Produktie van ß-interferon met behulp van E. Coli: Hergebruik van hulpstoffen

• • • f

,ltti

o

o

o

o

o

o

o

o

o

FVO Nr.

I

3120D

I

Fabrieksvoorontwerp

Vakgroep Bioprocestechnologie

Onderwerp

FABRIEKSVOORONTWERP voor de

PRODUKTIE van j1-INTERFERON

met behulp van

E. COL!;

Hergebruik van hulpstoffen

Auteurs

P.H.M. Vrij korte

Piet Heinstraat 135 2518 CG Den Haag

H.M van Veldhuizen

Zandhofsestraat 78 3572 GJ Utrecht

Keywords

Telefoon

070-3616822

030-718453

l1-interferon, oxidatie, reductie, hulpstoffen, dithiothreitol, sodiumdodecylsulfaat, ureum

Datum opdracht:

Datum verslag

september 1994

december 1994

Samenvatting

Een medicijn dat sterk in ontwikkeling en opkomst is in de strijd tegen ziekten als kanker en MS is p-interferon. Gezien het gunstige perspectief zal op korte termijn een grote behoefte zijn aan dit medicijn.

In dit verslag wordt de produktie van humaan p-interferon uit een E-Coli stam besproken. Het produkt wordt in de vorm van inclusion bodies opgeslagen in de cel. In een fed-batch proces van 3.9 m3 _{wordt de fermentatie uitgevoerd bij een temperatuur van 37°C. Na de} fermentatie volgt de opwerking die bestaat uit verwijdering van het medium, cel-disruptie, oplossen van inclusion bodies, extraktie, precipitatie, refolding en verdere opzuivering met behulp van size exclusion chromatografie. Uiteindelijk wordt per jaar 40 kg p-interferon verkregen met een zuiverheid van 98 %. Op jaarbasis worden 100 batches uitgevoerd. De nadruk in dit proces ligt op het hergebruik van hulpstoffen ten behoeve van de unfolding en refolding. Daarbij wordt uitgegaan van de base-case zoals die nu bij Chiron wordt

uitgevoerd. Er wordt met name gekeken naar de duurste hulpstoffen, SDS en DTT. Vervanging van SDS door ureum in de opwerkingsstappen na de extraktie levert een besparing van ft. 81600,

=

per jaar.

Door de refoldingstap fed-batch uit te voeren wordt de yield van deze stap verhoogd van 91 naar 99.5%.

Hergebruik van de waterfase uit vloeistof-vloeistof extractie, die veel DTT en SDS bevat, levert een besparing op het gebruik van hulpstoffen van ft.670.ooo, = per jaar. Tevens wordt de yield van de oplos- en extractiestap verhoogd van 46.4 naar 61.3

%,

doordat een gedeelte van het interferon wordt teruggevoerd. Een nadeel van deze optie is dat er herge-bruik van niet gesteriliseerd materiaal plaatsvindt.

Tenslotte worden de grote afvalstromen van een van de 'size exclusion' chromatografie kolommen en van een ultrafiltratieunit hergebruikt. Op deze manier wordt ft. 328.000, = per jaar bespaard.

Over het totale proces bekeken levert de alternatieve procesvoering een besparing van hulp-stoffen en een verbetering van de opbrengst op.

Het gebruik van hulpstoffen daalt met ft. 850.000,= per jaar ten opzichte van de 'base case'. De totale kosten van hulpstoffen per kg geproduceerd p-interferon dalen van fl 161000,= in de base case naar fl 139.000,= in dit proces.

De totale opbrengst van het opwerkingsproces stijgt van 20.1 % naar 27.4% van de in de fermentatie geproduceerde hoeveelheid.

Deze twee effecten samen resulteren in een kostprijsverlaging van ft. 1,46/mg in de base case naar ft. 1, 16/mg in dit proces. Hierbij wordt uitgegaan van een ROl van 35

%.

De huidige verkoopprijs is ft. 100, =/mg.

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING INHOUDSOPGA VE 1. INLEIDING 1.1. Algemeen. 1.2. Probleemstelling. 2. KEUZE PROCESROUTE

3. UITGANGSPUNTEN VAN HET ONTWERP 3.1. Exogene gegevens.

3.2. Endogene gegevens.

3.3. Veiligheidsmaatregelen en afvalverwerking. 4. BESCHRIJVING VAN HET PROCES

5.APPARATUURBEREKENINGEN 6. MASSA- EN WARMTEBALANS

7. OVERZICHT EN SPECIFICA TIE VAN DE APPARATUUR 8. GEVOELIGHEIDSANALYSE

9. PROCESBEHEERSING 10. ECONOMIE

11. CONCLUSIES EN AANBEVELINGEN LITERATUUR

BIJLAGE 2.1: stap- en overall yields base-case en FVO 3120D BIJLAGE 4.1: proces stappen met bijbehorende procestijden BIJLAGE 6.1: STROOM- EN COMPONENTENSTAAT BIJLAGE 6.2: MASSA- EN WARMTEBALANS

Hoofdstuk I: Inleiding pagina 1.1 1. Inleiding

1.1. Algemeen.

Halverwege de tachtiger jaren was er reeds een produktie-route bekend voor p-Interferon (P-IFN) op basis van genetisch gemanipuleerde E. eoU bacteriën. In die tijd wist men echter nog niet voor welke ziekten dit medicijn geschikt zou zijn. Na verschillende klinische proeven bleek dat bepaalde soorten kanker en sommige moeilijk te genezen virussen te bestrijden waren met p-IFN. Sinds kort is zelfs bekend geworden, dat de ziekteverschijnselen van multiple sclerose (MS) met een factor twee uitgesteld kunnen worden met dit medicijn. Door deze bevindingen is er vraag naar p-IFN "gecreëerd", die zo groot is dat de prijs hoog is. Door strenge keuringen en controles op de produktie van medicijnen in het algemeen is het echter niet mogelijk om het bestaande proces even snel aan te passen of verbeteringen aan te brengen. Pas wanneer blijkt dat de vraag naar p-IFN groot is en blijft, kan er overgegaan worden naar een zogenaamde tweede-generatie. Na verloop van tijd zal namelijk de druk op de markt voor p-IFN, door bijvoorbeeld patienten-organisaties, steeds groter worden om de prijs te verlagen. Bovendien liggen concurrenten op de loer om bij het verstrijken van de patenten direct een graantje mee te pikken. In deze tweede-generatie van een medicijn zal de produktie-capaciteit me~stal verhoogd worden. Dit betekent wel dat de producent reeds in een vroeg stadium op de hoogte moet blijven van mogelijke verbeteringen aan het proces en hoe deze verbeteringen op grotere

produktieschaal ingepast kunnen gaan worden. Vooral ook omdat de weg, die nodig is voor goedkeuring van een eventueel vernieuwd produktie-proces, lang en tijdrovend is. In dit _ vernieuwde proces zullen dan zaken als minimaliseren van de hulpstoffen, terugwinning en

hergebruik van de hulpstoffen, en alternatieve routes bekeken worden. Het belangrijkste optimalisatie aspect van het vernieuwde proces zal het economische voordeel zijn.

Afhankelijk van de koers, die het bedrijf wil volgen, kan dit een maximaal marktaandeel, een maximale winst of een maximale omzet zijn.

1.2. Probleemstelling.

In dit fabrieksvoorontwerp (FVO) wordt in eerste instantie uitgegaan van een produktie-proces. voor p-IFN op basis van door Chiron verstrekte gegevens, de zogenaamde "base case". Gezien de hoge verkoopprijs van p-IFN is het op dit moment nog niet nodig om hulpstoffen terug te winnen en opnieuw te gebruiken. Wanneer de vraag naar p-IFN groot blijft, is het belangrijk om verschillende mogelijkheden te onderzoeken om p-IFN

goedkoper te produceren. Er zal dan oo~ gekeken moeten worden naar het hergebruiken van dure hulpstoffen of schonere process,en. Ook "het lozen van milieubelastende stoffen verdient de nodige aandacht. Dit laatste met alleen omdat het laten verwerken hiervan de nodige kosten met zich meebrengt, maar ook gezien de ontwikkelingen van normen en waarden, dat elke producent zijn atvalstroom moet minimaliseren en zelf verantwoordelijk is en blijft voor een milieu-vriendelijke verwerking.

Uitgaande van de "base case" zal de nadruk in dit FVO liggen op het hergebruik van

SDS (UREUM) • _ I _oyo----' DIT ~I SDS (UREUM) . . I DIT + SDS (UREUM) . SDS (UREUM) DIT

+

SDS

.1

. . SDS (UREUM)

t----...

