Zagęszczanie i częściowe oczyszczanie enterotoksyny gronkowcowej

MARIA BURBIANKA

ROCZNIKI PZH 1960, t. XI, nr 3

ZAGĘSZCZANIE

I

CZĘŚCIOWE

OCZYSZCZANIE ENTEROTOKSYNY GRONKOWCOWEJ

Z Zakładu Badania Żywności i Przedmiotów Użytku PZH

Właściwości

enterotoksyny gronkowcowej, która pod wielu

względa­

mi

różni się

od innych toksyn bakteryjnych, nie

są

dobrze poznane.

Również

stosunkowo

mało są wyjaśnione

zagadnienia koncentracji i oczyszczania enterotoksyny oraz

właściwoś-ci

koncentrowanych prepa- ratów.

Piśmiennictwo dotyczące

tego zagadnienia obejmuje nieliczne pozycje. Z prac Davisona i Dacka (9) oraz Bergdolla i wsp.

(1-3)

wia- domo,

że enterotoksynę można wysalać

z

przesączów

hodowli siarcza- nem amonu oraz

wytrącać

kwasem solnym.

Wysalając enterotoksynę

siar-czanem amonu przy pH 5,5 Bergdoll i wsp., otrzymali aktywniejsze preparaty

niż

przy wysalaniu przy pH 3,5. Preparaty enterotoksyny otrzymane za

pomocą wytrącania

kwasem solnym z roztworów o pH 3,5

były dosyć

aktywne, lecz

wydajność była mała. Wytrąconą

z prze-

sączów

hodowli

enterotoksynę

autorzy

częściowo

oczyszczali za

pomocą

dializy lub dalszego

wytrącania

etanolem lub metanolem. Jako

zwierzęta doświadczalne służyły małpy,

któTym badane preparaty koncentrowanej enterotoksyny wprowadzano

sondą

do

żołądka.

DOŚWIADCZENIA WŁASNE

Praca mmeJsza

miała

na celu otrzymanie k_oncentrowanej i

częsc10wo

oczyszczonej enterotoksyny oraz przebadanie jak na

oczyszczoną

entero-

toksynę działają

enzymy proteolityczne pepsyna i trypsyna oraz jaka jest

wrażliwość

oczyszczonej enterotoksyny na

temperaturę.

Enterotoksynę

wysahno z

przesączów

hodowli siarczanem amonu, porównano przy tym

aktywność

preparatów koncentrowanej suchej enterotoksyny, otrzymanych za

pomocą

wysalania przy

różnym

pH i

różnym

stopniu wysycenia siarczanem amonu oraz przy zastosowaniu kombinowanego sposobu wysalania.

MATERIAŁY I METODYKA

Szczepy

Większość doświadczeń

przeprowadzano ze szczepem gronkowca nr 9 wyizolowanym z lodów, które

były przyczyną

masowego zatrucia. Prze-

sącze

hodowli tego szczepu

hemolizowały

krwinki królicze oraz w

sła­

bym stopniu krwinki baranie.

248

M. Burbianka Nr :3

P r z y g o t o w a n i e

podłoży

i hodowla Podstawowym

składnikiem podłoży płynnych był

hydrolizat enzyma- tyczny kazeiny, ewentualnie hydrolizat kazeiny

rozkładanej

kwasem.

Hydrolizat enzymatyczny przygotowywano z kazeiny technicznej za po-

mocą

trawienia

wyciągiem

z trzustki. Hydrolizat

kwaśny

otrzymywano

hydrolizując kazeinę techniczną

kwasem solnym.

Zawartość

azotu ogól- nego w dodawanych do

podłoża

hydrolizatach

wynosiła

3 mg

N/ml.

Zależnie

od

założeń

przeprowadzanych

badań

do hydrolizatu dodawan3 odpowiednie

ilości

innych

składników. Podłoża

te

były

sterylizowane

w autoklawie, pH

końcowe wynosiło

7,4.

Enterotoksynę

produkowano: a) w butelkach

wysokości

12 cm,

śr-ed­

nicy 5,5,

objętości

200 ml

zawierających

150 ml

podłoża;

b) w butelkach 2-litrowych

wysokości

19 cm,

średnicy

12 cm

napełnionych

do okolu

3/ 4 wysokości

1 500 ml

pod.łoża;

butelki zamykano korkami z waty;

c) w kolbach

okrągłych płaskodennych

obj. 8 litrów, które

napełniano

5 litrami

podłoża.

Kolby te zamykano korkami gumowymi przez które

przechodziła

rurka szklana z kranem. Po posiewie butelki z

podłożami

umieszczano w -eksykatorze

próżniowym,

z którego usuwano

część

po- wietrza i wprowadzano 300/o C0

2 •

Z kolb zamykanych korkiem gumo- wym usuwano powietrze

i

wprowadzano C0

2

w sposób

jałowy

przez

rurkę zamykaną

kranem. Jako

podłoże

kontrolne

służył

bulion z dodat- kiem 0,50/o agaru

używany

przy badaniu gronkowców na

zdolność

wy- twarzania enterotoksyny (4).

Obecność

enterotoksyny w

przesączach

hodowli stwierdzano za po-

mocą

próby biologicznej na kotach (4).

Poni-eważ

roztwory enterotoksyny

mogą

nie

działać

w

kwaśnym środowisku,

w przypadku zakwaszenia

podłoża,

co

miało

miejsce w

obecności

glikozy, badany

płyn

przed wpro- wadzeniem kotom doprowadzano do pH 7 ,2 za

pomocą

1-n

ługu

sodo- wego (6, 13).

Przy

określeniu

najmniejszej dawki enterotoksycznej suchych prepa- ratów toksyny

różne ilości

suchej toksyny rozpuszczone w 0,85°/o-owym NaCl wprowadzono kotom

dożylnie.

Jako

najmniejszą dawkę

enterotok-

syczną

suchej toksyny przyjmowano

tę najmniejszą ilość

toksyny wy-

rażoną

w mg, która powdduj e wymioty u 50'0/o

użytych

do

doświadcze­

nia kotów E D

_{50 •} Każdą dawkę

sprawdzano przynajmniej na 4 kotach.

O z n a c z a n i e h e m o 1 i z y n. Hemolizyny oznaczano w prze-

sączu

hodowli odwirowanym i

przesączonym

przez filtr Scitza EK.

Posługując się

roztworem izotonicznym NaCl, przygotowano

serię

roz-

cieńczeń przesączu

1 : 10; 1 : 20; 1 : 40 itp. po 1 ml w probówce z

każdego rozcieńczenia. Następnie zależnie

od

założenia

dodawano do

każdej

probówki 0,2 ml - 50/o zawiesiny krwinek króliczych lub baranich trzykrotnie przemytych roztworem izotonicznym NaCl. Probówki za-

wierające

krwinki królicze umieszczano na 1 godz. w

łaźni

wodnej o temp.

