Analysis of α-thalassemia mutations in patients diagnosed at the Institute of Hematology and Transfusion Medicine

(1)

Praca oryginalna/ Original research article

Analiza mutacji talasemii alfa u chorych diagnozowanych w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii

Analysis of a-thalassemia mutations in patients diagnosed at the Institute of Hematology and Transfusion Medicine

Edyta Klimczak-Jajor

^1,

*, Joanna Skulimowska

¹

, Paweł Turowski

¹

, Hanna Pyl

¹

, Ma łgorzata Uhrynowska

¹

, Katarzyna Guz

¹

,

Ewa Mendek-Czajkowska

²

, Anna Ejduk

³

, Izabella Kope ć

⁴

, Marzena D ębska

⁵

, Ewa Brojer

¹

1ZakładImmunologiiHematologicznejiTransfuzjologicznejInstytutuHematologiiiTransfuzjologii, kierownik:prof.drhab.EwaBrojer,Warszawa,Polska

2PoradniadlaChorychnaWrodzoneNiedokrwistościInstytutuHematologiiiTransfuzjologii, kierownik:drn.med.EwaMendek-Czajkowska,Warszawa,Polska

3PoradniaHematologicznaInstytutuHematologiiiTransfuzjologii,kierownik:lek.MonikaDąbrowska, Warszawa,Polska

4PoradniaHematologicznadlaKobietwCiążyInstytutuHematologiiiTransfuzjologii,kierownik:

drn.med.IzabellaKopeć,Warszawa,Polska

5IIKlinikaGinekologiiiPołożnictwaCentrumMedycznegoKształceniaPodyplomowego,Kierownik:

prof.drhab.med.RomualdDębski,Warszawa,Polska

informacje o artykule

Historiaartykułu:

Otrzymano:09.06.2016 Zaakceptowano:04.10.2016 Dostępneonline:14.10.2016

Słowakluczowe:

talasemiaalfa

mikrocytoza

gap-PCR

MLPA

abstract

Background:Alpha-thalassemia is genetically transmitted hemolytic anemia resulting fromdisturbanceoftheglobins chainsynthesis.Alpha-thalassemiaiscausedmostfre- quentlybydeletionsandlesscommonlybynondeletionaldefects.Aim: Tointroducethe molecular methods for routine identiﬁcations of alpha-thalassemia mutations and to studythe characteristics ofthese mutationsin Poland. Methods: Bloodsample of155 patientswithnormalorreducedHbA2valueswasobtainedforbloodcounting.Allsam- ples underwent gap-PCR to screen for the seven common a-thal deletions and MLPA analysis.TheDNAof21patientsinwhichdeletionswerenotdetectedhasbeendirectly sequenced. Results:We detected mutations in the alpha-globin gene in 72 of 155 patientsstudied.55outof72casesshowedmostcommonthalassemiadeletions,asthe

*Adres do korespondencji: Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej, PracowniaNiedokrwistościUwarunkowanychGenetycznie,ul.IndiryGandhi14,02-776Warszawa,Polska.Tel.:+48223496679(673);

fax:+48223496611.

Adresyemail:eklimczak@ihit.waw.pl,edytaklimczakjajor@gmail.com(E.Klimczak-Jajor).

ContentslistsavailableatScienceDirect

Acta Haematologica Polonica

journal homepage:www.elsevier.com/locate/achaem

http://dx.doi.org/10.1016/j.achaem.2016.10.002

zo.o.Allrightsreserved.

(2)

Wstęp

Talasemiealfa togrupagenetycznieuwarunkowanych nie- dokrwistościhemolitycznychspowodowanychzaburzeniami włańcuchualfaglobiny.Sątotakzwanehemoglobinopatie ilościowe będące efektem zaburzeń w produkcji prawidło- wychłańcuchówalfaglobiny.

Syntezaalfa globinyjest kodowanaprzezklastergenów znajdujących się na krótszym ramieniu 16 chromosomu (16p.13.3). W klastrze tym, na każdym chromosomie są obecne dwa geny kodujące łańcuch alfa hemoglobiny a:

genHBA2,genHBA1,atakżegenzeta,pseudogeny,genteta oraz elementy regulatorowe (m.in. HS-40) [1, 2].

W komórce diploidalnej znajdują się więc cztery geny kodującełańcucha.

