1
Spis treści
1.
W
STĘP... 4
2.
C
EL I ZAKRES PRACY... 7
3.
C
ZĘŚĆ LITERATUROWA... 9
3.1. MACIERZE PEPTYDOWE I ICH ZASTOSOWANIA ... 9
3.1.1. Budowa i struktura peptydów ... 12
3.1.2. Synteza peptydów ... 13
3.1.3. Metody immobilizacji peptydów ... 21
3.2. MACIERZE POLIMEROWO-PEPTYDOWE ... 24
3.2.1. Macierze peptydowe na polimerowym filmie ... 26
3.2.2. Macierze peptydowe z polimerowym linkerem ... 31
3.2.3. Metody syntezy macierzy peptydowych z liniowymi linkerami polimerowymi ... 41
3.3. METODY DETEKCJI STOSOWANE W BADANIACH Z WYKORZYSTANIEM MACIERZY PEPTYDOWYCH ... 46
3.3.1. Spektrometria mas ... 47
3.3.2. Spektroskopia fluorescencyjna ... 50
4.
C
ZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA... 52
4.1. STOSOWANE REAGENTY I ROZPUSZCZALNIKI ... 52
4.2. PRZYGOTOWANIE ROZPUSZCZALNIKÓW I ODCZYNNIKÓW ... 54
4.3. SYNTEZA ZNAKOWANYCH FLUORESCENCYJNIE PEPTYDÓW ... 54
4.3.1. Synteza CF-GR(Pbf)M ... 54
4.3.2. Synteza CF-GR(Pbf)MLG ... 56
4.4. SYNTEZA KONIUGATU POLI(TLENKU ETYLENU) Z PEPTYDEM ... 56
4.5. FUNKCJONALIZACJA PODŁOŻY KRZEMOWYCH ... 58
4.5.1. Utlenienie podłoży krzemowych ... 58
2
4.5.3. Oznaczenie gęstości amin na powierzchni ... 58
4.6. SZCZEPIENIE PEG DO PODŁOŻA ... 59
4.6.1. Wyznaczanie gęstości szczepienia PEG ... 59
4.7. IMMOBILIZACJA PEPTYDÓW I KONIUGATU ... 60
4.8. ADSORPCJA ALBUMINY Z SUROWICY WOŁOWEJ... 61
4.9. REAKCJA ENZYMATYCZNA NA PODŁOŻU ... 61
4.9.1. Krzywa kalibracji CF-GR ... 61
4.10. STOSOWANE TECHNIKI CHARAKTERYSTYKI PEPTYDÓW, KONIUGATU I PRODUKTÓW HYDROLIZY ENZYMATYCZNEJ ... 63
4.10.1.Spektrometria mas z jonizacją przez elektrorozpylanie (ESI-MS) ... 63
4.10.2.Wysokosprawna chromatografia cieczowa w układzie odwróconych faz (RP-HPLC) ... 63
4.10.3.Spektroskopia fluorescencyjna ... 64
4.10.4.Spektroskopia UV-vis ... 64
4.11. STOSOWANE METODY CHARAKTERYSTYKI POWIERZCHNI ... 64
4.11.1.Spektrometria mas jonów wtórnych z analizatorem czasu przelotu (ToF-SIMS) ... 64
4.11.2.Mikroskopia siła atomowych (AFM) ... 64
4.11.3.Pomiar kąta zwilżania (CA) ... 65
4.11.4.Rentgenowska spektroskopia fotoelektronowa (XPS) ... 65
5.
W
YNIKI BADAŃ I DYSKUSJA... 66
5.1. SYNTEZA I CHARAKTERYSTYKA PEPTYDÓW ... 67
5.2. SYNTEZA I CHARAKTERYSTYKA KONIUGATU PEG-PEPTYD ... 71
5.3. FUNKCJONALIZACJA PODŁOŻY KRZEMOWYCH ... 74
5.3.1. Charakterystyka sfunkcjonalizowanych powierzchni krzemowych ... 75
5.3.2. Oznaczenie gęstości obsadzenia amin na powierzchni ... 78
3
5.4.1. Charakterystyka powierzchni z PEG za pomocą spektrometrii mas jonów
wtórnych z analizatorem czasu przelotu ToF-SIMS... 80
5.4.2. Charakterystyka powierzchni z PEG za pomocą XPS ... 87
5.4.3. Oznaczenie gęstości szczepienia PEG ... 87
5.4.4. Analiza hydrofilowości i morfologii powierzchni z PEG ... 90
5.5. SYNTEZA MACIERZY PEPTYDOWYCH ... 93
5.5.1. Charakterystyka macierzy za pomocą ToF-SIMS ... 95
5.5.2. Charakterystyka powierzchni z peptydami za pomocą XPS ... 100
5.5.3. Oznaczenie gęstości immobilizacji peptydów ... 100
5.5.4. Analiza hydrofilowości i morfologii powierzchni peptydowych ... 104
5.6. BADANIE ADSORPCJI BIAŁEK NA POWIERZCHNI ... 106
5.6.1. Analiza ToF-SIMS powierzchni po adsorpcji BSA ... 107
5.6.2. Analiza XPS powierzchni po adsorpcji BSA ... 112
5.7. HYDROLIZA ENZYMATYCZNA MACIERZY PEPTYDOWYCH W OBECNOŚCI TRYPSYNY ... 113
5.7.1. Analiza powierzchni po reakcji enzymatycznej ... 116
5.7.2. Analiza roztworu ... 119