37°.

Probówki

zawierające

krwinki baranie po 1 godz. inkubacji w temp.

370

umieszczano na 24 godziny w

chłodni

o temp. 4°. Przy odczytywaniu wyniku jako

wartość graniczną

przyjmowano

probówkę wykazującą kompletną hemolizę

krwinek.

Siarczan amonu

używany

do wysalania enterotoksyny

był

chemicznie czysty, dodawano go

bezpośrednio

do

płynu,

z którego toksyna

była

wysalana.

Nr 3

Enterotoksyna gronkowcowa

249

Przy dializie toksyny

posługiwano się

woreczkami celofanowymi.

Dializę

przeprowadzano do zimnej wody destylowanej. pH oznaczano potencjometrycznie.

Zawartość

azotu ogólnego oznaczano

półmikrometodą

(Kjeldahla) (14).

WYNIKI BADANIA

Podłoże

do p r o d u k c j i e n t e r o t o k s y n y

Wstępne doświadczenia miały

na celu ustalenie

podłoża

do produkcji enterotoksyny. Przy wyborze

podłoża

oparto

się częściowo

na dawnie:;- szych

doświadczenia własnych

(4) oraz pra· cach

Favorite'a

i

Hammona

(10) oraz

^SurgaUi

i wsp. (16), które

wykazują, że

enterotoksyna wytwarza

się

przy hodowli gronkowców na

podłożach

z hydrolizatem kazeiny.

Podłoża

na hydrolizacie kazeiny znacznie

więcej nadawały się

do produkcji enterotoksyny

niż podłoże

agarowe, ze

względu

na

łatwiejsze

oddzielenie enterotoksyny od

składników podłoża.

Postanowiono wy-

bróbować różne

modyfikacje

podłoża używanego

przez

Favorite'a

i

^Ham- mona.

Po ustaleniu

podłoża należało również określić

jak szybko narasta enterotoksyna

zależnie

od

objętości podłoża

i naczynia oraz czasu hodowli.

Porównano wytwarzanie enterotoksyny i hemolizyn przy hodowli gronkowców o

składzie następującym:

1)

Podłoża

Favorite'a i Hammona:

Hydrolizat enzymatyczny kazeiny, kwas nikotynowy 0;000123°io, chloro- wodorek tiaminy 0,000005°/o, glikoza 0,25'0/o, 2) to samo

podłoże

tylko b€z glikozy, 3) hydrolizat kazeiny otrzymany z kazeiny hydrolizowanej kwasem, 4) hydrolizat 'kazeiny hydrolizowanej kwasem

z

dodatkiem tiaminy i kwasu nikotynowego w

ilościach powyżej

podanych.

Podłoża

te rozlane po 150 ml do buteleczek

objętości

200 ml posiewano 1 ml 5-godzinnej hodowli na analogicznym

podłożu,· następnie

inkubo- wano w temp. 37° w atmosferze powietrza

z

dodatkiem 3O0/o C02.

Kontrolą były

posiewy na

półpłynnym podłożu

agarowym normalnie

używanym

przy badaniu gronkowców na

zdolność

wytwarzania entero- toksyny (4).

W

wstępnych

badaniach stwierdzono,

że

enterotoksyna na

podłożach

z hydrolizatem tworzy

się

powoli.

Wprowadzając

kotom normalnie stosowane dawki,

można ją było wykryć

w

przesączach

dopiero po 5 - 6-dniowej inkubacji i wobec tego do badania pobierano próby z 6-dniowych hodowli. Po oddzieleniu bakterii za

pomocą

wirowania

około

1 godziny przy

około

3 OOO obrotów na wirówce typu Wifug D, klarowany

płyn

znad osadu

sączono

przez filtr Seitza EK. W

przesączu

oznaczano hemolizyny, pH oraz przeprowadzano badania na

obecność

enterotoksyny,

wr,rowadzając

kotom 2 ml gotowanego

przesączu.

Wyniki podano w tabeli I.

Enterotoksyna

wytworzyła się

na wszystki, ch

użytych

do

doświad­

czenia

podłożach.

Narastanie enterotoksyny przy hodowli gronkowców na

podłożach :o

hydrolizatem kazeiny

było słabsze

i wolniejsze

niż

na

pół płynnym

agarze na bulionie. Hodowle . na agarze z bulionem

już

po

3 dniach inkubacji

powodowały

u kotów wymioty przy wprowadzeniu

0,8 - 1,0 ml

przesączu.

Dla

wywołania

reakcji za

pomocą

tej samej

ilości należało

gronkowce

hodować

na

podłożu

z hydrolizatem 5 - 6 dni.

250

M. Burbianka

Nr 3

Tabela I

Wytwarzanie enterotoksyny i hemolizyn przy hodowli gronkowców na ró:bnych

cpodłożach

1)

2)

3)

4) 5)

6)

Hodowle 6-dniowe w temp. 37°

··-·· ··-·-

Hemolizyny

Ilość M H D w 1 ml Entero-

Rodzaj podłoża

toksyna

I

pH końcowe

krwinki krwinki króiicze baranie

-

Hy,droliza:t kazeiny, kazeinct

hY'drolizowana kwasem

+

⁴⁰

^o

Jak 1)

+

t,iamina i kwas ni-

kotynowy

+

²⁰

^o

Hydrolizat kazeiny enzyma- tyczny

+

tiamina i kwas ni-

kotynowy

+

⁴⁰

^o

Jak 3)

+

^{0,25°/o glikozy}

+ ^{o o}

Jak 3)

+

0,5¹¹/o agaru -* ^10.

o·

+

⁴⁰

^o

Bulion

+

^{0,5#/o agaru}

+·

^{160 20}

+

^{160 20}

* -

^{wyniki dotyczą 3} dniowej hodowli.

+ -

wymioty u kotów przy wprowadzeniu 2 ml przesączu hodowli.

- - brak wymiotów przy wprowadzeniu 2 ml przesączu hodowli.

6,0

7,4

7,4 5,1 74 * 7,4 7,4 7,4

Silniejsze wytwarzanie enterot<Yksyny na

półpłynnym

agarze nie

było związane

z

obecnością

agaru w

podłożu, gdyż

dodatek agaru do

podłoża

z hydrolizatem nie

wpłynął pobudzająco

ani na wytwarzanie enteroto- ksyny, ani hemolizyn. Na

podłożach

z hydrolizat-em

wytwarzało się

bardzo

mało

hemolizyn, co znacznie

ułatwiało późniejsze strącanie

ente- rotoksyny. Hemolizyny nie

wytwarzały się

wcale w

obecności

glikozy.

