RADIOIMMUNOLOGICZNE I RADIOKOMPETYCYJNE METODY OZNACZANIA POZIOMU HORMONÓW WE KRWI

(1)

DIAGN. LAB., 1971, T. VII, NR 2

TEODOR STELMASIAK, SŁAWOMIR LIPSKI, ZBIGNIEW MAZIARZ

RADIOIMMUNOLOGICZNE I RADIOKOMPETYCYJNE METODY OZNACZANIA POZIOMU HORMONÓW WE KRWI

Z Instytutu Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN Kierownik: prof. dr S. Alexandrowicz

i z Ośrodka Ochrony Radiologicznej i Radiobiologii w Warszawie Kierownik: dr med. T. Obara

Oznaczanie hormonów w płynach ustrojowych wykonywano dotych- czas metodami biologicznymi, immunologicznymi i chemicznymi. Ujemną stroną metod biologicznych jest duży rozrzut i niedokładność wyników.

Oznaczenia chemiczne wymagają często drogiej i trudno dostępnej apa- ratury, a w przypadku hormonów białkowych — żmudnej analizy ami- nokwasów. Wiele hormonów i witamin nie było wogóle oznaczanych przed pojawieniem się metod radioimmunologicznych i radiokompetycyjnych. Dodatnią cechą tych metod jest to, że pozwalają one na oznaczanie substancji w niewielkich ilościach płynów ustrojowych.

Oznaczanie poziomu badanej substancji przy użyciu metod radiokompetycyjnych i radioimmunologicznych polega na jej specyficznym wią- zaniu przez swoiste białko. W przypadku hormonu białkowego o dużej cząsteczce — białko takie uzyskuje się drogą wytwarzania przeciwciał u innych gatunków zwierząt. W przypadku małych cząsteczek — białko wiążące uzyskać można drogą skoniugowania antygenu z nośnikiem biał-

kowym, względnie wykorzystuje się białka, które spełniając w orga-

nizmie rolę transportową wykazują swoiste powinowactwo do oznacza-

nych substancji.

Metodę radioimmunologicznego oznaczania hormonu białkowego (in-

suliny) opracowali po raz pierwszy Yalow i Berson (58) w 1960 r. Metody te zostały później przystosowane do oznaczania innych hormonów biał-

kowych. Znaczny rozwój badań endokrynologicznych dokonany w ostat-

nich latach wytworzył potrzebę uzyskania znakowanych hormonów biał-

kowych o wielokrotnie wyższych aktywnościach właściwych niż otrzy- mywane poprzednio. Niektórzy badacze (55, 58) uzyskiwali znakowane preparaty hormonalne do testów radioimmunologicznych drogą zwiększa- nia ilości izotopu używanego do piętnowania (do 100 mCi). Metody te nie znalazły jednakże szerszego zainteresowania ze względu na dużą ra- dioaktywność użytego izotopu oraz z powodu uciążliwych sposobów oczyszczania radioaktywnego hormonu. Inni badacze (3, 16, 27, 28) zredu- kowali radioaktywność izotopu używanego do znakowania (do 2—4 mCi)) przez obniżenie ilości piętnowanego hormonu. Obecnie do znakowania

hormonów białkowych stosowana jest metoda Greenwooda i wsp. (16),

której zaletą są: małe ilości białka poddawanego znakowaniu (5 ug), szybkie usuwanie izotopu niezwiązanego z białkiem przez filtrację na

sefadeksie oraz mały stopień wprowadzenia izotopu do cząsteczki (0,5 —

2 atomy J-131). |

(2)

И tee

118 Metody radiokompetycyjne wprowadzon

Murphy i wsp. (37, 38

w i witamin oznaczanych metodami radioimmunolo-

mpetycyjnymi przedstawia tabela I.

udoskonalone przez

Wykaz hormonó gicznymi i radioko

T. Stelmasiak i inni

7 abela I

Wykaz hormonów i witamin oznaczanych metodami radioimmunologicznymi i radiokompetycyjnymi

