 b.d. 115 108 b.d. 245 1 133

stu m a w iększe szanse p e n e trac ji now ego środow iska ryzosfery, co pod­ nosi szanse udatności szczepienia. Rów nież zdolność do infekcji je s t n a j­ silniejsza w fazie najw iększej aktyw ności m etabolicznej grzyba.

D ośw iadczenie prow adzone n a podłożu z p e rlitu i pożyw ki Pp służyło w y kazan iu przy d atno ści m etody oznaczania ch ity n y do b adań szczepio­ nek m ikoryzow ych. U żyte w ty m dośw iadczeniu szczepy S. bovinus 1941 i H. m esophaeum 3037 są przedstaw icielam i typow ej w w aru n k ach n a ­ tu ra ln y c h m ikroflo ry korzeniow ej sosny. Ponadto z w cześniejszych b a­ dań znana jest także zaw artość ch ity n y w grzy bn i ty ch szczepów w za­ leżności od w ieku [29]. P rzed staw ion e w y nik i (tab. 10) pozw alają n a prześledzenie w zrostu poziom u ch ity n y w b adan ym podłożu w czasie in ­ kubacji. U w zględniając zm iany w y stęp u jące w zaw artości c h ity n y w raz z w iekiem grzybni b ad anych szczepów [29], stw ierdzono, że najw ięk szy p rzy ro st biom asy obu testow an y ch grzybów n astępow ał pom iędzy czw ar­ tym a szóstym tygodniem hodowli. W czasie dalszej inkubacji p rzy ro st ten był już niew ielki.

W próbach szczepień m ikoryzow ych dla potrzeb leśnictw a inokulum jest najczęściej przygotow yw ane na podłożu, w którego skład wchodzi torf. Jego ilość w ah a się zw ykle w granicach 5 - 10°/o objętości podłoża. W takich szczepionkach oznaczanie biom asy nam nożonego g rzyba m iko- ryzow ego może być kom plikow ane obecnością am inocukrów w hy d ro li­ zatach z sam ego podłoża. B adania w ykazują, że w h y drolizatach różnych gleb am inocukry, w ty m głów nie glukozoam ina i galaktozoam ina, sta n o ­ w ią 3 - 1 1 % azotu ogółem, a ich ilość jest skorelow ana z ilością w ęgla i organicznych zw iązków azotu w glebie [2, 4, 5, 27]. W h y d rolizatach sam ego to rfu m ożna więc w y k ry ć znaczne ilości glukozoam iny. O zna­ czanie biom asy grzyb a m ikoryzow ego w podłożu zaw ierającym to rf może być m ożliw e dopiero po silnym p rzerośnięciu podłoża przez bad an y grzyb, kiedy zaw artość c h ity n y będzie odpow iednio w ysoka. Poniew aż w p ro ­ d ukcji szczepionek dąży się do w y tw o rzen ia dużej biom asy grzyba w m o­ żliw ie najm n iejszej objętości podłoża, w spom niany w a ru n e k może być spełniony. U zyskano np. dobre re z u lta ty p rzy szacow aniu ilościow ym g rzyb ni m etodą oznaczania ch ity n y w glebie o dużej zaw artości m ate rii organicznej, szczepionej grzybem G lom us fa scicu latu m [15].

W celu sp raw dzenia czy znajdzie to potw ierdzenie w b adan ych przeze m nie szczepionkach, oznaczano ch ity n ę w p róbkach szczepionki z pół­ roczną hodow lą S. bovinus 5382 na podłożu, k tóre zaw ierało p e rlit i to rf w proporcji 9 : 1 oraz pożyw kę Pp. W ykonano także oznaczenia w n ie szczepionym podłożu k o n trolny m (rys. 2). Z aw artość glukozoam iny w h y ­ d rolizatach z czystych, nie szczepionych podłoży w ynosiła 306 - 326 (Lig s.m. N atom iast w hy d ro lizatach ze szczepionki znajdow ano 1560 - 2680 L ig

glukozoam iny na 1 g s.m. szczepionki. T ak więc zaw artość glukozoam iny w podłożu w zrosła w poró w n an iu z k o n tro lą 5 - 7-krotnie. O bliczona z różnicy ilość glukozoam iny, pochodząca z ch ity n y hodow anego grzyba,