Na

podłożu składającym się

z hydrolizatu enzymatycznego kazeiny z dodatkiem tiaminy i kwasu nikotynowego w zrost gronkowców

był

nieco lepszy

niż

na

pozostałych podłożach

bez glikozy. Wob-ec tego

podłoże

to

używano

w dalszych

doświadczeniach

do produkcji entero- toksyny. Gronkowce znacznie lepiej

rosły

w

obecności

glikozy,

jednakże podłoże ulegało

zakwaszeniu, co nie zawsze

było

wygodne przy

później­

szych pracach nad

zagęszczeniem

enterotoksyny.

Następne doświadczenia miały

na celu ustalenie, jak szybko narasta enterotoksyna

zależnie

od

ilości podłoża, objętości

naczynia i czasu hodowli. Badania te przeprowadzono

posiewając

gronkowce na

podłożu składającym się

z hydrolizatu enzymatycznego, tiaminy i kwasu niko- tynowego, które

były używane

stale do produkcji enterotoksyny w dal- szych

doświadcz.enia.

Podłoża

rozlewano: a) po 150 ml do butelek

objętości

200 ml, b) po

1 500 ml do butelek 2-litrowych. c) po 5 litrów do kolb 8-litrowych.

Nr 3 Enterotoksyna gronkowcowa

251 Do posiewu

używano 5-godzinną hodowlę

na tym samym

podłożu ,dodając

0,25 ml na

każde

100 ml

podłoża

i w

przesączu określano zawartość

hemolizyn i enterotoksyny.

Zależność

wytwarzania enterotok- syny

^zależnie

od czasu hodowli,

^{ilości podłoża}

i

^objętości

naczynia ilustruje tabela II.

Tabela II

Wytwarzanie enterotoksyny na podłożu z hydrolizatem enzymatycznym kazeiny

zależn'ie od czasu i objętości podłoża

Nr kolejny

doświad­

czenia

Objętość

naczynia w litrach

1 0,2

2 2,0

:3 8,0

4 8,0

. -- ---

I

Objętość podłoża

w litrach

-- ...

' 0,1

'

I

'

'

:

I

1,5 ^I

5,0 I I

i

I

I

5,0

i

I ! I

Szczep Nr 9

- --··· ---·-- -----· - ^_:_ __ . . . --- -. . - . -------.

Wyniki badania

Hemolizyny

Czas na kotach

Ilość MHD hodowli Dawka Liczba rea- w 1 ml w dniach wprowa- ^gująch/na Krwinki

liczbę królicze dzona -w ml _użytych

I

3 1,0 0/2 IO

4 1,0 0/2 10

5 0,75 1/2 20

1,0 1/2

6 0,5 1/2 40

0,75 2/2

6 0,85 0/2 10

7 1,0 1/2 10

8 0,8 1/2 40

9 0,5 2/2 40

5 2,2 0/3

o

6 2,2 2/2 10

7 1,1 0/1 20

2,0 2/2

8 1,8 1/2 20

9 1,0 0/2 20

1,5 2/2

Hemolizyny rozkładające krwinki baranie - nieobecne.

Najsz ybciej

wytwarzała się

enterotoksyna w

małych

butelkach, naj- wolniej w kolbach 8-litrowych

napełnionych

5 litrami

podłoża.

Przy

hodowli gronkowców w

dużych

naczyniach

enterotoksynę w podłożu można było stwierdzić

dopiero po 8 - 9 dniach hodowli,

wprowadzając

kotom

około

2 ml

przesączu.

Kontrola

różnych

partii wyprodukowanych w 8-litrowych kolbach enterotoksyny

wykazała, że

najmniejsza dawka enterotoksyczna 9-dniowych hodowli waha

się

w granicach 1,5 - 2,2 ml.

Ilości

wytworzonych hemolizyn

były nieduże,

hemolizyny

rozkłada­

jące

krwinki królicze rzadko

przekraczały

40 MHD

w

l ml

^podłoża.

-przesącze

nie

hemolizowały

wcale krwinek b ara nich.

252

^{i.VI. Burhianka Nr 3}

- 1

l

Wysalanie ,enterotoksyny za

siarczanu amonu

pomocą

Opierając się

na poprzednich

doświadczeniach

do produkcji entero- toksyny

używano podłoża składającego się

z hydrolizatu enzymatycznego kazeiny z dodatkiem tiaminy

i

kwasu nikotynowego.

Enterotoksynę

wysalano z 8 - 9-dniowych hodowli.

Każda

partia przed wysalaniem

była

sprawdzana na

obecność

enterotoksyny. Do wysalania

używano

tylko te hodowle, które

dawały dodatnią reakcję

na

enterotoksynę

przy wprowadzeniu

dożylnym

kotom 1,8 - 2,2 ml gotowanego

przesączu

hodowli.

Hodowle wirowano

około

1 godziny przy 3 OOO obrotów dla oddzielenia bakterii,

następnie płyn

znad osadu

sączono

przez filtr Seitza. O ile ente-

rotoksynę

wysalano z

kwaśnego środowiska

do odpowiedniego pH dopro- wadzano za

pomocą

HCl,

sprawdzając

pH potencjometrycznie . Po dodaniu odpowiedniej

ilości

siarczanu amonu i

dokładnym

wymieszaniu dla rozpuszczenia siarczanu amonu roztwór pozostawiano do

następnego

dnia w temp. 40.

Następnego

dnia

wytrąconą toksynę

oddzielano od

płynu

za

pomocą

wirowania. Zebrany na dnie lub

ściance

probówki osad rozpuszczano w zimnej wodzie destylowanej.

Następnie

roztwór przenoszono do wo- recz'ka celofanowego i dializowano

wodą destylowaną, ciągle ją

zmie-

niając

w

ciągu

3 - 4 dni w temp. 4°,

aż

do zaniku jonów SO

4•

W czask dializy toksyny

wytrącał się

brunatny osad. Po

ukończeniu

dializy

płyn

z woreczka celofanowego przenoszono do probówek do wirowania i od- wirowywano osad. Klarowany

płyn zawierający rozpuszczoną

entero-

toksynę

przenoszono do miseczki porcelanowej i suszono w eksykatorzP

próżniowym

nad P

2

O

5

w temperaturze pokojowej.

Otrzymaną

po wysuszeniu

toksynę

przechowywano w eksykatorze

próżniowym

nad P

₂

O

_{4 .} Ponieważ okazało się, że

toksyna w ten sposób przechowywana jest

nietrwała,

w niektórych

doświadczeniach później­

szych roztwór toksyny po

ukończeniu

dializy

zamrażano

i przechowywano w temp. -200.

Przy wysalaniu entoerotoksyny za

pomocą

dodatku 37,7

¹

'/o siarczanu amonu, co stanowi 500/o wysycenia, otrzymano bardzo

mały strąt.