Nr 2

e zostały w 1963 r. a następnie

„ 39, 40, 41, 42, 44),

Hormony peptydowe

Hormony peptydowe Inne hormony Witaminy

Insulina Hormon wzrostu (GH) ACTH FSH LH aMSH BMSH

TSH

Angiotensyna II Bradykinina Gastryna Glukagon Kalcytonina Laktogen łożyskowy Oksytocyna Renina Tyreoglobulina Wazopresyna

I. METODY RADIOIMMUNOLOGICZNE 1. Zasada reakcji

Oznaczanie poziomu hormonu białko

oparte jest na reakcji między hormon

łość tej reakcji w porównaniu z inny.

zastosowania antygenu znakowaneg

mierzenia radioaktywności produktó

tywność oceny wyników.

Do prawidłowego w

jest posiadanie: a)

uzyskanego w stosunku do dane

nego hormonu znakowanego

w sposób identyczny jak hormo - Podstawą ilościowe

materiale jest wykor

kowanego izotopem

promieniotwórczym oraz w wiązaniu się ze stałą ilością przeciwciała.

W początkowym okresie badania ustala

11-dezoksykortyzol Kortykosteron Kortyzol Kortyzon Progesteron

Kwas foliowy Vitamin By,

wego metodą radioimmunologiczną

em i swoistym przeciwciałem. Czu- mi metodami jest wyższa na skutek o izotopem. Możliwość dokładnego w reakcji eliminuje poza tym subiek-

ykonania testu radioimmunologicznego niezbędnym

dokładnie ' oczyszczonego hormonu, b) przeciwciała go hormonu, ce) niewielkiej ilości bada-

izotopem reagujacego immunologicznie n nieznakowany.

80 oznaczania poziomu danego hormonu w badanym

zystanie zjawiska współzawodniczenia hormonu zna-

hormonu nieznakowanego się takie proporcje przeciwciała i hormonu znakowanego, aby pula przeciwciał biorących udział w reakcji

była zdolna wiązać tylko około 50%

Zależność tą można przedstawić

H-J-131 -F Anty-H — (H-J-

100%/0

H-J- An

50?/o

131 — hormon znakowany jodem,

7 przeciwciała antyhormonalne.

onu znakowanego do przeciwciał jest stała i stosowana

o ogólnej ilości znakowanego hormonu.

wzorem:

Anty-H) + H-J-131

50%

(3)

Nr 2 Radioimmunologiczne 'oznaczanie hormonów 119

zarówno do przygotowania krzywej standardowej, jak i do oznaczeń po- ziomu hormonu w badanej surowicy.

W miarę zwiększania stężenie hormonu nieznakowanego w mieszaninie reakcyjnej, na skutek współzawodniczenia obu rodzajów hormonów (znakowanego i nieznakowanego) w wiązaniu się z przeciwciałem, ilość hor-

monu znakowanego z przeciwciałem obniża się. Obrazuje to poniższy Wzór:

HS albo HE , HS albo HE

+ я

H-J-131 (const.) + Anty-H (const.) + H-J-131 + Anty-H + H-J-131 100°/o 25°/o 75°/o

gdzie: |

HS — hormon nieznakowany uzywany jako standard,

HE — hormon endogenny.

Z powyższej zależności wynika, że ilość hormonu radioaktywnego

związanego z przeciwciałem jest funkcją stężenia hormonu nieznakowanego (standardowego albo endogennego) obecnego w badanym materiale.

Zależność tę przedstawia wykres krzywej standardowej na ryc. 1.

60 Хр

Ryc. 1. Wykres krzywej standardowej. Oś rzędnych: procentowa zawartość hormonu znakowanego (,„gorącego”); oś odciętych:

0 2, 4 mug 6 8 10 znane stezenia hormonu nieznakowanego („zimnego”).

