MACIEJ SZMITKOWSKI AKTYWNOŚCIĄ NAD GRANULOPOETYCZNĄ SUROWICY KRWI LUDZKIEJ VIVO BADANIA WSTĘP. donie- procesu. granulopoezy.

DIAGN. LAB., 1978, XIV, nr 3

MACIEJ SZMITKOWSKI

BADANIA IN VIVO NAD GRANULOPOETYCZNĄ AKTYWNOŚCIĄ SUROWICY KRWI LUDZKIEJ

Zakład Diagnostyki Klinicznej, Instytutu Biochemii i Analityki Medycznej, AM w Białymstoku

Przeprowadzono badanie aktywności granulopoetycznej surowicy ludzkiej po poddaniu jej chromatograficznemu rozdziatowi na kolum- nie z Sephadex G-200. Pomiar tej aktywności prowadzono poprzez dootrzewnowe podanie frakcji pokolumnowych myszom rasy „Swiss”

i śledzenie liczby granulocytów krwi przez okres 7 dni. Uzyskane wy- niki porównywano z wartościami otrzymanymi po dootrzewnowym podaniu substancji kontrolnych takich jak 0,9% roztwór NaCl oraz Encorton, powodujący wyrzut puli rezerwowej granulocytów. Określono także za pomocą sączenia molekularnego na Sephadex G-200 masę cząsteczkową białek surowicy, posiadających aktywność granulopoe- tyczną. Wynosiła ona dla trzech uzyskanych szczytów aktywności: 44 000, 14000 ż około 6 000. |

WSTĘP

Od wielu lat fizjolodzy postulowali istnienie hormonu odpowiedzial-

nego za inicjowanie i przebieg procesu granulopoezy. Pierwsze donie-

sienia zostały przedstawione przez Gordon (6) oraz Boggs (2, 38), którzy stwierdzili. we krwi obecność czynnika podwyższającego liczbę granulo- cytów krwi u psów z neutropenią oraz u ludzi którym podano endo- toksynę. Podobną białkową substancję opisał w 1964 r. Bierman i nazwał

Leukopoetyną G (1). |

Przedstawione przez wymienionych autorów wyniki badań opierały się na śledzeniu liczby granulocytów we krwi w przeciągu 24 godzin od czasu dootrzewnowego podania. szczurom lub myszom testowanych substancji. Tego typu postępowanie nie pozwoliło odróżnić wyrzutu puli marginalnej lub rezerwowej granulocytów od rzeczywistego pobudzenia.

procesu granulopoezy. | |

W 1966 r. Bradley i Metcalf (4) wprowadzili półpłynną agarową ho- dowlę granulocytów co dało możliwość prowadzenia badań nad białko- wym czynnikiem stymulującym wzrost kolonii granulocytów in vitro i zwanym „Colony Stimulating Factor” (CSF) (11, 18). Znane są dziś pewne własności fizyko-chemiczne i biologiczne tego czynnika, nie wia- domo jednak czy jest on substancją identyczną z czynnikiem działają- cym in vivo.

Celem przedstawionej pracy jest zbadanie surowicy krwi ludzkiej,

w nowo opracowanym przez nas systemie oznaczania, aktywności gra- nulopoetycznej oraz wstępna charakterystyka biochemiczna substancji

odpowiedzialnej za tą aktywność. |

104 | - M. Szmitkowski | Nr 3

MATERIAŁ I METODY

Krew do badań pobierano od ludzi zdrowych i po 30 minutach wy- krzepianiu poddawano ją wirowaniu przy 1000 X g przez 20 min w celu

uzyskania surowicy.

Myszy używane do badań miały wagę 20—22 gi były to dziewicze

| |

samice rasy „Swiss”. |

Chromatografie na Sephadex С-200 prowadzono w temperaturze po- kojowej przy uzyciu kolumny o wymiarach 2X40 cm, na którą nano- szono 2,5 mł surowicy (170 mg białka). Jako eluent stosowano 0,9*/6 roz- twór NaCl. Frakcje o objętości 6,5 ml zbierano co 30 min.

Oznaczanie masy cząsteczkowej przy pomocy sączenia molekularne-

$0 prowadzono na kolumnie z Sephadex G-200 o wymiarach 2X40 cm.

