PROSTA KOLORYMETRYCZNA METODA OZNACZANIA SZCZAWIANÓW W MOCZU

(1)

DIAGN. LAB., 1982, XVIII, 4

MICHAŁ ROZENTAL, LESZEK TOMASZEWSKI, HANNA ZBOROWSKA *

Z Zakładu Analityki Klinicznej Instytutu Biofarmacji A.M. w Warszawie Opracowano modyfikacje metody oznaczania szczawianów w moczu opisanej przez Hodgkinson i Williams (9). Jony C;042 są wytrącane z moczu w postąci trudnorozpuszczalnej soli wapniowej, redukowane do turze 190—-195°C,

Dzięki pedwyższeniu temperatury, dwukrotnie skrócono czas ogrzewania w porównaniu z oryginalną metodą. ‘

Przebadano wydalanie szczawianów w dobowym moczu dzieci zdrowych, z chorobami dróg moczowych oraz u zdrowych dorosłych.

Proponowana metoda jest prosta, szybka w wykonaniu, czuła, precyzyjna i specyficzna, Nadaje się do rutynowego stosowania.

WSTĘP

Szczawiany są stałymi składnikami moczu. Ludzie dorośli, zarówno mężczyźni jak i kobiety, wydalają podobne ilości szczawianów — 17—43 mg/24 h (średnio 31 mg na dobę) zaś dzieci w wieku 3—13 lat 8—36 mg/24 h (średnio 17 mg na dobę) (9).

W hiperoksalurii wydalanie szczawianów może dochodzić nawet do 650 mg na dobę (14). Może ona mieć charakter wrodzony i nabyty. Rozróż- nia się dwa typy pierwotnej hiperoksalurii. Typ pierwszy polega na braku swoistego enzymu — karboligazy 2-oksy-glutarowo-glioksalowej na skutek czego nagromadzą się w moczu metabolity przedblokowe: kwas szczawiowy i glikolowy (3, 7, 8). Drugi typ polega na braku dehydroge- nazy D-glicerynianowej z postulowaną jednócześnie dla tego enzymu ak- tywnością reduktazy glioksalowej. W moczu wydalają się duże ilości szczawianów i kwasu D-glicerynowego. Glicynuria z kamicą szczawianową de Vriesa jest również wadą meta- , boliczną, dziedziczną polegającą na nadmiernym wydalaniu glicyny z moczem przy jednoczesnym występowaniu kamieni szczawianowych w ner- kach. Kamica szczawianowa stanowi 30—65%/, wszystkich kamic nerko- wych.

Hipooksaluria — była opisywana w wadzie metabolicznej przemiany glicyny — hiperglicynemii z hipooksalurią (16).

Oznaczanie wydalania kwasu szczawiowego w moczu posiada więc znaczenie kliniczne. Pomiar wydalania tego związku w moczu był bada- niem dotychczas niepopularnym i niezbyt często wykonywanym ze względu na długotrwałą i skomplikowaną procedurę. Dotychczasowe metody można podzielić na miareczkowe (1, 5, 15), kolorymetryczne (4, 10), enzymatyczne. (6, 11, 12, 13) oraz chromatografii gazowej (2).

ыы Centraine Laboratorium CSK nr 1 w Warszawie.

(2)

138 M. Rozentat | Nr 4

Metody kolorymetryczne były połączone z. wielogodzinną ekstrakcją eterem etylowym lub trójfosforanem n-butylu. Wyizolowany z moczu kwas szczawiowy poddawano następnie redukcji i oznaczano koloryme- trycznie lub fluorymetrycznie (18). Hodgkinson i Williams (9) pominęli wielogodzinną ekstrakcję i kwas szczawiowy strącają siarczanem wapnia w środowisku etanolu. Celem niniejszej pracy było przystosowanie tej metody do rutynowego stosowania w laboratoriach klinicznych oraz uproszczenie procedury analitycznej. -

MATERIAŁ

Do badania używa się mocz z dobowej zbiórki, przechowywany w lo- dówce w 4C po uprzednim dokładnym wymieszaniu i zmierzeniu je-

go objętości. ę

METODA Odczynniki

1. Macierzysty wzorzec kwasu szczawiowego o stężeniu 200 mg/100 ml:

do kolby miarowej o pojemności 100 ml odważyć '0,2798 (COOH)e - 2H,O i uzupełnić wodą destylowaną do kreski. Roztwór jest trwały trzy ty- godnie w 4?C.