Odczyt poziomu hormonu polega na porównaniu stopnia hamowania

reakcji hormonu znakowanego z przeciwciałem przez znane ilości hormonu standardowego (krzywa standardowa) ze stopniem hamowania tej

reakcji przez nieznane ilości hormonu endogennego obecnego w materiale badanym.

2. Technika znakowania hormonów

Ze względu na łatwość wiązania się izotopów jodu z aminokwasem tyrozyną, do znakowania hormonów stosowane są powszechnie dwa izo- topy promieniotwórcze tego pierwiastka: J-125 i J-131. Zawartość reszt

tyrozyny w cząsteczce hormonu jest czynnikiem ograniczającym ilość

wprowadzanego izotopu. Nie wszystkie reszty tyrozyny obecne w czą-

steczce jodują się w jednakowym stopniu (56), co związane jest prawdo- podobnie z mniejszą lub większą ich dostępnością dla atomów jodu.

Badania wykazały, że im wyższa jest radioaktywność właściwa znakowa-

nego hormonu, tym niższe poziomy hormonu endogennego możemy ozna-

czać przy użyciu testu radioimmunologicznego. Osiąganie dowolhie wyso-

kich aktywności właściwych znakowanego hormonu nie jest jednakże

możliwe. Wprowadzenie dużej ilości jodu do cząsteczki hormonu powoduje

(4)

120 T. Stelmasiak i inni Nr 2

bowiem utratę jego właściwości immunologicznych i biologicznych (16, 28).

Optymalny stosunek atomów izotopu wbudowanych do cząsteczki hor- monu wynosi od 0,5 do 2. Konieczność uzyskania wysokiej radioaktywności

właściwej hormonu przy jednoczesnym zachowaniu jego aktywności immunologicznej wymaga użycia radioizotopu o wysokim stopniu czystości, zawierającego przynajmniej 95*/ radioaktywnych atomów. Izotop jodu stosowany do znakowania białek występuje zazwyczaj w postaci jodku.

Podczas procesu znakowania radioaktywny jod przeprowadzony zostaje

w formę atomową reagującą z białkiem.

3. Ocena stopnia uszkodzenia znakowanych hor- monów Utrata własności immunologicznych hormonu podczas jodowania może nastąpić na skutek radiolizy środowiska, wprowadzenia dużej ilości ato-

mów jodu do cząsteczki oraz działania środka utleniającego, używanego

do przeprowadzania jodu w formę atomową. Uszkodzony hormon biał- kowy zmienia swe własności fizykochemiczne, na skutek czego wzrasta

jego zdolność do adsorbowania się na powierzchni naczynia reakcyjnego

oraz na żelu dekstranowym.

Ocenę stopnia uszkodzenia hormonu znakowanego przeprowadza się w zasadzie przy użyciu dwu rodzajów metod

Metoda chromatoelektroforezy wykorzystywana jest do oceny stopnia uszkodzenia znakowanej insuliny (2, 58), hormonu wzrostu (15) oraz ACTH (12, 59). Metoda ta oparta jest na występowaniu różnic we wiązaniu się z celulozą hormonu znakowanego natywnego oraz uszkodzonego. Hor- mon nieuszkodzony wiąże się z bibułą w miejscu naniesienia, natomiast hormon uszkodzony wędruje w kierunku anody. ,

Inną metodą oceny stopnia uszkodzenia znakowanego hormonu jest obserwowanie jego zdolności wiązania się z przeciwciałami wytworzonymi przeciwko homologicznemu preparatowi. Metoda ta pozwała stwierdzić i ; jaki procent preparatu hormonalnego zachowuje reaktywność immunolo-

| - giczną.