Kolumnę kalibrowano przy pomocy 1% roztworów białek o znanej ma-

sie cząsteczkowej. Używano: Cytochrom C, Hemoglobine, Ovoalbumine, Albumine ludzka, Immunoglobuline G, Apoferrytyne. Elucje prowadzo-

no w temperaturze pokojowej 0,9%/6 roztworem NaCl. Objętość zerowa

kolumny wyznaczona przy pomocy Blue Dextran wynosiła 48 ml.

Białko w surowicy oznaczano metodą biuretową (21) a we frakcjach

pokolumnowych spektrofotometrycznie przy długości fali 260 i 280 nm (10).

Aktywność granulopoetyczna in vivo mierzono wstrzykujac dootrzew- nowo myszom w warunkach jałowych badany materiał (surowica, frak- cje pokolumnowe) w ilości 1 ml. Krew od myszy pobierano z żyły ogo- nowej między godziną 12.00 a 13.00. Jest to okres wyznaczonej poprzed- nio największej stabilności liczby granulocytów (20). Pobrań dokonywano co 24 godz. przez 7 dni. Oznaczano w tej krwi liczbę leukocytów na automatycznym liczniku krwinek TUR ZG-9 i wykonywano rozmaz na szkiełku podstawowym. Barwiono metodą Pappenheima i obliczano od-

setkową zawartość granulocytów. Za jednostkę aktywności granulopoe-

tycznej przyjęto umownie taką ilość badanej substancji, która powoduje jedno procentowy przyrost liczby granulocytów we krwi myszy w okre- sie 7 dni od dootrzewnowej iniekcji 1 ml testowanego materiału. Ak- tywność wyliczano wg wzoru:

-вха A ” 100

x

— aktywność granulopoetyczna w j/ml -

—- suma granulocytów z wszystkich pobrań (co 24 godz przez 7 dni)

— liczba granulocytów w warunkach prawidłowych (przed iniekcją)

— ilość pobrań krwi (7).

QU

> MK

Należy zaznaczyć, iż podane wartości aktywności granulopoetycznej są średnimi arytmetycznymi z badań przeprowadzonych każdorazowo na 10 myszach.

Aby wykazać rzeczywistą aktywność granulopoetyczną badanych sub-

| stancji, wprowadzono 2. grupy kontrolne. Pierwsza otrzymała 0,9%/0 roz-

twór NaCl w celu wykazania wpływu samej iniekcji (wyrzut puli mar-

ginalnej granulocytów) na testowane parametry. Druga grupa otrzymała

Encorton jako środek uruchamiający w pierwszych 12 godzinach pulę

rezerwową granulocytów. |

Мг 3 Aktywność granulopoetyczna in vivo 105

WYNIKI

Przeprowadzone badanie aktywności granulopoetycznej pełnej suro-

wicy krwi ludzkiej wykazuje iż aktywność ta wynosi około 40 j/ml tzn.

że we krwi myszy liczba granulocytów w okresie 7 dni od dootrzewnowej

iniekcji I ml badanego materiału wzrosła średnio o 400/0 w stosunku do wartości, które występują w tym samym czasie w warunkach prawidło-

wych. |

10000- SZ.)

| Г \ -| \

^ \

PN ОИ

| Mem NN

2 . — = eo

000 aS

mim SA — >.

SI

g$ | ——— Encorton

NSP 7 Nall

She, pr i A A AAAA AJ

6 12 24 48 72 96 120 144

Czas pobrania (godziny)

Ryc. 1. Zmiany liczby granulocytów w krwi myszy po podaniu 0,9P/6 roztworu NaCl i Encortonu .

‘

Jednocześnie dootrzewnowa iniekcja 0,9°/o NaCl nie daje zadnego przy- rostu liczby granulocytów. Natomiast Encorton jako środek mobilizujący pulę rezerwową granulocytów wykazuje aktywność 3 j/ml (19). Rycina 1 potwierdza słuszność przyjętego pomiaru liczby granulocytów (co 24

godz. od iniekcji) ze względu na widoczny po pierwszych ośmiu godzinach

wyrzut puli marginalnej oraz wyrzut puli rezerwowej właśnie po Encor- tonie w okresie 12—18 godz. po inkubacji.