Nieprawidłowąprodukcjęalfaglobinypowodująmutacje wgenachkodującychtebiałkalub wichregionachpromo- torowych(np.HS-40). Mutacje prowadzącedotalasemii alfa towokoło80%przypadkówdelecje[3,4]jednegolubwięcej genów.Znacznierzadziejsątomutacjepunktowe:substytu- cje,insercje lub delecjepojedynczego nukleotydulub kilku nukleotydów[5].

U chorychz talasemią alfaobserwuje sięzahamowanie produkcjialfaglobinywróżnymstopniu,cojestzależneod tego,ilespośródczterechgenówniegenerujeekspresjialfa globiny[6].

Mutacja powodująca brak ekspresji jednej kopii genu powoduje talasemię alfa plus. Pacjent z taką postacią talasemii alfa, (-a/aa) określany jest jako „cichy nosiciel alfa-talasemii”; dochodzi u niego do częściowego spadku poziomu alfa globiny. Najczęstszymi mutacjami pojedyn- czegogenusądelecje:a^3.7ia^4.2.

Delecje obejmujące oba genyHBA2 iHBA1 prowadządo talasemii alfa zero. W takim przypadku mutacja prowadzi do połowicznego zahamowania syntezy alfa globiny. Taka postaćtalasemii alfaokreślana jestjako„cecha alfa-talasemii” (alpha-thalassemia trait). Przykładami tych mutacji są MEDI,SEA,THAI,FIL,a^20.5,orazrzadziejwystępująceBRIT, SA,CAL[7–9].

Złożone heterozygoty, uktórych doszło dounieczynnie- niatrzechkopiigenów,prowadządotzw.chorobyhemoglo- biny H (HbH) [10]. Natomiast brak ekspresji wszystkich czterech genów alfa globiny prowadzi do powstania tzw.

hemoglobinyBart’s.

U pacjentówzmikrocytoząihipochromiącoraz częściej wykonywanesąwPolscebadaniawkierunkutalasemii[11].

Wykazują one, że choroba ta w Polsce występuje i należy rozszerzać i udoskonalać ich diagnostykę o zastosowanie metod molekularnych.Badania molekularne są szczególnie istotne dla zdiagnozowania talasemii alfa, bo tylko za ich pomocą można ustalić to rozpoznanie. W prezentowanej pracy przedstawiamy wyniki badań molekularnych w kierunku występowaniatalasemiialfawykonanych wnaszym ośrodkuorazcharakterystykęwykrytychmutacji.

Materiały i metody

Próbki pełnej krwi pobranej na EDTA po ocenie podstawo- wychparametrówkrwinkiczerwonej(aparatMythic,Orphee) poddawano analizie biochemicznej w kierunku talasemii.

Wynik badania poziomu HbA2 w granicach normy lub obniżony(norma1,9–3,5%)stanowiłpodstawędoprzeprowa- dzeniabadańgenetycznychw kierunkutalasemiialfau155 osób (91 kobiet i 64 mężczyzn), w dominujacej większości pochodzeniakaukaskiego.Wśródtejgrupybyły trzyrodziny oraz 147 niespokrewniomych pacjentów. W przeważającej większości byli to pacjenci z Poradni dla Chorych na Wrodzone Niedokrwistości Instytutu Hematologii i Trans- fuzjologii; niektórzy kierowanibyli do diagnostyki z innych ośrodków w Polsce. Stężenie HbA2 badane było metodą mikrokolumnowej chromatograﬁi anionowymiennej przy użyciu zestawu Beta-Thal HbA2Quick Column (Helena Bios- ciences). DNA izolowano z krwi obwodowej przy użyciu zestawuNucleospinDxBlood(MacheryNagel);jegostężenie iczystośćmierzonowNANODROP.

DNA wyizolowane od każdego chorego badano w kierunku najczęściej występujących mutacji: a^3.7, a^4.2, SEA;

MED I;FIL; a^20.5,THAI za pomocą specyﬁcznych dlakażdej delecji primerów przy użyciu multipleksowej reakcji gap- PCR (termocykler GeneAmp PCR system 9700), [12]. Do wykrycia triplikacji stosowano osobny PCR [13]. Produkty PCRrozdzielanoelektroforetycznienażeluagarozowym2%.

WizualizacjęprowadzonowświetleUV.Jakokontroli pozy- tywnych użyto otrzymane grzecznościowo z Uniwersytetu LeidenpróbkiDNAzww.delecjami.