~ DIT

+

SDS

SDS (UREUM) ~ I t---I"~ SDS (UREUM)

t----t.~ SDS (UREUM)

t---tl.~ DIT

+

SDS

Hoofdstuk 2: Keuze proeesroute

pagina 2.1 2. Keuze procesroute

Bij het produceren van humaan p-IFN door middel van E.

eoli

bacteriën, wordt het

gewenste eiwit tijdens de fermentatie opgeslagen in de vorm van inclusion bodies in de cel. Het eiwit zit daarin samen met DNA materiaal en endotoxines opgehoopt in een niet

natuurlijke vorm. Voor een waardevol produkt zal het eiwit daarom in z'n natuurlijke vorm moeten worden gebracht. Hiervoor moet het p-IFN na uit de cel te zijn gehaald door

middel van homogenisatie, eerst opgelost worden en moeten de aanwezige intermoleculaire zwavelbruggen verbroken worden door middel van reductie. Als dit heeft plaatsgehad kan het eiwit in z' n natuurlijke vorm worden gebracht door ervoor te zorgen dat de

intramoleculaire zwavelbruggen worden gevormd (bij p-IFN 1 stuks), door middel van oxidatie. Verder is het van belang dat het eiwit gedurende een groot gedeelte van het opwerkingsproces in opgeloste vorm blijft. In de 'base case', FVO 3120 A, wordt ten behoeve van deze eisen gebruikt gemaakt van hulpstoffen, die een groot gedeelte van de kosten van het proces bepalen. Om die reden is voor het ontwerpen van dit proces het volgende doel nagestreefd:

Het hooffdoel is om zoveel mogelijk te besparen op hulpstoffen, die gebuikt worden voor de reductie en oxidatiestappen en voor het in oplossing houden van de eiwitten. Als belangrijk nevendoel is hierbij van uitgegaan het feit dat verbetering van de yield in de reductie en oxidatiestappen en dus van de overall yield ook een belangrijke besparing van hulpstoffen oplevert.

Om bovenstaande doelen te bereiken is eerst een analyse gemaakt van de belangrijkste hulpstoffen en waar deze gebruikt worden in het proces van de 'base case'. Op basis van de prijs zijn de volgende stoffen belangrijk:

*

dithiothreitol (DTT), dat wordt gebruikt voor de reductie (verbreking van

*

*

*

zwavelbruggen),

natrium-dodecylsulfaat (SDS), een detergent, dat wordt gebruikt voor het in oplossing houden van de eiwitten en overig celmateriaal

iodosobenzoëzuur (lBA), dat wordt gebruikt voor de oxidatie (vorming van intramoleculaire zwavelbruggen) .

en ureum, dat dient als vervanging van SDS in een gedeelte van het proces (zie later). Ureum zorgt voor een hoge milieubelasting.

SDS en Ureum kunnen altijd hergebruikt worden, omdat ze niet omgezet worden tijdens het proces. DTT wordt echter geoxideerd tijdens de reductie van de eiwitten en mA wordt gereduceerd tijdens de oxidatie-stap. mA wordt equimolair toegevoegd, en wordt dus geheel gereduceerd. mA komt daarom niet in aanmerking voor hergebruik. DTT echter wordt in grote overmaat toegevoegd tijdens de reductiestappen (R 301 en R 402). Tijdens deze stappen wordt ongeveer 2 % van het toegevoegde DTT geoxideerd. De rest kan dus worden hergebruikt.

In de figuur hiernaast staat het opwerkingsproces volgens de 'base case' in blokschema weergegeven, met daarin de van belang zijnde in- en uitgaande hulpstoffen: DTT, SDS en Ureum.

Hoofdstuk

2: Keuze procesroute _{pagina 2.2}

Om het hierboven geformuleerde doel te kunnen bereiken zijn een aantal opties te bedenken om te besparen op huifstoffen enlof gelijkertijd de yield van de betreffende stappen te verbeteren. In het kort zijn dit de volgende:

1. SDS vervangen door ureum,

2. de oxidatie-stap (R 501) fed batch gewijze uitvoeren in plaats van batch gewijze, 3. DTT

+

SDS in de waterige afvalstroom uit de extractie-stap (C 301) terugvoeren

naar de reductiestap (R301) voor hergebruik,

4. hergebruik van DIT

+

SDS uit de centrifuge (C 302),

5. hergebruik van het eluent van de eerste 'size exclusion' chromatografie kolom (K401),

6. hergebruik van het filtraat van de eerste ultrafiltratie (F501)

7. en hergebruik van de afvalstromen van de tweede 'size exclusion' chromatografie kolom (K 601), van de laatste ultrafiltratie (F 601) en de ontzoutingskolom (K 602).

Ad 1. Voor de vervanging van SDS door Ureum geldt dat het een voordeel is dat Ureum aanzienlijk goedkoper is. SDS speelt echter wel een belangrijke rol in de extractie, waardoor p-IFN oplosbaar wordt in de butanol-fase. Daarom is besloten SDS pas te vervangen door ureum vanaf sectie 4 (R401): Oplossen van het precipitaat (eerste SDS gebruik na de extractie). Hierbij wordt uitgegaan van een 8 molair ureum-oplossing vanaf het oplossen van het precipitaat (R401) tot en met de eerste size exclusion chromatografie (K401). Voor de oxidatiestap (R501) en de tweede size eclusion chromatografiestap (K601) wordt uitgegaan van een ureum-oplossing van minimaal 4 molair.

In de huidige opzet van het proces is de besparing van deze operatie als weergegeven in onderstaande tabel (per batch):

Tabel 2

.

l'

.

Vergelijking van kosten per batch bij gebruik van ureum of SDS massa kost-prijs prijs (hf1)

afval-(kg) (hfl/kg) kosten

(hfl)

Ureum-verbruik 398 0.42 167 1695

SDS voor oplossen 4.21 precipitaat (R401)

SDS voor eerste S.E. 3.14 kolom (V 405)

SDS voor oxidatie 0 (V504)

SDS voor tweede S.E. 0.32 kolom (V601) Totaal SDS 7.67 342.80 2629 49 totaal kosten (hfl) 1862 2678

Hoofdstuk

2:

Keuze procesroute

pagina 2.3 Per batch wordt er dus 816 hfl bespaard aan kosten.

Ad 2. In de oxidatiestap moet de concentratie gedenatureerde eiwitten laag zijn om

aggregaatvorming (het vormen van intermoleculaire S-bruggen) te voorkomen. In de 'base case' wordt deze stap batch gewijze uitgevoerd. Bij een volume van ongeveer 1000 liter is de yield ongeveer 91 %. Door de oxidatie stap als een fed batch

operatie uit te voeren kan de yield aanmerkelijk verbeterd worden, omdat de concentratie gedenatureerde eiwitten laag gehouden kan worden. In hoofdstuk 5 over apparatuurberekeningen is de berekening te vinden van de oxidatiekinetiek. In het huidige proces wordt de stap zodanig uitgevoerd dat een opbrengst van 99.5% makkelijk haalbaar is. Om dezelfde produktie te behalen betekent dit een besparing van:

(1-91/99.5)*100% = 8.5 %

op het totaal van hulpstoffen en een ook een besparing van enkele procenten op de grootte van de apparatuur.

Ad 3. Uit de extractiestap (6) komt een waterige afvalstroom die een grote hoeveelheid hulpstoffen bevat (DTT en SDS). Aangezien DTT in grote overmaat wordt toegevoerd en dus een erg klein gedeelte hiervan geoxideerd is kan deze stroom gedeeltelijk worden teruggevoerd naar de reductiestap . Een bijkomend voordeel is dat hiermee ook p-IFN, dat in de 'base case' wordt weggegooid, wordt

teruggevoerd. Deze stroom bevat het p-IFN echter wel in onzuiverder vorm, dan in de hoofdstroom. Voor deze zuiverheid wordt later in het proces gecompenseerd, namelijk bij de tweede size exclusion chromatografie kolom (K601). Om dezelfde zuiverheid te halen gaat de yield van de size exclusion terug van 92 % naar 86 % Een nadeel van deze optie is dat er 2-butanol en zouten in de reductiestap komen, die er eerder niet waren. Verwacht wordt dat dit geen probleem oplevert voor de reductie.

Om ophoping van onopgelost materiaal te voorkomen moet dit eerst verwijderd worden. Dit gebeurt door een tiltratiestap (F301) waar het onopgeloste materiaal kwantitatief verwijderd wordt. Om ophoping van zouten en butanol te voorkomen moet een gedeelte van de recycle gespuid worden. Als criterium voor de grote van de recycle wordt de verhouding van de hoeveelheid gebruikt DTT per hoeveelheid geproduceerd p-IFN. De hoeveelheid gebruikt DTT per batch is de hoeveelheid die met stroom 301 wordt toegevoerd. Voor de hoeveelheid geproduceerd p-IFN wordt de hoeveelheid in stroom 310 genomen (is eerste produktstroom buiten recycle). In de volgende tabel staat de genoemde verhouding uitgezet als funktie van het

recyclepercentage (=stroom 318/stroom 315*100%) Tabel 2.2

recycle percentage 0 20 40 50 60 70 90

Hoofdstuk 2: Keuze procesroute pagina 2.4 Op grond van het bovenstaande is besloten om een recyclepercentage van 50 % te nemen, omdat daar de hoeveelheid DTT per ~-IFN het kleinst is.

Als gevolg van deze recycle van ~-IFN wordt er een stroom gerecycled, die niet gesteriliseerd kan worden voor de volgende batch. Om gevaar van 'besmetting' van volgende batches door vorige batches enigzins te beperken is ervoor gekozen ééns

in de zoveel tijd stroom 319 niet te recyclen, maar weg te gooien. Het aantal keren is gekozen op 5 maal per jaar, overeenkomend met ééns per 20 batches. Dit heeft echter wel invloed op de productie van de batches na het weggooien. Met behulp van de spreadsheet is gekeken hoeveel procent ~-IFN er in de batches minder wordt geproduceerd. De uitkomst hiervan staat weergegeven in de volgende tabel:

Tabel 2.3

nr. batch na weggooien 1 2 3 4 5

gemiste percentage ~-IFN 23.2 5.5 1.3 0.3 0

Betrokken op één batch is dit totaal 30.3

%.

Deze gemiste produktie is per 20

batches, dus 1.52

%

per batch. Bij 100 batches per jaar wordt er standaard per batch 400 gram geproduceerd. Om echter voor dit verlies te compenseren gaan we uit van

1.52 % extra, dus 400*1.0152 = 406 gram.