4. Technika oczyszczenia znakowanych hormonów

| Z uwagi na fakt, że uszkodzenie hormonu znakowanego wpływa nie-

| korzystnie zarówno na czułość, jak i na specyficzność testu radioimmu-

| nologicznego, opracowano szereg metod oczyszczenia znakowanych hor-

monów. Do oczyszczania insuliny stosowano np. kolumnę celulozową (58,

59), lub wypełnioną sefadeksem G-75 (3). Do oczyszczania ludzkiego hormonu wzrostu (HGH-J-131) — sefadeks G-200 (20, 24). Metody chromatograficzne wykorzystują różny stopień absorpcji cząsteczek hormonu uszkodzonych i nieuszkodzonych do celulozy i ziaren sefadeksu oraz różną

szybkość ich rugowania z kolumny.

„. Тара stosowaną grupę metod oddzielania zdegradowanych cząsteczek

— hormonu od hormonu natywnego są różne odmiany elektroforezy na żelu skrobiowym. Metodami tymi oczyszczano: ludzki harmon wzrostu (10, 15,

53) i prolaktyne owczą (1).

s Zarówno metody chromatograficzne, jak i elektroforeza na żelu skro-

| biowym pozwalają na uzyskanie preparatów jodowanych hormonów

| 'o aktywności immunologicznej powyżej 900/06 w pełni przydatnych do wy-

konywania testów radioimmunologicznych. .

(5)

Nr 2 Radioimmunologiczne oznaczanie hormonów _ 121 s Rozdzielanie hormonu wolnego od hormonu

wiązanego z przeciwciałem

Zależnie od' właściwości fizykochemicznych hormonu stosuje się różne

metody rozdzielania hormonu wolnego od kompleksu hormon—przeciw- ciało.

Metoda podwójnych przeciwciał (tzw. „second antibody technic”)

Oddzielenie kompleksu hormon—przeciwciato od hormonu niezwigza- nego następuje w tej metodzie przez precypitację kompleksu z przeciw- ciałem skierowanym przeciwko gamma-globulinie dawcy przeciwciał hormonalnych. Technika ta posłużyła do opracowania metod ilościowego oznaczania insuliny (19), HGH (55), ACTH (7), szezurzego hormonu wzro-

stu (50) i insuliny świń (32).

Metoda chromatoelektroforezy

Podstawą tej metody jest zdolność! adsorbowania przez bibułę (np.

Whatman 3 MM) wolnego hormonu, podczas gdy hormon związany z prze- ciwciałem wędruje w kierunku anody. Pomiar radioaktywności obu części

paska bibuły pozawala na ustalenie stosunku między kompleksem hor- mon—-przeciwciało oraz wolnym hormonem. Przy użyciu tej metody

oznaczano m. in. poziom insuliny (58), HGH (15), ACTH (59) i TSH (54).

Inne metody

Poza wymieniońymi powyżej metodami do rozdzielania kompleksu hormon—przeciwciało od hormonu wolnego stosowano np. amberlit (30, 35) oraz węgiel aktywowany wysycony białkiem (57). Stosowano także precy- pitację chemiczną siarczanem sodu przy oznaczaniu insuliny (17) i ACTH (26) oraz roztwór chlorku sodowego w etanolu przy oznaczaniu TSH (49).

Używane są także m.in. następujące techniki rozdziału: elektroforeza na

octanie celulozy (HGH) (25), filtracja na żelu dekstranowym (insulina) (14), elektroforeza na żelu poliakrylamidowym (HGH) (8) oraz wiązanie hormonu na krążek polimeru (styren, poliżetrafluoroetylen) (6).

Poza hormonami białkowymi metodami radioimmunologicznymi ozna-

czano także substancje o małej cząsteczce, jak np. renina (31) vit. Byo (52), angiotensyna II (5) oraz sterydy (47). Przeciwciała do tych substancji uzyskiwano po uprzednim skoniugowaniu ich z nośnikiem białkowym.

Przeciwciała uzyskane w ten sposób reagowały specyficznie z niskoczą-

steczkową substancją pozbawioną nośnika białkowego.