Wszystkie uzyskanewyniki zgap-PCRpotwierdzano me- todą MLPA (multiplex ligation – dependent probe ampliﬁcation) (MRC-Holland, Amsterdam, Holandia) z wykorzystaniem

alfaglobina

delecje

Keywords:

Alpha-thalassemia

Microcytosis

gap-PCR

MLPA

Alpha-globin

Deletions

following:asinglegenedeletion(a^3.7anda^4.2)andbothgenesdeletion(FIL,SEA,MEDI, anda^20.5).OwingtotheuseofMLPAtechnique,wefoundnontypicaldeletionsinanother 12 patients and multiplication of the alpha-globin genes in further 4 cases. We also identiﬁedapatientwithapointmutationHBA2:c.300+2T>AbyDNAsequencing.Conc- lusions: Molecularanalysisofthealpha-globinclusterisrequiredforacorrectdiagnosis inpatientswithnormalorreducedlevelofHbA2.

Theresultsofthestudyshowthatduetotheprogressivemigrationofthepopulation andglobalization,thalassemiamustbeincludedinthedifferentialdiagnosisofanemia inPoland.

(3)

zestawuSALSAMLPAprobemixP140-B4HBA.Badaniawyko- nanowedługzałączonejinstrukcji,rozdziałelektroforetyczny przeprowadzono za pomocą analizatora genetycznego ABI 3130 (Applied Biosystems, USA), analizę przeprowadzono przy użyciu programu Coffalyser. Metoda ta pozwala na ocenę liczby kopii eksonów lub genów, do których są skierowane sondy, wykrywając delecje bądź multiplikacje badanych obszarów chromosomu. Zasadą tej techniki jest powielanie sond, które uległy hybrydyzacji do określonych sekwencjibadanegoDNA.

U 21 pacjentów, u których nie wykryto przy użyciu powyższych metod delecji ani multiplikacji genów alfa globiny, przeprowadzono sekwencjonowanie genów HBA1 iHBA2w celuwykryciamutacjipunktowych.Produkty PCR uzyskane za pomocą primerów specyficznych dla HBA2 i HBA1 oczyszczano za pomoca QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), reakcje sekwencjonowania matrycy wykony- wano z użyciem zestawu odczynników BigDye terminator v1.1. Sequencing. Rozdział elektroforetyczny wyznakowa- nychfluorescencyjniefragmentówDNAwykonanozapomo- cąanalizatoragenetycznegoABI3130.

Wyniki

U155pacjentówpoddanychbadaniomgenetycznympoziom HbA2wynosiłod1,0%do3,1%. Zapomocąmetodygap-PCR zidentyﬁkowano mutacje odpowiadające za talasemię alfa u 55 pacjentów. Przykładowy wynik analizy produktów ampliﬁkacjiprzedstawiononarycinie1.

U 22 osób wykryto mutacjępojedynczego genu, delecję a^3.7. Wśród tych przypadków 8 osób wytypowano jako postaćhomozygotyczną(–a^3.7/–a^3.7),a14jakopostaćhetero- zygotyczną(–a^3.7/aa) tejdelecji. Jednegopacjenta zidentyﬁ- kowanojakonosicielamutacjia^4.2(–a^4.2/aa).

Wśród mutacji dwugenowych u badanych pacjentów zidentyﬁkowano delecjęFIL, SEA, MED I, 20,5kb. U 17 osób stwierdzono delecję FIL (–^FIL/aa). 7 chorych okazało się nosicielami delecji SEA (–^SEA/aa), w tym jeden przypadek

homozygotycznej postaci prowadzący do tzw. Hb Bart’s hydrops fetalis. Dwa przypadki zidentyﬁkowano jako mutacje MEDI(–^MED/aa),a1przypadekjakomutacjęa^20.5(–a^20.5/aa).

Wśród badanych zidentyﬁkowano 5 osób jako chorych z HbH. Oznacza to, że u tych badanych tylko jeden z czterech genów funkcjonuje prawidłowo. Trzy pozostałe ulegajądelecjilub2genydelecji,ajedenmutacjipunktowej.

Nasze przypadki stanowiły złożone heterozygoty z delecji a^3.7/FIL(-a^3.7/–^FIL)(3osoby),delecjia^3.7/SEA(-a^3.7/–^Sea)(jeden przypadek) i a^3.7/nietypowa delecja (-a^3.7/–) (również jeden przypadek).

