1. Spektrometria mas (MS)

1. Spektrometria mas (MS)

Spektrometria mas jest techniką analityczną, która w chemii organicznej i w naukach z niej się wywodzących służy zarówno do badania lub potwierdzenia struktury związków organicznych jak i oznaczania jakościowego oraz ilościowego określonych związków występujących w mieszaninie. Umożliwia wykrycie substancji znajdujących się w złożonych mieszaninach chemicznych nawet w minimalnych ilościach rzędu fentogramów.

Wykorzystywana jest przez chemików, fizyków, kryminologów, astronomów, biologów, biochemików w medycynie jak również w ochronie środowiska oraz wielu innych dziedzinach nauki.

Metodę tę wykorzystuje się między innymi do:

 identyfikacji i oznaczania ilości poszczególnych składników w mieszaninach organicznych,

 badaniach kinetyki i termodynamiki reakcji chemicznych,

 ustalania składu izotopowego analizowanych substancji, co m.in. umożliwia określenie ich źródła pochodzenia

 przeprowadzania ultraczułych wielopierwiastkowych analiz nieorganicznych,

 identyfikacji struktury cząstek,

 badań sekwencji białek i polisacharydów,

 identyfikacji substancji w kosmosie,

 monitoringu zanieczyszczeń środowiska,

 wykrywania fałszerstw i skażeń żywności,

 badaniach antydopingowych,

 monitorowania procesów przemysłowych.

Historia spektrometrii mas zaczęła się od badań Sir Josepha Johna Thomsona z Uniwersytetu w Cambridge dotyczących przewodzenia prądu przez gazy. Badania te doprowadziły do odkrycia elektronu w 1897 roku. Za te badania Thomson otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki w 1906 roku.

Na początku XX wieku Thomson zaobserwował, że promieniowanie katodowe (wiązka elektronów) może zostać odchylone przez pole elektrostatyczne. Urządzenie, w którym zaobserwowano to zjawisko, jest prekursorem spektrometru mas. Thomson nie poprzestał na obserwacji odchylenia wiązki elektronów i zaczął badać odchylenia wiązek różnych jonów.

Badania te doprowadziły do powstania w latach 1899-1911 pierwszego spektrometru mas, nazwanego przez Thomsona parabola spectrograph. W urządzeniu tym jony były poddawane działaniu pola elektromagnetycznego, co powodowało odchylenie toru ich lotu. Jony o różnym stosunku masy do ładunku (m/z) charakteryzowały się różnym stopniem odchylenia. Detektorem spektrometru Thomsona była płyta fotograficzna lub ekran fluorescencyjny. Jony o różnym m/z uderzały w różnych miejscach ekranu detektora.

Po I wojnie światowej współpracownik Thomsona, Francis William Aston zbudował spektrometr mas o znacznie większej rozdzielczości. Spektrometr ten pozwolił na obserwację izotopów. Za zbudowanie spektrometru mas i odkrycie wielu nie promieniotwórczych izotopów Astonowi przyznano Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 1922 roku. W tym samym czasie Arthur Jeffrey Dempster, podobnie jak Aston udoskonalił analizator magnetyczny. Dempster opracował także stosowaną do dziś metodę jonizacji substancji za pomocą strumienia elektronów (źródło jonów EI).

Thomson, Aston i Dempster stworzyli teoretyczne podstawy do rozwoju spektrometrii mas.

Ponad sto lat od pierwszych doświadczeń Thomsona spektrometry mas są niezastąpionym narzędziem w pracy fizyków, chemików, biologów i lekarzy prowadzących badania naukowe na ziemi i w przestrzeni kosmicznej. Coraz częściej spektrometry mas są stosowane w przemyśle, wojsku, policji i innych instytucjach.

Biologia molekularna jest jedną z dziedzin intensywnie korzystających ze spektrometrii mas. Analiza wielkocząsteczkowych biopolimerów nie byłaby możliwa bez wykorzystania łagodnych metod jonizacji - elektrorozpylania (ESI) i desorpcji laserowej z udziałem matrycy (MALDI). W roku 2002 Szwedzka Akademia Nauk przyznała Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii Johnowi Fennowi i Koichi Tanace za zastosowanie metod łagodnej jonizacji w badaniach wielkocząsteczkowych biopolimerów.