Alle stromen en apparaten zijn daarom berekend op grond van productie van 406 gram p-IFN.

De hoeveelheid DTT, die op deze manier in de huidige procesopzet per batch bespaard wordt is 2.14 kg (6700 hfl). Doordat er ook ~-IFN wordt gerecycled wordt er natuurlijk op het geheel van hulpstoffen extra bespaard. De totale yield van de oplosstap en extractiestap (R301 en C301) is van 0.504 in de 'base case' naar 0.656 in dit proces gegaan. Om toch aan de zuiverheid te voldoen is daardoor wel de yield van de tweede 'size exc1usion' chromatografie verlaagd van 0.92 naar 0.86. De overall yield van deze stappen is dan:

Base case: Dit proces:

0.504*0.92

=

0.464 0.656*0.86 = 0.613

Ad 4. De lichte fractie uit centrifuge voor het afscheiden van het precipitaat, C 302 bevat een hoeveelheid DTT, dat hergebruikt zou kunnen worden. Het probleem hierbij is echter dat het een butanoloplossing is, die niet eerder dan bij de extractie kan worden teruggevoerd. DTT is echter al bij de reductie nodig.

Ad 5. Uit de eerste 'size exclusion' chromatografie kolom (K401) komt een grote hoeveelheid eluent, die in de 'base case' als afval wordt weggegooid. Deze

afvalstroom kan na verwijdering van de eiwitten door middel een ultrafiltratie-unit, worden hergebruikt als eluent van de chromatografie kolom (K401). Omdat de stroom echter DTT bevat is de hoeveelheid die als eluent gebruikt kan worden

#323 #101 #104 #105 #107 #108 #406 #403 .... - - - I .. ~ #11 0 #106

.. I

FI03 .. #116 #402 #415 #412 .&. #416 #201

.. I

M~1

r'"

I

#424 #206 #510 #301 #307 #308 #311 #319 _#319

I

FSOI

~

_{• #511} P,:\()l--.J

/kSO;

•

#321 #603 .. #601 .. I K601

•

#322

•

#305 #306 #324 #614 #612 I--~.~ #606

Hoofdstuk

2:

Keuze procesroute

pagina 2.5 berperkt. We stellen daarom dat de DTT concentratie in de produktstroom van de chromatografie kolom (1(601) maximaal 2

mM

mag zijn. Op dit criterium zijn de berekeningen voor de grootte van de recycle (#422) gebaseerd. De rest kan worden hergebruikt voor het oplossen van het precipitaat (R40 1). Dit wordt gerecycled via stroom 406.

De hoeveelheid Ureum, die op deze manier per batch wordt bespaard is: Voor oplossen precipitaat via stroom 406:

Als eluent voor S.E.C.-kolom via stroom 422:

167 kg 316 kg

Ad 6. Het filtraat uit de eerst ultrafiltratie (F501) bevat een grote hoeveelheid ureum. Deze stroom kan daarom worden hergebruikt als eluent voor de eerste 'size

exc1usion' chromatografie kolom. Het aanwezige

p-IFN

wordt echter gesteriliseerd en is dus niet meer in de natuurlijke vorm. Deze stroom wordt gerecycled via stroom 510. Hiermee wordt 225 kg ureum per batch bespaard.

Ad 7. Deze stromen bevatten relatief weinig ureum en worden daarom niet hergebruikt

In bijlage 2.1 staan de yields van de 'base case' en van dit proces vergeleken in tabelvo~. Bovendien staan de step yields en de overall yields van dit proces daar grafisch

weergegeven. In de figuren hiernaast staat de alternatieve procesopzet, waar in dit proces

Hoofdstuk

3: Uitgangspunten van het ontwerp pagina 3.1

3. Uitgangspunten van het ontwerp

3.1. Exogene gegevens.

Er moet 40 kg p-IFN per jaar geproduceerd worden met een zuiverheid van 98% ten opzichte van totaal eiwit. In één jaar zijn 50 produktie-weken en 2 weken voor een "total shut down" gereserveerd. Per week wordt er 5 dagen continu gewerkt van maandagochtend

9 uur tot vrijdagmiddag 5 uur. Dit geeft 5200 uren netto beschikbaar voor de produktie van

40 kg p-IFN. Er moeten per week twee batches afgewerkt worden.

Het p-IFN wordt gewonnen uit met recombinant-DNA technieken behandelde E.

eoli,

waarbij het produkt als "inclusion bodies " wordt opgeslagen in de bacterie-cellen. Nadat de inhoud van de cellen is vrijgemaakt, moet het p-IFN afgescheiden worden van de overige proteïnen. Tevens zijn "unfolding-" en "refolding-" stappen nodig niet alleen als opzuive-ringsstap, maar ook voor het in de juiste conformatie brengen van het p-IFN, voor het gebruik als medicijn bij mensen.

3.2. Endogene gegevens.

De fysische eigenschappen van de hulpstoffen staan vermeld in tabel 3.1.

Tabel

3.1.

Stofeigenschappen (onder standaard omstandigheden, 298 Ken 1 bar).

compo- formule MWin pin TI in

s,in

overige

nent g/mol kg/m3 _{Pa·s J/(kg'K)}

lucht 80% N2 29 1.2 1.8.10-5 1300 20% O2 water _H20 18 1000 1.10-3 _{4180 ).=0.607} W/(m·K) Tb = 100 °C ureum H2NCONH2 60.06 1323 DTT _C4HlO0 2S2 154.2 EDTA _C1oHl6N20g 292.3 glucose C~1206 180.2 biomassa CHI.7700.49 29 NO.22S0.0045 PO.OO55 kaliumfos- K3P04 212.3 faat mA C7H50 2I 263.9 ammoni- _(NH4hS04 132 urn-sulfaat

Hoofdstuk

3:

Uitgangspunten van het ontwe rp

pagina 3.2 sucrose C12H22011 342.3 1 581 l-octanol _C8H18O 130.2 8 27 0.01 2121 Tm

= -16°C

Tb

=

194 °C SDS NaC12H1S04S 288.4 2-butanol C4HlOO 74.1 8 08 0.003 2885 Tb

=

99.5 °C 3.3. Veiligheidsmaatregelen en afvalverwerking.

Het organisme dat gebruikt wordt voor de productie van ~-interferon is een met recombi-nant DNA genetisch gemanipuleerde E.

coli.

De wetgeving is zeer strikt bij het gebruik van dit soort organismen en vereist, dat geen enkel levende bacterie uit de opstelling of de fabriek kan onsnappen naar de omgeving. Om aan deze overheidseis te voldoen dient de opstelling "containment proof" te zijn. Dit betekent dat er bewezen moet worden dat tijdens de produktie in die gedeelten van de apparatuur, waar levende cellen aanwezig zouden kunnen zijn, niets vanuit de opstelling naar buiten kan komen. In de fermentor worden de

E-coli

met 1 volumeprocent l-octanol, een voor de cellen dodelijke concentratie, afgedood. Ondanks dit afdoden is de eis van containment van toepassing tot en met de extractie, waar mogelijkerwijs de laatste 'levende' micro-organismen gescheiqen worden van de product-stroom. Vanaf de extractie zal het accent van containment voornamelijk komen te liggen op het weren van vreemde micro-organismen, welke de productstroom (door eiwitafscheiding-en) sterk kunnen verontreinigen. Dit gebeurt onder andere door het toepassen van de dead-end filtratie. Deze tweede vorm van containment is echter voornamelijk gericht op het garanderen van productkwaliteit.

Om te voldoen aan de primaire containment worden een aantal maatregelen genomen. Ten eerste worden de vloeibare afvalstromen uit het proces en uit het schoonmaken afgevoerd naar een kill tank alwaar 100% afdoding (chemische I thermisch) gegarandeerd wordt vóór afvoer naar de rioolwaterzuivering.

De gebruikte hulpstoffen, die nodig zijn bij het proces, leveren over het algemeen en bij de condities waarbij gewerkt wordt nauwelijks gevaar op. Alleen in het geval van brand dient er een goede blus installatie aanwezig te zijn, omdat de ontleding van stoffen als DIT, ureum en EDTA zure gassen geeft, die gevaarlijk zijn bij blootstelling. Verder dient er vanwege het gebruik van een genetisch gemanipuleerd micro-organisme reeds gewerkt te worden volgens de GILSP-GSI (Good Industrial Large Scale Practice-klasse 1). Dit houdt in dat de werknemers bijna niet in aanraking kunnen komen met de stoffen in het proces en

bovendien speciale kleding en mondbeschermmg moeten dragen. ₁₁

~

....

~

_VJ el) Q

~

_~

~

o

~

~

N ~

~

VJ Q ~ ~

~

_Q ~

e

L.o ~

_..

...-4 ~

~

VJ

~

.c VJ ~ o C ...-4

t

stoom stikstof (2) stikstof (2) stoom "'Cl

~

~ lucht \" @D .t:J ...-4

.