II. METODY RADIOKOMPETYCYJNE

1. Zasada metody

Metodami radiokompetycyjnymi oznaczane są we krwi sterydy kory nadnercza: kortyzol i kortykosteron (37, 41, 44), płciowe: progesteron (11, 13, 18, 29, 46, 60), testosteron (9, 23,.33, 34, 38) i estradiol (38), tyroksyna (36, 43, 45) oraz witamina Bja (4). Oznaczenia mogą być też wykonywane w płynie mózgowo-rdzeniowym (40) i moczu (39). Ww substancje oznaczane są dzięki zdolności wypierania ich znakowanych wzorców z kom-

pleksu z białkiem.

Prawidłowe wykonanie oznaczeń wymaga, aby: mierzona substancja

w formie izotopowej miała wysoką aktywność właściwą, wiązała się

ze specyficznym białkiem w określonym dla niego miejscu.

(6)

~

122 . T. Stelmasiak i inns Nr 2

2, Biatka wiazace

Do oznaczeń radiokompetycyjnych najczęściej używana jest alfa;-glo- bulina transkortyna — CBG (corticosteroid binding globulin) o c¢. cz.

64 000. Białko to posiada jedno centrum aktywne i jest jednowartościowe względem sterydu. Własności tego białka zostały ostatnio opisane (21, 22, 51). Transkortyna jest białkiem specyficznym w stosunku do następują- cych sterydów: kortykosteronu, kortyzolu, 11-dezoksykortyzolu i proge- steronu. Najwięcej transkortyny . zawiera surowica kobiet będących

w ostatnim trymestrze ciąży, lub po terapii estrogenowej (18, 51). Suro- wicę taką używa się do testu radiokompetycyjnego. .

Poza transkortyną do białek wiążących należą: albumina, której czą- steczka ma wiele wiążących centrów aktywnych. Stężenie jej we krwi jest wprawdzie o wiele większe od CBG, ale wiązanie jej z hormonem jest niespecyficzne i bardzo słabe; beta-globuliny, wiążące androgeny i estrogeny; mukoidy, wiążące się zmiennie niestale z progesteronem.

Otrzymywanie specyficznych białek z krwi wymaga dużej czystości,

ponieważ obniżenie jej powoduje istotne zmiany w odczycie. Celem wy-

eliminowania wpływu albumin oraz zmniejszenia ilości endogennego hor- monu, osocze należy wielokrotnie rozcieńczyć. Białko o małym powino- wactwie i dużym stężeniu konkuruje z białkiem o wysokim powino-

wactwie i małym stężeniu, co daje błędne wyniki. Czułość metody można ustawiać przy pomocy dużych rozcieńczeń białka wiążącego. Na ogół stę- żenie surowicy dobiera się w ten sposób, żeby mieć ok. 80% związania

z białkiem. |

3. Preparatyka badanej surowicy

Do testu radiokompetycyjnego badaną surowicę należy wyekstrahować celem usunięcia czynników miogących wiązać oznaczany steryd. Dobór

płynu ekstrahującego (chloroform, eter naftowy) zależy od rodzaju ozna-

czanego sterydu. Badana próba zawiera całą pulę hormonu — wolną

i związaną. Oznaczana jest więc całkowita zawartość hormonu we krwi.

Różne sterydy konkurują jednak w wiązaniu ze specyficznym białkiem i dlatego domieszka innego sterydu może dawać fałszywe wyniki.

Oczyszczanie związków sterydowych i ich rozdział najlepiej jest wy- konać przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej.

4,Oznaczanie ilościowe

Oznaczanie ilościowe polega na wypieraniu przez steryd ,,zimny” (ba-

dany) sterydu ,gorącego” (znakowanego), którym uprzednio wysycono transkortynę. Steryd znakowany nie musi być identyczny z nieznakowa- nym — badanym, chodzi tu tylko o jednakowe powinowactwo danych

sterydów do białka wiążącego. W mieszaninie sterydów (,„zimnego” i „go- rącego”) dochodzi do równowagi pomiędzy nimi i wiązaniem z CBG. Ilość

sterydu znakowanego musi być większa niż białka wiążącego, tak, aby

białko było wysycone. Dopiero w takim układzie można obliczyć wypie-.