Na rycinie 2 przedstawiono rozdział białek surowicy ludzkiej na ko-

lumnie z Sephadex G-200 oraz uzyskany rozkład aktywności granulo-

2,0 r Sephadex G-200 F

™ 2

80 5

Е Białko” ,, es

= ———Aktywnose granulopoe- | =

2 łyczna К 4608

а Or z” А ł IN \ = 5

* i farsa |

^{|| 1}

3

^`

i poy ' 20 8

IAW \ =

1 "qr д Е 1 JĄ $

50 100 150 200 =

Objętość (mi)

Ryc. 2. Aktywność granulopoetyczna surowicy ludzkiej poddanej chromatografii kolumnowej na Sephadex G-200. 1, 2, 3 — szczyty aktywności granulopoetycznej

106 M. Szmitkowski | Nr 8 1 poetycznej lokalizującej się w trzech szczytach z których pierwszy osią-

ga aktywność 40, drugi 50 a trzeci 60 j/ml. Zarówno drugi, jak i trzeci

szczyt związany jest z frakcjami zawierającymi niskie stężenie białka (0,1—0,2 mg/ml), co pozwala wnioskować iż jest ono w dużej mierze swoistym nośnikiem stwierdzanej aktywności granulopoetycznej. Jedno- cześnie dializa uzyskanych frakcji nie powodowała utraty ich aktyw-

ności.

Sephadex G-200

150 | (3)

Cytochrom C

> e Hemaglobina

Е

G 100 |--

(1)

° Ovoalbumina

5 g Albumina ludzka mmunoylobulina 6

g G

Apoferrytyna

„m. 50 |- = о

1= 44000 m.cz.

2= 14000 m.cz.

3% 6000 m.cz.

4,0 J 44 LI 48 l 52 | 5,6 i

log masy czqsteczkowej

Ryc. 3. Oznaczanie masy cząsteczkowej białek surowicy posiadających aktywność granulopoetyczną na kolumnie z Sephadex G-200. 1, 2, 3 — szczyty aktywności granulopoetycznej i odpowiadająca im masa cząsteczkowa białek związanych z tą

aktywnością | |

Rycina 3 prezentuje wyniki oznaczania ciężaru cząsteczkowego bia-

łek z którymi związana jest aktywność granulopoetyczna uzyskanych trzech szczytów. Mają one w przybliżeniu masę: 44000, 14000, 6000.

Ostatnia uzyskana wartość może być jedynie orientacyjna ze względu

na ograniczoną zdolność rozdzielczą kolumny w tym zakresie mas cząs-

teczkowych. | |

DYSKUSJA

Po okresie intensywnych badań metodą hodowli agarowej granulo- cytów nad aktywnością CSF (4, 5), stwierdzono, iż nie zezwalają one

w pełni na wyciągnięcie wniosków potwierdzających podobny sposób

działania tego czynnika w warunkach in vivo i in vitro.

Zastosowana przez nas metoda pomiaru aktywności granulopoetycz-

nej „in vivo” pozwala uniknąć błędów wynikających ze zbyt krótkiego

okresu śledzenia liczby granulocytów tak jak to robili inni badacze (1,

18). Przedłużyliśmy ten okres do 7 dni co ze względu na około 6-cio dniowe dojrzewanie granulocytów (12), pozwala niewątpliwie uchwycić elekt granulopoetyczny badanych substancji.

Zastosowanie z kolei w. grupach kontrolnych 0,9%/0 roztworu NaCl

i Encortonu pozwoliło uniknąć błędnych interpretacji wynikających

z możliwości brania pod uwagę mobilizacji puli marginalnej lub rezer- wowej granulocytów. Pozwoliło to wybrać taki czas pobierania krwi,

wj

я

Nr 3 | Aktywność granulopoetyczna in vivo 107 kiedy z tymi zjawiskami nie mamy już do czynienia (po pierwszych 24 godzinach od iniekcji).

Metoda chromatografii kolumnowej pozwoliła połączyć dwa efekty, pierwszy to częściowe oczyszczanie i orientacyjne określenie masy cząs- teczkowej białek wykazujących tę aktywność, drugi to prawdopodobnie

oddzielenie aktywności granulopoetycznej od inhibitorów, których ist-

nienie i lipoproteidowy charakter określono w stosunku do CSF (7, 6, 9).

Stwierdziliśmy, że substancje aktywne granulopoetycznie posiadają

różne ciężary cząsteczkowe. Sytuacja taka może wynikać jedynie z faktu jch białkowej struktury jak to sugerują także inni autorzy zarówno © w badaniach in vivo (1) jak i im vitro (15, 16). Może to wskazywać na możliwość istnienia aktywnych podjednostek tego białka, mających zdol- ność dysocjacji w określonych warunkach. Podobne wnioski można wy- ciągnąć w stosunku do CSF izolowanego z różnych tkanek i narzą-

dów (13, 14).