2. Roboczy wzorzec kwasu szczawiowego o stężeniu 20 mg/100 ml: roz- - cieńczyć dziesięciokrotnie macierzysty wzorzec wodą destylowaną.

3. 18/0 wodny roztwór soli: dwusodowej kwasu chromotropowego (C„HsO;SzNa;): rozpuścić 100 mg soli dwusodowej kwasu chromotropowego w 10 ml wody destylowanej. Przygotowywać każdorazowo przed użyciem.

4. Cynk elektrolityczny w postaci drutu (© 2 mm). Producent: Huta

„Silesia” — Katowice. Aktywacja drutu cynkowego: bezpośrednio przed oznaczeniem zanurzyć drut cynkowy w stężonym kwasie azotowym na 8 sekund, przemyć wodą destylowaną po czym pociąć na 5 mm kawal- ki o ciężarze 60—70 mg. Czynności te wykonywać pod wyciągiem ze względu na toksyczność wydzielających się par tlenków azotu.

5. 0,05%/6 roztwór alkoholowy błękitu bromotymolowego: rozpuścić 5 mg związku w 10 mil 40%/o etanolu.

6. Stężony kwas siarkowy cz.d.a.

7. Stężony kwas azotowy cz.d.a.

8. Etanol 96*/v.

9. 0,1 M NaOH.

10. 0,1 M HCI |

11. Nasycony wodny roztwór CaSQ,.

12. 2 N H,SO,.

13. 1 N H,SO,.

Sporzadzenie wykresu kalibracyjnego

Z roboczego wzorca kwasu szczawiowego przez rozcieńczenie wodą przygotowano szereg wzorców o stężeniach 4, 8, 12, 16, 20 mg/100 ml.

Przygotować 6 kalibrowanych probówek stożkowych: (wirowniczych) o pojemności 10 ml. Do pięciu z sześciu przygotowanych probówek wlać

„kolejno po 0,5 ml każdego przygotowanego wzorca, do szóstej zaś 0,5 ml

(3)

Nr 4 . Oznaczanie szczawianów w moczu 139 wody (próba ślepa), po czym dodać do wszystkich probówek po 0,5 ml ‘

2 N H;SO,. Do każdej probówki wrzucić 60—70 mg uaktywnionego drutu cynkowego. Umieścić probówki w statywie i wstawić na 15 minut do suszarki z ustabilizowaną temperaturą 190—195?C. Po ostudzeniu na po- wietrzu dodać do każdej probówki 0,25 ml 1%/6 roztworu soli dwusodowej kwasu chromotropowego oraz po 3 ml stężonego kwasu siarkowego.

Wymieszać dokładnie przedmuchując powietrze przez pipetę zanurzoną w roztworze. Wstawić ponownie do suszarki o temp. 190—195°C na 15 minut. Po ochłodzeniu pobrać do serologicznych probówek po 0,5 ml od- powiednich roztworów, dodać po 2 ml wody, dobrze wymieszać i po 5 mi- nutach kolorymetrować wobec ślepej przy 570 nm w kuwetach o dro- dze świetlnej 1 cm.

Sporządzić wykres kalibracyjny. Punkty układają się wzdłuż prostej przechodzącej przez początek. układu (ryc. 1).

as

Absorbancja przy 570nm

в ве

2 т

oai & óbce ть ^{w pró} 1 w ©

mg/100 mi (COOH).

Ryc. 1. Wykres kalibracyjny dla kwasu szczawiowego.

Uwagi

1. Wykres kalibracyjny nie jest powtarzalny „z dnia na dzień”, Należy go wykonywać przy każdej serii oznaczeń (nawet tego samego dnia).

2. W przypadku gdy roztwory po drugim ogrzewaniu w suszarce nie są klarowne, należy je odwirować przez 5 minut przy 2500 obr./min.

3. Po drugim ogrzewaniu w suszarce sprawdzić objętości płynów w poszczególnych probówkach i w razie potrzeby dopełnić stężonym kwa- sem siarkowym do wyjściowej jednakowej objętości.