Po odwirowaniu

ilość

jego

była

nieznaczna. Wysalanie za

pomocą

dodatku 56,50/o siarczanu amonu, co

stanowiło

750/o wysycenia ,

powodowało wytrącenie większej części

enterotoksyny. Dodatek 75,40/o siarczanu amonu, co

odpowiadało

1000/o wysycenia,

powodował wytrącenie się całej

enterotoksyny.

Płyn pozostały

po odwirowaniu

wytrąconej

za

pomocą

1000/o wysycoenia toksyny, przedializowany w celu

usunięcia

siarczanu amonu,

zagęszczony

w

próżni

nad PzO

5

w temperaturze pokojowej i zbadany na

obecność

enterotoksyny ni,e

wywoływał

reakcji u kotów, nawet przy wprowadzeniu dawek

odpowiadających 50

ml pierwotnego

przesączu.

Jest to zgodne ze

spostrzeżeniem

BergdoLla

i

wsp. (1).

Przy 75°/ o-owym wysyceniu siarczanem amonu enterotoksyna wy-

trącała się

w postaci

żółtawych kłaczków,

przy 1000/o wysyceniu

strąt wytrąconej

toksyny

przedstawiał drobnoziarnistą zawiesinę

w czasie wirowania

opadającą

na dno probówki.

Na powierzchni odwirowanego

płynu występował

zwykle

nieduży

brunatny zbity cienki

kożuszek

niekiedy

pływajacy

w postaci wyser,ek.

j 1

'j

l

_I

Nr 3 Enterotoksyna gronkowcowa

253

Kożuszek

ten oddzielono od

płynu

i zbadano osobno.

Rozpuszczał się

on

łatwo

w wodzie destylowanej na zimno. Nie

wykazał

ani

obecności

hemolizyn, ani enterotoksyny.

Strąt

odwirowanej,

znajdującej się

na dnie naczynia toksyny roz-

puszczał się łatwo

w wodzie destylowanej na zimno lub w roztworze fizjologicznym soli. W czasie dializy,

którą

prowadzono

wodą

destylo-

waną, wytrącało się

nieco brunatnej zawiesiny, która

była

tym

większa,

im

dłużej trwała

dializa.

Zawiesina ta

zawierała

w niektórych wypadkach pewne

ilości strąco­

nych hemolizyn oraz - jak stwierdzono

doświadczalnie

-

pewną ilość

enterotoksyny w formie

mało

rozpuszczalnej w wodzie.

Zawiesinę

odwirowano,

przepłukano

roztworem fizjologicznym soli,

następnie

zawieszono w

jałowym podłożu

z hydrolizatu kazeiny w sto- sunku 1

część

osadu na' 100

części podłoża.

Po kilkukrotnym

wstrząs­

nięciu

pozostawiono na 24 godziny w

chłodni. Następnego

dnia odwiro- wano nie rozpuszczony osad.

Płyn

znad osadu wprowadzony kotom w

ilości

2 - 3 ml

wywoływał

u niektórych wymioty.

Wysuszona w

próżni

nad P

205

toksyna

miała wygląd

ciemnobrunatnego

dosyć

higroskopijnego proszku.

Świeżo

wy,produkowana sucha toksyna

łatwo się rozpuszczała

na zimno w wodzie destylowanej lub izotonicznym roztworze soli. W

miarę

przechowywania

rozpuszczalność

toksyny

się zmniejszała.

Równolegle

zmniejszała się

jej

aktywność.

Otrzymane pre- paraty suchej toksyny

wykazywały

czasem

ślady

hemolizyn, szczególni·~j gdy toksyna

była

wysalana siarczanem amonu przy pH 7 ,4. Toksyna wysalana przy pH· 5,5 nie

wykazywała właściwości

hemolitycznych.

Roztwory oczyszczonej toksyny nie

koagulowały

plazmy ludzkiej ani króliczej i nie

wykazywały właściwości

hemaglutynacyjnych w stosunku do krwinek króliczych lub baranich.

Przy

określaniu

najmniejszej dawki enterotoksycznej w otrzymy- wanych przy

zagęszczaniu

toksyny preparatach, wprowadzano kotom

doży

lnie

różne ilości

toksyny rozpuszczonej w roztworze izotonicznym NaCl. W

początkowych doświadczeniach

roztwory te przed wprowadze- niem kotom ogrzewano 30 minut w temp. 100°, podobnie jak przy badaniu

przesączów

hodowli.

Ponieważ

koty nie

chorowały

nawet przy wprowadzeniu

dużych

dawek przypuszczano,

że

enterotoksyna nie

strąciła się

lub

uległa

w czasie wysalania inaktywacji. Wobec stale

powtarzającego się

braku dodatnich wyników przy

różnym

sposobie wysalania, postanowiono

przeprowadzić

równolegle próby z nie ogrzewanymi roztworami suchej enterotoksyny.

Okazało się, że

brak dodatnich wyników

był

spowodowany

szybką inaktywacją

oczyszczonej enterotoksyny w czasie ogrzewania.

Roztwory suchej toksyny po 30-minutowym gotowaniu nie powod-::i-

wały

wymiotów u kotów, podczas gdy te same roztwory nie ogrzewane

powodowały

u kotów objawy zatrucia. Wobec tego w dalszych

doświad­

czeniach przy

określaniu

najmniejszej dawki enterotoksycznej wprowa- dzano kotom stale nie ogrzewane roztwory suchej toksyny.

^Przykłady

oznaczania najmniejszej dawki enterotoksycznej podano w tabeli III.

Niektórzy autorzy

zwracają uwagę, że nieswoistą reakcję

u kotów

mogą wywołać

czasem beta-hemolizyny,

jeśli się

wprowadza

dożylnie

nie ogrzewane

przesącze

hodowli. Po 30-minutowym ogrzaniu w temp.

100°, nawet silne beta- hemolizyny nie

wywołują

reakcji u kotów (5, 15).

254

M. Burbianka

Nr 3

Tab e 1 a III

.Reakcja kotów na różne ilości wrprowa<lzanej dożylnie enterotoksyny. Enterotoksyna

strącana (NH_{4) 2}S04, dializowana i wysuszona w próżni

===,=c====== ==~~, ,= --- - - --·-· ---·· ----

Szczep i--D-a_w_-~_i_m_to_:_s_yn_y _ _

o,o:

^{0,04- 0,06- 0,08 - 0,1}

1_:_

nr 9 Liczba kotów reagu-

jących/na liczbę ko-

tów użytych 1/4 1/4 1/4 1/4 3/4 3,4

- - - - 1 - - - -- - - - --

Szczep nr 4074

Dawka toksyny w mg 0,15 0,30 0,50 0,89

, _________

- - - -- -- - Liczba kotów reagu-

jących/na liczbę ko-

tów użytych 1/6 3/8 6/8 ^3/3

Roztwory suchej enterotoksyny w

rozcieńczeniu,

w którym

były

wpro- wadzane kotom, nie

wykazywały obecności

beta-hemolizyn i nie hemoli-

zowały

lub w bardzo

słabym

stopniu krwinki królicze.

