D O R O TA SO SN O W SK A
ZMIANY AKTYWNOŚCI ANTY OKSYDACYJNEJ (+) KATECHINY W WYNIKU UTLENIANIA ENZYMATYCZNEGO
S t r e s z c z e n i e
(+) katechina w ykazuje cenne właściwości biologiczne, je st efektywnym zmiataczem w olnych rodni
ków. W pracy badano w pływ enzym atycznego utleniania (+) katechiny na jej aktywność anty oksydacyj
ną. Proces utleniania (+) katechiny prowadzono przy udziale polifenolooksydazy (PPO) i tyrozynazy w pH 4 i 7. Aktyw ność antyoksydacyjną badanych roztworów określano dwoma metodam i polegającym i na zmiataniu rodników: DPPH i ABTS. Zm iany zaw artości (+) katechiny oraz produkty jej degradacji reje
strowano m etodą H PLC i TLC. Szybkość utleniania (+) katechiny była w yższa w obecności PPO niż tyrozynazy. O bniżenie pH środowiska reakcyjnego z 7 do 4 powodowało zm niejszenie szybkości utlenia
nia katechiny. D wugodzinne utlenianie katechiny (PPO w pH 7) pow odowało spadek zawartości tego m onom eru o 57% i pojaw ienie się dimerów i tetramerów. N atom iast efektywność zm iatania stabilnego rodnika DPPH obniżyła się o 25% a A BTS tylko o 12%, co może sugerować, że produkty enzym atyczne
go utleniania (+) katechiny w ykazują pew ną aktywność antyoksydacyjną w stosunku do tych rodników.
W stęp
B adania ostatnich lat w ykazały, że cennym składnikiem ow oców i w arzyw strączkow ych są flaw anole należące do zw iązków polifenolow ych o szkielecie C6-C 3- C6. W tkankach roślin flaw anole w ystępują zarów no w form ie m onom erów flaw an-3- oli czyli katechin, ja k i w form ie spolim eryzow anej jak o proantocyjanidyny. Z uw agi na dużą liczbę grup hydroksylow ych w cząsteczce są one zw iązkam i labilným i, łatw o utlen iają się, reag u ją m iędzy sobą i w chodzą w reakcje z innym i składnikam i środow i
ska.
K atechiny są dobrym i substratam i dla fenolooksydaz. Pierw szym produktem ich enzym atycznego utleniania są bardzo reaktyw ne chinony, które u leg ają dalszym prze
m ianom do brunatnych m elanin, co obniża jakość produktów ow ocow ych, szczególnie
M gr inż. D. Sosnowska, Instytut Biochem ii Technicznej Politechniki Łódzkiej, ul. Stefanowskiego 4/10, 90-924 Łódź.
70 Dorota Sosnowska
jabłkow ych. N a przebieg procesu enzym atycznego brunatnienia m a w pływ w iele czynników , a w śród nich: stężenie i rodzaj substrata, pH środow iska reakcyjnego, ak
tyw ność i pow inow actw o substratow e polifenolooksydaz (PPO) [4, 6].
Z drugiej zaś strony flaw anole w ykazują cenne w łaściw ości biologiczne, są b ar
dzo efektyw nym i zm iataczam i w olnych rodników , które należą do czynników uszk a
dzających kom órki i w yw ołujących m utacje i now otw ory. Skuteczność zm iatania przez (+) katechiną szczególnie groźnych dla zdrow ia anionorodników ponadtlenkow ych była 7-krotnie w yższa w porów naniu z kw asem askorbinow ym [5], a jak o czynnik opóźniający utlenienie LD L katechina okazała się 10-krotnie skuteczniejsza niż kwas askorbinow y i aż 2 0-krotnie w porów naniu z a-toko fero lem [1 0].
R easum ując m ożna stw ierdzić, że katechiny są to zw iązki nietrw ałe, ulegające łatwo enzym atycznym i nieenzym atycznym przem ianom w pływ ającym na cechy sen
soryczne i w artość biologiczną przetw orów owocowych.
N atom iast m ało je st doniesień na tem at w pływ u pow yższych przem ian na aktyw ność anty oksydacy jną flaw anoli.
C elem pracy było określenie zależności pom iędzy stopniem enzym atycznych przem ian (+) katechiny, a jej aktyw nością antyoksydacyjną.
Materiał i metody badań
E nzym atyczne utlenianie 0,6 m M (+) katechiny (Sigm a) prow adzono z udziałem polifenolooksydazy (PPO) w yizolow anej z jab łek odm iany Lobo [8] lub tyrozynazy (Sigm a) (3,3-104j.a ./d m 3) w buforze M cllv ain e’a o pH 4,0 lub 7,0.
