Alternatywne sposoby terapii i profilaktyki zakażeń biofilmowych. Część 2.

(1)

ALTERNATYWNE SPOSOBY TERAPII I PROFILAKTYKI ZAKAŻEŃ

BIOFILMOWYCH. CZĘŚĆ 2.

ALTERNATIVE WAYS OF THERAPY AND PROPHYLAXIS OF BIOFILMASSOCIATED INFECTIONS. PART 2.

ORCID*: 0000-0001-6383-3972 | 0000-0001-8895-7082 | 0000-0002-2980-6273 | 0000-0002-5627-7354 | 0000-0001-8465-659X

Pracownia Biologii Zakażeń Katedry Immunologii i Biologii Infekcyjnej Instytutu Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego

} BEATA SADOWSKA

Pracownia Biologii Zakażeń,

Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii,

Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź, Tel.: 42 635 45 25, e-mail: beata.sadowska@biol.uni.lodz.pl Wpłynęło: 28.10.2019 Zaakceptowano: 07.11.2019 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2019054 *według kolejności na liście Autorów

STRESZCZENIE: W pracy zaprezentowano syntetyczny przegląd dostępnej wiedzy na temat wykorzystania biologicznych substancji czynnych przeciwdrobnoustrojowo, takich jak biosur-faktanty, enzybiotyki (w tym pochodzenia bakteriofagowego) oraz roślinne olejki eteryczne. Rozważaniami objęto ich aktualne i potencjalnie perspektywiczne zastosowanie w obszarze szeroko pojętej terapii (leczenia, antyseptyki, sanityzacji i dezynfekcji). Poruszono aspekt zapo-biegania i/lub możliwości zwalczania zakażeń, u których podstaw leży tworzenie bioﬁlmu. Po-nadto uwagę poświęcono problemom związanym z możliwościami kontroli źródeł zakażeń w abiotycznym środowisku szpitalnym oraz poza nim.

SŁOWA KLUCZOWE: biosurfaktanty, enzybiotyki, olejki eteryczne, sanityzacja, zwalczanie bioﬁlmu ABSTRACT: This paper presents a synthetic review of the available knowledge on the use of biological antimicrobial active substances, such as biosurfactants, enzybiotics (including bac-teriophage-origin) and plant essential oils. It coveres their current and potentially prospective application in the area of broadly understood therapy (treatment, antiseptics, sanitization and disinfection). The aspect of prevention and/or the possibilities of combating bioﬁlm-associated infections was discussed. In addition, some attention was given to the problems of controlling the sources of infection in an abiotic hospital environment and beyond.

KEY WORDS: bioﬁlm control, biosurfactants, enzybiotics, essential oils, sanitization

WSTĘP

Przed zagłębieniem się w rozważania merytoryczne do-tyczące nowoczesnych przeciwdrobnoustrojowych rozwią-zań profilaktycznych/terapeutycznych należy zapoznać się ze skrótowo przedstawionymi obowiązującymi regulacja-mi prawnyregulacja-mi odnośnie wprowadzenia na rynek polski tego rodzaju środków. Mowa o definicjach decydujących o przy-należności określonych kategorii produktów stosowanych przez człowieka w celu ochrony jego zdrowia (zachowania dobrostanu). Zgodnie z Ustawą z dnia 6 września 2001 roku Prawo farmaceutyczne (art. 2, pkt. 32) produkt leczniczy definiowany jest jako „substancja lub mieszanina substan-cji posiadająca właściwości, dzięki którym może być zasto-sowana w celu zapobiegania chorobom, leczenia chorób wy-stępujących u ludzi lub zwierząt, podawana w celu postawie-nia diagnozy, przywrócepostawie-nia, poprawiepostawie-nia lub modyfikacji