Należało więc przypuszczać, że

nie

będą

one

mogły powodować

nieswoistych reakcji

wywoływanych

przez nie ogrz.ewane beta-hemolizyny.

Dla sprawdzenia czy w wysolonej enterotoksynie

mogą być

poza ente-

rotoksyną jakieś

czynniki

dające

przy wprowadzeniu

dożylnym podobną reakcję

jak enterotoksyna, przeprowadzano

kontrolę

ze szczep€m nie

wytwarzającym

enterotoksyny.

Przesącz

hodowli tego szczepu przed wysoleniem siarczanu amonu

wykazywał

takie same

ilości

hemolizyn, jakie

występowały

w hodowlach szczepów enterotoksycznych.

Rozkładał

krwinki królicze w

rozcieńczeniu

1/ 20 - 1 / 40, na baranie

działał

tylko bez

rozcieńczenia.

Otrzymany po wysoleniu siarczanem amonu osad.

rozpuszczony w wodzie destylowanej i podany dializie podobnie jak przy

wytrącaniu

enterotoksyny, nie

powodował

wymiotów u kotów , pomimo wprowadz-enia

większych ilości niż

zwykle stosowano przy enterotok- synie.

W dalszych

doświadczeniach

przeprowadzano próby wysalania entero- toksyny przy

różnym

pH. Porównano wyniki otrzymywane przy wy- salaniu enterotoksyny przy pH 4,0; pH 5,5 i pH 7,4. Sprawdzono

również,

czy

istnieją różnice

w

aktywności

toksyny wysalanej za

pomocą

75°/ n i 100

¹¹

/o wysycenia przy wymienionych pH.

Wyniki przeprowadzanych

badań przedstawiają średni

wynik z kilku partii

wytrącanej

toksyny. Liczby

są

zebrane w tabeli IV.

Aktywność

toksyny otrzymanej za

pomocą

wysalania przy pH 5,5 i 7,4

mało się między sobą różniła.

Toksyna wysalana z

pomocą

75°/o wysycenia siarczanem amonu

wykazywała

nieco

większą aktywność niż

toksyna wysalana za

pomocą

100°/o wysycenia. Najmniejsza dawka enterotoksyczna preparatów otrzymanych za

pomocą

75¾ wysycenia przy pH 5,5

i

7,4

wahała się około

0,08 mg. Przy wysalaniu za

pomocą

100°/o wysycenia

około

0,1 mg. Pojedyncze koty

reagowały

na 0,02 mg suchej toksyny, a nawet w jednym wypadku

wywołano reakcję

u kota przy wprowadzeniu 0,0075 mg suchej toksyny.

Większą ilość

toksyny

otrzymywało się

przy wysalaniu przy pH 5,5

niż

przy pH 7,4 ..

Ilość

otrzymywanej suchej toksyny z 1 litra hodowli

Nr 3

Enterotoksyna gronkowcowa

255

przy

100°/o

wysycenia siarczanem amonu przy pH 5,5

wynosiła średnio około

70 mg, przy pH '7,4

około

50 mg. Strata toksyny w przeliczeniu do

przesączu wyjściowego wahała się

w granicach

^około

40 - 500/o.

W toksynie suchej

wytrącanej

przy 750/o wysycenia

zawartość

azotu ogólnego

była

nieco

wyższa niż

w toksynie

wytrąconej

przy 10O0/o wysy- ceniu (tabela IV).

Ta be 1 a IV

Wysalanie enterotoksyny siarczanem amonu Szczep nr 9

Toksyna po wytrąceniu dializowana i suszona w próżni

Nr kolejny

doświad­

czenia

2

3

4

5

6

Sposób zagęszczania

1oksyny

I

^pH 4,0 100¹'/o wysycenia (NH_{4) 2}SO4

pH 5,5 75% wysycenia (NH_{4) 2}SO₄

pH 5,5 1000/o wysycenia

(NH_{4 ) 2}SO₄

pH 7,4 75¹¹/o wysycenia (NH,hSO"

pH 7,4 1000/o wysycenia (NH₄}iSO₄

a) pH 3,0 strącono za

pomocą HCl b) ,płyn znad osadu a)

zobojętniony do pH 7,2 i wysolony (NH_{4) 2}SO4

100'¹¹/o wysycenia

Najmniejsza ilość

toksyny w mg

powodująca re-

akcję u 50% kotów

>0,24

0,08

10,

0,08

0,1

0,05

%N

w suchej toksynie

9,38

12,6

11,7

12,34

11,4

13,55

Na

ogół

przy

wytrącaniu

siarczanem amonu

aktywność

ostatniego produktu

była uzależniona

od okresu

wytrącania

toksyny po

ukończeniu

hodowli.

O

ile ze

względów

technicznych

przesącz

hodowli pozostawiono na 1 - 2 dni w temp. 4° i po tym czasie wysalano,

wytrącały się

jeszcze

jakieś

uboczne substancje. Ogólna

ilość strątu była większa,

lecz ostateczny produkt

był

znacznie mniej aktywny.

Wysalanie enterotoksyny przy pH 4,0 nie

dało

dobrych wyników.

Po

wytrąceniu,

dializie

i

wysuszeniu otrzymano znacznie

więcej

osadu

niż

przy wysalaniu przy pH 5,5 i pH 7,4 -

średnio około

150 mg z jed- nego litra hodowli. Otrzymany preparat

miał wygląd

brunatnego

błysz­

czącego

proszku,

różnił się

swym

wyglądem

od toksyny wysalanej przy

pH 5,5 i pH 7,4, która

była

bardziej szaromatowa. Otrzymana substancja

nie

była

aktywna. Nawet wprowadzenie dawki 0,24 mg nie

wywołało

256

^{M. Burbianka}

Nr 3 wymiotów u kotów. Preparat ten

wykazywał mmeJszą zawartość

azotu ogólnego

niż

otrzymane toksyn y przy wysalaniu przy pH 5,5 i pH 7,4.

Było interesujące

czy dwukrotne wysalanie siarczanem amonu

będzie miało jakiś wpływ

na oczyszczanie toksyny.

Okazało się

jednak,

że aktywność

enterotoksyny jednokrotnie wysalanej i dwukrotnie wysalanej

była

taka sama.

Bergdoll (1)

wytrącał enterotoksynę

za

pomccą

zakwaszania kwase m solnym do pH 3,5.

Otrzymał

on

mocną toksynę,

lecz

wydajność była mała. Probując

w

doświadczeniach własnych wytrącać enterotoksynę

za

pomocą

kwasu solnego zaobserwowano ,

że

przy zakwaszaniu do pH 3,0

wytrąca się

bardzo

dużo

osadu, który zawiera

między

innymi entero-

toksynę,

lecz

większa część

enterotoksyny pozostaje w roztwmze. Roz- twór ten postanowiono

wykorzystać

do otrzymania bardzie j oczyszczo- nych preparatów suchej toksyny.

