ANNALES
UNIVERSITATIS MARIAE C U R I E - S К Ł O D O W S К A LUBLIN — POLONIA
VOL. XIII, 39 SECTIO D 1958
Zakład Antropozoonoz Instytutu Medycyny Pracy i Higieny Wsi w Lublinie Kierownik: prof, dr Józef Parnas
Anna KpZICKA i Józef PARNAS
Wyniki badań histopatologicznych narządów
wewnętrznych małych ssaków w kierunku leptospirozy
Результаты гистопатологических исследований внутренних органов мелких млекопитающих, зараженных лептоспирами
Results of Histopathological Examination of Internal Organs of Small Mammals for Detection ofLeptospirosis
MATERIAŁ BADAŃ
II i III ekspedycja badawcza naszego Instytutu dla opracowania ognisk lepto
spirozy na Lubelszczyźnie (1956, 1957) posiadała odrębną pracownię histopatolo
giczną. Dzięki temu można było uzupełnić metodykę badawczą ekspedycji, bada
niami histopatologicznymi. Badania te, prowadzone w ciągu lata w Tomaszowie Lubelskim kontynuowane są w dalszym ciągu w Zakładzie Antropozoonoz.
Materiałem naszych badań były małe ssaki, głównie gryzonie, odłowione w ra
mach ekspedycji przez grupę zoologiczno-ekologiczną. Małe ssaki z odłowów dostar
czono do naszej pracowni w liczbie 1127 zwierząt. Ponadto zbadano 80 świnek morskich zakażonych doświadczalnie.
Przy przeglądaniu literatury światowej (1—7), nie spotkaliśmy wypadku aby bezpośrednio w skład ekspedycji badawczej w ogniskach przyrodniczych antro
pozoonoz, a w szczególności leptospiroz, wchodziła pracownia histopatologiczna.
Badania histopatolog:czne małych ssaków wykonywane były dotąd w badaniach leptospirologicznych tylko fragmentarycznie i na małym materiale. Dlatego też, oprócz histopatologii choroby Weila u człowieka, szczura i świnki morskiej, — znaleźliśmy w literaturze krajowej i zagranicznej znikome dane o histopatologii leptospirozy małych ssaków. Nasze badania systematycznie prowadzone na 1127 małych ssakach dziko żyjących i na 80 świnkach morskich, eksperymentalnie zaka
żonych, można uznać za pierwsze tego rodzaju.
METODYKA PRACY I WYNIKI
Badacze radzieccy, a w szczególności W a r f o lo m i ej ew a *), przy
wiązują dużą wagę do badania mikroskopowego materiału, pobranego świeżo z tkanki nerkowej małych ssaków. Metoda ta polega na tym, że
) informacja ustna.
odrazu przy sekcji małego ssaka pobiera się pipetą pasteurowską nieco materiału z kilku miejsc nerek, zawiesza się materiał w roztworze fizjologicznym i bada się w ciemnym polu widzenia.
W naszych badaniach mikroskopowych zastosowaliśmy również me
todę barwienia leptospir. Nie mając własnego doświadczenia wypróbo
waliśmy kilka sposobów barwienia, a mianowicie metody: Kiktenki, Pulchera, Romanowskiego-Giemzy, metodę kombinowaną May-G r ü n w a Ida-P a ppe nheim a, i metodę impregnacji wg Fo n t a n y.
W wyniku tych prób wstępnych doszliśmydo przekonania, że najbar
dziej odpowiada nam metoda Fo nt any. Tą metodą przebadaliśmy 800 szt. małych ssaków.
Biorąc pod uwagę, że preparaty mazane sporządzano każdorazowo ze śledziony, wątroby i nerek, trzeba było przebadać 2400 preparatów mikroskopowych. To zadanie zostało wykonane w czasie ekspedycji.
Metoda impregnowania polega na tym, że przygotowuje się trzy różne roztwory w skład których wchodzą: formaldehyd, kwas octowy, tanina, fenol, AgNOs i amoniak.