4. Fioletowe zabarwienie trwałe jest 24 godziny.

Oznaczanie w moczu

Z dobrze wymieszanej dobowej zbiórki moczu pobrać 10 ml i dodać 0,1 ml stężonego kwasu solnego. Pobrać 0,5 ml zakwaszonego moczu do stożkowej probówki wirowniczej (takiej samej jak przy wykonywaniu

(4)

140 4 M. Rożental o Nr 4

wykresu kalibracyjnego), dodaé 1 ml wody oraz dwie krople 0,05% błę- kitu bromotymolowego. Doprowadzić pH do 7 przez zakraplanie 0,1 M NaOH (zabarwienie zielone). Następnie dodać 2 ml nasyconego roztworu CaSO, oraz 5 ml 96% etanolu. Zakryć szczelnie gumowym korkiem i kil- kakrotnie wymieszać przez odwrócenie probówki dnem do góry. Pozo- stąwić na dwie godziny (lub lepiej na całą noc) w temperaturze pokojo- wej. Odwirować w ciągu 10 minut przy 2500 obr./min. Zlać ostrożnie su- pernatant a ściankiprobówki osuszyć delikatnie bibułą nie dotykając po- wstałego zbitego osadu na dnie probówki. Dodać do probówki z osadem © 1 ml 2 N H,SO, oraz wrzucić 60—70 mg uaktywnionego drutu cynkowego.

Wstawić do suszarki o temp. 190—195°C na 15 minut. Dalsze postepo- wanie jest identyczne jak to opisano w punkcie „sporządzenie wykresu

kalibracyjnego”. :

Uwagi:

1. Końcowa objętość płynu w próbie badanej musi być taka sama jak przy wykonywaniu wykresu kalibracyjnego.

2. Próbę badaną kolorymetruje się wobec „Ślepej” używanej przy wykonywaniu wykresu kalibracyjnego.

Obliczanie dobowego wydalania szczawianów jako kwasu szczawiowego

к Dobowa

Dobowe wydalanie Wynik w mg/100 ml . objętość kwasu szczawiowego = odczytany z wykresu w moczu w mg kalibracyjnego 'X moczu w ml

: 100

WYNIKI

Dokładność metody mierzona odzyskami kwasu

szczawiowego |

Sporządzono próbki moczy o znanej procentowej zawartości kwasu szczawiowego i dalej postępowano jak z moczem badanym. Odzyski wy- noszą 96,3—100% (średnio 93,8%).

Tabela I. Odzyski kwasu szczawiowego z moczu

Е rtość | Znaleziona ' |

Nr Pa BA” toś | zawartość ae

próbki w mg/100 ml moczu. «w mg/100 ml moczu! (COOH)2 (m

1 4 г 3,85 96,3

2 6 5 83,3

3

4 10

8 "8

10

‘ 100,0

100,0

+

в

5 ₇ _,

*

12

14 13

12 100,0

92,8

16 14 : 87,5

8

₉

17 16 94,1

20 18 } 90,0

średnio 93,8

(5)

№4 Oznaczanie szczawianów w moczu 141

Próbę ślepą stanowił mocz do którego nie dodawano kwasu szczawiowego. Wymiki ilustruje tabela I.

Specyficzność metody

Przebadano szereg związków w różnych stężeniach pod kątem ich wpływu na odzyski kwasu szczawiowego z moczu. (tabela II i IIn).

Tabela IL Wpływ różnych związków na odzyski kwasu szczawiowego w moczu _ __. _ (Średnie z trzech równoległych oznaczeń) .