Przesącz

hodowli zakwaszano HCl do pH 3,0

i

pozostawiano do na-

stępnego

dnia w

chłodni

w temp. 4°. W

przesączu wytrącał się kłaczko­

waty

strąt. Strąt

ten odwirowywano

wirując około

1 godziny prz:7

około

2 500 obrotach. Na dnie probówki

zbierał się ciężki kłaczkowaty

osad. Barwa jego

była biała

z lekko

żółtawym

odcieniem , odmienna od

wyraźnie

brunatnego osadu, otrzymywanego przy

wytrącaniu

s iarczanem amonu . Po oddzieleniu za

pomocą

wirowania

wytrąconego

przy pH 3,C

strątu, pozostały płyn

doprowadzano za

pomocą

100/o-owego

ługu

sodo- wego do pH 7,2

i

dodano siarczanu amonu do

całkowitego

wysyc enia, co

spowodowało wytrącenie się

obecnej w roztworze enterotoksyn y.

Po dializie

i

wysuszeniu

wykazywała

ona

większą aktywność niż

toksyna

wytrącana

siarczanem amonu

bezpośrednio

z

przesączów

hodowli. Naj- mniejsza dawka enterotoksyczna

wynosiła

0,05 mg.

Zawartość

azotu ogólnego w otrzymanym preparacie

była wyższa niż

w poprzednio otrzymanych preparatach,

wynosiła

13,550/o (tabela IV). Jednak

ilość

otrzymanej

tą metodą

toksyny

była

znacznie mniejsza

niż

przy bezpo-

średnim wytrącaniu

siarczanem amonu,

ponieważ część

enterotoksyny

znajdowała się

w osadzie

wytrąconym

za

pomocą

kwasu solnego . W p

ł

YI w r

ó ż

n y c h c z y n n i k ó w n a z _a g

ę

s z c z o n

ą

i oczyszczoną enterot o ksynę

W p

ł

y w t e mp e r a t u r y. W czasie

badań

przeprowadzonych z

zag~szczoną enterotoksyną

stwierdzono ,

że

toksyna, otrzymana za

pomocą wytrącania

siarczanem amonu i oczyszczona za

pomocą

dializ:,7, inaktywuje

się

po 30-minutowym ogrzewaniu w temp. 100°. T ymczasem wiadomo,

że występująca

w

przesączach

hodowli gronkowców entero- toksyna wytrzymuje 30-minutowe, a nawet 60-minutowe ogrzewanie, a jak podaje Dack (7) w

doświadczeniach

Jordana i wsp. 20-minutowe ogrz.ewanie w temp. 120°

powodowało osłabienie aktywności

enteP)- toksyny, lecz nie

była

ona

całkowicie

zniszczona .

Było interesujące,

jaka jest

wytrzymałość

enterotoksyny na krótszy okres ogrzewania w temp. 100° oraz na

niższe

temperatury. W t y.m celu wodny roztwór oczyszczanej enterotoksyny ogrzewano w

łaźni

wodnej w temp. 100° i 60°;

różnym

okresie czasu .

.

Okazało się, że

oczyszczona enterotoks yna ulega inakty wacji

już

przy IO-minutowym ogrzewaniu zarówno w temp . 100°, jak

również

w temp. 60°.

Nr 3

Enterotoksyna gronkowcowa

257 Jakie czynniki

warunkują oporność

na ogrzewanie surowej toksyny,

występującej

w

przesączach

hodowli gronkowców,

dotąd

ni,e wiadomo.

Możliwe, że występuje

ona w postaci

jakichś połączeń

kompleksowych, które

zostają

rozbite podczas jej

zagęszczania

i dializy.

D z i a

ł

a n i

e

p e p s y n y i t r y p s y n y. W

piśmiennictwie

;;potykamy

się

ze sprzecznymi wynikami

dotyczącymi działania

pepsyny

i

trypsyny na

ent,erotoksynę. Dotyczyły

one

przeważnie

enterotoksyny

znajdującej się

w

przesączach

hodowli.

Według

Minetta (12) enterotok- syna jest

rozkładana

przez

trypsynę.

Davison (8) podaje,

że rozkłada ,)ą

pepsyna. Hamrnon

(11)

twieridzi,

że

jest ona oporna na

działanie

pepsyny i trypsyny. Bergdoll (1) we

wcześniejszych

pracach podaje,

że

trypsyna powoduje

obniżenie aktywności

konoentrowanej

czt;ściowo

oczyszczonej enterotoksyny w

późniejszych· (2) zaś, że

jest ona oporna na

działanie

trypsyny.

W celu ustalenia

własnego poglądu

na to zagadnienie postanowiono

przeprowadzić doświadczenie

z

enterotoksyną oczyszczoną.

Trawienie

pepsyną

przeprowadzano w temp. 37° przy pH 2,0 zakwa-

szając

kwasem solnym. Do 10 ml roztworu wodnego toksyny

zawierają­

cego 1 mg suchej toksyny w 1 ml roztworu dodawano 1 ml - 1'0/o-owego roztworu wodnego aktywnej pepsyny i po doprowadzeniu do pH 2,0 pozostawiano na 24 godz. w temp. 37°. Jako kontrola

służył

ten sam roztwór enterotoksyny zakwaszonej do pH 2,0 oraz bulion podobnie jak roztwór toksyny trawiony

24-godzinną pepsyną.

Przed wprowadzeniem

dożylnym

kotom badane

płyny

doprowadzano za

pomocą ługu

sodowego do pH 7,2.

Przy trawieniu

trypsyną

do

10

ml roztworu toksyny, taki-ego jak

używano

przy trawieniu

pepsyną,

dodawano 1 ml - 1°/o-owego roztworu aktywnej trypsyny, doprowadzano do pH 8,0. Dla zahamowania wzrostu bakterii dodawano 1

krnplę

chloroformu. Trawienie przeprowadzono w temp. 37° w

ciągu

24 godz. Jako kontrola

służył

roztwór enterotoksyny zalkalizowany do pH 8,0 oraz bulion trawiony

trypsyną.

Po 24 godz.

płyny

doprowadzano do pH 7,2 i wprowadzano kotom.

Pepsyna

Trypsyna

Tabela V

Wyiniki trawienia enterotoksyny pepsyną i try:psyną

Enterotoksyna trawiona

pepsyną.

Enterotoksyna po 24 godz.

w temp. 37° przy pH 3,0.

Bulion trawiony pepsyną.

Enterotoksyna trawiona

trj'ipsyną.

Enterotoksyna po 24 godz.

w temp. 37° przy pH 8,0.

Bulion trawiony trypsyną.

