ŻYW NO ŚĆ 3(24) S u p i, 2000
AGNIESZKA ORKUSZ
PRZEGLĄD METOD CHROMATOGRAFICZNYCH STOSOWANYCH W ANALIZIE AMINOKWASÓW
S t r e s z c z e n i e
Celem artykułu je s t przegląd m etod chrom atograficznych stosowanych w analizie aminokwasów (chromatografia bibułow a i cienkowarstwowa, elektrochromatografia, chrom atografia gazowa, cieczowa - kolumnowa, w ysokospraw na chrom atografia cieczowa). Szczegółowo omówiona zostanie metoda z zasto
sowaniem HPLC chrom atografu A m inoQuant 1090 seria II z detektorem UV-Vis (DAD) firmy H ewlett Packard.
D uża ilość m etod oznaczania i chrom atograficznego rozdziału am inokw asów spow odow ana je s t poszukiw aniem dobrej m etody ich rozdziału (chrom atografia bibu
łow a i cienkow arstw ow a, gazow a, cieczow a - kolum now a, w ysokospraw na chrom ato
grafia cieczow a).
Chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa
A m inokw asy były je d n ą z pierw szych klas zw iązków , które udało się rozdzielić m etodą chrom atografii bibułow ej, stosow aną początkow o do jakościow ej identyfikacji poszczególnych am inokw asów , a następnie do ilościow ego ich oznaczania. Jako pierw si m etodę chrom atograficznego rozdziału am inokw asów na bibule opracow ali C ondon M ., G ordon A ., M artin J. [18]. Po ukazaniu się pracy wyżej w ym ienionych autorów , w ielu badaczy pracow ało nad udoskonaleniem owej m etody, m .in. Opieńska- B lauth, która ulepszyła bibułow ą chrom atografię dw ukierunkow ą opracow ując zim ny test ninhydrynow y - w yw oływ ania am inokw asów w postaci barw nych plam , dzięki którem u udało się zidentyfikow ać 21 am inokw asów [17]. M etodę nadającą się do ilo
ściow ego oznaczania am inokw asów na bibule opracow ał M c Farren [16, 18], który
M gr inż. A. Orkusz, Katedra Technologii Żywności Pochodzenia Zwierzęcego Akadem ii Ekonomicznej we Wrocławiu, ul. K om andorska 118/120, 53-345 Wrocław.
rozdzielił m ieszaninę am inokw asów na kilku chrom atogram ach jednokierunkow ych, rozw ijanych w różnych rozpuszczalnikach.
M etoda chrom atografii bibułowej nie pozw alała na całkow ite rozdzielenie m ie
szaniny w szystkich am inokw asów na jednym arkuszu bibuły, zanieczyszczenia bibuły pow odow ały pow staw anie sm ug i zniekształcenia w yw ołanych plam am inokwasów . W adą chrom atografii bibułow ej dw ukierunkow ej było stosunkow o duże zużycie bi
buły i odczynników , długotrw ałość postępow ania oraz konieczność użycia dwóch nie
zależnych kom ór chrom atograficznych.
U doskonaleniem chrom atografii bibułowej była chrom atografia cienkow arstw o
w a (zam iast bibuły stosow ano płytki pokryte w arstw ą sorbentu), dzięki której znacznie skrócono czas rozw ijania chrom atogram u, plam ki były mniej rozm yte niż na bibule oraz m ożna było w ykryw ać m niejsze ilości analizow anych substancji. W iększa un i
w ersalność chrom atografii cienkow arstw ow ej, w porów naniu z chrom atografią bibu
łową, w ynika rów nież z m ożliw ości stosow ania różnych sorbentów , które są mniej niż bibuła w rażliw e na niszczące działanie rozpuszczalników stosow anych zarów no do rozw ijania, ja k i w yw oływ ania chrom atogram ów [1 0].