O znaczanie c h ity n y w grzybach m ik oryzow ych 1 3 7

w ynosiła 1,2 - 2,3 m g/g s.m. podłoża. P odane w yniki całkow icie p o tw ier­ dzają możliwość oznaczania biom asy g rzyba m etodą o kreślania ch ity n y rów nież w szczepionkach zaw ierający ch torf.

3000 г g * 2500 . ч~ «о о о > СП - -

гооо

R ys. 2. Z aw artość glu k ozoam in y w h yd rolizatach półrocznej h od ow li Suillu s b o v i n u s 5382 (S) na podłożu z p erlitu i torfu oraz w hyd rolizatach z podłoża n ie szczep io­

nego (K)

Fig. 2. G lu cosam in e con ten t in h y d ro ly sa tes of h a lf-y ea r cu ltu re of S uillu s b o vin u s 5382 (S) on th e n u trien t m edium o f p erlite and p eat as w e ll as h yd rolyzates of

n on in ocu lated n u trien t m edium (K)

W NIO SK I

1. Poziom c h ity n y w grzy b ni w eg etaty w nej grzybów m ikoryzow ych zm ienia się w zależności od stężenia cu k ru i sto sunku С : N w podłożu, a także w zależności od dostępu tlenu.

2. Na poziom ch ity n y w grzy bn i n ie w pływ a zm iana pH podłoża ho­ dowlanego, spow odow ana n agrom adzaniem się w czasie w zrostu kw aso­ w ych m etabolitów .

3. Na podstaw ie obecności ch ity n y w korzeniu m ożna w ykazać in fek ­ cję m ikoryzow ą.

4. O znaczanie c h ity n y może być p rzy d a tn e do bad ań m ikotrofizm u w szkółkach leśnych, a zwłaszcza w ocenie efektyw ności zabiegu sztucz­ nej m ikoryzacji w szkółkach.

5. O znaczanie zaw artości ch ity n y może być p rzy d a tn e do określania biom asy g rzyba w szczepionkach m ikoryzow ych zarów no p rzy przygo­ to w aniu i optym alizacji w a ru n k ó w hodow li inokulum m ikoryzowego, jak i przy ocenie kolejnych p a rtii produkow anej już se ry jn ie szczepionki.

6. Na podstaw ie zaw artości c h ity n y m ożna określić biom asę grzyba dopiero po oznaczeniu poziom u ch ity n y w grzybni określonego szczepu grzyba w danych w a ru n k a ch hodow lanych.

LITER A TU R A

[1] B e c k e r W. N., G e r d e m a n n J. W. C olorim etric q u a n tifica tio n o f v e sic u la r - -a rb u scu la r m ycorrh izal in fectio n in onion. N ew P h ytol. 1977, 78 s. 2 8 9 -2 9 5 . [2] B e n z i n g - P u r d i e L. A m in o sugar d istrib u tion in four soils as determ in ed

by high reso lu tio n gas chrom atography. S o il Sei. Soc. A m . J. 1984, 48 s. 219 - 222.

[3] B r a i d G. M. , L i n e M. A. A sen sitiv e ch itin a ssay for th e e stim a tio n of fu n g a l biom ass in hardw ood. H olzforschu n g 1981, 35 s. 10 - 15.

[4] C h e s h i r e M. V. O rigin and sta b ility o f soil p olysacch arid e. J. S o il Sei. 1977, 28 s. 1 - 10.