- ranie sterydu znakowanego przez „zimny”. Spadek radioaktywności kom-

_ pleksu hormonu znakowanego z transkortyną jest więc wprost proporcjo- nalmy do hormonu „zimnego”. Przebieg krzywej standardowej jest taki sam jak w metodach radioimmunologicznych (ryc. 1).

Następnym etapem jest rozdzielenie sterydu wolnego od związanego.

Na ogół mierzy się radioaktywność hormonu związanego. Rozdzielanie

można przeprowadzać na kolumnie jonowymiennej, wykorzystując róż-

nice ciężaru cząsteczkowego. Jako pierwsza frakcja wypływa wtedy hor-

(7)

Nr 2 Radioimmunologiczne oznaczanie hormonów 123 mon związany (44). Stosowane są również metody adsorpcji wolnego

hormonu na różnych sorbentach jak: krzemiany, ziemia Fullera, reagent Lloyda i węgiel aktywowany opłaszczony dekstranem (48).

Należy tu zwrócić uwagę na rygorystyczne przestrzeganie czasu wy- trząsana badanej próbki z adsorbentem, gdyż przedłużony czas adsorpcji powoduje wtórną dysocjację sterydu z białkiem i uwalnia go. Wiązanie

na sorbencie nie jest zakończone, lecz przerwane w określonym czasie.

Stopień adsorpcji zależy od ilości materiału adsorbowanego, czasu wy-

trząsania i temperatury.

Poza powyższymi metodami stosowana jest też technika wysalania bia-

łek siarczanem „.amonowym. Hormon związany z białkiem przechodzi wtedy do osadu, a hormon wolny znajduje się w nadsączu.

Straty badanego hormonu, jakie zaszły w trakcie wykonywania testu szacuje się na podstawie odzysku. Odzysk oblicza się albo przy pomocy

jednakowych, równocześnie z właściwą próbką wykonywanych próbek, albo przez dodanie znakowanego hormonu do próbki właściwej. Straty

radioaktywności pozwalają ocenić jaka jest wydajność procentowa metody, co pozwala na skorygowanie uzyskanych wyników.

Jednym z istotnych minusów oznaczania hormonów białkowych metodą radioimmunologiczną jest fakt, że metodą tą określa się białko aktywne immunologicznie, co nie zawsze pokrywa się z jego aktywnością biolo- giczną. Pewne produkty metabolizmu hormonów mogą powracać do krwi,

zachowując aktywność immunologiczną po stracie aktywności biologicznej i odwrotnie.

Może też istnieć białko o własnościach hormonalnych, które nie będzie reagować immunologicznie, lub też zmieniona zostanie jego swoistość immunologiczna. Oznaczanie radioimmunologiczne jest więc metodą ozna-

czania białka, która może, ale nie musi mieć cechy hormonu.

Należy również brać pod uwagę, że przeciwciała skierowane są tylko na część konfiguracji cząsteczki białka, gdyż peptydów, które wykazują cechy antygenu jest względnie mało. W ACTH np. konfiguracja pierw- szych 24 aminokwasów nie wykazuje cech antygenu, a posiada pełną ak- tywność biologiczną (co zostało wykorzystane w preparacie „Synacthen —

Ciba) — dopiero ostatnich 15 aminokwasów nadaje cząsteczce ACTH

własności antygenu. Trudno jest także uzyskać wysoko specyficzne prze-

ciwciała, gdyż ilość cząsteczek mających własności antygenu jest ogra- niczna. Możemy więc oznaczać tylko substancje mające tę samą deter-

minantę antygenową. Zachodzić. może np. reakcja z podobnymi hormo-

nami, a nawet z dwoma różnymi fragmentami peptydu tego samego hormonu. Źródłem błędów może być więc nieidentyczność immunologiczna hormonu i standardu. Stąd duże znaczenie ewentualnych zanie- czyszczeń.