Badanie MLPA potwierdziło występowanie wszystkich ww. mutacji (Ryc. 2), a także pozwoliło na wykrycie kolejnych mutacji, niewykrywalnych w metodzie gap-PCR u 16 kolejnych pacjentów. U 2 osób zidentyﬁkowano mutację w obrębieregionupromotorowegogenualfaglobiny,HS-40.

Inne przypadki z tej grupy to: 2 przypadki delecji, które obejmują tylko jeden genHBA1, oraz 8przypadkówdelecji obejmująceobageny:HBA1,jakiHBA2orazregionpromoto- rowy, HS-40. Dokładna wielkość oraz końcowa sekwencja delecji nie jest znana. Przypadki te wymagają dalszych, szczegółowychbadań.DziękiMLPAwykrytoteż4przypadki multiplikacji.U3pacjentówtotriplikacja3.7(aa/aaa^anti^3.7), potwierdzona też metodą gap-PCR. Natomiast u jednego pacjentazaobserwowanokwadryplikacjęgenówHBA1,HBA2 (aaaa/aa).

U 21 osób, u których nie wykryto mutacji delecyjnych, wykonano sekwencjonowanie. U jednego pacjenta, trzy- dziestoośmioletniegomężczyzny,znalezionomutacjępunk- tową (Ryc.3.) Byłato heterozygotyczna substytucjatyminy na adeninęw intronie2, genu HBA2 w miejscu wycinania intronu. Stężenie HbA2 u tego pacjenta wynosiło 2,6%.

Parametry czerwonokrwinkowe były następujące: liczba krwinek czerwonych (RBC) -6,2410⁶/ml, Hb – 14,7g/dl, średnia objętość krwinki (MCV) – 71,6 ﬂ, średnia masa Hb w krwince (MCH) – 23,6 pg, rozpiętość rozkładu objętości krwinkiczerwonej(RDW)–11,8%.

Ogółem,zastosowanemetodybadańgenetycznychpozwo- liły na wykrycie mutacji w genie alfa globiny u 72 ze 155 badanych chorych (46%) z podejrzeniem talasemii alfa.U 67 osób, odpowiedzialna za talasemię alfa okazała się delecja.

Natomiast w jednym przypadku, w wyniku sekwencjonowania, wykryto mutację punktową. W 4 przypadkach wykryto multiplikacjęliczbygenówalfaglobiny.

Wśród 67 pacjentów z delecją wytypowano 17 osób z brakiem jednej kopii genu alfa globiny, a 44 pacjentów z brakiemdwóchgenów.U5osóbstwierdzonomutacjedla 3kopii genówalfa globiny,au1brakekspresjiwszystkich czterechkopiigenów(Ryc.4).

Analizując wyniki badań morfologicznych chorych ze zdiagnozowaną delecją w alfa globinie,stwierdzono uprze- ważającej większościchorychprawidłowąliczbęerytrocytów 5,8x10⁶/ml0,8 (Tab. I). Większość pacjentów wykazywała mikrocytozę w stopniu zależnym od rodzaju mutacji. Przy delecjijednegogenu(-a^3.7/aa)MCVwzależnościodpacjenta wynosiłood66fldo93fl.Wprzypadkuuszkodzeniadwóch genów mikrocytoza była większa. Przy homozygotycznej postaci delecji a^3.7 (-a^3.7/-a³⁷) średnie MCV=66,7 fl4,1, w przypadkudelecjiFIL,MCV=63,33,1fl,delecjiSEA 65,6

7,2ﬂ,delecjiMedI(2pacjentów)62,81,8ﬂ,delecjiHS-40 Ryc.1–Obrazelektroforetycznyproduktówotrzymanych

wwynikugap-PCR:Ścieżki:M-markerwielkości2kb;1:

prawidłowy,2:a^3.7,3:FIL,4:a^20.5,5:MED1,6:a^4.2,7:SEA;

Wielkośćamplifikowanychfragmentówpodanawparach zasad

Fig.1–GelelectrophoresisofPCRamplifieda-thaldeletions;

Lanes:M=DNAsizemarker,2kbDNAladder;1:WT;2:a^3.7; 3:FIL;4:a^20.5;5:MED1;6:a^4.2;7:SEA;Sizeofamplified fragmentsaregiveninbasepairs

(4)

MCV=63,45,7 fl (2 pacjentów), delecji 20,5kb (1 pacjent) MCV=61,3 fl. U 12 pacjentów z nieokreśloną delecją, MCV wynosiło66,61,3fl.Dla 5chorych zwykrytąchorobąHBH średnieMCV miałowartość57,86,8fl,awartośćhemoglo- binywynosiła8,81,1g/dl,natomiastMCHiRDWodpowied- nio:17,4pg1,1i19,6%2,5.