Określona przez nas masa cząsteczkowa pokrywa się w przypadku aktywności związanej ze szczytem pierwszym (44 000) z wynikami badań

prowadzonych przez Stanley i wsp. nad CSF w osoczu i w moczu (16,

17). Nie można też wykluczyć, iż CSF jest tylko jedną z podjednostek białka odpowiedzialnego za stymulację procesu granulopoezy w warun-

kach in vivo. |

Stwierdzone przez nas fakty mają charakter doniesienia wstępnego 'i dopiero dalsze badania biochemiczne i porównawcze z CSF pozwolą:

wypowiedzieć się czy testowane substancje są identyczne i jakie jest

miejsce ich blosyntezy. . |

Oddzielnego poruszenia wymaga też sprawa gatunkowej swoistości

badanej aktywności. Z naszych niepublikowanych doświadczeń na su- rowicy mysiej oraz z całej dostępnej literatury i z faktu braku swoi- stości gatunkowej takich hormonów jak erytropoetyna, trombopoetyna,

CSF i chalony granulocytarne, można wnioskować, iż aktywność gra-.

nulopoetyczna jest nieswoista gatunkowo przy w pełni zachowanej jej swoistości tkankowej.

М. Шмитковски

ИССЛЕДОВАНИЯ ТМ УПУО ГРАНУЛОПОЭТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЧЕЛО- ВЕЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ КРОВИ

Содержание

Исследовали гранулопоэтическую активность человеческой сыворотки, когда ее подвергли хроматографическому разделению на колонке из Сефадекса G-200.

Провели измерение этой активности с помощью прямобрюшинного применения послеколонных фракций мышам из рода „Свисс” и наблюдения числа грануло- цитов крови в течение 7 дней. Полученные результаты сравнивали с величи- нами, полученными после прямобрюшинного применения контрольных веществ, как 0,9°%/, раствор Мас! и Энкортон, вызывающий выбрасывание запасного фон- да гранулоцитов. Оиределили также с помощью молекулярной фильтрации на Сефадексе С-200 молекулярную массу белков сыворотки, обладающих грануло- поэтической активностью. Она для трех полученных верхушек активности со-

стояла: 44 000, 14 000 и около 6000. |

108 | M. Szmitkowski Nr 3

M. Szmitkowski

IN VIVO INVESTIGATIONS OF GRANULOCYTOPOIETIC ACTIVITY OF HUMAN | SERUM |

Summary

The granulocytopoietic activity of human serum was investigated after subject- ing the serum to separation on a Sephadex G-200 column. The measurements of this activity were performed administering intraperitoneally postcolumnar frac- tions to Swiss mice and tracing of the blood granulocyte count during 7 days. The obtained results were compared with the values obtained after intraperitoneal, injection of control substances such as 0.9% NaCl solution and prednisone causing release of the pool of stored granulocytes. By means of molecular filtration on Sephadex G-200 the molecular weight of serum proteins showing granulocytopoietic

‘activity was determined as well. It was 44 000, 14000 and about 6000 for the obtained activity peaks.

PISMIENNICTWO

1. Bierman H. R.: Characteristics of leukopoietin G in animals and man. N. Y. Acad. Sci., 113, 753—765, 1964.

2. Boggs D. R., Cartwright G. E., Wintrobe M. M: Neutrophilia inducing activity

‘in plasma of dogs recovering from drug induced myelotoxicity. Am. J. Physiol., 211, 51—60, 1966.

3. Boggs D. R., Marsh J. C., Chervenick P. A.: Neutrophil releasing activity in plasma of normal human subject injected with endotoxin. Proc. Soc. Exp., Biol. Med., 127, 689—693, 1968.

4. Bradley T, R., Metcalf D.: The growth of mouse bone marrow cells in vitro.

Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 44, 287—300, 1966.

5. Bradley T. R., Metcalf D., Robinson W. A.: Stimulation by leukemic sera of colony formation in solid agar cultures by proliferation of mouse bone marrow cells. Nature, 213, 926—927, 1967.