Barwienie: na wysuszony na powietrzu preparat nalewa się trzykrotnie przez 30 sek. roztwór pierwszy. Potem spłukuje się alkoholem absolutnym, w którym pozostawiamy go na 3 minuty. Po odparowaniu alkoholu i wyschnięciu, preparat zadaje się na 30 sek. roztworem drugim i podgrzewa do ukazania się pary.
Następnie dokładnie spłukuje się najpierw wodą bieżącą, potem destylowaną i za
nurza się w roztworze trzecim, który podgrzewa się przez 1 minutę; następnie spłukuje się wodą destylowaną i pozostawia do wyschnięcia.
Przeglądając preparaty spostrzegaliśmy leptospiry w wątrobie w po
staci krętków impregnowanych srebrem w skupiskach między komór kami. Podobny obraz spostrzegano w śledzionie. W niektórych prepara tach były to tylko pojedyncze leptospiry, w innych mniejsze lub większe zgrupowania. W tkance nerkowej zauważono krętki bardziej wydłużone pojedynczo lub w skupiskach. Oczywiście tego rodzaju badania mikro skopowe przyjmowaliśmy jako kontrolne, starając się przy tym odróżnić leptospiry od artefaktów. Jednakże, przy zestawieniu wyni ków badań mikroskopowych z wynikami pracowni serologicznej, stwier
dzaliśmy, że są zgodne one w dużym odsetku; w innych przypadkach, badanie mikroskopowe uzupełniało badanie serologiczne. Ogólnie poda
my, że wśród 800 małych ssaków zbadanych metodą Fo n ta n y, mikro- skopowo dodatnich było:
1. Microtus arvalis na ogólną liczbę bad. 373 dodatnich — 24
2. Arvicola terrestris „ „ „ „ 100 — 25
3. Fiber zibethicus ,, ,, ,, » 29 „ — 0
4. Rattus norvégiens », ,, ,, », 0 „ — 0
5. Erinaceus roumanïcus „ „ „ „ 57 — 1
6. Sorex araneus ... 6 — 1
Wyniki badań histopatologicznych narządów wewnętrznych 441 7. Neomys îodiens na ogólną liczbę bad. 20 dodatnich — 4
8. Apodemus agrarius ,, ,, ,, ,» 1 — 0
9. Cricetus cricetus ,, ,, ,, ,, 50 — 9
10. Micromys minutus ,, „ »» ,, 13 — 4
11. Talpa europaea ,, », ,, ,, 2 — 1
12. Sorex minutus ,, », », „ 28 — 5
13. Crocidura leucodon ,, ,, ,, ,, 3 — 0
14. Mustella nivalis ,, ,, », 7 — 7
15. Microtus ratticeps ,, », ,, ,, 188 — 41
16. Clethrionomys glareolus ,, ,, ,, ,»" 3 — 1
17. Mustella putorium ,, ,, ,, ,, 1 — 0
Badania histopatologiczne małych ssaków:
Od każdego małego ssaka (1127 szt.) pobierano nerki, śledzionę, wątrobę, płuca,, serce i węzły chłonne. Narządy te odpowiednio numerowane, utrwalono w 7—lO°/o roztworze obojętnego fcemolu. Utrwalony materiał zanurzano w 95°/o alkoholu, stąd przenoszono do wody destylowanej kilkakrotnie zmienianej. Potem przeno
szono do świeżo przyrządzonego 1—3% azotanu srebra na 2—3 dni przy temp. 37°C w termostacie a po dokładnym spłukaniu wodą destylowaną zanurzano w utrwa
laczu zawierającym kwas pyrogallowy i formol, na 1—2 dni w temp, poko
jowej. Następnie skrawki płukano w wodzie destylowanej i odwadniano alko
holem absolutnym i ksylenem. Po dokładnym odwodnieniu i zamknięciu w para
finie wykonywano skrawki mikrotomowe grubości 3—5 mikronów, a następnie spo
rządzano preparaty. Jest to skrócona przez nas metoda Levaditiego. Równo
cześnie wykonywano preparaty barwione hematoksyliną i eozyną celem określenia zmian w komórkach narządów. Preparaty barwione metodą Levaditiego dają piękniejszy obraz aniżeli preparaty mikroskopowe barwione metodą F o n t a n y.