Zasada działania spektrometru masowego

Podstawą działania każdego spektrometru, bez względu na konstrukcję, jest jonizacja cząsteczek badanej substancji, co umożliwia przyspieszenie jej w polu elektrycznym w próżni. Jonizację próbki można przeprowadzić za pomocą jednej z metod wymienionych w dalszej części instrukcji. Heterogeniczny strumień jonów (dodatnich lub ujemnych) zostaje rozdzielony na szereg składowych, zależnie od stosunku masy do ładunku (m/z). Ze stosunku masy do ładunku jonu można zwykle wywnioskować, jaka była masa cząsteczkowa analizowanego związku chemicznego lub jego fragmentu. Metody jonizacji w niektórych

spektrometrach mas są tak dobrane, aby ładunek (z) był dla większości jonów równy 1, a zatem przy interpretacji widma można przyjąć, że m/z odpowiada po prostu masie cząsteczkowej jonu. Warto zauważyć, że masa cząsteczkowa jednokrotnie naładowanego jonu jest w przybliżeniu równa masie cząsteczkowej niezjonizowanej substancji tylko wtedy, gdy jonizacja jest dokonywana przez dołączenie elektronu (ze względu na bardzo małą masę elektronu). Jeśli do cząsteczki dołączany jest proton, to masa jonu jest większa od masy substancji niezjonizowanej o masę protonu (1,00727646688 Da).

Dokładną masę badanego, wyjściowego związku chemicznego, na podstawie miejsca występowania sygnału powstałego z jego niepofragmentowanego jonu w widmie można obliczyć według wzoru:

gdzie:

m_zw - masa wyjściowej cząsteczki, która ulegała jonizacji bez fragmentowania

m/z - wartość odczytana z dobrze skalibrowanego widma dla niepofragmentowanego jonu, odpowiadająca stosunkowi masy analizowanej cząsteczki w Daltonach do liczby ładunków elementarnych (z) które niósł z sobą jon, który wygenerował analizowany sygnał;

mcz - suma mas cząstek lub jonów, które nadały ładunek poprzez przyłączenie się do wyjściowej cząsteczki w daltonach, (protonu - 1,00727646688 Da; elektronu około 0,00054862 Da). Jeśli jonizacja następuje na skutek oderwania cząstki to należy podstawić jej masę ze znakiem minus.

1.1. Rodzaje jonów w spektrometrii mas

Jon molekularny to kation rodnikowy M^+.powstały podczas jonizacji próbki w wyniku utraty elektronu przez cząsteczkę badanego związku. Wartość m/z tego jonu odpowiada masie cząsteczkowej tych molekuł, które zbudowane są z najlżejszych izotopów pierwiastków wchodzących w skład związku.

Jony izotopowe. Pikom odpowiadającym jonom złożonym z izotopów o najmniejszych masach atomowych towarzyszą piki o wartości m/z większej o jedną, dwie, a czasem kilka jednostek o intensywności na ogół znacznie mniejszej, odpowiadające jonom zawierającym izotopy o większych masach atomowych.

Jon fragmentacyjny – jon powstały w wyniku spontanicznej fragmentacji substancji (np.

podczas jonizacji metodą EI) lub uzyskany techniką tandemowej spektrometrii masowej.

Dostarcza informacji o strukturze substancji analizowanej.

Jon podstawowy to najintensywniejszy jon w widmie.

1.2. Teoria procesu fragmentacji

Kierunki fragmentacji często daje się przewidzieć na podstawie dwu uzupełniających się teorii fragmentacji: teorii trwałości produktów fragmentacji oraz teorii lokalizacji ładunku.

Teoria trwałości produktów fragmentacji opiera się na założeniu, że energia stanu przejściowego w procesie fragmentacji jest niewiele większa od energii produktów fragmentacji (Rys. 1).

Rys. 1. Zmiany energii podczas fragmentacji.

Z założenia wynika, że im mniejsza jest sumaryczna energia wewnętrzna produktów fragmentacji, tym mniejsza jest energia aktywacji procesu fragmentacji. Uprzywilejowana powinna więc być fragmentacja prowadząca do produktów o większej trwałości (mniejszej energii wewnętrznej). Przy ocenie trwałości produktów fragmentacji należy brać pod uwagę sumaryczną energię wszystkich produktów fragmentacji. W szczególności należy brać pod uwagę następujące czynniki:

 Stabilizację kationów karbeniowych, co powoduje wzrost ich trwałości wraz ze wzrostem rzędowości;

 Stabilizację rezonansową kationów typu allilowego i benzylowego;

 Stabilizację rezonansową kationów z ładunkiem dodatnim przy węglu α względem heteroatomu.

Teoria lokalizacji ładunku zakłada, że ładunek dodatni jonu jest zlokalizowany w pewnych szczególnych jego miejscach. Tymi miejscami są orbitale heteroatomów obsadzone

w neutralnych cząsteczkach przez niewiążące pary elektronowe, a także wiązania π nie wchodzące w skład układów sprzężonych. Miejsce lokalizacji ładunku działa jako inicjator fragmentacji, która może się odbywać w sposób homolityczny, polegający na niezależnym przemieszczaniu się niesparowanych elektronów lub w sposób heterolityczny, polegający na przemieszczaniu się par elektronowych.

1.3. Fragmentacja głównych klas związków 1.3.1.Alkany

Jon molekularny w widmach alkanów prosto-łańcuchowych jest z reguły widoczny.