Pow szechnie używ anym i układam i rozpuszczalników do rozw ijania chrom ato
gram ów w chrom atografii bibułow ej i cienkow arstw ow ej były: n-butanol, kwas octo
wy, w oda (12:3:5); fenol, w oda (3:1); n-butanol, aceton, am oniak, w oda (10:10:5:2);
izopropanol, kw as m rów kow y, w oda (20:1:5). Najczęściej używ anym odczynnikiem do w yw oływ ania am inokw asów była ninhydryna w acetonie [2 1,1 0] lub w butanolu [7], Stosow ano rów nież m odyfikacje odczynnika ninhydrynow ego, przez zw iązanie go z m etalam i, m.in.: z m iedzią [20], rtęcią [5],
M im o niew ątpliw ych zalet chrom atografia cienkow arstw ow a m iała rów nież w a
dy. R óżnice w strukturze sorbenta na poszczególnych płytkach oraz w w arunkach p a
nujących w kom orach chrom atograficznych w czasie procesu rozw ijania chrom ato
gramu, uniem ożliw iały otrzym anie stałych, pow tarzalnych w yników [23].
Elektrochromatografia
H augaard i K roner, jak o pierw si opracow ali m etodę rozdziału am inokw asów z za
stosow aniem pola elektrycznego. Połączyli oni chrom atografię bib ułow ą z rów nocze
sną elektroforezą. M etoda ta polegała na przyłożeniu napięcia do arkusza bibuły nasy
conego buforem fosforanow ym o pH = 6,2 z rów noczesnym rozdziałem chrom atogra
ficznym za p o m ocą fenolu jak o fazy ruchom ej. W ten sposób rozdzielili 10 am inokw a
sów [18]. Lepsze w yniki rozdziału m ieszaniny am inokw asów otrzym ano stosując elektrochrom atografię w ysokonapięciow ą, polegającą n a stosow aniu w ysokiego spad
ku potencjału (40 do 200 V/cm ). Z aletą tej m etody było zm niejszenie efektu dyfuzji i elektroosm ozy, co pozytyw nie wpłynęło na jako ść rozdziału poszczególnych frakcji oraz krótki czas rozdziału. G łów ną w adą tej m etody była konieczność odprow adzenia
16 Agnieszka Orkusz
dużej ilości energii cieplnej, ja k a w ytw arzała się w toku elektroforezy. Po raz pierw szy elektrochrom atografię w ysokonapięciow ą zastosow ali K ickhofen i W estphal, którzy rozdzielili am inokw asy najpierw elektroforetycznie (przy zastosow aniu spadku poten
cjału 70 V /cm w ciągu 200 m in), a następnie - w kierunku prostopadłym do poprzed
niego stosow ali chrom atografię rozdzielczą w układzie: pirydyna - kw as octow y - w oda (50:75:15) w ciągu 17 godzin [11]. M etoda ta nie daw ała całkow itego rozdziału w szystkich am inokw asów . N ad udoskonaleniem elektrochrom atografii w ysokonapię
ciowej pracow ał M asłow ski, który przeprow adził dokładne badania dotyczące m.in.:
doboru odpow iedniej kom ory elektroforetycznej, czasu rozw ijania elektroforegram ów oraz w ysokości stosow anych napiąć [14]. Skonstruow ał on kom orę, w której odprow a
dzanie ciepła zachodziło przez bezpośrednie położenie zw ilżonej buforem bibuły na ochłodzoną od zew nątrz płytę s z k la n ą a nie ja k w kom orze M ichla [18, 24] zastoso
wanej w m etodzie K ickhofena i W estphala, za pom ocą cieczy izolującej np. toluenu.