Zm iany zaw artości (+)katechiny rejestrow ano m etodą HPLC [7]. A nalizy w yko
nano przy użyciu chrom atografu cieczow ego firm y K nauer w yposażonego w detektor U V -V IS i kolum nę LiC hrospher-100, RP-18 (5 μηι). Szybkość przepływ u fazy rucho
mej w ynosiła 1 cm3/min. D etekcję (+)katechiny prow adzono przy długości fali 280 nm. F azę ruchom ą stanow ił układ rozpuszczalników : (A) acetonitryl; (B) w oda redestylow ana zakw aszona do pH 2,6 85% kw asem orto-fosforow ym .
Do badania stopnia polim eryzacji stosow ano chrom atografią cienkow arstw ow ą na silikażelu G -60 w układzie rozw ijającym : toluen - aceton - kw as m rów kow y (3:3:1).
C hrom atogram y w yw oływ ano 4% roztw orem w aniliny w C H3O H /H C l (4:1) [3], W łaściw ości przeciw utleniające oznaczano m etodam i polegającym i na spektro- fotom etrycznym pom iarze zm ian stężenia barw nych rodników:
1) stabilnego rodnika D PPH' (1,1 diphenyl-2-picrylhydrazyl) - aktyw ność antyoksy
d acy jną podano jak o stężenie antyoksydanta potrzebne do 50% redukcji DPPH.
C zym m niejsza w artość liczbow a IC 5o tym w yższa aktyw ność antyoksydacyjna badanego zw iązku [1 2],
2) kationorodnika A B T S+ (2 ,2 ’azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) - w yniki w yrażano jak o TE AC (Trolox Equivalent A ntioxidant C apacity) określają
cy m ilim olow e stężenie troloxu odpow iadające stężeniu Im M badanych antyoksy- dantów. C zym w yższa w artość liczbow a TEAC tym w yższa aktyw ność antyoksy- dacyjna badanego zw iązku [9],
W y n ik i i d y sk u sja
K atechiny obok kw asu chlorogenow ego i kaw ow ego są polifenolam i najbardziej podatnym i na utlenianie enzym atyczne. Szybkość tego procesu zależy m .in. od rodzaju enzym u i pH środow iska. D la polifenolooksydazy optym alne pH w ynosi około 7, ale pH ow oców i przetw orów ow ocow ych je st znacznie niższe i w ynosi 3-4. W obec tego badania szybkości enzym atycznej degradacji katechiny prow adzono w pH 4 i 7. W tab.
1. przedstaw iono zm iany zaw artości (+) katechiny w czasie enzym atycznego utleniania rejestrow ane m eto dą HPLC.
T a b e l a 1
Zmiany zaw artości (+) katechiny w wyniku enzymatycznego utleniania.
Changes o f (+) catechin contents during enzymatic oxidation.
Czas reakcji Reaction time
U tlenianie katechiny w obecności PPO Enzym atic oxidation o f catechin
in the presence o f PPO
U tlenianie katechiny w obecności tyrozynazy
Enzym atic oxidation o f catechin in the presence o f tyrosinase
pH = 7 pH = 4.0 pH = 7.0
Zachowalność Zachowalność Zachowalność
[min] Retention Retention Retention
[%] [%] [%]
0 100 100 100
5 83,4 - 91,0
30 57,4 91,1 90,0
60 48,2 90,0 88,9
120 43,3 92,6 90,6
240 - 86,9 90,6
24h 30,9 82,0 71,5
W początkow ym etapie proces enzym atycznego utleniania (+) katechiny w obec
ności PPO w pH 7 zachodził bardzo szybko - czas połow icznego rozpadu τ0 , 5 = 47 m in (R 2= 0,9). D alsze utlenianie było ju ż znacznie w olniejsze i po 24 godzinach zachow al- ność substrátu w ynosiła 30% . O bniżenie pH środow iska reakcyjnego z 7 do 4 p ow o
72 Dorota Sosnowska dow ało zm niejszenie szybkości utleniania (+) katechiny. Po 47 min. jej zachow alność w ynosiła około 90% , a po 24 godzinach 80%. A ktyw ność tyrozynazy w procesie u tle
niania katechiny była znacznie niższa niż PPO. W roztw orze o pH 7 szybkość brunat
nienia była zbliżona do zaobserw ow anej z udziałem PPO przy pH 4.
D o kontroli przem ian (+) katechiny w procesie enzym atycznego utleniania zasto
sowano chrom atografię cienkow arstw ow ą (rys. 1).
Rys. 1. Chrom atogram TLC produktów utleniania (+) katechiny w obecności PPO w pH 7.