Jego intensywność maleje wraz ze wzrostem długości i stopnia rozgałęzienia łańcucha.

W widmach alkanów prosto-łańcuchowych obserwuje się grupy jonów przy wartościach m/z różniących się o 14 daltonów. Najmocniejszy jon w każdej grupie odpowiada jonom o wzorze CnH2n+1 występującym przy m/z=29, 43, 57, 71, 85, 99, 113 itd., a powstałym w wyniku rozpadu wiązań C-C w różnych miejscach łańcucha węglowego.

Rys. 2. Rozpad wiązań C-C w różnych miejscach łańcucha węglowego.

Przykładem może być widmo mas dekanu (Rys. 3).

Rys. 3. Widmo mas dekanu.

Rozgałęzienie węglowodoru zmienia wygląd widma w sposób radykalny. Zwiększa się intensywność jonów odpowiadających stabilniejszym kationom o wyższej rzędowości, powstającym w wyniku rozszczepienia łańcucha węglowego przy jego rozgałęzieniu. W widmie 3-etyloheksanu jonom tym odpowiadają piki przy m/z=58 i 71 (Rys. 4).

(mainlib) Decane

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

0 50 100

14

27 29

30 39

41 43

44 53

56 57

67 69

71

77 83

85

99 113 142

Rys. 4. Widmo mas 3-etyloheksanu.

1.3.2. Alkeny

Jon molekularny w widmach alkenów prosto-łańcuchowych jest zazwyczaj widoczny.

Ładunek dodatni w jonie molekularnym jest zlokalizowany w znacznym stopniu w obrębie wiązania podwójnego, co stabilizuje jon, a równocześnie inicjuje rozpad wiązania α, β względem wiązania podwójnego. Prowadzi to do powstania stabilizowanego rezonansowo kationu allilowego lub jego pochodnych. Kation allilowy w widmie 1-decenu daje pasmo główne przy m/z=41 (Rys. 5).

Rys. 5. Widmo mas 1-decenu.

1.3.3.Węglowodory aromatyczne i alkiloaromatyczne

Jony molekularne niepodstawionych związków aromatycznych są wyjątkowo stabilne i ulegają fragmentacji w niewielkim tylko stopniu, dlatego odpowiednie jony molekularne są z reguły jonami podstawowymi, tak jak w widmie naftalenu (Rys. 6).

(mainlib) Hexane, 3-ethyl-

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

0 50 100

1 12 15

27 28

29

30 37

39 41

42 43

44 50 53

57

58 63 66 69 71

72 77 79 81 83 84

85

86 91 93 98 114

(mainlib) 1-Decene

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

0 50 100

15

27 29

30 37

39 41

44

56

57

65 69

70

77 83

84

91 96 97

111

125

140

Rys. 6. Widmo mas naftalenu.

Charakterystycznym typem fragmentacji węglowodorów aromatycznych jest odszczepienie cząsteczki acetylenu od jonu molekularnego.

Dominującym typem fragmentacji węglowodorów alkiloaromatycznych jest rozpad wiązania między atomami α i β względem pierścienia aromatycznego. Rozpad ten prowadzi do powstania silnie stabilizowanego rezonansowo, aromatycznego kationu tropyliowego (Rys.

7), któremu odpowiada zazwyczaj mocny jon o m/z = 91, tak jak np.

Rys. 7. Kation tropyliowy.

Kation tropyliowy może odszczepić cząsteczkę acetylenu, przekształcając się w kation cyklopentadienylowy [C5H5]⁺ o m/z=65.

1.4 Aparatura

Każdy spektrometr mas składa się z następujących elementów:

 układ wprowadzenia próbki,

 źródło jonów,

 analizator,

 detektor,

 rejestrator (najczęściej komputer).

(mainlib) Naphthalene

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

0 50 100

26 37 39

51 52

64

65 75 78 85 87 89 97

102

113

128

Rys. 8 Schemat ideowy zasady działania spektrometru mas.

1.4.1. Układ wprowadzania próbki

W spektrometrii mas, analizuje się jony w stanie gazowym.

 wlot zimny: nie ma problemu z próbkami w fazie gazowej (gazy, substancje lotne – zasysane (przeciek) w wyniku różnicy ciśnień). Stosuje się wprowadzenia składające się z komory, do której wprowadza się próbki, oraz zawór dozującego próbkę do aparatu,

 wlot gorący – próbki w postaci cieczy i roztworów wymagają wstępnego ogrzewania injektora. Maks. temperatura portu ~ 480°C. Ciśnienie ~ 10^-5 Torr,

 sondy wprowadzające – substancje stałe,

 Układy GC-MS,

 Układy LC-MS,

 Układy HPLC-MS.