Dodatek do 100 ml moczu związku Odzysk SWEĘ kzanwega

Białko (albumina) 200 mg 96,1

d-Ryboza 200 mg бы 93,0

d-Ksyloza 200 mg 91,0

l-Arabinoza 100 mg 92,0

i-Ramnoza 100 mg 93,5

d-Glukoza 500 mg 270,0

Kwas glikolowy 10 mg 120,0

Kwas moczowy 50 mg 100,0

Kwas mrówkowy 10 mg i 101,0

Kwas bursztynowy 3 mg 98,0

Kwas metylomalonowy 2 mg Glicyna 140 mg 95,0 98,0

Kwas szcząwiooctowy 2 mg о 115,0

Табе! nn а ПТ. Wpływ różnych stężeń glukozy w moczu na „odzyski kwasu szcza- ` wiowego (średnie z trzech równoległych oznaczeń) NBC Z izech równoległych oznaczeń)

Stężenie glukozy w moczu w / . „Odzysk* kwasu szczawiowego м %

= 0,25

0,5 Se 250 270

1,0 340

1,5 _2,0 440

600

Czułość metody

Różnicy odczytu absorbancji na fotokolorymetrze ,,Specol” o 0,025 jed- ae odpowiada zmianom. stężenia kwasu szczawiowego o ok. 1 mg/100 ml.

. Precyzja metody

Precyzja metody określona współczynnikiem zmienności w serii jed- noczesnej wynosi +2% dla oznaczeń w roztworach wodnych oraz +4%

dla oznaczeń w moczu.

Wydalanie szczawianów u zdrowych dorosłych i dzieci

Przebadano wydalanie szczawianów w moczu 15 osób dorosłych (kobiety i mężczyźni) oraz u 13 dzieci w wieku 3—14 lat, Wyniki przed-

stawiono w tabeli IV. ś *

(6)

142 M. Rożental Nr 4

Tabela IV. Dobowe wydalanie szczawianów w moczu zdrowych ludzi dorosłych

i dzieci

Gru Liczba osób zakres wartości Wartość

и A badanych kwasu szczawiowego średnia

‘ (n) , w mg/24 godz. X+OS

Dorośli 15 14,4—39 307,9

Dzieci

w wieku 3—14 lat 13 9,4—35 157,2

Wydalanie szcząwianów u dzieci w różnych

‘ stanach chorobowych

Przebadano wydalanie szczawianów w moczu w kamicy nerkowej, ostrej i przewlekłej niewydolności nerek i innych chorobach. Wyniki ilustruje tabela V.

Tabela V. Dobowe wydalanie szczawianów w moczu u dzieci w wieku .3—14 lat z chorobami dróg moczowych

Liczba Zakres dobowego ;

‘ rzypadkó wydalania Średnia

Rozpoznanie р м а Ww mo Mi | x+0D

№ ше

Dzieci zdrowe 13 9,4—35 1537,2

Infekcja dróg moczowych 11 14—39 22,88

Kamica nerkowa

nawracająca i29 11—56 25,6411

Kamica nerkowa : 30 10—73 27,613

Krwiomocz 49 12—85 33+17

Ostra niewydolność nerek 9 22—50 34,57

Dobowe wydalanie szczawianów u dzieci w zależności od wieku

Wobec faktu nie zaobserwowania istotnych zmian w wydalaniu kwasu szczawiowego w moczu dzieci ze schorzeniami dróg moczowych przeprowadzono próbę analizy zależności wydalania tego kwasu od wieku.

Wyniki przedstawiono w tabeli VI.

Tabela VI Dobowe wydalanie 'szczawianów w moczu dzieci z chorobami dróg moczowych w zależności od wieku

s Liczba Zakres dobowego z

e dej * przypadków wydalania . s

(n) szczawianów w mg |

0— 1 9 4 6—16 12 + 4,5

1— 3 14 11—22 18,44 2,8

3— 7 ` 33 10—35 24 Етл

7—9 : 15 14—73 34,5+11,5

9—11 11 20—69 38 +17

11—14 83 11—13 40 +12

(7)

Nr 4 Oznaczanie szczawianów w moczu

" OMÓWIENIE WYNIKÓW

W opisanej metodzie zasadnicze znaczenie ma ścisłe przestrzeganie temperatury i czasu ogrzewania, które należy przeprowadzać w suszarce z termostatem w temperaturze 190—195%C. Otwieranie suszarki powo- duje obniżenie się temperatury. Dlatego należy rozgrzać suszarkę do temperatury 195?C i szybko wstawić statyw z badańymi próbkami. Tem- peratura nie powinna być niższa aniżeli 190°C.