"I:!' L.o =' ~ ~

lucht (5 bar) uit compressiesysteem stikstof (5 bar)

stoom (3 bar; 190 C) koelwatercircuit (10 C) warmwater (70 C)

leidingwater

afval( water+vast) naar afdodingstank s naar een tra al afgassysteem

R 101 P 101 P 102 F 101 F 102 P 103 F 103

+

t

Fermentor + terugvoervat Doseerpomp Doseerpomp Sterilisatiefil ter Filter Drukpomp Crossflow Microfilter (I) ,.... ~ (I)

o

... P 201 P 202 M 201 C 201 V 201 V 202 Drukpomp Voedingspomp Homogenizer

Tubular Bowl Centrifuge Voorraadvat Homogenizer Voorraadvat Homogenizer z » » ;0 ~ 00;0 stikstof (2)

..

fT! o C ( ) :::! fT! afgas (8) afval (7) afvalstroom FVO 3120 D: PROCESSCHEMA VOOR DE PRODUKTIE VAN BETA-INTERFERON (BLAD

Peter Vrijkorte en Henry van Veldhuizen

december 1994

~

Hoofdstuk

4:

Beschrijving van het proces

pagina 4.1

4. Beschrijving van het proces

In het nu volgende hoofdstuk wordt een beschrijving van het proces gegeven. Dit zal geschieden aan de hand van het flowsheet in figuur 4.1, blad 1,2 en 3. In paragraaf 4.7 wordt de cycle time analyse beschreven.

4.1. Sectie 1: de fermentatie.

In de fermentor, R101, wordt een groeimedium gebracht vanuit VlOl. Vervolgens wordt geïnoculeerd met een reeds ontdooide voorkweek. Deze bestaat uit een met recombinant DNA-techniek behandelde E.

coU

van de stam

K12.

Na een lag-fase van 5 uur zal aan de fermentor fed-batch substraat toegevoegd worden uit V102 onder aerobe omstandigheden, waarbij exponentiële groei plaatsvindt. De lucht die hiervoor nodig is wordt eerst door een filter, F101, ontdaan van m.o. van buitenaf. Ook de afgassen worden gefilterd in F102 om te voorkomen dat de genetisch gemanipuleerde m.o. ontsnappen uit de fabriek. Na 18 uur exponentiële groei zal de fermentor zodanig bedreven gaan worden, dat de celculture overgaat naar de produkt-fase, waarbij vooral p-interferon geproduceerd wordt, dat opge-slagen wordt in "inclusion bodies ". Deze fase in de fermentatie zal 6 uur in beslag nemen. De celdichtheid is aan het eind van de fermentatie 13.3 gIl. Tenslotte worden de cellen geïnactiveerd met l-octanol, V103, gedurende 1 uur.

Na het af doden wordt de celsuspensie in de fermentor geconcéntreerd middels cross-flow microfiltratie, F103, waarbij gecirculeerd wordt over het membraan en fermentor. Deze concentreringsstap tot 100 gIl neemt drie uur in beslag. Hierna wordt met een fosfaat

gebufferde saline-oplossing uit VI04 de geconcentreerde celsuspensie gewassen, waarbij het droge stof gehalte op het eind weer 100 gil is. Bij deze diafiltratiestap worden de opgeloste componenten (zouten, exoenzymen, glucose en octanol) merendeels uitgewassen. Er gaat 5% p-IFN verloren door kapotgeslagen E.

coU

cellen en door het dode volume in het

membraan. De afvalstroom van de microflltratie verloopt via het vat V105. Af en toe zal dit vat onder druk worden gezet om de microflltratie te "back flushen" .

4.2. Sectie 2: de eerste opwerkingsfase.

De geconcentreerde celsuspensie wordt vervolgens naar de eerste tank, V202, van de homogenizer verpompt. In de homogenizer, M201, wordt de celsuspensie in 2.2 uur drie maal batchgewijs doorgevoerd via de tanks V201 en 202. Hierbij wordt door afschuifspan-ningen vanwege een grote drukval (450 bar) de celwand kapotgeslagen, waarmee de inclusi-on bodies met 60% p-IFN vrijkomen. Bij drie passes komen 87% van de "inclusiinclusi-on-bodies" vrij uit de cel en wordt de viscositeit als gevolge van vrijkomend DNA en eiwit niet te hoog. Koeling, H201, van de suspensie is nodig.

Met behulp van een doseerpomp wordt de suspensie samen met een sucrose-oplossing uit V203 gevoed aan vier tubular bowl vloeistof-vast-centrifuges, C201. De sucrose-oplossing helpt bij de afscheiding van de solide "inclusion bodies" met relatief hoge dichtheid (1300

kg/m3

Q) 'Q ~ 'Q

.;;

Q)

~

(IJ

5

Q)

~

(IJ (IJ ~

=

~ ~ ~ c. <:) Q) 'Q

E

_..

~

~

(IJ

1

~

<:) c N 'Q Q) ~

....

- ' t .c Q) . . (IJ .-c ~

. =

~~

!3

~

6'n~ .- c. ~ <:)

~

I

°l lIll

(TI 0 - t o o ... - i l l l - t ~ }> Ol fosfaat N I c:r c stoom (3) p H C 1 r -o 1.0 o Ol ~: o N S:

[LEGENDA: zi~

ElLAO-l-j

lP 301

, _{R 301} 'p 302 R 302 C 301 C 302 Reductie + Extractietank Precipitatietank L-L Centrifuge Tub.B Centrifuge P 304 P 305 P 306 ~ o eb _.., Doseerpomp Doseerpomp Voedingspomp Voedingspomp Voedingspomp afgas(8) . . Ol r ? ~ Ol

o

~: N ~

afval(7~

R 401 F 401 R 402 V 404 F 402

Tank voor oplassen precipitaat

Dead end filter Reductietank Recyclevat Ultrafiltratie P 401 P 402 P 403 V 405 K 401 P 404 Ol I~ 10 r ? 0 -t o r ? - t o Cl> 3 .., afgas(~) ~ o r ? Cl> ..,

•

~ 0

IC

I(TI 0 0 ' " 0 r?(l)(l)-t Cl> r ? C }> .., 0 3 ...,0 Ol ... stoom ) ~4 .. K.W.CÎrcuit i) ~14 .. W. W.CÎrcuit z }> }> ;u o x ~ ~14 I ~I. @ ~ 6 afvalstroom (7) FVO 3120 D: PROCESSCHEMA VOOR DE

PRODUKTIE VAN BETA INTERFERON (BLAD 2) Peter Vrijkorte en Henry van Veldhuizen

december 1994 }> ::l (TI Voedingspomp Doseerpomp Voedingspomp Eluentvloeistoftank S.E. kolom

Hoofdstuk

4:

Beschrijving van het proces

pagina 4.2 uur durende centrifugestap worden de "inclusion bodies" met een droge stofgehalte van 200 gil batchgewijs uit de centrifuges geschrapt met een opbrengst van 90%.

4.3. Sectie 3: de tweede opwerkingsfase.

Om de extractie uit te kunnen voeren dienen de inclusion-bodies uit de celdisruptie te worden opgelost. De oplosstap en de extractie worden na elkaar uitgevoerd in hetzelfde vat R 301. Voor het oplossen wordt gebruik gemaakt van SDS, dat als detergent de eiwitten in oplossing houdt. Tevens wordt denaturant (DTT) en een chelating agent (EDT A) gebruikt. Genoemde stoffen worden toegevoegd vanuit vat V301. Hierin is ook een gedeelte aanwe-zig vanuit de vorige batch, inclusief p-IFN. Na de sterilisatie, die wordt uitgevoerd vóór het bijvoegen van de stroom uit de vorige batch (319), wordt het vat afgekoeld tot 78°C. Samen met de stoom uit de vorige batch(319) en de produktstroom uit de centrifuge (209) levert dit een temperatuur van 50°C. Deze temperatuur is vereist voor het oplossen in R301. Na een reaktietijd van 10minuten, gevolgd door afkoelen en pH-correctie tot pH 7.0 is 95% van de inclusion-bodies en dus van p-IFN opgelost.

De extractie wordt uitgevoerd door het toevoeren van 2- butanol aan het oplosvat (R301), zodanig dat een 1 op 1 (v/v) water-butanol systeem ontstaat. Tevens wordt een hoeveelheid keukenzout toegeveogd voor het uitzouten van p-IFN en voor een verlaging van de oplos-baarheid van 2-butanol in water. De water en butanol-fasen worden gescheiden met behulp van een vloeistof-vloeistof centrifuge (C302). Een gedeelte van de waterfase (zie hoofdstuk 2) die uit de centrifuge komt wordt gefiltreerd in een 'dead end' operatie (F301; O.22jLm)

voor het verwijderen van onopgelost materiaal. Vervolgens wordt deze stroom (319) teruggevoerd naar het voorraadvat (V301) voor de oplosstap. Met deze stroom wordt een grote hoeveelheid van de benodigde hulpstoffen en van p-IFN teruggevoerd en hergebruikt. De butanol-fase uit de centrifuge gaat door naar de precipitatietank (R302).

De zure precipitatie wordt uitgevoerd door het toevoegen van een hoeveelheid fosfaatbuffer uit V303 gelijk aan 1/3 van de hoeveelheid 2-butanol. Hierna wordt de pH op 5 gebracht met behulp van ijsazijn (306). De precipitatie duurt 3 uur.

Met behulp van twee tubular bowl centrifuges (C302; zelfde als bij het terugwinnen van de inclusion bodies in sectie 2: C201) worden de geprecipiteerde eiwitten gedurende 3 uur in geconcentreerd tot een concentratie van 200 gIl. Het concentraat gaat door naar de tank voor het oplossen van het precipitaat (R401) in sectie 4.