Omówienie

W prezentowanej pracy wykonaliśmy badania genetyczne wkierunkutalsemiialfauchorychkierowanychdoleczenia

i diagnostykidoPoradni DlaChorych naWrodzone Niedo- krwistości oraz doPracowni NiedokrwistościUwarunkowa- nychGenetycznieIHiT. Zgodniezwcześniejszymiobserwa- cjami stwierdziliśmy, że talasemia alfa jest obecna u pol- skichchorych,choćPolskanienależydotypowychrejonów występowaniatalasemii ihemoglobinopatii [14]. U 72 pa- cjentów stwierdziliśmy defekt w łańcuchu alfa globiny, czyliwskazaliśmymutacjęcharakterystycznądlatalasemii alfa u46% badanych pacjentów.Wśród tejgrupy przynaj- mniejpołowamiałakaukaskiepochodzenie.Uosóbskiero- wanychnabadaniemolekularnestwierdzonoróżnystopień nasilenia mikrocytozy,któryokazałsięzależnyodrodzaju mutacji. Niewielką mikrocytozę lub nawet normocytozę zaobserwowano u chorych z uszkodzonym tylko jednym genem (–a^3.7/aa). Natomiast użadnegochorego z mutacją obejmującąprzynajmniejdwageny MCVniebyłopowyżej 80ﬂ,co zgodnejestz dostępnąliteraturą[15].Ubadanych chorych stwierdzono też obniżony czy pozostający wgranicachnormypoziomHbA2.Należyjednakzaznaczyć, że wartość HbA2 może też być obniżona (lub pozostająca w granicach normy) w przypadku niedoboru żelaza [16], niedokrwistości aplastycznej, niedokrwistości syderoblas- tycznej czy też niedokrwistości będącej wynikiem chorób przewlekłych. Istniejąteż przypadki hemoglobinopatii(np.

hemoglobina Lepore) czy współwystępowania różnych typów talasemii i hemoglobinopatii, które mogą zaniżać poziomHbA2[17].Tylkozastosowaniemetodbiologiimole- kularnej pozwala nawykrycie mutacji powodujących tala- semięalfa.

Ryc.2–WynikianalizywybranychmutacjidelecyjnychwgenachaglobinymetodąMLPAprzyużyciuprogramuCoffalyser:

A[genotypprawidłowy],B[genotyp-a^3.7/aa],C[genotyp:–a^3.7/–a^3.7],D[genotyp:–/aa],E[genotyp:–^SEA/aa],F[genotyp:

-a^3.7/–^FIL]

Fig.2–Resultsofselectedmutationanalysisofalpha-globingenesemployingMLPAusingCoffalyser:A[genotypeWT],B[genotype:

-a^3.7/aa],C[genotype:-a^3.7/–a^3.7],D[genotype:S/aa],E[genotype:–^SEA/aa],andF[genotype:-a^3.7/–^FIL]

Ryc.3–Fragmentsekwencjialfaglobiny.Strzałkawskazuje miejscemutacji;HBA2:c.300+2T>A

Fig.3–DNAsequenceofa-globingenevariant.Thearrow pointstothemutationsite;HBA2:c.300+2T>A

(5)

Na całym świecie powszechnie wykrywa się jednoge- nowądelecjęa^3.7[18–20].Podobniewnaszejpracytadelecja byławykrywana najczęściej – wykrytoją u 27 chorych, co stanowiprawie40%wykrytychtypówmutacji.Wewcześniej przeprowadzonych badaniach w IHiT opublikowanych w 2010 [21]wśród 10 pacjentówz delecjami 5przypadków stanowiłydelcjea^3.7.Następnapodwzględemczęstotliwości w naszych badaniach była delecja FIL (prawie 30% wśród analizowanych przypadków), a dalej delecja SEA (12%).