Szczególnie charakterystyczny jest układ leptospir w tkance nerko
wej. W świetle własnych spostrzeżeń możnaby podać następujące typy tego układu:
Typ I: W świetle kanalików nerkowych widoczne są gęste, intensyw
nie barwiące się zlepy leptospir, przylegające ściśle do nabłonka.
Typ II: W świetle kanalików nerkowych widać skupiska przypomi
nające luźne kłębki.
Typ III: W świetle kanalików nerkowych widoczne są luźne i nie
regularne skupiska, częściowo tylko przylegające do nabłonka.
Typ IV: Małe, punkcikowate skupiska leptospir w świetle kanalików nerkowych.
Preparaty te wyjaśniają nam jak wielką rolę odgrywa tkanka ner kowa, a w szczególności kanaliki, jako długotrwałe siedlisko leptospir u małych ssaków. Mocz, przepłukując kanaliki nerkowe, unosi z sobą masę leptospir i nic dziwnego, że Warfołomiejewa i współpra cownicy stwierdzali czasem w moczu małych ssaków około 300 leptospir w polu widzenia. Fakt ten ma duże znaczenie epidemiologiczne. Małe ssaki, u których w nerkach stwierdzono leptospiry bez obecności swoistych przeciwciał w surowicy krwi są klasycznymi nosicielami i siewcami leptospir (tab. 1).
И
д’ H
nadanieserologiczne(odczynaglut.) topowe ТЦР rozmie szcze nia Lepto spir HMH-<1—IMMI—lk-M*-ll —II—IH-IM-II—IHM^b-ll—ll-M (ЛO
Ж 6
41 Prepa raty histopa tologi czne
+ + + + + + + + + + + + + + + + + g
К Prepa raty mazane
+ + + + + 1 + + + + +,+.+ + + 1 +
Badanie bakter.' wyod rębnio no szcze pów Lepto spir 1 .1 I-I I-I 1 i 1 - - 1 1 1
1/160 1160 1HO — 1 1 1 1 1 1
L. ani
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
O -i g 1 1 1 1 .1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
ij — -> 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
O ~ g 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Il 1 1 1 1
1/20
-4 ó. i i i i i i i i i i B. i 1 i i i i
co c L bo. 160 1/160 160 180 1/160 1/160, 140
s
4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
091/1
.2
’S 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
ON U s NO
*4 e 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
4 d 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Э Z) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
4 «5 08/1 —
03l 1 1 1 1 1 1
<3 од 1/16
0 1/160 1/160 1/40 1/80 1/160 1/160 1/160
Miejsce skąd pochodzi zwierzę Niemi rówek »• »» >> », ,, Żurawce Machnów
»Nazwamałegossaka Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusarvalis Musmusculus Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusralticeps Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusarvalis Musmusculus
Z bada nego zwie rzęcia ^кОЮОСОСООООСЧСЧV—« vH ł—1 127 156 174 195 198 314
Wyniki badań histopatologicznych narządów wewnętrznych 443
aa о
О Typ rozmie szcze nia Lepto- splr НЧ *—4 ►—< *—1 1—( 1 HH - >—( ►—( »4 1—( i—И 1—< —• К-( >—I о
Я
V
Prepa raty histopa tologi czne
+ + + + + + + + + + + + + + + +
Badanie_, ,,ÀBadani bakier. iwyod- 1rębnio- L.inoPrepa- szcze-raty l'iP^wmazane 1Lepto spir
+ + + + + + + + 1 I++ + + +I
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 . 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
со 1-4 § 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 т—< « 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
О g 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
о сч *4 d. ! 1 1 1 1 III 1 1 1 I - 1 1 1 1
CO в
СО kJ o o 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
odm
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
3
й <! »Q 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
о N
5 и N О