4.4. Sectie 4: de derde opwerkingsfase.

In R401 wordt het concentraat gedurende 10 uur opgelost en verdund tot 3 gIl. Hiervoor

wordt ureum (8M), EDTA (5mM) en fosfaatbuffer (50mM) toegevoegd via stroom 403. In

deze stroom zit een gedeelte gerecycled materiaal (stroom 406) uit de vorige batch (zie verder in de beschrijving van deze sectie). Vanuit R401 wordt de productstroom door een "dead end" filter van 0.22 jLm geperst, F401, waarmee onopgelost materiaal verwijderd

(1) ~ !=' i>

..

IoC (1)

~

_til

=

(1) (1)

~

til til 0.()

=

~

"'"

~

c. o (1) "C á:l .S:

'!i

~

_til

...:

~

.s::

til ~ o C

..

('f") "C (1) ~

....

-

....

..c ~

..

~

~

=

~!i! "'" "'" ::s (1) ~~ .... c. ~ 0 o .0 o o ... IQ o

Noor eluent voorraadvat (V405)

[LEGENDA: zie BLAD 1

I

R 501 F 501 P 501 P 502 P 503 P 504 o .0 o (I) o .0 o

~

Ol

cl

[Tl o () .... 0 . . . (1) (1) -i (1) . . . C »

.... g

3 en'" ' - ' <B stoom (3 Oxidatietank Ultrafiltrotie Doseerpomp Doseerpomp Doseerpomp Voedingspomp stoom (3) afval (7 V 6031 Eluentvloeistoftank K 601 S.E. kolom P 602 Voedingspomp o ... IQ o ~J1,. - .~ V 602 P 602 P 603 K 602 V 603 (I)

...

~ (I)

...

o ;:!:. N '--' o .0 o (I) .-... ~ ~ z » » ;0 -., o 1§)

.,~

.,4

®

~ ~

Oxidatietank Voedingspomp Voedingspomp Ontzoutingskolom Eluen tvlaeistaftank afval I (7) Afvalstroom FVO 3120 D: PROCESSCHEMA VOOR DE PRODUKTIE VAN BElA INTERFERON (BLAD 3)

Peter Vrijkorte en Henry van Veldhuizen

december 1994 r [Tl ::Q z Cl

Hoofdstuk

4:

Beschrijving van het proces

pagina 4.3 wordt.

In de opvolgende reductiestap, R402, wordt evenals in de oplosstap het p-IFN volledig ontvouwen door toevoeging van extra DTT als denaturant uit V 402. De pH wordt ver-hoogd naar 8.5, en vervolgens wordt verwarmd tot 50°C, op welke temperatuur de oplos-sing 10 minuten wordt gehouden. Daarna vindt afkoeling naar 25°C plaats. In deze reduc-tiestap gaat 5% van het p-IFN verloren ten gevolge van verandering in primaire structuur. Vervolgens wordt in twee 'size exclusion' Chromatografie (SEC) kolommen, K401, met hoge effectiviteit het denaturant DTT verwijderd, welke stof een storende invloed heeft op de erna komende oxydatie. Met twee parallelle Sephacryl S-l00HR kolommen, die twee maal beladen worden, gaat 5% van het p-IFN verloren en wordt in 5.5 uur alle DTT

verwijderd. Bovendien stijgt de zuiverheid van p-IFN van 57% naar 80%. Het eluent wordt aangevoerd vanuit vat V405 en bevat ureum (8M), EDTA (lmM) en acetaat (50mM). Aan dit vat worden twee stromen (422 en 510) uit de vorige batch toegevoegd die worden hergebruikt (zie verder). De recycle uit het afval van de SEC (stroom 422) bevat DTT, als gevolg waarvan er wel DTT in de produktstroom terecht komt. Als gevolg hiervan bevat de produktstroom van de SEC (K401) toch een hoeveelheid DTT. Daarom wordt deze recycle op een zodanige manier beperkt dat de concentratie van DTT in de produktstroom van de SEC (K401) niet hoger wordt dan 2mM. De produktstroom gaat door naar het voorraadvat (V501) voor de oxidatie (zie sectie 5).

De afvalstroom van de SEC (K401) wordt met behulp van een ultrafiltratie-unit geconcen-treerd tot 0.75 gIl. Deze operatie duurt ongeveer 3 uur. Het concentraat (411) wordt gespuid. Het filtraat (419) wordt gedeeltelijk hergebruikt als eluent voor de volgende batch (stroom 422) en gedeeltelijk hergebruikt voor het oplossen van het precipitaat (stroom 406). De rest wordt gespuid (415).

4.5. Sectie 5: de vierde opwerkingsfase.

De produktstroom uit sectie 4 die opgevangen wordt in vat V 501 wordt gedurende 3 uur fed-batch toegevoegd aan reaktor R501, waarin vantevoren al oxidatievloeistofuit vat V504 is gebracht. Deze oxidatievloeistof bevat jodosobenzoëzuur (!BA), Ureum (ongeveer 4M) en EDTA (1 mM). Jodosobenzoëzuur wordt equimolair aan de hoeveelheid eiwit plus niet geoxideerd DTT toegevoegd. Hierdoor worden de ontvouwen eiwitmoleculen gecontroleerd weer opgevouwen. De opbrengst van p-IFN bedraagt als gevolg van de fed-batch operatie 99.5%.

Om de correct opgevouwen p-IFN verder op te zuiveren wordt de produktstroom over twee SEC-kolommen, K601, geleid ten behoeve van verwijdering van gevormde dimeren en overige nog aanwezige E. coU-eiwitten. De productstroom uit de oxydatie bedraagt echter ruim 1.1 m3

, waardoor concentrering van de eiwitstroom middels ultrafiltratie F501 nodig

is. De oplossing wordt geconcentreerd tot 10 gIl eiwit met een yield aan p-IFN van 94%. Hierbij wordt uitgegaan van een hollow fiber membraan met MWCO 3000 en concentrering tot 20 gIl gevolgd door naspoeling met eenzelfde volume uit de penneaatstroom.

Hoofdstuk 4: Beschrijving van het proces pagina 4.4

4.6. Sectie 6: de vijfde opwerkingsfase.

Met een eiwitoplossing van 10 gil wordt in twee parallelle Sephacryl S-100HR kolommen, K60l, met een opbrengst van 86% de ~-IFN opgezuiverd tot 98% ten opzichte van het totaal eiwit. De elutievloeistofkomt uit vat V60l en bevat ureum (4M), EDTA (1mM) en acetaat (50mM).

Om bij gelijkblijvende eindzuiverheid van 98 % de zouten uit de elutievloeistof te verwijde-ren is een ontzoutings-gel-chromatografie stap vereist. Wederom is éérst een concentrering naar 10 gil eiwit vereist met behulp van de ultrafiltratieunit V602/F601. Via de procedure concentreren tot 20 gil en naspoelen met eenzelfde volume ureum-oplossing worden de eiwitten geconcentreerd met een opbrengst van 94% aan ~-IFN.

Tenslotte wordt dit concentraat gedoseerd toegevoegd aan een laatste opzuiveringsstap, de ontzoutinschromatograaf, K602. Als elutievloeistof wordt uitgegaan van verdunde (1 mM)

natronloog uit vat V603. Er wordt gebruik gemaakt van twee parallelle Sephadex G50 kolommen, welke met een rendement van 97% de zouten afscheiden van de productstroom

~-IFN. Na deze stap is er 406 gram ~-IFN verkregen per batch met een zuiverheid van 98%.

4.7 Cycle Time analyse

Bij niet-continue processen is het van belang dat apparatuur en utilities zo efficient mogelijk gebruikt worden. Het is dan ook van groot belang de verschillende proces stappen nauwkeu-rig in kaart te brengen, zodat een compleet overzicht wordt verkregen op welke tijdstippen de verschillende operations plaatsvinden. Voor de produktie van ~-interferon vinden verschillende processtappen plaats, waarbij de volgende units worden gebruikt:

procesaktie unit 1 RlOl 2 VlOl 3 V102 4 V 103 S Vl04 6 F103 7 VlOS 8 V202 9 V201 10 M201 11 C201 12 V203 13 R301 14 V301 fermentor

voorraadvat met medium voorraadvat met glucose voorraadvat oktanol

voorraadvat fosfaatoplossing module voor rnicro- en diafiltratie vat voor backflushen membraan (F103) voorraadvat homogenizer

voorraadvat homogenizer homogenizer

centrifuge voor afscheiden inclusion bodies voorraadvat sucroseoplossing

vat waarin reduktie en extraktie plaatsvindt voorraadvat met reduktie-stoffen

40

38

36

34

32

30

28

26

Q)

:;:: 24

~

22

~

20

o

o

18

' -0..

16

14

12

10

8

6

4

2

o

-- ft-;

-

IIH

-

~

-H,

. ' ~

-o

11 " I--H I--H 11 ". I 111 II

20

" I 11 I " :' I 11 II'! "

40

,~ ': ",' t;H

HH

-t----tt-:J

!--:-'1 ~j.

.. ..