Wykryliśmyteżpojedynczeprzypadkidelecjiwystępujących często w krajach śródziemnomorskich: Med I, a^20.5 [22, 23]

orazdelecjia^4.2.Użadnegozbadanychchorychnie wykry- liśmydelecjiTHAI,popularnejwTajlandii[24].

Uzyskanewynikiwykazały,żewbadanejgrupieprzewa- żają delecje dwugenowe. Stanowią 65% ogółem wykrytych

delecji,8chorychztejgrupymanietypowedelecje,niemie- szczące się w grupie siedmiu popularnych mutacji. Ich wykrycie możliwe było tylko dzięki zastosowaniu techniki MLPA.

Wśród badanych w obecnej pracy chorych wykryto aż 5 pacjentów z chorobą HbH oraz jeden przypadek najcięż- szej postaci alfa-talasemii, prowadzącej do braku syntezy alfa globiny tzw. Hb Bart’s hydrops fetalis. Tacy chorzy, zekspresjątylkojednegogenuHBA,częstosądiagnozowani w południowo-wschodniej Azji [25]. Wobec coraz większej migracji osób z tych regionów świata do Polski musimy liczyćsięzrozpoznawaniemtychpostacitalasemiialfa.

Punktowe niedelecyjne postaci talasemii alfa występują na świecie zdecydowanie rzadziej [14]. Wśród grupy badanych pacjentów zdiagnozowaliśmy jeden taki przypadek, gdzie miała miejsce zamiana pojedynczego nukleotydu (tyminy na adeninę) w intronie II genu HBA2. Mutacja ta występuje wbazie hemoglobinjakoHBVar ID2522 IVSII-2 (T>A)HBA2:c.300+2T>Aalpha+/alpha0.Dotej poryopisano w literaturze jedną rodzinę z tą mutacją [26]. Wykryto ją u trzydziestosześcioletniego mężczyzny w północnej Euro- pie. Zarówno nasz przypadek, jak i opisany w literaturze, charakteryzowały się podobnymi wynikami morfologicz- nymi ibiochemicznymi. Unaszego pacjentaMCVwynosiło 78,5 ﬂ, MCHC 23,3 pg, a HbA2 2,6%. U pacjenta opisanego przezHartevelda(odpowiednio)75ﬂ,23,7pgi2,6%.

Kolejny typ mutacji, który odkryliśmyw grupie polskich chorych,tomultiplikacjełańcuchaalfaglobiny.Zwiększenie liczbykopiigenualfaglobinyniejesttalasemią,aleprowadzi do zaburzenia równowagi w ilości alfa i beta globiny w komórcei,ostatecznie,przywspółwystępowaniuztalase- miąbetaprowadzidocięższejpostacifenotypowejtalasemii.

[27]. Badania genetyczne w kierunku talasemii beta u tych pacjentówsąwtoku.

Zewzględunapostępującąmigracjęludnościiglobalizację talasemia musibyć uwzględniona w diagnostyce różnicowej niedokrwistości w krajach poza jej głównym endemicznym

TabelaI–Wartościskrajnewskaźnikówhematologicznychibiochemicznychdlapacjentówzdelecjamiwklastrzea globiny

TableI–Hematologicalandbiochemicaldata(ranges)forpatientswithdeletionsinthea-globingene Genotyp

ogólny

Genotyp szczegółowy

badanych pacjentów

Liczba przypadków

RBC

10⁶/l K

RBC

10⁶/l M

Hb (g/dl)

K

Hb (g/dl)

M

MCV (ﬂ)

MCH (pg)

HbA2

(%)

-a/aa -a^3.7/aa 14 4,4–5,6 4,3–7,2 11,4–13,2 11,0–14,3 66,0–93,0 20,0–31,5 1,6-2,8

-a^4.2/aa 1 – 5,4 – 12,2 69,0 22,7 1,7

-a^NN/aa 2 6,1–6,6 – 12,1–13,5 – 56,5–71,0 18,3–22,1 2,0–2,3

-a/-aoraz–/aa -a^3.7/-a^3.7 8 5,0–6,3 5,5–5,7 10,6–13,0 11,1–11,8 62,3–73,0 20,1–22,1 1,5–2,4