1.4.2. Źródła jonów

Źródła jonów służą do przeprowadzania substancji analizowanych w spektrometrze w jony znajdujące się w fazie gazowej pod bardzo niskim ciśnieniem. W analizie ilościowej stosowane są następujące rodzaje jonizacji: jonizacja elektronami i jonizacja chemiczna.

Electron impact (EI)

Historycznie pierwsze i dotychczas najbardziej rozpowszechnione źródło jonów. Jego integralnym elementem jest katoda (filament). Po przyłożeniu napięcia emituje elektrony o ściśle określonej energii, które zderzając się z cząsteczkami próbki wybijają elektron lub elektrony z ich orbit walencyjnych.

Najczęściej stosowany zakres analizy: 10-1000 Da. Cząsteczki o wyższych masach ulegają łatwo dekompozycji przy stosowaniu jonizacji typu EI. W takich przypadkach należy rozważyć użycie innej techniki jonizacji.

Najczęściej analizowane próbki: niskocząsteczkowe, nieorganiczne, organiczne w postaci stałej.

Zastosowania: potwierdzanie masy cząsteczkowej substancji po syntezie, ochrona środowiska (analiza niskocząsteczkowych zanieczyszczeń), nadzór prawidłowości procesów technologicznych, kontrola antydopingowa.

Postać wyników: piki obserwowane na widmie masowym posiadają zazwyczaj ładunek +1.

W przypadku niskorozdzielczej analizy typu EI masa cząsteczkowa próbki jest zazwyczaj równa m/z.

Jonizacja chemiczna (CI)

Metoda jonizacji “łagodniejsza” w porównaniu do EI, tzn. daje możliwość uzyskania jonu molekularnego o większej intensywności w porównaniu do jonów fragmentacyjnych niż w metodzie EI. Jonizacja substancji następuje na skutek zderzeń z tzw. jonami pierwotnymi występującymi w źródle jonów (najczęściej są to jony gazów obojętnych, metanu, izobutanu, amoniaku). Aby zderzenia pomiędzy analitem i jonami pierwotnymi zachodziły wystarczająco często, w źródle jonów typu CI należy wytworzyć ciśnienie około 60 Pa.

Najczęściej stosowany zakres analizy: 10 - 3000 Da.

Najczęściej analizowane próbki: niskocząsteczkowe nieorganiczne i organiczne w postaci stałej.

Zastosowania: detekcja w chromatografii gazowej, farmakologia, kontrola antydopingowa, ochrona środowiska (np. analiza TCDD, PCB).

Postać wyników: jonizacja następuje zazwyczaj poprzez przyłączenie protonu (-ów) do analizowanych cząsteczek co należy uwzględnić podczas obliczania rzeczywistej masy analitu (dla z=+1 m/z = M-1).

Electrospray (ESI)

Electrospray to jedna z nowszych metod jonizacji próbki w spektrometrii masowej.

Próbka ulega jonizacji pod ciśnieniem atmosferycznym przy użyciu napięcia rzędu 2000- 5000V.

Podstawowe zalety metody to:

 minimalna fragmentacja próbki podczas jonizacji,

 wysoka czułość oznaczeń,

 kompatybilność z technikami chromatograficznymi (HPLC) oraz elektroforetycznymi (CE),

 możliwość analizy dużych cząsteczek (do ok. 80 000 Da).

Rys. 9. Jonizacja ESI.

Cechą charakterystyczną widm masowych ESI są serie pików odpowiadających kolejnym, wielokrotnie naładowanym, protonowanym jonom [M+zH]^z+, [M+(z+1)H]^(z+1)+, itd. Powyższe zjawisko umożliwia analizowanie mas znacznie większych niż nominalny zakres pomiarowy analizatora przy zachowaniu stosunkowo wysokiej rozdzielczości, np.

związek o masie 5000 Da po przyłączeniu 5 protonów będzie obserwowany przy m/z=1001 ([5000 + 5]/5=1001). W celu transformacji widma jonów wielokrotnie zjonizowanych do masy rzeczywistej (dekonwolucja) stosuje się oddzielny program komputerowy.

Najczęściej stosowany zakres analizy: 50 – 80 000 Da.

Najczęściej analizowane próbki: średnio- i wysokocząsteczkowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinowe w postaci ciekłej.

Zastosowania: biochemia, biotechnologia, farmakologia, neurochemia, medycyna sądowa, detekcja w chromatografii cieczowej.

Postać wyników: serie pików o różnej ilości przyłączonych/oderwanych protonów. M = (m- nz)/nz dla z+.

MALDI (desorpcja/jonizacja laserowa w matrycy)

W metodzie MALDI analizowaną substancję jonizuje się po jej uprzednim zmieszaniu z roztworem matrycy (małe cząsteczki organiczne silnie absorbujące promieniowanie przy stosowanej długości fali lasera). Po odparowaniu rozpuszczalnika próbkę naświetla się impulsami lasera, co powoduje wzbudzenie elektronów w matrycy. Jony, utworzone przez przeniesienie protonu między wzbudzoną matrycą a analizowaną substancją, ulegają

następnie desorpcji. Jedną z zalet metody jest możliwość analizowania substancji o masach nawet do 1 000 000 Da.