[5] C h e s h i r e M. V., A n d e r s o n A. S o il p olysacch arid es and carb oh yd rate p hosphates. S oil Sei. 1970, 119 s. 3 5 6 - 362.

[6] C h e t I., H ü t t e r m a n n A . C hem ical com p osition o f hyp h al w a lls o f F om es annosus. Europ. J. For. Path. 1980, 10 s. 65 - 70.

[7] H e p p e r H. M. A colorim etric m ethod for estim a tio n v esicu la r-a r b u scu la r m ycorrhizal in fectio n in roots. S oil B iol. B iochem . 1977, 9 s. 15 - 18.

[8] J a w o r s k i E. G., W a n g L. C. G ross cell w a ll com p osition o f V e n tu ria in a eq u a lis. P h ytop ath ology 1965, 55 s. 401 -4 0 3 .

[9] J a w o r s k i E. G., W a n g L. C., C a r p e n t e r W. D. B io sy n th esis o f c h itin in c e ll-fr e e ex tra cts of V e n tu ria in a eq u a lis. P h y to p a th o lo g y 1965, 55 s. 1309 - 1312.

[10] L a i h o O. F urther stu d ies on th e ectoen d otrop h ic m ycorrhiza. A cta F orest. F en n . 1965, 79 (3) s. 1 - 35.

[11] M e n t i o n M. , P l a s s a r d C. C om parison de la n u tritio n n itriq u e ęt ammo-* n ica le de quatre esp eces de B a sid io m y c e te s e c to m y c o rh izie n s . C.R. A cad. Sc. Paris, Ser. I l l, 1983, 297 s. 4 8 9 -4 9 2 .

[12] N a n d i B. G lu cosam in e a n a ly sis of fu n g u s— in fected w h ea t as a m ethod to d eterm in e the e ffe c t of a n tifu n g a l com pounds in grain preservation . C ereal Chem . 1978, 55 s. 121 - 126.

[13] P a c h l e w s k a J. B ad an ia nad syn tezą m ik oryzow ą sosn y (Pinus. s ilv e s tr is L.) w czystych k u ltu rach na agarze. Pr. IBL, 1968, 345 s. 3 - 76.

[14] P a c h l e w s k i R. G rzyby sy m b io ty czn e i m ikoryza so sn y (P in u s s ilv e s tr is L.). Pr. IB L 1983 615 s. 1 - 132.

[15] P a c h o v s k y R. S., B e t h l e n f a l v a y G. J. M easu rem en t of the ex tr a d ic a l m y celiu m of a v esicu la r-a r b u scu la r m ycorrh izal fu n gu s in soil by ch itin d eter­ m ination. P lan t and S oil 1982, 68 s. 143 - 147.

[16] P l a s s a r d C. S., M o u s a i n D. G., S a l s a с L. E. E stim ation o f m y celia l grow th of b a sid io m y cetes by m ean s of ch itin d eterm in ation . P h y to ch em istry 1982, 21 s. 245 - 348.

[17] P l a s s a r d C., C o l l A., M o u s a i n D., S a l s a c L. D osage de la ch itin e fon giq u e: ap p lication à l ’estim a tio n de la m a sse m y célien n e p résen te dans les racin es m ycorh izées du P in m aritim e c u ltiv é in vitro ou en p ép in ière. C.R. A cad. Sc. P aris, Ser. III. 1983, 297 s. 233 - 236.

[18] P l a s s a r d C., M o u s a i n D., S a l s a c L. D osage de la ch itin e sur des ecto - m ycorh izes de pin m aritim e (P in u s p in a ste r) à P iso lith u s tin c to r iu s : é v a lu a tio n de la m asse m y céllen e et de la m ycorhization. Can. J. Bot. 198Э, 61 s. 6 9 2 - 699. [19] P r i t c h e t t W. L. M ycorrhizae: form s and fu n ction s. (In:) P rop erties and

m an agem en t of forest soil. Ed. W iley J. and Sons. N e w York, C hichester, B risbane, Toronto 1979 s. 173 - 188.