Uwagi powyższe nie umniejszają jednak wielkich zalet cechujących

omawiane metody. Do zalet tych należy zaliczyć: ich wysoką czułość i małą ilość badanego materiału niezbędnego do wykonania analizy,

Dzięki temu, zastosowanie metod. radioimmunologicznych i radiokompetycyjnych pozwala na dokładne określenie. sekrecji gruczołów wewnętrz- nego wydzielania, umożliwiając prawidłową ocenę szeregu endokryno-

patii i stanowiąc cenne uzupełnienie konwencjonalnych metod diagno-

stycznych.

(8)

124 | T. Stelmasiak ż inni Nr 2

PISMIENNICTWO

1, Arai Y., Lee T. H.: Endocrinology, 1967, 81, 1041. — 2. Banerjee R. M.: J. En- docrin., 1965, 33, 109. — 3. Banerjee R. M., Gibson K.: J. Endocrin., 1962, 25, 145. — 4, Britt R. P., Bolton F.G., Cull A. C., Spray G. H.: Brit. J. Haemat., 1969, 16, 457. — 5. Cain M.D., Catt K.J., Coghian J. P.: Nature, 1969, 223, 617. — 6. Catt K., Nial H.D., Tregear G. N.: Biochem. J., 1966, 100, 31 c. — 7. Felber J. P.: Experientia, 1963, 19, 227. — 8. Fitschen W.: Immunology, 1964, 7, 307. —- 9. Forest M.G., Riva- rola M. A., Migeon C. J.: Steroids, 1968, 12, 323. — 10. Frantz A.G., Rabkin M. T.:

New Engl. J. Med., 1964, 271, 1375.

ll. Frick I., Kinol F. A.: Steroids, 1969, 13, 495. — 12. Galskov A.: Experientia, 1966, 22, 63. — 13. Ganguly M., Westphal U.: Biochim. Biophys. Acta, 1968, 170, 309. — 14. Genuth S., Frohman L. A., Lebovitz E. E.: J. Clin. Endoc. Metab., 1965, 25, 1043. — 15, Glick S.M., Roth J., Yalow R.S., Berson S. A.: Nature, 1963, 199, 184. — 16. Greenwood F. C., Hunter W. M., Glover J. S.: Biochem. J., 1963, 89, 114. — 17. Grodsky С. М., Forsham O. H.: J. Clin. Invest., 1960, 39, 1070. — 18. Gueri- guian J., Pearlman W.: J. Biol. Chem., 1968, 243, 5226. — 19. Hales C.N., Randle P.J.: Biochem. J., 1963, 88, 137. — 20. Hartog M., Gaafar M. A., Fraser R.: Lancet,

1964, 2, 376. i

21. Heyns W., van Baelen H., de Moor P.: Clin. Chim. Acta, 1967, 18, 361. — 22. Heyns W., van Baelen H., de Moor P.: J. Endocr., 1969, 43, 67. — 23. Horton R., Kato T., Sherius R.: Steroids, 1967, 10, 295. — 24. Hunter W. M.: Biochem. J., 1965, 97, 199. — 25. Hunter W. M., Greenwood F.C.: Biochem. J., 1964, 91, 43. — 26. Imu- ra H., Sparks L. L., Grodsky G. M., Forsham P. H.: J. Clin. Endocr. Metab., 1965, 25, 1361. — 21. 1220 J.L., Bale W.F., Izzo M.J., Roncone A.: Fed. Proc., 1962, 21, 204, — 28. Izzo J. L., Roncone A., Izzo M. M.J., Bale W.F.: J. Biol. Chem., 1964, 239, 3749. — 29. Johansson E. D.B.: Acta Endocrin., 1969, 61, 592. — 30. Lazarus L., Yiung J. D.: J. Clin. Endocr. Metab., 1966, 26, 213.