Rys. 10. Jonizacja MALDI.

Zakres analizy: 500-1 000 000 Da

Najczęściej analizowane próbki: średnio- i wysokocząsteczowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinowe

Zastosowania: biochemia, biotechnologia, farmakologia, neurochemia, immunologia Postać wyników: zazwyczaj jonizacja +1, rzadziej +2, możliwość obserwacji

niekowalencyjnych kompleksów

Termorozpylanie (Termospray, TE)

Jonizacja przez podgrzanie przy pomocy prądu elektrycznego roztworu zawierającego sól i analizowaną substancję wewnątrz stalowej kapilary. Gorąca substancja jest rozpylana w komorze próżniowej z prędkością naddźwiękową.

Bombardowanie szybkimi atomami (Fast-Atom Bombardment FAB)

Jonizacja polegającą na bombardowaniu cząsteczki obojętnymi atomami o wysokiej energii (zwykle 17 lub 70 eV). Cząsteczki mogą znajdować się w fazie gazowej lub być rozpuszczone w ciekłej, mało lotnej substancji (matrycy) np. glicerolu.

Bombardowanie jonami (spektrometria mas jonów wtórnych – Secondary Ion Mass Spectrometry – SIMS)

Metoda ta początkowo była stosowana do substancji przewodzących prąd lub substancji naniesionych na metalowe płytki. Obecnie metodę SIMS stosuje się z powodzeniem do substancji nie przewodzących prądu. Istnieje odmiana techniki SIMS, w której badana substancja jest rozpuszczona w ciekłej matrycy (najczęściej glicerolu).

Technika ta jest nazywana czasami LSIMS (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry) lub FIB (Fast Ion Bombardment).

Desorpcja laserowa (Laser Desorption – LD)

W metodzie tej jonizacja następuje przez naświetlanie próbki silnym laserem, a zatem bombardującymi cząstkami są wysokoenergetyczne fotony.

Plazma wzbudzona indukcyjnie (ICP)

Jonizowana substancja jest wprowadzana do plazmy płomienia palnika znajdującego się w kwarcowej rurze. Rura otoczona jest cewką, przez którą przepływa prąd zmienny o wysokiej częstotliwości. Plazma ogrzewa się do temperatury rzędu 10 000 K w wyniku wzbudzenia polem magnetycznym wytworzonym przez prąd płynący w cewce. Metoda nadaje się doskonale do analizy pierwiastków metalicznych.

1.4.3. Analizator

W spektrometrach mas stosowane są różne typy analizatorów masy, tj.:

Analizator czasu przelotu (Time Of Flight TOF)

Jony wprowadzane do analizatora są przyspieszane przy pomocy impulsu elektrycznego i zaczynają dryfować przez komorę analizatora. Na końcu analizatora znajduje się detektor jonów połączony z urządzeniem rejestrującym czas od impulsu przyspieszającego do momentu uderzenia określonego jonu w detektor. Pomiar m/z jest oparty na fakcie, że ze wzrostem masy cząsteczkowej jonów, wydłuża się ich czas przelotu. Obecnie stosuje się często analizatory czasu przelotu ze zwierciadłem elektrostatycznym, które zwiększa rozdzielczość aparatu, ale zmniejsza zakres dopuszczalnych mas cząsteczkowych.

Analizatory TOF charakteryzują się stosunkowo dużymi rozdzielczościami rzędu kilkudziesięciu tysięcy (do 100 000) oraz dosyć dużą czułością. Są najczęściej stosowane razem ze źródłami jonów MALDI.

Sektor magnetyczny (Magnetic sector)

Analizator ten wykorzystuje zjawisko zmiany toru lotu jonów w polu magnetycznym.

Tor lotu jonów jest zakrzywiany, stopień zakrzywienia lotu zależy od stosunku masy do ładunku (m/z) i prędkości jonu a także od parametrów pola magnetycznego. Sektor magnetyczny charakteryzuje się stosunkowo małą rozdzielczością – mniej niż 5000.

Związane jest to głównie z dużymi różnicami prędkości cząsteczek wpadających do urządzenia. Problem ten rozwiązuje przez zastosowanie sektora elektrycznego przed sektorem magnetycznym, w którym cząsteczki są rozpędzane, dzięki czemu różnice prędkości są mniejsze.

Sektor elektryczny

Urządzenie to wykorzystuje zjawisko zmiany toru lotu jonów w polu elektrostatycznym, jest zbudowane z dwóch równoległych, zakrzywionych płyt do których przyłożono potencjał elektryczny. Jony o jednakowej energii translacyjnej mają jednakowe tory lotu w sektorze elektrycznym. Za sektorem elektrycznym znajduje się szczelina przez którą przelatują tylko jony o określonej energii. Sektor elektryczny jest stosowany przed sektorami magnetycznymi w spektrometrach mas o podwójnym ogniskowaniu.