-^FIL/aa 17 5,2–6,1 6,2–6,8 10,3–12,0 12,2–14,8 59,5–69,5 17,7–22,8 1,7–2,8

-^SEA/aa 6 5,2–6,1 6,2–7,3 10,2–10,9 12,1–13,5 57,9–76,1 16,7–21,2 1,6–2,6

-^MED/aa 2 5,3 6,7 11,9 14,5 60,8–64,7 21,6–22,5 2,7–3,0

-a^20.5/aa 1 – 7,6 – 13,2 61,3 17,4 1,6

-^NN/aa 8 5,7–6,5 6,2–7,0 10,2–12,7 13–14,7 60,6–68,9 17,8–22,0 2,2–2,7

-^HS40/aa, 2 6,3 4,8 11,4 10,4 59,3–67,4 17,9–21,9 2,2–2,6

-a/– -a^3.7/-^FIL 3 4,8–5,4 5,8 8,5–10,1 9,6 55,5–57,7 16,7–18,8 1,0–1,4

-a^3.7/-^Sea 1 4,1 – 7,3 – 68,7 17,8 1,4

-a^3.7/– 1 – 5,3 – 8,5 50,2 16 1,5

a^NN/aa–nieznanedelecjeobejmującejedengen,-^NN/aa–nieznanedelecjeobejmującedwageny,K–płećżeńska,M–płećmęska Ryc.4–Liczbawykrytychprzypadkówdelecjiobejmujących

jeden(-a/aa),dwa(-a/-aorazS/aa),trzy(-a/–)lubcztery (–/–)geny

Fig.4–Mutationratedependingontheamountofdeleted genes(mutationinvolvingonegene(-a/aa),two(-a/-aand –/aa),three(-a/–)orfour(–/–)genes)

(6)

występowaniemw pasie okołorównikowym. Badania bioche- miczneumożliwiająilościoweijakościoweoszacowanieobec- ności poszczególnych frakcji hemoglobin, natomiast badania molekularne prowadzą do zdiagnozowania mutacji. Opraco- wanywnaszymzespolesystembadańmolekularnychoparty nazastosowaniutrzechmetodbadawczychpozwoliłnajedno- znaczną identyﬁkację u chorych z podejrzeniem talasemii alfa, a tym samym potwierdził diagnozę. Rozpoznanie talasemii alfa ma bardzo istotne znaczenie kliniczne, bo chroni pacjentów przed niepotrzebną suplementacją preparatamiżelaza,awdalszejperspektywieprzedrozwi- nięciemsięhemochromatozy.

Podziękowania/Acknowledgement

Dziękujemy panudr Cornelisowi Harteveldowiz Uniwersy- tetu Leiden w Holandii za udostępnienie próbek DNA ze określonymimutacjami

Wkład autorów/Authors’ contributions

Wedługkolejności.

Konﬂikt interesu/Conﬂict of interest

Niewystępuje.

Finansowanie/Financial support

Pracaczęściowoﬁnansowana zplanunaukowego Instytutu HematologiiiTransfuzjologii,Warszawa,Polska –tematnr:

4.15/2015

Etyka/Ethics

Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami DeklaracjiHelsińskiej,dyrektywamiEUorazujednoliconymi wymaganiamidlaczasopismbiomedycznych.

pi smiennictwo/references

[1] WuMY,HeY,YanJM,LiDZ.Anovelselectivedeletionof themajora-globinregulatoryelement(MCS-R2)causinga- thalassaemia.BrJHaematol2016Feb25.http://dx.doi.org/

10.1111/bjh.14005[Epubaheadofprint].

[2] WayeJS,ChuiDHK.Thea-globingenecluster:geneticsand disorders.ClinInvestMed2001;24:103–109.

[3] GalanelloR,CaoA.Alpha-thalassemiaGenetMed 2011;13:83–88.

[4] HarteveldC.Stateoftheartandnewdevelopmentsin moleculardiagnosticsforhemoglobinopathiesin multiethnicsocieties.IntJnlLabHem2014;36:1–12.

[5] HiggsDR,VickersMA,WilkieAOM,PretoriusIM,JarmanAP, WeatherallDJ.Areviewofthemoleculargeneticsofthe humana-globingenecluster.Blood1989;73:1081–1104.

[6] HiggsDR.TheMolecularBasisofa–Thalassemia.Cold SpringHarbPerspectMed2013;3:a011718.

[7] ShajiRV,EuniceSE,BaidyaS,SrivastavaA,ChandyM.