31. Lequin R. M., Hackeng W.H., Schopman W.: J. Endocrin., 1969, 43, xiv. — 32. Machlin L. J.. Horino M., Hertelendy F., Kipnis D. M.: Endocrinology, 1968, 82, 369. — 33. Maeda R., Masatoshi O., Wegienka L.C., Forsham P. H.: Steroids, 1969, 13, 83. — 34. Mayes D., Nugent C. A.: J. Clin. Endocr. Metab., 1968, 28, 1169. — 35. Meade R.C., Klitgaard H. M.: J. Nucl. Med., 1962, 3, 407. — 36. Murphy B. E. P.:

J. Lab. Clin. Med., 1965, 66, 160. — 37. Murphy B.E.P.: J. Clin. Endocr. Metab., 1967, 27, 974. — 38. Murphy B. E. P.: Canad. J. Biochem., 1968, 46, 299. — 39. Mur- phy B.E.P.: J. Clin. Endocr. Metabol., 1968, 28, 343. — 40. Murphy B. E. P., Cos- grove J. B.: Canad. Med. Ass. J., 1967, 97, 13.

41. Murphy B.E.P., Engelberg W., Pattee Ch. J.: J. Clin. Endocr. Metab., 1963, 23, 293. — 42. Murphy B.E.P., Hood A. B., Pattee C.J.: Canad. Med. Ass. J., 1964, 90, 775. — 43. Murphy B. E. P., Pattee Ch. J.: J. Clin. Endocr. Metab., 1964, 24, 187. — 44. Murphy B. E. P., Pattee Ch. J.: J. Clin. Endocr. Metab., 1964, 24, 919. — 45. Nauman J. A., Nauman A., Werner S.C.: J. Clin.-Invest., 1967, 46, 1346. — 46. Neil I. D., Johansson E. D.B., Fatta I. K., Knobil K.: J. Clin. Endocr. Metab., 1967, 27, 1167. — 47. Neri R. O., Tolksdorf S., Belser S.M., Erlanger B. F., Agate F., Lieberman S.: Endocrin., 1964, 74, 593. — 48. Nugent C., Mayes D.M.: J. Clin.

Endocr. Metab., 1966, 26, 1116. —- 49. Odell W.D., Wibur J.F. Paul W.E.: J. Clin.

Endocr. Metab., 1965, 25, 1179. — 50, Parker M. L., Jarezz L., Schalch D. S., Kipnis D. M.: Endocrin., 1965, 76, 928.

51. Rosenthal H.E., Slaunwhite W.R., Sandberg “A. A.: J: Clin. Endocr. Metab., 1969, 29, 352, — 52. Schwartz M., Redbro P.: Radioaktive Isotope in Klinik und Forschung, 1966, 7, 344. Urban Schwarzenberg, Miinchen. — 53. Stelmasiak T., Li- piński S.; Acta Physiol. Pol., 1969, 20, 199. — 54. Utiger R. D.: J. Clin. Invest., 1965, 44, 1277. — 55. Utiger R.D., Parker M. L., Daughaday W.H.: J. Clin. Invest., 1962, 41,

(9)

Nr 2 Radioimmunologiczne oznaczanie hormonów 125

254. — 56. Van Doesburgh J.T.S., Having E.: Biochim. Biophys. Acta, 1964, 82, 96. — 57. Wool M.S., Selenkow H. A.: Acta Endocr., 1968, 57, 109. — 58. Yalow R. S., Ber- son S. A.: J. Clin. Invest., 1960, 39, 1157. — 59. Yalow R.S., Glick S.M., Roth J., Berson S. A.: J. Clin, Endocr., Metab., 1964, 24, 1219. — 60. Yoshimi T., Lipsett M. B.: Steroids, 1968, 4, 527. i

Wpłynęło dnia 17.III. 1970 r.

Adres autorów: Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Warszawa, ul. Nowy Świat 72.