Ilość wprowadzonego Liczba kotów rea- roztworu enteroto- gujących (na liczbę

ksyny w ml kotów użytych

0,55 2/3

0,55 2/2

0,25 1/2

0,7 0/2

0,25 2/2

0,25 2/2

0,25 0/2

258

M. Burbianka

Nr 3

Przeprowadzone badania

wykazały, że

ani trypsyna, ani pepsyna nie

rozkładają

ent,erotoksyny.

Wyniki podano w tabeli V.

W p

ł

y w p r z e c h o w y w a n i a.

Kontrolując

co pewien czas

aktywność

otrzymanych preparatów oczyszczon,ej suchej toksyny, stwier- dzono,

że

okres

aktywności

enterotoksyny

był zależny

od sposobu jej przechowywania. Oczyszczona sucha toksyna przechowywana w tempe- raturze pokojowej w

próżni

nad P

2

0

5 dosyć

szybko

ulegała

inaktywacji.

Równocześnie

bardzo

się zmniejszyła

jej

rozpuszczalność

w wodzie lub roztworz,e fizjologicznym. Roztwory toksyny wodne lub w roztworze fizjologicznym NaCl przechowywane w

chłodni

w temp. 4°

traciły swą aktywność

po bardzo

różnym

czasie - od kilku do

30

dni. Najlepiej

się przechowywały

wodne rozwtory toksyny

zamrożone

do minus 20°,

chociaż

po 13

miesiącach

przechowywania

aktywność

ich nieco

się zmniejszała

(tabela VI).

Tab e 1 a VI

Wpływ i;,posobu przechowywania na trwałość enterotoksyny

Ehterotoksyna nieoczyszczona w go- towanym przesączu hodowli . . • Roztwór wodny toksyny zagęszczo­

nej i oczyszczonej .

Toksyna oczyszczona sucha prze- chowywana w próżni nad P₂05 . .

Roztwór wodny toksyny oczyszczo- nej

+20° do 25°

-20°

Okres aktywności

enterotoksyny

Ilość dni

5 - 40

5 - 30

Po 25-60

zmniejszyła się roz-

puszczalność i aktyw-

ność.

13 miesięcy, dalej nie badano, aktywność nie- co się zmniejszyła.

Toksyna zagęszczona

dializy.

oczyszczona za pomocą wytrącania siarczanem amonu

WNIOSKI

Do produkcji enterotoksyny w celu dalszego

J€J zagęszczania

i oczy- szczania nadaje

się

zmodyfikowane

podłoże

Favorite'a i Hammona

skła­

dające się

z hydrolizatu enzymatycznego kazeiny, kwasu nikotynowego

i

chlorowodorku tiaminy.

Szybkość

narastania enterotoksyny na tym

podłożu

jest

zależna

od

objętości podłoża

i naczynia, szybciej

się

wytwarza przy

małych objętoś­

ciach

podłoża.

Za

pomocą

wysalania siarczanem amonu z

przesączóv,r

hodowli, a

następnie

dializowania

wodą

otrzymywano preparaty za-

gęszczonej

i

częściowo

oczyszczonej enterotoksyny.

Nr 3

Enterotoksyna gronkowcowa

259

Znaczna

częsc

enterotoksyny wysala

się

przy 750/o wysycenia siarcza- n€m amonu, przy 1000/o wysycenia enterotoksyna

wytrąca się całkowicie.

Dobre wyniki otrzymuje

się

przy wysalaniu enterotoksyny siarczan€m amonu przy pH 5,5 i 7,4,

jednakże

przy

wytrącaniu

za

pomocą

750/o wysycenia

aktywność

suchej enterotoksyny jest nieco

większa niż

przy wysalaniu za

pomocą

1000/o wysycenia.

Wysalając enterotoksynę

za

pomocą

75'0/o wysycenia siarczanem amonu przy pH 5,5 i 7,5

można było otrzymać suchą toksynę,

która

działała

na koty przy wprowadzaniu

dożylnym

0,08 mg. Wysalanie siarczan€m amonu przy pH 4,0 nie

dało

dobrych wyników.

Najbardziej

aktywną toksynę

otrzymywano, gdy

przesącz

hodowli zakwaszano do pH 3,0 za

pomocą

HCl i po wydzieleniu

wytrąconego

osadu,

enterotoksynę wytrącano

z

pozostał€go przesączu

za

pomocą

1000/o wysycenia siarczanem amonu. W ten sposób

można było otrzymać suchą toksynę,

która

powodowała reakcję

u kotów przy

dożylnym

wprowadzeniu 0,05 mg.

Wrażliwość

na

działanie

temperatury

zagęszczonej

i oczyszczonej ente- rotoksyny jest znacznie

większa niż

enterotoksyny surowej (natywnej).

Enterotoksyna

znajdująca się

w

prz€sączach

hodowli jest oporna na ogrzewanie. Toksyna oczyszczona ulega inaktywacji po 10 min. ogrzewa- nia

w

temp. 100°, jak

również

60°.

Enterotoksyna oczyszczona nie j€st

rozkładana

ani przez

pepsynę,

ani przez

trypsynę.

Trwałość

suchej enterotoksyny przy przechowywaniu w

próżni

jest nie

duża.

Toksyna szybko ulega inaktywacji. Najtrwalsza

była

toksyna przechowywana w postaci roztworu wodnego

zamrożonego

do minus 20°.

M. E y ,p 6 ,1 H Ka

CfYlllAI-H1E H LJACTvIqI !Ml OLJvlCTKA CTA<l>vlJlOKOKKOBOfO 31-ITEPOTOKCHHA

Co,1ep,Ka1111E-

Tipo.'1,('.TT,IHbl HC'CJl(',1_01Wlll!51 OTHOC'HTeJlbllO cry111a111151 li 'laCTl·!'-IHOH QlJJ!CTK'II CTa·ljl!I.TTOKOK- hOBOrO 311TepOTOKl:llllil. 311T{'p0TOKCHIH OC3-IK.laJIH np1-1 IIOMOW.H ·113-CbllllCHJISl pacrBOp3 CCj}HlłCTl,IM aMMOllll(':11 np11 pi!3Jlll'll!b!X pl-I H pa3„1!l'-IH()ii CT•ef!CHH H3CblW.CH'l!51. Jl,m1 npo- i\YKU-HH 3HTC,POT0Kl'll-llil l!OJJb:JOBa,'1%Cb MO.iUHjJHK31\HOHHOH flHTaTemmoii -cpenof1 Favorita

M Hammona. :1KCfl('flll,M('IITaJ!bl!blMH ,l(llBOTHb!MII Ób]JJ:I KOlllKII, K01'0pbL11 !B:BO,'\'H,111 4C'j)C3 il<Jrny cry111cm16IC ll)l('T!,lpiiTl,I OCillK.U<'HllOfO 11 ,1H,rnll30Bal!l!Of0 3HTCj)OTOKCHHa. EoJiblllilll 'li!Cfb 3HTCjlOTOKOHHa OCiliK.'\,lJlilCb npH l!O~IOll\11 750/o IJii!CblIJJ.ffill!51 cepH'-HCTbl.M aMMOHHC~,t - · BCCb ~IIT0j)OTOl{Cl1:II lljlll 10()11/,J 11aCbll!\{'fllHI. Ocam,1ełrHC 3HTt''))0TOKCMHa ce,pI!HCThl\1 aMMOHHeM n:pH pH fi,5 H pH 7,4 ,'\aB,IJIO CXOll:Hhie pe3yJJhT3Tbl.