Kwadrupol (Quadrupole)

Analizator ten jest zbudowany z czterech symetrycznie ułożonych równoległych prętów. Działa jako filtr masy – w jednym momencie przepuszcza tylko jony o określonym stosunku masy do ładunku (m/z). Dzieje się to dzięki przykładaniu do prętów prądu zmiennego o określonej częstotliwości i napięciu oraz napięcia stałego. Kwadrupol można ustawić tak, aby przepuszczał jony o szerokim lub wąskim zakresie m/z. Jony przechodzące przez kwadrupol mogą być poddawane dalszej analizie.

Rys. 11. Analizator kwadrupolowy.

Pułapka jonowa (Ion trap – IT)

Jest analizatorem pozwalającym na przetrzymywanie jonów. Analizator ten działa na zasadzie podobnej do kwadrupola. Manipulując parametrami prądu przyłączonego do elektrod można uwięzić w pułapce jony o określonym stosunku masy do ładunku (m/z) lub można uwięzić jony o szerokim zakresie m/z. Pomiaru masy dokonuje się przez uwięzienie w

pułapce jonów o szerokim zakresie m/z i wyrzucanie z pułapki kolejnych grup jonów o określonym m/z. Wnętrze pułapki jonowej wypełnione jest gazem obojętnym – helem pod ciśnieniem rzędu 10^-1 Pa. Jeżeli jony w pułapce zostaną wzbudzone (przyspieszone), zderzenia z atomami helu spowodują fragmentację jonów. Pułapki jonowe charakteryzują się zwykle dość niewielką rozdzielczością (kilku tysięcy) oraz bardzo dużą czułością.

Liniowa pułapka jonowa (Linear Ion Trap, Linear Trap Quadrupole – LTQ)

Pułapka jonowa jest zbudowana, jak kwadrupol, z czterech równoległych prętów. Na obu końcach analizatora przykładany jest potencjał elektryczny, który uniemożliwia ucieczkę jonów z analizatora. Pomiar masy odbywa się przez wyrzucanie jonów o określonym m/z z analizatora i detekcję. W liniowych pułapkach jonowych stosuje się często dwa detektory, co zwiększa czułość. Liniowe pułapki jonowe charakteryzują się bardzo dużą czułością (większą niż zwykłe pułapki jonowe) i stosunkowo niską rozdzielczością (kilka tysięcy). W liniowej pułapce jonowej, jony można przechowywać, poddawać fragmentacji i mierzyć masy fragmentów.

Analizator cyklotronowego rezonansu jonów (Ion Cyclotron Resonance ICR)

Analizator cyklotronowy wykorzystuje zjawisko zakrzywienia toru lotu jonów w polu magnetycznym. Jony są pułapkowane w cyklotronie, gdzie wpadają w ruch kołowy. Widmo m/z jest tworzone przez działanie na jony polem elektromagnetycznym o zmieniającej się częstotliwości i rejestrację zmian natężenia prądu w płytach detektorowych lub zmiany absorpcji fali elektromagnetycznej. W analizatorze panuje bardzo wysoka próżnia – ciśnienie nie większe niż 10^-4 Pa, zwykle 10^-6 Pa lub mniejsze. Rozdzielczości analizatorów cyklotronowych mogą być bardzo duże, zwykle kilkaset tysięcy, mogą dochodzić nawet do miliona (przy m/z 500 Th). Rozdzielczości tych analizatorów szybko zmniejszają się wraz ze wzrostem m/z analizowanej cząsteczki.

Analizator cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją wyników (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance FT-ICR)

Analizator ten działa podobnie jak analizator cyklotronowego rezonansu jonowego. W analizatorze FT-ICR zastosowano bardziej wydajną metodę zbierania danych niż w ICR. W analizatorze FT-ICR przy pomocy złożonej fali elektromagnetycznej wzbudzane są jednocześnie wszystkie jony. Na płytach detektora rejestrowany jest sygnał zawierający wiele częstotliwości charakterystycznych dla jonów o różnym m/z. Sygnał ten jest przekształcany w

widmo m/z przy pomocy Transformacji Fouriera. Analizatory FT-ICR są znacznie szybsze niż analizatory ICR, inne parametry (rozdzielczość, czułość itp.) są podobne. Analizatory FT- ICR wyparły obecnie z rynku analizatory ICR.

Orbitrap

Zbudowany jest z dwóch elektrod zewnętrznych i jednej elektrody wewnętrznej pomiędzy którymi poruszają się jony. Tak więc analizator ten jest rodzajem pułapki jonowej.