1 1 1 ? 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
<i u 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 i 1 1 1 1 1
э cc • 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
*4 cć 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ! oh i 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Miejsce skąd pochodzi zwierzę Niemi rówek ,, Ruda Żurawiecka », ,1 ,, ,, », ,, ,, Niemi rówek .Ruda Żurawiecka Niemi rówek
Nazwamałegossaka Micromysminutus Musmusculus Mustellanivalis Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusarvalis Neoniÿsfodiens Microtusratticeps Microtusarvalis Microtusarvalis Microtusratticeps Microtusarvalis
Ź bada nego zwie rzęcia 650 771 779 782 786 787 791 798 824 828 849 879 884 928 950 9
Wyniki badań histopatologicznych narządów wewnętrznych 445
W badanych narządach małych ssaków zakażonych leptospirami stwierdzaliśmy następujące zmiany histopatologiczne: objawy zwyrod nienia miąższowego, drobne ogniska martwicy w miąższu, pojedyncze nacieki limfocytarne i leukocytarne, wybroczyny krwawe w tkance podścieliskowej narządów miąższowych z minimalnym odczynem łączno- tkankowym. Spostrzegane przez nas zmiany anatomiczno-patologiczne w narządach małych ssaków wskazują na to, że leptospiroza przebiega u nich, jeśli mowao naszych badaniachi o leptospirach: L. grippotyphosa, L. sejroe i inne, — z wyłączeniem L. icterohaerrtorrhagiae, L. canicola, — w postaci raczej przewlekłej, bez ognisk martwicy i większych nacieków zapalnych. Świadczy to o symbiotycznych stosunkach układających się w pewnych granicach, między ustrojem małych ssaków, a bytującymi u nich leptospirami. Pozostaje to zapewne w związku ze wspólną, długą drogą wzajemnego rozwoju ewolucyjnego.
WNIOSKI
1. W kompleksie badań leptospirologicznych nie można zarówno w ekspedycjach, jak i w pracach doświadczalnych, pomijać metodyki mikroskopowej i histopatologicznej; w tym zakresie nasza praca wnosi pewien wkład do piśmiennictwa polskiego i zagranicznego.
2. Zarówno badania mikroskopowe narządów małych ssaków, wy konywane metodą Fontany, jak również bardziej dokładne bada nia histopatologiczne wykonywane metodą Lewaditiego i bar wione hematoksyliną i eozyną, wykazały, że wśród 1127 małych ssaków, odłowionych w ogniskach przyrodniczych leptospiroz, stwierdzono liczne przypadki dodatnie. Pokrywały się one w części z badaniami serologicz
nymi krwi małych ssaków, oraz z posiewami bakteriologicznymi ich narządów. Pewna ■ część dodatnich wyników mikroskopowo-histopatolo- gicznych, uzupełniała wyniki badań mikrobiologicznych. Jak przedsta
wiono w tabeli 1, u części małych ssaków stwierdzono w tkance nerek leptospiry bez obecności przeciwciał antyleptospirozowych w surowicy krwi. Są to klasyczni nosiciele i siewcy leptospir, odgrywający dużą rolę epidemiologiczną w ogniskach przyrodniczych gorączki błotnej.
3. Można było wyróżnić 4 postaci charakterystycznego układu lepto spir w tkance nerkowej.
4. Badania histopatologiczne wykazały w narządach małych ssaków, zakażonych leptospirami,zmiany następujące: objawy zwyrodnienia miąż szowego, drobne ogniska martwicy w miąższu, pojedyncze nacieki limfo cytarne, wybroczyny krwawe w tkance podścieliskowej narządów miąż
szowych z minimalnym odczynem łączno-tkankowym.
Результаты гистопатологических исследований внутренних органов 447 PIŚMIENNICTWO
1) Au sto ni M.: Le Leptospirosi — monografia. Padova 1953, 2) G sell О.:
Leptospirosen, monografia. Basel 1952, 3) Popowa E. M. i Amo senk o- w a N. J.: Rezultaty diagnostiki leptospiroznoj żełtuchy metodom bioprob. Ż.M.E.I.