Tipe,na.p;nbl no.;1y'lOll1lhlC np,H 75°/o -H<!Cbllll.CH!l,H ÓbJ.qJI 6<rnce aKTIIBllbl li BsHlllJIH !l'l' KOlUK,lf npll :1.0:iax 0,08 Mr cyxoro 3'HTCpOTOl{Clllla. Oca/K,Qe-Hne np-11 pH 4,0 HC ,1.313aJ!O xopo11rnx pe3yJJi,T3TOB. C,lMb!H aKTHBJ!blH 3HTl',POTOKCHH flOJJYlllWII npHMC,Hllll KOMÓ>lHH·pO- na11HblH cnocoó rn:am:1c,:1Hll. Cua,l!aJJa <jJHJlbTj)3T C 3JITepOTOKCHIIOM HO,QKHCJIHJJH flj)H nOMOU\11 COJJ51JIOH K'IICJH)Tl,I Jl.O pl-I 3,0 11 noc.qc OT,'1,ea1Cl!IHH oca,QKa OT OCT3Bll1C'T0Cll <jl,HJlbT- paTa, OCćllK113Jf!Jl 311TC'j)OTOKC-H'll Hj)H flOMOW.H ] OOO/o H3'Cblll\eHJISl cepHHCTblM 3MMOIH'l1e,w.

Kom1e1rrp11posa11111,1ii 1-1 tmcTH'-1110 ot1111L1.eH1161i\ 311TcporoKc.11~1 6hIJI He croii.,KHM Ha t1.ei'1CTB1+e TCMncp;nypbl Il 110:lBl'praJJCH ·HH3KTHBH381\HH nocJJe ,a.eC·flTH ,MHHY'PH<Ol'O Har,peBalll!H ,10

100 li ,'1,i\,KC 60°. On IIC 110A.t1a1JaJJCH ,QeiiCTBHIO 'f,JYHflCHHa H nenc.rnia. Cyxoi-i KQiHUC'IITp11-

260

^{M. Burbianka}

Nr 3

poBaH'llblH 311TepoTOKCHH x.paHHMblH B lcHIKYYMt" O4Cllh CKOpo '1O.'llll'pra.:1CH !1,H3Kl'HBU:lilUHII. Ca•MblM Y,CTOH4!1.BbflM 6bUI 3HTe<pOTOKCIIJ! xpa-HIIMblH •B BO!\'11O\1 pa-cnnre 3il\lO'jlO}K('Jl\llblcl JlO 2QO,

M. B u r b i a n k a

CONDENSATION AND PARTIAL PURIFICATION OF STAPHYLOCOCCAL ENTER OTO XI N

Summary

Trials of condensation and partial purificabon of staphylococcal enterotoxin were carried out. Enterotoxin was salted out by means of ammonium sulphate at different pH and at different degree of sa·turation. Favor~te and Hammon's modified medium was employed for the production of the enterotoxin. Cats used as experimental anima1s received 'intravenously concentrated preparations of predpitated and dialyzed enterotoxin. Majority of enterotoxin salted out at 750/o saturation by ammonium sulphate, entire enterotoxin at 1000/o saturation. Salting out of enterotoxin by means of ammonium sulphate at pH 5.5 and pH 7.4 yiekled similar results. The preparations obtained by means of 750/o saturation were .a bit more active, they acted upon cats in a dose of 0.08 mg dry enterotoxin.

Sa1ting out at pH 4.0 did not yield favorable results. The most active enterotoxin was obtained when a combined method of precipitation was used. At first the culture filtrate was acidified u,p to pH 3.0 by means of HCI, after the separation -of the prodced sediment, from the reemaining fi!trate enterot·oxin was precipitated by means of 1000/o saturaition with ammonium suLphate. Concentrated and partly purified enterotoxin was sensit'ive to the action of temperature, after 10 minutes heating at lOOoC and 60°C it became inactivated. It was not decomposed by trypsjn or pe,psin. Dry concentrated enterotoxin stored in vaccum became inacti- vated in a very s'hort time. The enterotoxin stored in the form of aqueous solution frozen to -20°C proved to be best.

PIŚMIENNICTWO

1. BergdoH M. S., Kadavy I. L., Surgalla M. J., Dack G. M.: Archiv Biochem.

Biophysics, 33, 259, 1951. - 2. BergdoU M. S.: Am. N. Y. Acad. Sc., 65, 139, 1956. Cyt. Bull. Inst. Pasteur 55, nr 12, 3634, 1957. - 3. BergdoU M. S., Lavin Barbara, SurgaUa M. J., Dack G. M.: Science, 116, 633, 1952. - 4. Burbianka M., Pliszka A., Tworek R.: Roczniki PZH, 3a, 355, 1953. - 5. Burbianka M.: Acta Microb. Polonica, 5, 245, 1956. - 6. CostLow R., Cone F. J., Garey J.: Bact. Proc. Soc. Am. Bac,teriolo- gists, 18, 1952. - 7. Dack G. M.: Food poisoning. Wyd. The University of Chicago Press, 1949. - 8. Davison E.: Doc-toral diss. University of Chicago 1954. Cyt. wg Dacka 115, (,poz. 7). - 9. Davison E., Dack G. M.: J. Infect. Dis., 62, 302, 193\l, cy,t. wg Dacka 114 (poz. 7). - 10. Favorite G. O., Hammon W.: J. Bact., 41, 3, 305, 1941.

11. Hammon W.: Cyt. wg Dacka, 115 (ipoz. 7). - 12. Minett F. C.: J. Hyg., 38, 623, 1938. - 13. Pliszka A.: Acta 1\/licrobiologica Pol., 5, 253, 1956. - 14. Rzymowska Cz., Bernstein I., ·Grochowska H.: Roczni/ki PZH, 1, 1, 1953. - 15. SurgaHa M . . J.:

A. J. Infect. Dis., 81, 97, 1947. - 16. Surgalla M. J., Kadavy J. L., Bergdoll M. S., Dack G. M.: J. Infect. Dis., 89, 180, 1951.

Otrzymano: 29.IV.1959 r.

Adres aut,ora: Warszawa, ul. Chocimska 24 PZH.