[20] R a c u s e n D., F o o t e M. T he h ex o sa m in e co n ten t o f lea v es. Can. J. Bot. 1974, 52 s. 2 1 1 1-2113.

O znaczanie c h ity n y w grzybach m ik oryzow ych 1 3 9

[21] R i d e J. P., D r y s d a l e R. B. A ch em ica l m ethod for estim a tin g F u sa riu m o x y s p o r u m f. ly c o p e rsic i in in fected to m a to plants. P h ysiol. Pl. Path. 1971, 1 s. 409 - 420.

[22] R o b e r t s R. M., C e t o r e l l i J. J., K i r b y E. G., E r i c s o n M. L ocalization of glu cop rotein s that co n ta in glu co sa m in e in plan t tissu es. P la n t. P h y sio l. 1972, 50 s. 531 - 535.

[23] R o b e r t s R. M. , P o l l a r d W. E. The in corp oration of D -g lu co sa m in e into g ly co lip id s and gly co p ro tein s of m em brane p reparations from P h a seo lu s a u reu s hyp ocotyls. P lan t P h ysiol. 1975, 55 s. 431 - 436.

[24] S a к u a r i Y., H o L e e T., S h i о t a H. On th e co n v in ien t m ethod for g lu co ­ sam in e estim a tio n in koji. A gricu lt. B iol. Chem . 1977, 41 s. 619 - 624.

[25] S h a r m a P. D., F i s h e r P. J., W e b s t e r J. C ritique of ch itin assa y te c h ­ n iq u e for estim a tio n of fu n g a l biom ass. Trans. Br. M ycol. Soc. 1977, 69 s. 4 7 9 - 483.

[26] S t e v e n s o n F. J. In v estig a tio n s of am in o p o ly sa cch a rid es in soils. I. C olori­ m etric d eterm in ation of h ex o sa m in es in soil h y d rolysates. S oil Sei. 1957, 83 s. 1 1 3 -1 2 2 .

[27] S t e v e n s o n F. J. Isolation and id en tifica tio n of am in o sugars in soil. S o il Sei. Soc. A m . J. 1983, 47 s. 6 1 - 6 5 .

[28] S w i f t M. J. The estim a tio n of m y celia l b iom ass by d eterm in ation of th e h ex o sa m in e con ten t of w ood tissu e d ecayed by fu n gi. S o il B iol. B iochem . 1973, 5 s. 321 - 332.

[29] T r z c i ń s k a M. , P a c h l e w s k i R. B adania poziom u c h ity n y w grzyb n i w e ­ g eta ty w n ej w y b ra n y ch g rzyb ów m ik oryzow ych . A c ta M ycol. 1986, 22 s. 8 9 -9 4 . [30] W h i p p s J. M. , L e w i s D. H. M ethodology o f c h itin assay. T rans. Br.; M ycol.

Soc. 1980, 74 s. 1 1 6 - 118.

[31] W h i p p s J. M. , H a s e l w a n d t e r K. , M c G e e E. E. M. , L e w i s D. H. U se of b ioch em ical m arkers to d eterm in e grow th, d ev elo p m en t and b io m a ss : o f fu n g i in in fected tissu es, w ith p articu lar r e feren ce to a n ta g o n istic and

m u tu a listic biotrophs. Trans. Br. M ycol. Soc. 1982, 79 s. 385 - 400.

[32] W h i t e L. O., N e w h a m H. C., R i d e J. P. E stim ation o f A b s id ia ra m o sa in fectio n in th e brain and k id n ey s of co rtiso n e-trea ted m ice by ch itin assay. M yco p a th o lo g ia 63, 1978 s. 1 7 7 - 179.

[33] Z i e l i ń s k i R. T ab lice sta ty sty czn e. PW RiL, W arszaw a 1972.