Udało m u się rów nież zm niejszyć do m inim um elektroosm ozę, przez zastosow anie folii celofanow ej łączącej bibułę filtracyjną z buforem [14]. M asłow ski w ykazał, że stosow anie w ysokich napięć: 120-150 V /cm skracało czas analizy, ale pow odow ało jednocześnie pow staw anie dużych ilości ciepła. Z byt niskie napięcia (poniżej 35 V/cm ) nie daw ały całkow itego rozdziału. N ajodpow iedniejszym napięciem do rozdziału am i
nokw asów kw aśnych i zasadow ych przy zastosow aniu buforu o pH 6,5, okazało się 5 0 -6 0 V /cm , natom iast w przypadku am inokw asów obojętnych przy zastosow aniu buforu o pH = 2, 6 0 -8 0 V/cm. Czas rozw ijania elektroforegram ów przy zastosow aniu pow yższych napięć pow inien w ynosić 60 do 120 m inut. D łuższy czas na skutek dyfu
zji pow odow ał bow iem zw iększenie pow ierzchni plam , co w pływ ało negatyw nie na rozdział am inokw asów leżących blisko siebie.
M etoda opracow ana przez M asłow skiego pozw oliła na rozdzielenie m ieszaniny 18 am inokw asów w postaci zw artych i sym etrycznych plam ek, co w ogrom nej m ierze ułatw iło oznaczenie ilościowe.
Chromatografia gazowa
R ozdział am inokw asów przeprow adzano rów nież stosując m eto dą chrom atografii gazow ej, w której konieczne było przeprow adzenie am inokw asów w ich lotne pochod
ne, takie jak: N -acetylow e, trinitroacetylow e [3] trim etylosililow e [26] estry n-butylow e N -trifluoroacetyloam inokw asów . Jako fazy stacjonarne stosow ano gliko- bursztynian neopentylu lub też bursztynian polibutanodiolu [3], Trudności w tej m eto
dzie spraw iało przeprow adzanie am inokw asów w ich lotne pochodne.
Chromatografia kolumnowa jonowymienna
Z w ielu m etod chrom atografii cieczowej pow szechne uznanie zyskała chrom ato
grafia jonow y m ienn a z użyciem żyw icy polistyrenow o-sulfonow ej D ow ex 50. C hro
m atografia na jonitach pozw alała na jednorazow e rozdzielenie stosunkow o dużych ilości oznaczanych am inokw asów , a także charakteryzow ała się m ałym błędem m eto
dycznym. M etoda opracow ana przez M oorea i Steina, zaliczana do m etod klasycznych, polegała na przepuszczaniu przez jo n it m ieszaniny am inokw asów i eluow aniu ich bu
forami cytrynianow ym i o w zrastającym pH [18, 21]. Frakcje zbierano za p o m o cą ko
lektora frakcji, będącego jed n y m z pierw szych autom atycznie działających aparatów do zbierania frakcji w ycieku [18], w uzyskanych frakcjach am inokw asy oznaczano ilościow o odczynnikiem ninhydrynow ym . Z biegiem lat kolektor frakcji zastąpiono detektoram i przepływ ow ym i, które w sposób ciągły rejestrują strum ień eluentu, auto
m atycznie w skazu ją kiedy analizow ane zw iązki opuszczają kolum nę chrom atogra
ficzną [12]. D alsze uspraw nienia w końcow ym efekcie doprow adziły do konstrukcji autom atycznych analizatorów am inokwasów .
Do rozdzielania am inokw asów stosow ano rów nież kolum ny w ypełnione jonitam i skom pleksow anym i z kationam i cynku lub miedzi [13].
Wysokosprawna chromatografia cieczowa
D użym osiągnięciem w analizie am inokw asów jest w ysokospraw na kolum now a chrom atografia cieczow a, będąca m etodą w pełni zau tom atyzo w aną sterow aną kom puterow o, z system em przetw arzania danych. Pow stała ona w oparciu o tradycyjną chrom atografię kolum now ą, dzięki m.in.: zm niejszeniu długości kolum n oraz ich śred
nicy w ew nętrznej i ulepszeniu system ów detekcji. Stosow ane w klasycznej kolum no
wej chrom atografii cieczowej kolum ny do oznaczania am inokw asów m iały różnorodną długość 100 cm [8], 150 cm [9], i średnicę, np. 5,5 m m [18], O becnie do oznaczania am inokw asów stosow ane są kolum ny o dł. 20 cm [22] - 25 cm [4], i średnicy 2,1 mm [22] i 4,6 m m [1], K onsekw encją redukcji długości kolum ny i jej średnicy je st m.in.
zm niejszenie zużycia kosztow nych rozpuszczalników stosow anych w HPLC, skrócenie czasu analizy, lepsza odtw arzalność w yników [19, 25]. Najczęściej stosow anym i obec
nie detektoram i do oznaczania am inokw asów są: detektory U V -V is [2, 22] i detektory fluorescencyjne [1, 6, 15].