Moskwa 1953, 4) Roza now N. J.: Mikrobiołogiczeskaja diagnostika zabolewanji siel.-chaz. żiwotnych. Moskwa 1952, 55) Salminen A.: Studies on the Occurrence of various Leptospirae types in Finland — monografia — Helsinki 1956, 6) Zwierz J.: Leptospirozy. PZWL, Warszawa 1957, 7) Zoonoses — connaissan
ces et techniques nouvelles — WHO — Geneve, monografia 1954.
РЕЗЮМЕ
Следует подчеркнуть, что в комплексе лептоспирологических исследований нельзя как в научных экспедициях, так и в экспери
ментальных лабораторных работах, упускать из виду микроскопиче
скую и гистопатологическую методику; в этом отношении работа ав торов в некоторой степени обогащает как соответственную польскую, так и зарубежную научную литературу.
И микроскопические исследования органов мелких млекопита ющих, производимые по методу Фонтаны, и более точные и подроб ные гистопатологические исследования, проводимые по методу Левади- ти и методом окрашивания гематоксилином и эозином показали, что среди 1127 мелких млекопитающих, словленных в натуральных оча гах лептоспирозов, были установлены многочисленные положитель ные случаи, которые частично совпадали с результатами серологиче ских исследований крови мелких млекопитающих, а равно и с посе
вами бактерий, выделенных из их органов. Определенная часть по ложительных микроскопически — гистопатологических результатов была дополнением микробиологических исследований.
Как показано на таблице I, у части мелких млекопитающих обнаружены в почечной ткани лептоспиры при полном отсутствии соответственных антител в сыворотке крови. Эти млекопитающие являются подлинными носителями лептоспир, играющими ргромную эпидемиологическую роль в природных очагах водной лихорадки.
В почечной ткани авторам удалось выделить четыре штамма лептоспир характерных для этой ткани.
На основании гистопатологических исследований в органах мел ких млекопитающих, зараженных лептоспирами, обнаружены следу
ющие изменения: .симптомы паренхиматозного вырождения, мелкие очаги некроза в паренхиме, единичные лимфатические инфильтраты, кровоизлияния в подстилающей ткани паренхиматозных органов с минимальной соединительнотканевой реакцией.
SUMMARY
In the complex of leptospirological investigations, both during expe
ditions and in experimental research work, the microscopic and histo pathological methods should not be neglected; in this connection the present paper is a certain contribution to the Polish and foreign litera ture on this subject.
Both microscopic examination of organs of small mammals carried out with the use of Fontana’s method, and more exact histopathological investigations conducted according to Levaditi with the use of haema toxylin and eosin staining showed that in 1127 small mammals caught in natural foci of leptospirosis, numerous positive cases could be found;
they partly fitted in with serological blood tests and with bacteriologi
cal cultures from organs of small animals. A certain part of positive microscopic and histopathological results supplemented the results of microbiological tests.
It follows from table I that in a number of small mammals there were found Leptospira in the kidney tissue while antileptospirosis antibodies were absent from blood serum. These are the classic carriers and spreaders of Leptospira and they play an important epidemiological role in natural foci of swamp fever.
4 forms of the characteristic behaviour of Leptospira in the kidney tissue could be distinguished.
Histopathological examination revealed the following changes in the organs of small mammals infected with Leptospira: symptoms of paren chymatous degeneration, small necrotic foci in the parenchyma, single lymphocytic infiltrates, extravasations in the lining tissue of parenchy matous organs with a veryweak connective tissue reaction.
Papier druk. sat. Ill ki. 80 g Format 70x100 Druku 10 str.
Annales UMCb. Lublin 1958. Lub. Druk. Prasowa — Lublin, Unicka 4 Z.am. 666 10.II 1959 r.
800 + 125 egz. E-3 Data otrzymania manuskryptu 10.11.1959 r. Data ukończenia druku 31.VII. 1959 r.