м . ТШЦИНЬСКА ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАСЕЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ МИКОРИЗНЫМИ ГРИБАМИ ПО МЕТОДУ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХИТИНА Отдел почвоведения и удобрения Научно-исследовательского института лесного хозяйства в Сэнкоцине Р е з ю м е В первой части статьи рассматривается влияние факторов культуры на содержание хитина в вегетативном мицелии выбранных микоризных грибов. Установлено, что коли­ чество хитина в мицелии повышается после снижения содержания глюкозы в питательной среде. Расширение соотношения C :N в питательной среде может привести к росту уровня хитина в мицелии, однако эта реакция является гораздо более слабой, чем при снижении уровня сахара в питательной среде. Установлено также, что субстратный мицелий мико­ ризных грибов содержит меньше хитина, чем воздушный мицелий. С другой стороны, не

установлено, чтобы на уровень хитина в мицелии влияли изменения pH питательной среды вызванные накоплением в ходе культуры кислых метаболитов. Затем определяли хитин в микоризных корнях сосны взятой из лесного питомника и во­ зделываемой в микоризных синтезах in vitro, а также в изолированных микоризах. Устано­ влено, что на основании содержания хитина в корнях можно установить микоризную ин­ фекцию. Однако, определение биомассы симбионта в корню возможно только при зна­ комстве штамма гриба образующего микориз. Проведенные исследования в микоризных вакцинах показали пригодность метода опре­ деления хитина для исследований микоризного инокулум. М . T R Z C IŃ S K A

D ETE R M IN A TIO N OF SETTLEM EN T OF THE N U T R IEN T M EDIUM W ITH M YCO RR H IZA L F U N G I BY THE C H ITIN D ETERM INA TIO N METHOD

D ep artm en t of S oil S cien ce and F ertiliza tio n F orestry R esearch In stitu te at S çk ocin

S u m m a r y

In th e first part of th e w ork the e ff e c t o f cu ltu re con d ition s on th e ch itin con ten t in v e g e ta tiv e m y celiu m of selected m ycorrh izal fu n g i w a s in v estig a ted . It has b een proved that the ch itin con ten t in th e m y celiu m is grow in g a fter d ecrea se of the glu cose le v e l in th e substrate. A w id en in g o f th e С :N ra tio in th e n u tr ie n t m edium can lead to a grow th of the ch itin le v e l in m yceliu m , s t ill th is reaction is m uch w ea k er than at d ecrease o f the sugar con cen tration in the substrate. It has been proved as w e ll that the su b stra te m y celiu m o f m ycorrh izal fu n g i w ou ld con­ tain less ch itin th an the aerial m yceliu m . On the other hand, su b strate pH ch a n g es brought about by the a ccu m u la tio n o f acid m eta b o lites during th e cu ltu re do n o t in flu en ce the ch itin le v e l in m y celiu m of m ycorrh izal fungi.

T hen th e ch itin con ten t in m ycorrh izal roots of pin e ta k en from th e fo rest nur­ sery or cu ltiv a ted in m ycorrhiza sy n th eses in v itr o and in iso la ted m ycorrh izas w a s determ ined. It has been p roved th at th e m ycorrh izal in fectio n can b e proved on the b asis of th e ch itin con ten t in roots. S till the sym b ion t b iom ass determ in ed in roots w ou ld be p ossib le on ly, if the strain o f the m ycorrh iza-form in g fu n gu s w ere know n.

The tests in m ycorrh izal in ocu la proved su ita b ility of the m ethod of ch itin d eterm in ation for in v estig a tio n s on the m ycorrhizal inoculum .

D r M. T r z c i ń s k a P r a c a w p ł y n ę ł a d o r e d a k c j i w l i s t o p a d z i e 1988 r.

I n s t y t u t B i o t e c h n o l o g i i P r z e m y s ł u R o l n o - S p o ż y w c z e g o 02-532 W a r s z a w a , R a k o w i e c k a 36