P rzykładem urządzenia do przeprow adzania oznaczeń am inokw asów m etodą HPLC je st w pełni zautom atyzow any A m inoQ uant 1090 firm y H ew lett Packard (czyn
ności m anualne sprow adzają się tylko do przygotow ania próbki i w zorca oraz do uru
chom ienia kom putera), którego podstaw ow e elem enty stanowią: autom atyczny do
zow nik, prekolum na (2 0x2 , 1 mm), w łaściw a kolum na chrom atograficzna (2 0 0x2 , 1
18 Agnieszka Orkusz
mm), detektor U V -V is (D iode-A rray D etector) lub fluorescencyjny oraz kom puter z odpow iednim oprogram ow aniem .
A utom atyczny dozow nik um ożliw ia w prow adzenie badanej próbki oraz fazy ru
chomej na kolum nę chrom atograficzną. Przy dozow niku znajduje się stojak, w którym kolejne pięć m iejsc zajm ują: odczynniki służące do przeprow adzania am inokw asów w pochodne (ortoftalaldehyd-O PA i 9-fluoroenylom etylochloroform -FM O C ), bufor bo- ranow y i trzy w zorce zaw ierające m ieszaniny tych sam ych am inokw asów , ale o róż
nych stężeniach; kolejne m iejsca (do 99) zajm ują próby badane.
W prekolum nie (20x2,1 mm), której w ypełnienie stanow i ODS H ypersil (C i8) o w ielkości ziaren 5 μιη następuje przeprow adzanie am inokw asów w pochodne orto- ftalaldehydow e i 9-fluoroenylom etylochloroform ow e.
W e właściw ej kolum nie chrom atograficznej (200x2,1 m m ), której niepolam e, stałe w ypełnienie stanow i V ydac (C i8) o w ielkości ziaren 5 μιη następuje w ym yw anie am inokw asów za pom ocą układu dwóch rozpuszczalników (chrom atografia gradien
towa), które stanow ią polarną fazę ruchom ą. W skład pierw szego rozpuszczalnika wchodzi: octan sodu, trietyloam ina i tetrahydrofuran; skład drugiego to: octan sodu, acetonitryl i m etanol. W elucji gradientowej w ym yw anie am inokw asów zaczyna się eluentem o małej sile elucji, a następnie dodaje eluent o dużej sile. Sum aryczna obję
tość eluentu przepływ ającego przez kolum nę w jednostce czasu je s t stała, natom iast różne są objętości poszczególnych eluentów (początek analizy 1 0 0% rozpuszczalnika A, 0% rozpuszczalnika B, w 18 m in 0% rozpuszczalnika A i 100% rozpuszczalnika B).
Jako, że w ypełnienie kolum ny je st niepolam e, a faza ruchom a je st polarna, m am y do czynienia z odw róconym układem faz, który jest obecnie stosow any znacznie czę
ściej niż norm alny u kład faz. Jest to spow odow ane tym , że polarne adsorbenty używ a
ne w norm alnym układzie faz silnie adsorbuj ą w odę obecną w rozpuszczalnikach na
w et w ilościach śladow ych, w w yniku czego aktyw ność adsorbentu m aleje, a kolum na traci swoje początkow e w łaściw ości rozdzielcze. Zjaw isko to nie w ystępuje na niepo- lam ych w ypełnieniach kolum ny chrom atograficznej [8], Czas rozdziału w ynosi 18 m inut.