Dzięki zastosowaniu wysokiej temperatury skrócono łączny czas ogrzewania do 30 min, podczas gdy w postępowaniu opisywanym przez Hodg- kinson i Williams (9) ogrzewanie trwa 60 min w 100°C. Ponadto mak- symalnie uproszczono postępowanie oraz zmniejszono objętości odczyn- ników. Pominięto czynność wyjmowania drutu cynkowego z probówki po zakończonej redukcji kwasu szczawiowego. Ważnym czynnikiem jest skuteczność uaktywnienia drutu cynkowego. Bez uaktywnienia reakcja nie zachodzi. Do oznaczeń zastosowano drut cynkowy polskiej produkcji, który okazał się równie dobry jak angielski stosowany przez Hodgkin-

son i Williams (9).

Do oznaczeń stosować należy wirownicze probówki stożkowe, gdyż w nich najlepiej zachodzi strącanie się osadu szczawianu wapnia i nie ma potrzeby jego ponownego przenoszenia, co ma ujemny wpływ. na do- kładność oznaczeń.

Opisana metoda charakteryzuje się dużą precyzją oraz dobrym odzys- kiem. Wynosi on średnio 93,8% a więc jest wyższy niż w pracy Hodgkin-

son i Williams (9).

Metoda okazała się praktycznie specyficzna dla kwasu szczawiowego.

Zawyżone wyniki dawały: kwas glikolowy, szczawio-octowy i glukoza (tabela II i III). Praktyczne znaczenie ma tylko obecność glukozy, któ- ra jest obecna w moczu ludzi chorych na cukrzycę. Zawyża ona w stęże- niu 0,25—20%/ wyniki 2,5—6 krotnie. Przed oznaczeniem kwasu szczawiowego należy więc mocz zbadać na obecność glukozy (np. testem scree- ningowym) i w przypadku jej obecności usunąć np. fermentacyjnie. Do- bowe wydalanie szczawianów w moczu wynosi średnio y dorosłych 30+

£7,9 mg i 15+7,2 u dzieci w wieku 3—14 lat. Dane nasze zgodne są z wynikami innych autorów (4, 8, 9, 13, 17). Wyniki uzyskane przy uży- ciu metod miareczkowych są niższe i wynoszą 10—15,7 mg/dobę (1, 5).

We wszystkich przebadanych schorzeniach dróg moczowych u dzieci zaobserwowano nieco podwyższone dobowe wydalanie szczawianów (tabela V). Około dwukrotnie podwyższone wartości zaobserwowano w przypadku kamicy, ostrej niewydolności nerek i krwiomoczu. W pozo- stałych przypadkach (infekcja dróg moczowych, kamica nerkowa na- wracająca) wydalanie szczawianów było około 1,5 raza wyższe w porów- naniu z grupą kontrolną. Ponieważ nie było statystycznie istotnych róż- nie w wydalaniu kwasu szczawiowego pomiędzy poszczególnymi schorże- niami przeprowadzono analizę wydalania szczawianów w moczu w-za- leżności od wieku (tabela VI). Wraz z wiekiem dzieci rośnie wydalanie szczawianów. Wydalanie w grupie dzieci w wieku 11-14 lat jest Sred- nio ponad trzy razy wyższe w porównaniu z grupą do 1 roku życia.

Reasumując należy stwierdzić, że proponowana procedura oznaczania kwasu szczawiowego jest szybka w wykonaniu w porównaniu do innych metod a ponadto czuła, specyficzna i precyzyjna. Nie wymaga skompli- kowanej aparatury ani drogich odczynników. O jej dokładności decy- dują wysokie odzyski, oraz potwierdzenie dobowego wydalania szczawia-

(8)

144 M. Rożental Nr 4

nów w moczu z danymi innych autorów. Zalety te kwalifikują ją do rutynowego stosowania w laboratoriach klinicznych.

М. Розенталь, Л. Томашевски, Х. Зборовска

ПРОСТОЙ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКСАЛАТОВ. В МОЧЕ

Резюме

Разработали модификацию метода определения оксалатов Ходжкинсоном и Вилиамсом (9). Ионы СО?