Ol 11 I .i 11 ::

60

procestijd [h]

~

Figuur 4.2: cycle-time diagram

',', " " I I I

f-Hl

;, 1,,"-" " " H " " " ,,' ,!IIII I I :: :,' .:' " :! " ~ '~ "

80

100

120

Hoofdstuk

4:

Beschrijving van het proces

pagina 4.5 15 V302 voorraadvat met natronloog

16 C301 liquid-liquid centrifuge (butanol/water) 17 R302 precipitatievat

18 V303 voorraadvat fosfaatoplossing

19 C302 centrifuge voor afscheiden precipitaat 20 R401 oplosvat precipitaat

21 V401 voorraadvat stoffen voor oplossen precipitaat 22 F401 dead-end microflltratie

23 R402 reduktievat

24 V402 voorraadvat met reduktie-stoffen 25 V403 voorraadvat natronloog

26 K401 size exclusion chromatografie 1 27 V404 buffervat voor ultraflltratie F402 28 F402 ultraflltratie unit

29 V501 voorraadvat voor fed-batch toevoegen 30 V504 voorraadvat hulpstoffen fed-batch oxidatie 31 V405 voorraadvat elutievloeistof

32 R501 oxidatie vat

33 V502 voorraadvat met natronloog 34 F501 ultraflltratie unit

35 K601 size exclusion chromatografie 2 36 V503 voorraadvat ijsazijn

37 V601 voorraadvat elutie-vloeistof 38 V602 buffervat voor ultraflltratie F601 39 F601 ultraflltratie unit

40 K602 ontzoutings chromatografie 41 V603 voorraadvat elutie-vloeistof

Voor de berekening van de cycle-time wordt uitgegaan van een werkweek van 104 uur (maandagochtend 9.00 uur tot vrijdagmiddag 17.00 uur). In de weekenden wordt niet gewerkt. Dit betekent dat er per week op basis van 50 werkweken per jaar en 100 batches per jaar, 2 batches compleet moeten worden afgewerkt. Per batch wordt dan 406 gram

13-interferon geproduceerd.

In bijlage 4.1 staan de proces stappen gegeven met de procestijden. Belangrijkste aannames zijn:

voor het vullen en legen van vaten wordt een standaard tijd van 0.5 uur genomen het schoonmaken van units duurt standaard 2 uur

het schoonmaken van de membraan-units bedraagt standaard 20 uur

het afkoelen van vaten nadat gesteriliseerd is met stoom is kleiner dan 5 uur de overige procestijden zijn gebaseerd op gegevens die verkregen zijn bij de di-mensionering van de units

Hoofdstuk 4: Beschrijving van het proces

pagina 4.6 Het blijkt dat de gebruikstijd van de fermentor (RIOl) limiterend is. Op grond hiervan wordt het meest ideale proces-pad bepaald.

Het maximaal aantal fermentaties dat ingezet kan worden bedraagt 2. Een volledige fermen-tatie duurt 40 uur, zodat het onmogelijk is 3 fermenfermen-taties uit te voeren in de beschikbare 104 uur. Gekozen wordt om de tweede fermentatie 2 uur na het einde van de eerste fermen-tatiein te zetten. De down-stream-processing voor deze tweede batch wordt dan afgebroken nadat het reduktievat (12) gevuld is met de inclusion bodies vanuit de centrifuge (11).

De down-stream-tijd van de eerste batch ligt binnen 104 uur, zodat deze in zijn geheel kan worden afgewerkt.

De belangrijkste conclusies zijn

- de gebruikstijd van de fermentor is limiterend in het cycle-time diagram; dit betekent dat het aantal batches dat maximaal uitgevoerd kan worden bij continue procesvoering door de fermentatietijd bepaald wordt

- alle down-stream-processtappen duren korter dan de fermentatie; dit betekent dat de procestijd voor de proces stappen die relatief duur zijn vergroot kan worden, zodat de investeringskosten verkleind worden. Hierbij kan gedacht worden aan het verkleinen van het membraanoppervlak bij bv. ultrafiltratie. De investeringskosten worden zodoende verkleind en de procestijd vergroot.

- uit het cycle diagram kan afgelezen worden dat bepaalde vaten 'dubbel' gebruikt kunnen worden. Er wordt echter aangenomen dat om containment te minimaliseren voorraadvaten niet gevuld mogen worden met produktstromen. Wel kunnen de centrifu-ges gebruikt voor het afscheiden van de inclusion bodies (C201, procesaktie 11) ook gebruikt worden voor het afscheiden van het precipitaat (C302, procesaktie 19).

- bij vol continu zijn van de fabriek kunnen maximaal 200 batches worden ingezet. (8000 werkuren per jaar en 1 fermentatie duurt 40 uur). De produktie bij vol continue bedrijfs-voering bedraagt dus 80 kg.

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. pagina 5.1

5. Apparatuurberekeningen.

5.1. Algemeen.

In het nu volgende hoofdstuk zullen de verschillende "unit operations" verder uitgewerkt worden. Hierbij wordt inzicht gegeven in de modellen die zijn gebruikt voor de

dimensionering.

In bijlage 5.1 wordt ingegaan op de warmtewisselaar, H201, die nodig is voor het koelen na

de cel-disruptie en de opwarmtijden voor het oplossen van de inclusion bodies in RJOI.

5.2. De fermentor R101.

Het micro-organisme (m.o.) waarmee het p-IFN wordt geproduceerd is een genetisch

gemanipuleerde E. coli van de stam K12. Na raadplegen van Atkinson (1991) werd er een

gekeuze gemaakt omtrend het groei-traject van de bacterie. Deze trajecten zijn weergegeven in tabel 5.2.1. met de groei-parameters. Er wordt verondersteld dat de groei in de

exponentiële en de produkt-fase met Monod-kinetiek kan worden beschreven en dat in de "lag phase" geen groei plaats vindt.

Tabel 5.2.1. De verschillende kweek-stadia van de gebruikte E. coli.

tijd in eh] Ilmax in [1/h]

"lag-phase" 5 0

exponentiële-fase 18 0.4

produkt-fase 6 0.1

De overige groei-parameters worden constant genomen gedurende de fermentatie:

~ ms = Y_xs 6.8.10-2 0.012 0.5 mg/l, kg substraat/(kg biomassa·h), kg biomassa/kg substraat.

Uit de patenten (zie literatuuroverzicht) volgen de aanbevelingen voor het bedrijven van de

fermentatie bij 37

oe

onder 2 bar. De substraat-concentratie, glucose, kan het beste liggen

tussen de 5 tot 10 gil met een opgeloste zuurstof-concentratie van 40% van het maximaal

haalbare. Uit de keuze van de batch-grootte volgt dat er elke run 49.5 kg biomassa gemaakt moet worden. Terugrekenen geeft een benodigde ent van 20.0 g biomassa per batch.

Bij het opstarten van de fermentor worden alle nutrienten, die nodig zijn voor het verkrijgen

van 49.5 kg biomassa, in een watervolume van 3 m3 gedaan. Een overzicht van het kweek

medium is in tabel 5.2.2. weergegeven. Alleen glucose zal fed-batch toegevoegd worden. Het

eindvolumemoet 3.84 m3 _{zijn met een biomassa-concentratie van 13.3 gil.}

, , . .~. "". .' ~' ... ' ".,.', .:.... '. '

14

- : - - - - -

-12

---:

10

-

.

î

8

-_

.

.

.

_

.

- - -.=-7='=--_ _ ·_··· . ..::(

S=U=b=::S

~=r_a_at-,I

0') -~ "'"-' Cf)

-x

I

4

~

_I I !

2

J

I

O~!---====

====~~~---o

6

12

18

tijd

(uur)

->

. . ..' . ; ~ '., '," ~-0.95

-

0

.

9

!·

-0.85

. . ... ~

---,---'-

;

0.75

24

--

I

----Ü c . -U>

>

---->

Figuur

5.2.1:

biomassaconcentratie, substraatconcentratie en relatief volume (VNeind)

tijdens fermentatie

als funktie van de tijd

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. pagina 5.2 berekend worden uit de yield van biomassa op substraat, de maintenance en de substraat concentratie in het medium en komt op 132.6 kg glucose. Hiervan zit al 22.6 kg in het

beginvolume van 3 m3

• Dit betekent dat de 0.71 m3 fed-batch toegevoegde stroom nog 110 kg

glucose moet bevatten. De toevoegsnelheid is afhankelijk van de hoeveelheid biomassa en daarmee van de tijd, om tussen de grenzen van de aanbevolen glucose concentratie te blijven.

Het debiet als functie van de tijd is verder uitgewerkt in bijlage 5.2. In figuur 5.2.1. staan de

biomassaconcentratie, de substraatconcentratie en het volume als functie van de tijd.

Tabel 5.2.2. De samenstelling van het kweekmedium.

!F='=---component 1 ... -ZnS04·7H20

1..----MnS04·4H20 1 ... -CuS04·5H20

1..----Na₃Citraat· 2H₂0

1..----KH2P04

1..----(NH4)2S04

1..----MgS04·7H20 1 ... -FeS04·7H20

1..----L-Tryptofaan 1 ... -Thiamine-HCI Tetracycline 1 ... -Glucose concentratie in M 30~M 30~M l.5mM 21 mM 72mM 3mM 72~M 70 mg/l 20 mgll 5 mg/l 7.5 gil

Bij het ontwerpen van de fermentor is gebruikgemaakt van van 't Riet (1991). Voor de afmetingen van de fermentor wordt gekozen voor een standaard configuratie met een zesbladige turbine-roerder op een afstand D van de bodem en met keerschotten:

H

=

2·Tv,

D

=

0.33·Tv,

H_s

=

0.2·D,

met H

=

hoogte van de fermentor in m,

D

=

diameter van de roerder in m,

Tv

=

diameter van de fermentor in m,

H_s

=

hoogte van het roerderblad in m.

Het vloeistof volume is maximaal VI = 3.9 m3• Met een veronderstelde hold-up en foam van

30% van het vloeistofvolume moet het totale fermentor-volume V

=

5.1 m3 _{zijn. Hieruit volgt}

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. pagina 5.3 De volgende stap is het bepalen van de zuurstof-overdrachtscapaciteit in de fennentor. In de eerste plaats moet dan bekend zijn hoeveel zuurstof het m.o. opneemt:

1

OUR =

«- -

1.0525)' IJ. + m)' X

y - (5.1)

met OUR = "oxygen up-take ratelt in kg/(m3·s).