W skład A m inoQ uantu 1090 w chodzi detektor U V -V is (D iode A rray D etector), który m oże być używ any do detekcji przy ośm iu różnych długościach fal jednocześnie (w zakresie długości fal od 190 nm do 950 nm ), ale tylko dw ie długości fali są u żyw a
ne do oznaczania am inokw asów , tj. 262 nm dla am inokw asów - pochodnych FM OC oraz 338 nm dla am inokw asów będących pochodnym i OPA. D etektor diodow y m oże być zastąpiony przez detektor fluorescencyjny, który je st detektorem bardziej czułym od opisanego pow yżej.
C ały proces analizy am inokw asów kontrolow any je st za pom ocą zintegrow anego układu, w skład którego w chodzi: kom puter, m onitor i klaw iatura. W szystkie operacje:
ich ilość, czas, kolejność, są zaprogram ow ane przed przystąpieniem do analizy (np.:
przeprow adzanie am inokw asów w pochodne, kolejność dodaw ania odczynników do badanej próbki, szybkość i czas trw ania m ieszania tych odczynników z b ad a n ą prób
ką).
K om puter rejestruje sygnały w ychodzące z detektora, charakteryzujące poszcze
gólne piki (rejestruje czas retencji, pow ierzchnię pików ); oblicza ilościow y skład p rób
ki oraz identyfikuje poszczególne składniki analizowanej m ieszaniny n a podstaw ie chrom atogram ów am inokw asów w zorcow ych w prow adzonych do pam ięci kom putera.
Ł ączny czas analizy - od m om entu pobrania próbki przez dozow nik do w ydruku w yników - w ynosi 35 min.
W ydruk w yników otrzym uje się w postaci chrom atogram u (przykładow y chro
m atogram ilustruje rys. 1) oraz tabeli. C hrom atogram przedstaw ia rozdział m ieszaniny am inokw asów . N a osi x znajduje się czas retencji, na osi y w skazanie detektora. A m i
nokw asy w ym yw ane są z kolum ny chrom atograficznej w kolejności, ja k pokazano na rys. 1. W oparciu o czas retencji dokonuje się identyfikacji poszczególnych am inokw a
sów. Tabela zaw iera kolejno: nr am inokw asu, czas retencji, długość fali św ietlnej, przy której je st oznaczany, nazw ę am inokw asu, pow ierzchnię piku, zaw artość am inokw asu (ng/μΐ w prow adzonej próbki), stężenie am inokw asu (pm ol/μ ΐ w prow adzonej próbki), które w zależności od sposobu prezentacji w yników , m ożna przeliczać na: azot, białko, surowiec użyty do analizy.
Rys. 1. Rozdział am inokwasów z mięsnego hydrolizatu.
Fig. 1. The chrom atogram o f amino acids from m eat hydrolyzate.
20 Agnieszka Orkusz
LITERATURA
[1] Ashworth R.B.: A m ino acid analysis for meat protein evaluation. J. Assoc, o f Anal. Chem., 1, 1987, 80.
[2] A ristoy M .C., Toldra F.: D eproteinization techniques for HPLC amino acid analysis in fresh pork muscle and dry-cured ham. J. Agric. Food Chem., 39, 1991, 1792.
[3] Berthillier A.: Chromatografia i jej zastosowania. PWN, W arszawa 1975.
[4] Biesaga M ., O rska J., Trojanowicz M.: HPLC o f amino acids using tetraphenyloporphyrin-silica stacionary phases. Chem, Anal., 43 (4), 1998, 647.
[5] Borkowski T., M adecka-Borkow ska I.: Oznaczanie aminokwasów m etodą chrom atografii bibułowej.
Chem. Anal., 1-2, 1959, 119.
[6] Chuaqui-O fferm ans N ., M cDougall T.: An HPLC method to determine o-tyrosine in chicken meat. J.
Agric. Food Chem., 39 (2), 1991, 300.
[7] Gouw T.H. (red.): N ow oczesne metody instrumentalne analizy. WNT, W arszawa 1976.