6. Gordon A. S., Handler E. S., Siegel C. D., Dornfest B. S., Lobue J.: Plasma factor influencing leukocyte release in rats. Ann. N. Y. Acad. Sci., 113, 766—774, 1964.

7. Granstrom M.: Studies on inhibitors of bone marrow colony formation in normal human sera and during a viral infection. Exp. Cell. Res, 82, 426—432, 1973.

8. Granstrom M.: Condition influencing inhibitors of the colony stimulating fac- tor (CSF). Exp. Cell. Res., 87, 307—312, 1974.

9. Granstrom M., Wahren B., Gahrton G., Killander O.: Inhibitors of the bone marrow colony formation in sera of patients with leukemia. Inst. J. Cancer.,

10, 482—488, 1972. |

10. Kalckar H. M.: Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes. III. Studies of the enzymes of purine metabolism. J. Biol.

Chem., 167, 461475, 1947.

11. Metcalf D., Moore M. A. S.: Frontiers in Biology, vol. 24, Amsterdam, North- -Holland Publishing Company, 1971.

12. Perry S., Godwin H. A. Zimmerman T. S:: Physiology of the granulocyte. J.A.M.A., 203, 937—1025, 1968. | 13. Price G. B., Senn J. S., McCulloch E. A,, Till J. E.: Heterogeneity of molecules with low molecular weight isolated from media conditioned by human leuko- cytes and capable of stimulating colony formation by human granulopoietic progenitor cells. J. Cell. Physiol., 84, 383—396, 1974.

14, Price G. B., Senn J. S., McCulloch E. A., Till J. E.: The isolation and pro- perties of granulocytic colony-stimulating activities from medium conditioned by human peripheral leucocytes. Biochem. J . 148, 209—217, 1975.

15. Stanley E. R., Metcalf D.: Partial purification and some properties of the factor in normal and leukemic human urine stimulating mouse bone marrow colony growth in vitro. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 47, 467—483, 1969.

16. Stanley E. R., Metcalf D.: The molecular weight of colony-stimulating factor (CSF). Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 137, 1029—1031, 1971.

17. Stanley E. R., Robinson W. A,, Ada G. L.: Properties of the colony stimulating

Мг 3 Aktywnosé granulopoetyczna in vivo 109 factor in leukemic and normal mouse serum. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 46, 715—726, 1968.

18. Steinberg В., Martm R. A.: Plasma factor increasing circulatory leukocytes.

Am. J. Physiol., 161, 14—20, 1950.

19. Szmitkowski M., Prokopowicz J.: Badania nad granulopoetyezna aktywmnoscia osocza krwi myszy. VI Zjazd PTDL, Poznan. Streszczenia 10, 1976.

20. Szmitkowski M., Prokopowicz J.: Rytm dobowy liczby leukocytów i ich posz- czególnych rodzajów we krwi obwodowej samic myszy. Zwierzęta lab., 14, 1977 (w druku).

21. Wolfson M., Cohns C., Colvary E., Ichiba F.: Studies of serum proteins. Am.

J. Clin. Path., 18, 723—728, 1948.

Adres autora: Zakład Diagnostyki Klinicznej, AM

15-276 Białystok, ul. M. Skłodowskiej-Curie 24 A tel. 2-28-00

KOMUNIKAT

W ramach Polskiego Towarzystwa Histochemików i Cytochemików powstała

Sekcja Tkanki Łącznej. |

Celem Sekcji jest między innymi:

1) zbieranie informacji na temat badań prowadzonych w kraju w zakresie biologii i patologii tkanki łącznej

2) inspirowanie tych badań

3) organizowanie sympozjów naukowych

4) współpraca z odpowiednimi organizacjami i ośrodkami zagranicznymi.

Sekcja Tkanki Łącznej P.T.H.C. planuje zorganizowanie wiosną 1979 r. Sym- pozjum na temat biologii i patologii tkanki kostnej z udziałem uczestników z CSRS i NRD.

Ośrodki i osoby zajmujące się w kraju problematyką tkanki łącznej proszone są o łaskawe przesłanie informacji, zawierających nazwiska kierowników i nazwi- ska wykonawców prac oraz ich tematów.

W/w informacje umożliwią sporządzenie ewidencji badań nad tkanką łączną.

Wspomniane informacje proszę przesyłać pod adresem:

Prof. dr hab. med. Eugeniusz Małdyk Instytut Reumatologiczny

ul. Spartańska 1 02-623 Warszawa

4 - Diagn. Lab.