Elektrody zewnętrzne mają kształt zwężających się na jednym z końców beczek. Elektrody te są ustawione szerszymi końcami do siebie. Wrzecionowata elektroda wewnętrzna umieszczona jest w środku urządzenia, jej oś symetrii pokrywa się z osiami symetrii elektrod zewnętrznych. Jony wprowadzone do analizatora poruszają się dookoła oraz wzdłuż jego osi.

Pomiar częstotliwości oscylacji jonów wzdłuż osi analizatora pozwala na obliczenie stosunku masy do ładunku jonu. Analizatory typu orbitrap charakteryzują się dużą rozdzielczością (do 200 000).

1.4.4. Detektor Puszka Faradaya

Ten typ detektora zbudowany jest z wydłużonej, cylindrycznej komory. Jony wnikające do jej wnętrza przez niewielki otwór dochodzą do dna i przekazują tam swój ładunek. Powstający w ten sposób prąd rozładowania jest wzmacniany i mierzony za pomocą elektrometru. Czułość puszek jest dość ograniczona, jednak ponieważ ładunek puszek nie jest zależny od masy i prędkości jonów, stosowane są one między innymi do bardzo precyzyjnego pomiaru stosunku izotopowego.

Detektor mikrokanalikowy

Detektor mikrokanalikowy zbudowany jest z płytki, w której przewiercono cylindryczne, równoległe otworki (kanaliki). Każdy z nich ma średnicę 0,4-2,5 mm. Na stronie wejściowej płytki utrzymywany jest potencjał rzędu 1 kV w stosunku do strony wyjściowej. Na powierzchnię każdego kanalika naniesiona jest cienka warstwa półprzewodnika. W wyniku uderzenia jonu w powierzchnię kanalika następuje emisja elektronów wtórnych, które są następnie powielane w kolejnych zderzeniach ze ściankami kanalików. Efekt lawinowy może zwiększyć liczbę elektronów 10⁵ -krotnie. Można także stosować układ dwu lub więcej płytek co daje wzmocnienie nawet 10⁸. Przy wyjściu z

każdego kanalika metalowa anoda zbiera strumień elektronów wtórnych i przekazuje sygnał do elektrometru.

Powielacz elektronów

Powielacze elektronów są zbudowane w formie rogu z rur wykonanych ze szkła ołowiowego, mającego dobre właściwości emisji elektronów wtórnych i jednakowy opór elektryczny. Napięcie przyłożone między dwoma końcami rury spada stopniowo wzdłuż całej jej długości. Każda cząstka, docierająca do wewnętrznej powierzchni detektora, powoduje emisję elektronów, które następnie przyspieszane są przez pole elektryczne do wnętrza rury, aby znów zderzyć się ze ścianką i spowodować emisję elektronów wtórnych. Sygnał wyjściowy podlega detekcji na płytce kolektora na końcu rury. Zasada działania powielacza elektronów podobna jest więc do zasady działania fotopowielacza. Jednak w tym przypadku nie stosuje się układu kilkunastu dynod, z których każda jest na wyższym potencjale w stosunku do poprzedniej tylko jedną elektrodę nazywaną dynodą ciągłą.

1.4.5. Rejestrator

Komputer, w który wyposażony spektrometr mas, rejestruje otrzymywane z niego dane i przekształca je najczęściej w graf wartości m/z - intensywności pików lub chromatograf całkowitego prądu jonowego. Na ekranie monitora lub w postaci wydruku otrzymuje się widma w postaci grafów lub tablic, normalizując je przez przyjęcie za 100% intensywność piku podstawowego. Komputer może zawierać bazę danych, gdzie są zamieszczone widma znanych związków. Porównanie zmierzonego widma z kompletnym widmem z bazy danych zidentyfikowanym przez komputer może zasadniczo ułatwić interpretację otrzymanych wyników.

2. Metoda GC-MS

Metoda GC-MS polega na połączeniu chromatografu gazowego ze spektrometrem mas.

Jest stosowana zarówno do identyfikacji składników mieszanin związków organicznych jak i do oznaczania ilościowego poszczególnych związków. Oznaczanie ilościowe metodą GC-MS stosuje się w tych przypadkach, gdy badana mieszanina składa się z wielu składników, zaś stężenie oznaczanego składnika jest niewielkie. W tym przypadku stosując tylko analizę chromatograficzną, często nie uzyskuje się wystarczającego rozdziału

chromatograficznego, a także nie ma pewności czy dany sygnał odpowiada oznaczanemu związkowi.