Het getal 1.0525 volgt uit de elementen-balans over het m.o. met als samenstelling:

CHI.770o.49No.22So.004sPo.ooss' De OUR is het hoogst op het einde van de exponentiële groei en is dan: OUR = 8.8.10.3 _kg/(m3_{·s). Voor de zuurstof die wordt overgedragen van de gas-fase naar}

de vloeistof-fase geldt:

met OTR

=

klA

=

Col"

=

Col

=

"oxygen transfer ratelt in kg/(m3_·s),

stofoverdrachtscoëfficiënt maal specifiek oppervlak per vloeistofvolume in lis,

verzadigingsconcentratie van zuurstof in de vloeistof kg/m3

,

zuurstofconcentratie in de vloeistofbulk in kg/m3•

(5.2)

in

Voor de maximale zuurstof concentratie in zuiver water volgt uit Binas bij 310 K en 1 bar: Col"

=

35 mg/l. Met behulp van de Henry-coëfficiënt volgt dan de maximale

zuurstof concentratie in water als functie van de partiaalspanning van de zuurstof in de lucht:

p

C' - ~

0 / - H

met H = Henry-coëfficiënt, bij 310 K: H = 2.96.103 _Pa·lImg.

Verder wordt verondersteld, dat in de fermentor als gevolg van de toevoeging van voedingstoffen en de aanwezigheid van m.o. maximaal 0.9·Col" gehaald kan worden.

(5.3)

Er wordt vanuit gegaan dat de uitputting van de luchtbellen verwaarloosd mag worden en dat de weerstand voor stof overdracht volledig aan de vloeistof zijde ligt. Voor een geroerde tank bij 20

oe

en een coalescerende vloeistof is de klA dan met een maximale fout van 30%:

met

=

Pil 04 c

kof'1 E 0.026'(-)· .

(v,r

v,

het door de roerder ingebracht vermogen per vloeistof-volume in W/m3

,

de gecorrigeerde superficiële gassnelheid in mis.

De hold-up voor een CSTR, heterogeen en non-flooding volgt uit:

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. pagina 5.4

met €

=

volume gas/(volume gas

+

volume vloeistof).

Verder kan nu het luchtdebiet berekend worden uit:

Q _• A _{. - ' v} P. c

p. p

waarbij

Q

=

luchtdebiet in m3/s,

A

=

dwarsdoorsnede van de fermentor in m2

, Ps

=

druk ter hoogte van de beluchter in Pa, Pa

=

druk bovenin de fermentor in Pa,

R

=

gasconstante, 8.3144 J/(mol'K),

T

=

temperatuur in K,

Pgem

=

gemiddelde druk in de fermentor in Pa.

Het vermogen dat door het gas wordt ingebracht in Wis:

P = F'R'T'ln(P,)

g g P.

met Fg = molenstroom lucht in mol/s (= Q*pgemIR/T).

Het door het gas ingebrachte vermogen mag nooit groter zijn dan het vermogen van de roerder om flooding te voorkomen.

(5.5)

(5.6)

(5.7)

De belangrijkste warmte-produkties vinden plaats door het m.o., door de roerder en door het inkomende gas: waarbij = = = = = = r ~ 460.103 • OUR . V HM I r _HG ~ C _pg '(T _gt -1)'Q' P _g

warmte-produktie, door het m.o. in W,

toegevoerde warmte door ingaande gas in W, warmtecapaciteit in J/(kg·K),

temperatuur van het ingaande gas in

oe,

temperatuur in de fermentor in

oe,

dichtheid van het gas in kg/m3•

(5.8)

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. pagina 5.5 De afvoer van warmte geschiedt door verdamping van vloeistof en door warmteoverdracht aan de wand: met rHV

=

Hy

=

po

₌

hvü

=

hyi

=

rHW

=

hw

=

Af

=

TI

=

°

r = H . Q' (L. h - h ) HV Y Pa "" yj

afgevoerde warmte door verdamping in W, verdampingswarmte in J/kg [=2.35*106

J/kg] standaard druk in Pa,

waterdampconcentratie bovenin de fermentor in kglm3 ,

waterdampconcentratie van de ingaande lucht in kglm3,

afgevoerde warmte door de wand in W, warmteoverdrachtscoëfficiënt in W l(m2

• K),

wandoppervlak van de fermentor in m2,

temperatuur van de omgevingslucht in K.

(5.10)

(5.11)

Voor het geval dat er te veel warmte geproduceerd wordt tijdens de fermentatie, zal deze afgevoerd moeten worden. Hiervoor moet een koelmantel aangebracht worden. Als koelmedium wordt water gebruikt. Het benodigde oppervlak kan berekend worden uit:

met rHs h À N v (5.12) À N'D1 C ." h = _. 0.6' ( _ _ )067 . (_'_)0.33 Ty v À (5.13)

=

=

=

=

=

l I d .. - = - + -hl h À .. (5.14) (5.15) P

·Q·e

T-T A = < < pc '1n( _ _ <I) C h T-T I co (5.16)

warmte-produktie door de roerder in W.

warmteoverdrachtscoëfficiënt in de fermentor in W/(m2_·K),

warmtegeleidingscoëfficiënt van de fermentorvloeistofin W/(m·K),

toerental van de roerder in lis,

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. pagina 5.6 Cp ht

<lw

Àw Qe He Teo Tci

Ac

= = = = = = = = =

warmtecapaciteit van de fermentorvloeistofin J/(kg'K), totale warmteoverdrachtscoëfficiënt in W/(m2·K), dikte van de fermentorwand in m,

warmtegeleidingscoëfficiënt van de fermentorwand in W/(m·K), debiet van het koelmedium in m3/s,

de over te dragen warmte van de fermentor naar het koelmedium in W, uitgaande temperatuur van het koelmedium in K,

ingaande temperatuur van het koelmedium in K, oppervlak van de koelspiraal in m2

•

De volgende aannamen zijn gedaan voor de bovenstaande ontwerpvergelijkingen van de reactor:

- de weerstand van warmteoverdracht ligt geheel aan de zijde van de fermentorvloeistof, - de uitputting van de gasbellen is verwaarloosbaar,

- het ontwerp is gericht op het zogenaamde "worst case" geval; dat wil hier zeggen dat er gekeken wordt naar de situatie waarin de DUR in de reactor maximaal is en waarbij de warmte-produktie maximaal is.

De variabelen die zijn gekozen staan weergegeven in tabel 5.2.3.

Tabel 5.2.3. Gekozen variabelen.

grootheid waarde opmerkingen

Col O.4,Col' PstNI 4000 W/m 3 _{maximaal 5000 W/m}3 _voor commerciële fermentoren vgs e 0.025 mis Pa 2 bar Ps 2.3 bar Pgem 2.15 bar

Tgi 60°C hoge temperatuur door

compressor

hvi 0.004 kg/m3

T 37

oe

hw 10 W/(m2·K) waarde genomen uit

voorbeeld boek

hvo 0.05 kg/m3 waarde genomen uit

voorbeeld boek

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. pagina 5.7

~ 0.05m

Àw 80 W/(m·K) roestvrijstalen fennentor

Col- 12.9 mg/l

De belangrijkste ontwerp grootheden staan in tabel 5.2.4.

Tabel 5.2.4. Ontwerpgrootheden grootheid waarde e 0.17 Q 0.0493 m3_/s Pg 1482 W kolA 0.113 1/s OTR 0.88.10-3 _kg/(m3_·s) OUR 0.88.10-3 _kg/(m3_·s) ht 3320 W/(m2·K) Fe 0.00313 m3_/s He 65.4 kW Ae 0.81 m2 r_HM 49.3 kW rHs 15.6 kW rHG 5.31 kW rHV 2.43 kW rHW 2.33 kW

Zoals is te zien in tabel 5.2.4 treden er onder de condities zoals gekozen geen problemen op voor wat betreft de zuurstof in de fennentor. Tevens blijkt dat er geen flooding op zal treden. Voor de koeling in de fennentor moet gezorgd worden dat de snelheid van het koelwater in de spiraal groter is dan 0.1

mis

om de wannteweerstand geheel aan de kant van de

fermentorvloeistofte hebben. Bij een snelheid van 1

mis

is dan de lengte van de koelspiraal 4.1 m.

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. pagina 5.8 Het toerental van de roerder kan berekend worden uit:

P • N . P . N3_{• D S}

• P

=

roerderkental, 5 bij Re> 1 05 •

Onder de berekende omstandigheden is Re = 1.3.106

• Hieruit volgt

N

=

4.7 lis.

Een analyse van de karakteristieke tijden leert dat:

1:zuurstofconsumptie ~

=

toverdracht 15 s, 53 s, 9 s,

(zuurstof concentratie in medium/DUR) (mengtijdrelatie voor STR, R. V.d. Lans) (1I(k₁A)).

Deze tijden liggen allemaal in dezelfde orde van grootte. Dat geeft aan dat er geen of nauwelijks gradienten in de zuurstof concentratie in de fermentor verwacht worden.

(5.17)

Tenslotte moet nog vermeld worden dat voor het verkrijgen van de juiste temperatuur in de fermentor er een goede regelaar aangebracht moet worden. Er moet rekening mee gehouden worden, dat vooral aan het begin van de fermentatie de mogelijkheid bestaat dat de vloeistof in de fermentor nog niet op de juiste temperatuur gebracht is en er juist verwarmd dient te worden. Verder zal er in het begin van de fermentatie veel minder zuurstof verbruikt worden waardoor of de hold-up of het roervermogen in de fermentor lager kan zijn dan verderop in de fermentatie. Dit kan met behulp van een goede regeling energie besparen.