[8] Ham ilton R.J., Sewell P.A.: W ysokosprawna chrom atografia cieczowa. PW N, W arszawa 1982.
[9] Hirs C.H., M oore S., Stein W.: The chrom atography o f Amino Acids on ion exchange resins. Use o f volatile acids for elution. J. Am. Chem. Soc., 76, 1954, 6063.
[10] Jarosz M ., M alinow ska E.: Pracow nia chemiczna. A naliza instrumentalna. W SiP, W arszawa 1999.
[11] Kickhôfen B., W estphal O: Z. N aturforsch, 7b, 1952, 659.
[12] Kirkland J. (red.): W spółczesna chrom atografia cieczowa. PWN, W arszawa 1976.
[13] M asłowska J., Gasińska E.: N ow e metody rozdzielania m ieszaniny am inokwasów na kolum nach jonitow ych obsadzonych kationami cynku lub miedzi. Chem. A n a l, 29 (2), 1984, 163.
[14] M asłowski P.: W ysokonapięciow a elektrochromatografia bibułowa am inokwasów w różnych okre
sach kiełkowania Hordeum sativum. Roczn. Nauk Roln., 81, 1960, 561.
[15] M eier W ., B uergin R., Froehlich D.: Analysis o f o-tyrosine as a method for the identification o f *
irradiated chicken meat. Beta Gamma, 1, 1988, 34.
[16] M uszkatow a B.: Badania nad składem aminokwasowym i uzupełnianiem się białek produktów spo
żyw czych z zastosow aniem ilościowej chrom atografii bibułowej. Roczniki PZH, XIV (3), 1963, 249.
[17] Opieńska-Blauth J.: W ykryw anie aminokwasów w analizie chrom atograficznej. Chem. Anal., 2, 1957, 123.
[18] Opieńska-Blauth J., W aksm undzki A., Kański M.: Chromatografia. PWN, W arszawa 1957.
[19] Peak.: From the HP bookshelf. H ew lett Packard, 4, 1992.
[20] Sanecka-Obacz M.: Przystosow anie testu ninhydryno-m iedziow ego do identyfikacji aminokwasów w płynach ustrojow ych. Chem. A nal., 6, 1961, 419.
[21] Škrabka T.: Chromatograficzny rozdział aminokwasów niektórych hydrolizatów z surowców odpad
kow ych przem ysłu rolno-spożywczego. Zesz. Nauk. WSE, W rocław 1963, 111.
[22] Skrabka-Błotnicka T., Rosiński A., Przysiężna E.: The effect o f dietary formulation supplemented with herbal m ixture on the goose breast muscle quality. Report 1: The effect on the chem ical com po
sition. Arch. G eflugelk., 61(3), 1997, 135.
[23] Suprynowicz Z., Różyło J.K., K owalczyk S., Staszewski R., M alzacka M.: Ilościow a analiza chro
matograficzna cieczow a i gazowa. PAN 1973. -
[24] Szyszko E.: Instrum entalne metody analityczne. PZW L, W arszawa 1975.
[25] Tyszkiew icz S. (red.): Postęp w analizie żywności. Wyd. IPM iT, W arszawa 1993.
[26] Żegota A., Żegota H.: Chromatograficzny rozdział izomerów tyrozyny. O -tyrozyna jako produkt radiacyjnej hydroksylacji fenyloalaniny i wskaźnik naprom ieniowania żywności. Żywność. Techno
logia. Jakość., 4 (13), 1997, 37.
REVIEW OF CHROMATOGRAPHIC METHODS USED FOR ANALYSIS OF AMINO ACIDS
S u m m a r y
The review o f the chrom atographic methods (paper, thin-layer, electrochrom atography, gas, liquid - colum n and high pressure liquid chromatography) used for the analysis o f amino acids in the paper is pre
sented. The method w ith using o f the H ewlett Packard’s HPLC chrom atograph Am inoQ uant 1090 series II with a diode array detector is especially exhibited. ^