Fig. 1. The TLC chrom atogram o f (+)catechin oxidation products in the presence o f PPO at pH 7.
N a chrom atogram ie TLC (PPO w pH 7) zaobserw ow ano w yraźny ubytek m ono
m eru (+) katechiny i pow staw anie zw iązków o w artości w spółczynników R f odpow ia
dających dim erom i tetram erom tanin skondensow anych [3], które rów nież w ykazują aktyw ność antyoksydacyjną. Po 24 godzinach nie stw ierdzono obecności m onom eru, natom iast zaobserw ow ano pojaw ienie się „ciągnącej się plam y”, w skazującej na poja
w ienie się szeregu produktów polim eryzacji o zróżnicow anych m asach cząsteczko
w ych. G uyot ze wsp. [2] stw ierdził, iż w w yniku utleniania (+) katechiny polifenolook- sydazą w yizolow aną z w inogron pow staw ały zw iązki będące izom eram i proantocyja- nidyn typu A i B.
N atom iast na w idm ach absorpcji przedstaw iających utlenianie katechiny przez PPO w pH 7 (rys. 2) zaobserw ow ano niew ielki w zrost absorbancji przy 280 nm oraz pojaw ienie się piku w zakresie w idzialnym , który odpow iadał barw nym produktom
ZMIANY AKTYWNOŚCI ANTYOKSYDACYJNEJ (+) KATECHINY W WYNIKU UTLENIANIA. 73 utleniania (+) katechiny. W edług Guyota i wsp. [1], w procesie utleniania (+) katechi- ny w pH 6 przew ażały zw iązki o zabarw ieniu żółtym - λ™* 385 i 412 nm, zaś w pH 3 produkty utlenienia (+) katechiny w ykazyw ały m aksim um absorbancji przy 280 nm i pow staw ały jed y n ie śladow e ilości zw iązków barw nych z m aksim um absorbancji przy 400 nm.
Rys. 2. W idm a absorpcji w czasie utleniania (+) katechiny w obecności PPO w pH 7;
po czasie: 1 - 0 min; 2 - 1 0 min; 3 - 3 0 min; 4 - 6 0 min.
Fig. 2. Spectra (+)catechin during enzymatic oxidation in the presence o f PPO at pH 7;
1 - 0 min; 2 - 1 0 min; 3 - 3 0 min; 4 - 6 0 min.
A ktyw ność antyoksydacyjną produktów utleniania (+) katechiny określano dw o
m a m etodam i polegającym i na spektrofotom etrycznym pom iarze zm ian stężenia barw nych rodników (rys. 3). Po dw óch godzinach enzym atycznego utleniania (+) katechiny przez PPO w pH 7 spadek zaw artości katechiny w ynosił 57% , natom iast efektyw ność zm iatania stabilnego rodnika D PPH (w yrażana jak o IC 50) obniżyła się o 25% zaś kationorodnika A B TS (w yrażona jak o TEA C ) tylko o 12%. D alsze utlenianie (+) katechiny nie pow odow ało istotnych zm ian IC 50, zaś w spółczynnik TEA C obniżył się aż o 40% . Sugerow ać to m oże, że produkty enzym atycznego utleniania (+) katechi
ny w y kazują ró ż n ą aktyw ność antyoksydacyjną w stosunku do badanych rodników . W obecności tyrozynazy (+) katechina ulegała utlenieniu znacznie w olniej, a w łaści
wości anty oksydacyjne badanych roztw orów tylko w niew ielkim stopniu uległy zm ia
nie. W cześniejsze badania w łasne w ykazały rów nież, iż w czasie ogrzew ania roztw o
74 Dorota Sosnowska rów (+) katechiny w 90°C, w pH 7 pom im o szybkiego spadku zaw artości tego m ono
m eru w łaściw ości anty oksydacyjne badanych roztw orów obniżały się znacznie wolniej (określane jak o IC 50 w m etodzie z D PPH ) [11],
Rys. 3. Relacja pom iędzy zdolnością zm iatania rodników DPPH [IC50 - μΜ] oraz kationorodnika A BTS+ [TEAC - μΜ] a spadkiem zawartości (+) katechiny [%] w czasie utleniania roztworów modelowych w pH 7,0 w obecności: A - PPO; B - tyrozynazy.
Fig. 3. Influence o f enzym atic oxidation on the relationship between antioxidant activity determined by DPPH [IC50 - μΜ] and A BTS+ [TEAC - μΜ] radical scavenging and (+) catechin retention [%]
in the presence: A - PPO; B - tyrosinase.