Rozdział mieszaniny związków organicznych znajdujących się w badanej próbce zachodzi na kolumnie chromatograficznej (kapilarnej lub znacznie rzadziej pakunkowej). Kolumna podłączona jest do źródła jonów spektrometru mas. Związki organiczne eluują się (czyli schodzą) kolejno z kolumny do źródła jonów, gdzie zachodzi jonizacja. Gazem nośnym w metodzie GC-MS jest hel. Jeżeli stosujemy kolumny kapilarne, w których przepływ gazu nośnego przez kolumny analityczne wynosi około 1 ml/min, możemy stosować połączenie bezpośrednie, gdyż system próżniowy spektrometru mas jest w stanie utrzymać wymaganą w aparacie próżnię około 10^-6 mmHg, pomimo dopływu helu w wyżej podanej ilości. Jeżeli stosujemy kolumny pakunkowe, gdzie przepływ gazu nośnego wynosi do kilkudziesięciu ml/min konieczne jest zastosowanie pomiędzy chromatografem gazowym a spektrometrem mas urządzenia oddzielającego większość gazu nośnego (separatora), bądź wprowadzającego jedynie część eluatu do spektrometru mas (dzielnika przepływu).

W metodzie GC-MS spektrometr mas może spełniać rolę detektora:

 nieselektywnego, czyli czułego na wszystkie składniki mieszaniny,

 selektywnego, czyli czułego jedynie na określony związek lub grupę związków.

Jako detektor nieselektywny, spektrometr mas rejestruje całkowity prąd jonowy w czasie.

Całkowity prąd jonowy jest proporcjonalny do ilości jonów, która jest z kolei proporcjonalna do zawartości eluującego się składnika analizowanej mieszaniny. Tak więc zapis całkowitego prądu jonowego w czasie jest odpowiednikiem chromatogramu uzyskanego przy zastosowaniu nieselektywnego detektora chromatografu gazowego np. detektora płomieniowo-jonizacyjnego czyli FID. Rejestrację całkowitego prądu jonowego stosuje się przy identyfikacji składników mieszaniny.

Spektrometr mas działający jako detektor selektywny rejestruje jedynie wybrane jony, charakterystyczne dla danego związku lub grupy związków i w ten sposób wykrywa się jedynie określone związki.

W metodzie GC-MS oprócz właściwości fazy ciekłej związanej z separacją składników rozdzielanej mieszaniny istotny jest jej górny limit temperaturowy. Stosując połączenie chromatografii gazowej ze spektrometrią mas maksymalna temperatura pracy kolumny chromatograficznej nie powinna przekraczać temperatury równej górnemu limitowi pracy kolumny pomniejszonemu o 50^oC. Jest to związane z pojawianiem się w temperaturze bliskiej górnemu limitowi jonów pochodzących z jonizacji cząsteczek fazy ciekłej.

Literatura

1. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa 2005 2. Z. Witkiewicz, J. Hepter, Chromatografia gazowa, WNT, Warszawa 2001

3. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 2005

4. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN W-wa, 1997.

5. W. Zieliński, A. Rajca (red.), Metody spektroskopowe i ich zastosowanie do identyfikacji związków organicznych, WNT W-wa, 1995.

6. R. M. Silverstein, G. C. Bassler, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych,

PWN W-wa, 1970.

7. R. A. W. Johnstone, Spektrometria masowa w chemii organicznej, PWN W-wa, 1975

Przebieg ćwiczenia:

1. Przygotowanie próbek badanych leków

Należy przygotować próbki badanych leków do analizy ilościowej oraz jakościowej (według wskazania prowadzącej).

W celu dokonania analizy ilościowej należy zważyć tabletki bądź proszki (w zależności od postaci badanego leku), przeliczyć zawartość substancji czynnej. Sproszkować tabletki w moździerzu. Odważyć proszek do kolbki okrągłodennej o objętości 10 cm³. Do kolbki dodać odpowiednią ilość rozpuszczalnika tj. etanolu (w zależności od zawartości substancji czynnej). Mieszać całość na mieszadle magnetycznym przez co najmniej 30 minut.

Przesączyć roztwory do fiolek, fiolki zabezpieczyć do następnego dnia.

Do analizy jakościowej próbki przygotować należy jak wyżej.

2. Przygotowanie roztworów wzorca do krzywej kalibracyjnej

Oszacowanie wielkości naważek do krzywej kalibracyjnej (na podstawie zawartości oznaczanego związku w wybranych lekach).

Odważenie naważki wzorca, co najmniej 5 (paracetamolu) w kolbkach analitycznych o objętości 10 cm³. Dopełnić czystym etanolem do kreski.

3. Wykonanie analizy GC-MS

Wykonanie analizy GC-MS, przygotowanych próbek wzorcowych (do krzywej kalibracyjnej). Sporządzenie krzywej kalibracyjnej w programie ChemStation.

Wykonanie analiz GC-MS wybranych leków (przygotowanych uprzednio próbek do analizy ilosciowej).

Oznaczenie ilości substancji czynnej w zbadanych próbkach.

Wykonanie analiz GC-MS wybranych leków (przygotowanych uprzednio próbek do analizy jakościowej).

Porównanie widm analizowanych związków z danymi literaturowymi za pomocą biblioteki widm.

Sporządzenie sprawozdania.