>

определяются колориметрически с помощью кислоты. Осаждение проводилось в этаноле statu nascendi” npu температуре 190—195°С. вл время определения, по ‘сравнению с оригинал раза. Исследовали выделение оксалатов в сут

в моче, описанного осаждаются из мочи в виде труд- ваются до гликолевой кислоты и агодаря повышенной температуре ьным методом, сократилось в два очной моче у здоровых детей, де- У здоровых взрослых. Предлагае-

‚мый метод характеризуется простотой, чувствительностью, точностью и специ- фичностью. Можно ero рекомендовать для рутинового применения.

M. Rozental, Г, Tomaszewski M. Zborowska

A SIMPLE COLORIMETRIC METHOD FOR DETERMINATION OF OXALATES IN URINE Summary

A modification of the method of determin:

Hodgkinson an Williams (9) has been elabor from. urine as poorly soluble caleium salt and mined then colorimetricaly with disodium salt

was carried out in ethanol and reduction was achieved with hydrogen in statu nascendi at 190—195°C, Owing to increased temperature the time of the test was reduced to one half as compared with the original method. Oxalate excretion with urine was studied in healthy children, in children with urinary tract infections and in healthy adults. The method is simple, rapid, sensitive, precise and specific.

ing urinary oxalates described by ated. Oxalate ions are precipitated reduced to glycolic acid, and deter- of chromotropic acid. Precipitation

It is suitable for routine use.

PISMIENNICTWO

1. Archer H. E. i wsp.: Urinary excretion of oxalate by normal subjects. Clin. Sci., 16, 405, 1957. |

2. Charransol G., Desgraz P.: Utilisation de la chromatographie on phase gazeuse pour la determination quantitative de l’acide oxalique. J. Chromatogr., 48, 530, _1970.

3. Dean B.M., Griffin W. J.. Watts R. №. Е: Primary hyperoxaluria. The demon- stration of a metabolic abnormality in kidney tissue. Lancet, 1, 406, 1966, 4. Ретрзау Е. Е. $ wsp.: Urinary oxalate excretion. Metabolism, 9, 52, 1960. 5. Dick M.: The determination of oxalic acid in urine. Proc. Assoc. Clin. Biochem., 21, 186,- 1965.

6. Hallson P. G., Rose G. A: A simplified and rapid enzymatic method for determination of urinary oxalate.Clin. Chim. Acta, 55, 29, 1974.

1. Hockaday T. D. R. Clayton J. E. Smith L. H.: Metabolic error in primary hyperoxaluria. Arch. Dis. Childn., 40, 485, 1965.

"8 9.. Hodgkinson A., Williams А: An improved colorimetric procedure . Hockaday T. Г. R., Frederick Е. W. i wsp.: Studies on primary hyperoxaluria. Oxalate. Clin. Chim. Acta, 36, 127, 1972. II. Urinary oxalate,. glycolate, and ‘glyoxylate measurement by isotope dilution methods, J. Lab. Clin. Med., 65, 677, 1965. ‘ . for urine |

10. Hodgkinson A., Zarembski P. M: The determination of oxalic acid in urine. Analyst, 86, 16, 1961.

(9)

"Nr 4

11.

12.

13.

14.

15.

17. 16.

18.

#

Oznaczanie szczawianów w moczu i 145 Knowles C. F., Hodgkinson A.: Automated enzymic determination of oxalie acid in human serum. Analyst, 97, 474, 1972.

Mayer С. G. i wsp.: Enzymatic oxalate determination in urine. Clin. Chem. 9, 334, 1963.

Riberio M. Elliot J. S.: Direct enz Invest. Urol., 2, 78, 1964.

Scriver C..R. i Rosenber Sauders Comp., 1973. `

Sivorinowskii G. A.: K metodike koliczestwennowo op kisłoty w mocze. Lab. Deło, 7, 401, 1969.

Tomaszewski L.: Biochemiczna diagnostyka czynnościowa u dzieci. PZWL, 1972.

Yarbro C. L., Simpson R. E.: The determination of total urinary oxalate. J. Lab.

Clin. Med., 48, 304, 1956, _

Zarembski P. M., Hodgkinson A.: The fluronietric determination of oxalic acid in blood and other biological materials. Biochem. J., 96, 717, 1965.

ymic determination of urinary oxalate.

9 Г. E.: Amino acid metabolism and its disorders.

redelenia szczawiennej .