Podsumowanie
Szybkość enzym atycznego utleniania w dużej m ierze zależy od rodzaju zastoso
w anego enzym u oraz pH środow iska reakcyjnego. Proces dw ugodzinnego utleniania
(+) katechiny w obecności PPO w pH 7 pow odow ał obniżenie zaw artości tego m ono
m eru o około 60% oraz pojaw ienie się now ych zw iązków o w spółczynnikach R f od
pow iadających dim erom i tetram erom tanin skondensow anych. A ktyw ność antyoksy- dacyjna tych roztw orów ulegała obniżeniu znacznie wolniej niż spadek zaw artości katechiny (IC 5o o 25% , zaś TEA C tylko o 12%). M oże to być spow odow ane tym , iż produkty enzym atycznego utleniania (+) katechiny w ykazują aktyw ność antyoksyda
cyjną w stosunku do badanych rodników.
L IT E R A T U R A
[1] Guyot S., Cheynier V., Souquet J.M., M outounet M.: Influence o f pH on the enzym atic oxidation o f (+ )catechin in model systems; J. Agric. Food Chem., 43, 1995, 2458.
[2] G uyot S., V ercauteren J., Cheynier V.: Structural determination o f colourless and yellow dimers resulting from (+)catechin coupling catalysed by grape polyphenoloxidase; Phytochem ., 42, 1996, 1279.
[3] Lea A .G.H., Bridle P., Tim berlake C.F., Singleton V.L.: The procyanidins o f white grapes and wines;
Am. J. Enol. Vitic., 30, 4, 1979, 289.
[4] Łoś J., W ilska-Jeszka J., Paw lak M.: Enzymatic oxidation o f polyphenols in fruit products and model solutions.; Pol. J. F oodN utr. Sci., 5/46, 1996, 83.
[5] Oszmiański J., Lamer-Zarawska E.: A ntymutagenna i antykancerogenna aktywność roślinnych polifenoli; Przem. Spoż., 10, 1992, 253.
[6] Oszmiański J., Lee C.Y.: Enzymatic oxidative reaction o f catechin and chlorogenic acid in a model system; J. Agric. Food Chem., 38, 1990, 1202.
[7] Oszmiański J.: Przem iany enzym atyczne związków fenolowych w układach modelowych i ekstraktach owocowych.; Zesz. Nauk. A R we W rocławiu, Rozprawy, 74, 1988, 1.
[8] O w usu-Ansah Y.I.: Polyphenoloxidase in w ild rice (Zizania palustris); J. Agric. Food Chem., 37, 1989, 901.
[9] Re R., Pellegrini N ., Proteggente A., Pannala A., Yang M. Rice-Evans C.: A ntioxidant activity ap
plying an im proved ABTS radical cation decolorization assay; Free Radic. Biol. Med, 26, 1999, 1231.
[10] Vinson J.A., Dabbagh Y .A., Serry M .M ., Jang J.: Plant flavonoids, especially tea flavonols are pow erful antioxidants using an in vitro model for heart disease; J. Agric. Food Chem., 43, 1995, 2800.
[11] W ilska-Jeszka J., Sosnowska D.: A ntioxidant activity o f anthocyanins in relation to other phenolic compounds present in fruits, Proceedings o f Euro Food Chem X - Functional Foods - A new chal
lenge for the food chemists, Budapeszt, 1999, 423.
[12] Yem G .C., Chen H.Y.: A ntioxidant activity o f various tea extracts in relation to their antim utagenic
ity; J. Agric. Food Chem., 43, 1995, 27.
76 D orota Sosnow ska
CHANGES OF (+)CATECHIN ANTIOXIDANT ACTIVITY DURING ENZYMATIC OXIDATION
S u m m a r y
The effect o f enzym atic oxidation o f (+) catechin on its antioxidant activity was investigated. Enzy
matic oxidation o f (+) catechin in the presence o f apple polyphenol oxidase (PPO) and tyrosinase was studied at 25°C and in solution at pH 4 and 7. The antioxidant activity was determ ined by tw o methods:
ABTS and DPPH radical scavenging. (+) Catechin and the reaction products w ere monitored by HPLC and TLC.
The rate o f reaction in the presence o f PPO at pH 7 was higher than at pH 4. The reaction products o f catechin oxidation w ere dim ers and tetram ers. The rate o f oxidation o f catechin in the presence o f tyrosi
nase w as slower than in the presence o f PPO. A ntioxidant activity o f catechin after two hours oxidation (PPO at pH 7) w as reduced about 25% in DPPH method (expressed as IC50) and only about 12% in ABTS m ethod (expressed as TEAC), in spite o f big decrease content o f monom er catechin (57%). This finding indicates that as a result o f (+) catechin enzymatic oxidation the compounds w ith antioxidant activity are formed. ^