Determinationofthebreakpointandmoleculardiagnosis ofacommona-thalassaemia-1deletionintheIndian population.BrJHaematol2003;123:942–947.

[8] EngB,GgreenlayB,WayeJS.CharacterisationoftheBritish a⁰-thalaessemiadeletion:evidenceofafoundereffectin Newfoundland.CanadaBrJHaematol2009;147:150–156.

[9] FicheraM,SpallettaA,FiorenzaF,etal.Molecularbasisof a-thalassemiainSicily.HumGenet1997;99:381–386.

[10] FuchareonS,ViprakasitV.HbHsisease:clinicalcoursand diseasemodiﬁers.Hematology2009;2009:26–34.

[11] AlbrechtK,Adamowicz-SalachA,SiwickaA,BurzyńskaB, MatysiakM.Nowoczesnerozpoznawanietalasemiiudzieci –doświadczeniawłasne.JTransfMed2011;4:105–114.

[12] KiddJL,AzimiM,LubinB,VichinskyE,HoppeC.Application ofanexpandedmultiplexgenotypingassayforthe simultaneousdetectionofHemoglobinConstantSpring andcommondeletionala-thalassemiamutations.IntJnl LabHem2010;32:373–380.

[13] WangW,MaESK,ChanAYY,etal.Singletubemultiplex- PCRscreenforAnti-3,7andanti-4,2a-globingene triplications.ClinChem2003;49:1679–1682.

[14] HarteveldCL,HiggsDR.a-thalassaemia.OrphanetJRare Dis2010;5:13–21.

[15]ChanLC,MaSK,ChanAYY,etal.Shouldwescreenforglobin genemutationsinbloodsampleswithmeancorpuscular volume(MCV)greaterthan80ﬂinareaswithahigh prevalenceofthalassaemia?JClinPathol2001;54:317–320.

[16] GulenH,HanimeliO,KaracaO,TaneliF.a-thalassaemia frequencyandmutationsinchildrenwithhypochromic mirocytcanemiaandrelationwithb-thalassemia,iron deﬁciencyanemia.PediatrHematolOncol2012;29:241–246.

[17] TurowskiP,UhrynowskaM,BrojerE.Talasemie- patoﬁzjologia,podstawymolekularneidiagnostyka.

Hematologia2013;4:239–256.

[18] WayeJS,EngB.Diagnostictestingfora-globingene disordersInaheterogeneousNorthAmericanpopulation.

IntJnlLabHem2013;35:306–313.

[19] WeiXF,ShangX,HeDQ,HuangJW,ZhangXH,XuXM.

Molecularcharacterizationofanovel27,6-kbdeletion causinga⁺thalassemiainaChinesefamily.AnnHematol 2011;90:17–22.

[20] BorgioJF.Molecularnatureofalpha-globingenesinthe Saudipopulation.SaudiMedJ2015;36:1271–1276.

[21] SplittA,MokrasU,WindygaJ,KościelakJ.Zastosowanie metodmPCRiMLPAwdiagnostycetalasemiia.PrzLek 2010;67:460–464.

[22] OrigaR,PagliettiME,SollainoMC,etal.Complexityof alpha-globingenotypesidentiﬁedwiththalassemia screeninginSardinia.BloodCellsMolDis2014;52:46–49.

[23] NichollsRD,HiggsDR,CleggJB,WeatherallDJ.a8- thalassaemiaduetorecombinationbetweenthea1-globin geneandanAluIrepeat.Blood1985;65:1434–1438.

[24] ViprakasitV.a-thalassaemia:agenotype-phenotype correlationandmanagement.InternationalSocietyof BloodTransfusion2015;10:295–304.

[25] ChuiDHK.a-thalassaemia:HbHDiseasesandHbBarts HydropsFetalis.AnnNYAcadSci2005;1054:25–32.

[26] HarteveldCL,JebbinkMCW,vanderLelyN,vanDelfP, AkkermansN,ArkesteynS,etal.a-thalassemiaphenotype inducedbythenewIVS-II-2(T!A)splicedonorsite mutationonthea2-globingene.Hemoglobin2006;30:3–7.

[27]JiangH,LiuS,ZhangYL,WanJH,LiR,LiDZ.Association ofana-globinclusterduplicationandheterozygous b-thalassemiainapatientwithaseverethalassemia syndrome.Hemoglobin2015;39:102–106.