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. pagina 5.9

S.3. Microfiltratie en diafiltratie (FI03).

Nadat de fermentatie is beëindigd door toevoegen van octanol, wordt de verkregen suspensie door middel van microfiltratie geconcentreerd tot een suspensie met celconcentratie 200 kg

droge stoflm3

• Vervolgens wordt de geconcentreerde oplossing gewassen met een fosfaat

gebufferde saline oplossing om de opgeloste zouten voor het grootste gedeelte te verwijderen. Er wordt gebruik gemaakt van cross-flow microfiltratie. T.o.v dead-end filtration biedt dit het

voordeel dat de flux door het membraan na verloop van tijd geen funktie meer is van de tijd.

De dikte van het filter-cake heeft een maximum, waardoor de weerstand over deze laag niet verder toeneemt, terwijl in dead-end filtratie de dikte blijft toenemen.

Voor het beschrijven van de flux door het membraan wordt gebruik gemaakt van de

concentratie polarisatie theorie [Hanish, 1986 en Flaschel et al., 1983]. Deeltjes worden naar het membraan getransporteerd door het convectief transport van het oplosmiddel en worden gedeeltelijk ofgeheel tegengehouden aan het oppervlak. Daarbij wordt een concentratie-gradient opgebouwd. Onder stationaire omstandigheden is het convectief transport naar het membraan gelijk aan de diffusie van het membraan af. Voor de flux J geldt:

c

-

c

J = kl ri-!---l'-)

c

_b

-

c

_P

volumetrische flux

stofoverdrachts coëfficient

gel concentratie aan membraan oppervlak

permeaat concentratie (aanname: Cp

=

0)

gemiddelde bulk concentratie retentaat

[m3/m2/s] [mis] [kg/m3 ] [kg/m3 ] [kg/m3] (5.18)

De stofoverdrachts coëfficient, k, is gebaseerd op de shear-enhanced diffusie waarde, die gegeven is volgens D a Y a 2 D = 0.025·(-)·y 2 diffusie coëfficient straal van de cel wand shear snelheid Voor turbulente stroming geldt:

f u x Re y =fu'-2x

Fanning Friction Factor gemiddelde snelheid

karakteristieke dimensie

=

dfiber

[m2/s] [m] [lis] [-] [mis] [m] (5.19) (5.20)

3.5

---

200C

-+-3

300C ---7fE-400C

2.5

,..., en

co

a..

E

...

₂

-·m

_...

en 0 0 en .S:

₁

_.

₅

O.5-+0---r10---.2r--O---3'"O---4""TO---,50---6'O---i70

concentratie biomassa droog [kg/m3]

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. pagina 5.10 De stofoverdrachts coëfficient wordt berekend met de vergelijking

k=O.023(Re)o.8(Sc)o33(D)

Re Sc

x

Reynolds getal = p*u*dfibe/1)

Schmidt getal = 1)/plD

[-]

[-]

(5.21)

Deze relatie geldt voor circulaire of rectangular geometrie in het turbulente flow regime. De axiale drukval over het membraan kan berekend worden met

I1P = 2fL·tl.E..

x

L lengte membraan kanaal [m]

Om de filtratie zo effectief mogelijk uit te voeren, moet de stroming turbulent zijn. Voorwaarde hiervoor is Re>2500.

p'u'd

Re = fiber > 2500

1)

(5.22)

(5.23)

De viscositeit is een funktie van temperatuur en ce1concentratie. In figuur 5.3.l. is de

viscositeitsafhankelijkheid van temperatuur en ce1concentratie gegeven [Advanced Course on Downstream Processing, 1994, deel I, 2.17]. Bij hoge ce1concentraties neemt de viscositeit toe, waardoor Re kleiner wordt. Er moet echter wel aan de voorwaarde Re>2500 worden

voldaan.

De fermentatie wordt uitgevoerd bij een temperatuur van 37 °C. Aangenomen wordt dat de micro filtratie en dialyse plaatsvindt bij ongeveer 30 °C. Een eerste orde fit voor de viscositeit geeft:

1)3O"C = 0.7795 + 0.028006·C_b

Voor de verdere berekeningen wordt genomen

d = 2

*

10.3 _[m] fiber p 1050 [kg/m3 ] a 0.5*10-6 [m] u 5 [mis] L = 0.5 [m]

f= Fanning Friction Factor

=

0.04*(Re)"O.16 [Perry]

3.9 13.3

10~---+~---~ 8~---~~--- . - - -- -- - - -- - - 7 ' -7~

---6

. " " ' /

-5 ""'--=,...---,,---_.~---_._--

--4-l

- -

._---~ ---_._----3~---~---~q---~~ 2~---~~---~~---~ 1~--- ==--O+---~~--~----~--~----~--~----~----~--~--~

o

0.2

0.4

0.6

0.8

1

dimensieloze tijd [sj

---J (1 e-4*m3jm2js) -+-Cg (0.1 *kgjm3) delta P (bar) -B-k (1 e-5*mjs) ~ Re (1 e-3)

Figuur 5.3.2: celconcentratie, stofoverdrachtscoefficient, drukval, Reynolds en flux tijdens microftItratie als funktie van dimensieloze tijd (t/teind)

•

•

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. pagina 5.11

=

500 Er geldt nu dV - ~ -A·J dt (5.25) met A=4.2m2

De suspensie moet geconcentreerd worden tot 100 kglm3

• In figuur 5.3.2 is de

celconcentratie (eb), de stofoverdrachts coëfficient (k), de drukval (~P), Reynolds (Re) en de flux (1) uitgezet tegen de tijd.

De gewenste ce1concentratie (100 kglm3

) wordt bereikt na 8726 s. = 2.4 uur Er geldt dan:

J = 2.53*10-5 [m3_/m2 /s] Vconc = 0.519 [m 3 ] ~p = 1.47 [bar] Re = 2919 [-] k = 1.58* 10-5 _[mis]

De fraktie verwijderde zouten tijdens de dialyse bedraagt

VtJIiVIlIr_~

l-exp( - ) = l-exp(-N)

V ...

w_ " " '

-Indien N=3 wordt 95% van de zouten verwijderd. De tijd benodigd hiervoor is

NV 't dkIIyse • ~ = 4.1 uur J·A De totale procestijd is 't __ = 't _ + 't dkIIyse = 6.5 uur (5.26) (5.27) (5.28)

De procestijd kan eventueel verkleind worden door een groter membraan oppervlak te nemen. De procestijd verandert dan rechtevenredig met het oppervlak. Voor de microfiltratie en diafiltratie kan echter 6 uur worden genomen, zodat berekend wordt:

A= 4.2 m2

Voor de berekening van het axiale volume-debiet zijn de volgende gegevens nodig:

AjIbIr K rc'djlblr'L • 3.l4·10

-3 _m

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. pagina 5.12

A

aantal fibers = nJU- K - = 670

AJU-(5.30) (5.31) (5.32) Er wordt berekend:

4>v

=

Voor de wannteproduktie geldt:

4> ..

= 4>v·~p = 1.55 kW (5.33)

Indien alle wannte wordt gebruikt voor het opwannen van de concentraat stroom kan de

temperatuur-stijging berekend worden: ~p·(bv·'t

~T=

-P·C·V p CtIttC

(5.34)

De maximale temperatuur-stijging (betrokken op V conc

=

0.519 m3) is dan 15

oe

en is dus niet

te verwaarlozen. Er moet gekoeld worden. De koeling vindt plaats in de fermentor.

Indien het pomprendement 0.8 is wordt de temperatuurstijging 19

oe.

Bij het diafiltreren

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. pagina 5.13

5.4. De homogenizer (M201).

Voor de disruptie van de E-Coli cellen zal gebruik worden gemaakt van een APV

-Gaulin-homogenizer

Om de mate van disruptie in zo'n apparaat te bepalen, wordt gebruik gemaakt van Sauer (1989), waarin de disruptie afhankelijk wordt gesteld van druk, aantal passes en de concentratie: Hierin is R k !J.P ex N

P

1 log(--) • k-N~·!J.P· (l-R)

= fractie gedisrupteerde cellen (-) = disruptiesnelheidsconstante (MPa-a) = drukval over homogenizer (MPa) = drukexponent ( -)

= aantal discrete passes (-) = passexponent (-)

(5.35)

Voor de disruptiesnelheidsconstante, k geldt voor een recombinante E-Coli cel, die bij

maximale groeisnelheid is geproduceerd, een waarde van 1.8E-3 MPa-t

,407. De bijbehorende

drukexponent is dus 1.407. Voor

p

geldt de onderstaande relatie voor een soortgelijk

orgarusme.

p

= 0.57

+

0.002

*

X

hierin is X = droog gewicht cellen (kg/m3

)

Deze ingangsconcentratie wordt bepaald op 100 gil daar dan zowel homogenizer als de hierop volgende centrifuge nog efficiënt werken, i.V.m. respectievelijk viscositeits- en

hinderingseffecten.

Voor de temperatuurstijging per pass geldt:

Er geldt: !J.P N R !J.T ~ !J. T = !J.p (p'e) =45 MPa =3 =0.87 = 10.7 K = 600 lIuur Dus de benodigde procestijd bedraagt:

't = 2.7 uur (drie passes van 540 1)