fizjologicznych funkcji organizmu poprzez działanie far-makologiczne, immunologiczne lub metaboliczne”. W myśl ustawy (art. 2, pkt. 38) za wyrób medyczny uznawane jest „narzędzie, przyrząd, urządzenie, oprogramowanie, mate-riał lub inny artykuł, stosowany samodzielnie lub w połą-czeniu, w tym z oprogramowaniem przeznaczonym przez jego wytwórcę do używania w celach diagnostycznych lub terapeutycznych i niezbędnym do jego właściwego stosowa-nia”. Powyższe definicje często budzą wątpliwości interpre-tacyjne, gdyż przykładowo niektóre wyroby medyczne przy-pominają produkty lecznicze z uwagi na ich postacie: maści, czopki, pasty do zębów, syropy, nawilżające krople do oczu, pastylki do ssania, np. umożliwiające tworzenie ochronne-go filmu na błonie śluzowej jamy ustnej i gardła, lizaki, a na-wet iniekcje (np. w formie ampułkostrzykawek do poda-nia dostawowego w przebiegu choroby zwyrodnieniowej). Wyroby medyczne mogą też zawierać substancje lecznicze,

(2)

w tym ekstrakty ziołowe i roślinne oraz substancje pocho-dzące z ludzkiej krwi lub osocza, które działają na orga-nizm w sposób pomocniczy, wspierający względem wyro-bu. Jeżeli jednak takie substancje działają w większym stop-niu niż pomocniczy i jest to działanie główne, a wyrób me-dyczny jest dla nich tylko nośnikiem, wtedy produkt praw-dopodobnie zostanie sklasyfikowany jako produkt leczni-czy. Z kolei Ustawa z dnia 9 października 2015 roku o pro-duktach biobójczych (Dz.U. z 2018 r., poz. 122 z późn. zm.) stanowi, że produkt biobójczy to substancja lub mieszanina składająca się z jednej lub kilku substancji czynnych, której przeznaczeniem jest „niszczenie, odstraszanie, unieszkodli-wianie organizmów szkodliwych, zapobieganie ich działa-niu lub zwalczanie ich w jakikolwiek sposób inny niż dzia-łanie czysto fizyczne lub mechaniczne” [56]. Niezależnie od czasem trudnej, bo wieloznacznej, klasyfikacji formalnej wszystkie nowe produkty, których działanie obejmuje za-pobieganie lub zwalczanie organizmów szkodliwych – np. bakterii, grzybów, wirusów, ekto- i endopasożytów – są cen-ne, ponieważ rozszerzają zakres i ofertę ich zastosowania. Wyżej wymienione deklarowane działanie danego produk-tu może bowiem dotyczyć ogólnie pojętego środowiska/oto-czenia/obszaru funkcjonowania człowieka, jak również jego organizmu (skóry, błon śluzowych, tkanek i organów we-wnętrznych).

Pierwszą część prezentowanego opracowania poświęco-no omówieniu przyczyn pogłębiającego się deficytu sku-teczności konwencjonalnych antybiotyków i chemiotera-peutyków oraz perspektyw dla innych opcji terapeutycz-nych. Uwagę skupiono na aktywności przeciwdrobnoustro-jowej produktów nieantybiotykowych oraz ich potencjale w zakresie immunomodulacji wrodzonych mechanizmów obronnych. W drugiej części przedstawiono uzasadnienie zastosowania w profilaktyce i terapii produktów z tzw. po-granicza, czyli takich, których działanie może być opisywa-ne definicjami produktu leczniczego, wyrobu medyczopisywa-ne- medyczne-go lub produktu biobójczemedyczne-go, zależnie od zadeklarowanemedyczne-go sposobu i obszaru zastosowania.

Rozpatrując znaczenie kliniczne biofilmów w kontek-ście ich zwalczania, nie można nie doceniać powstawania i utrzymywania się tzw. biofilmów środowiskowych. Podob-nie jak biofilmy tworzone w organizmie człowieka są one wysoce oporne/tolerancyjne, w tym przypadku na działa-nie czynników fizycznych (np. promieniowania UV), che-micznych i biologicznych środków dezynfekcyjnych/anty-septycznych. Z punktu widzenia epidemiologii właśnie ta-kie biofilmy obecne w szeroko pojętym otoczeniu są czę-stym źródłem zakażeń u hospitalizowanych pacjentów, wy-kazujących zazwyczaj już na wstępie pewne deficyty odpor-ności i/lub poddawanych inwazyjnym procedurom medycz-nym. Dlatego też świadoma higiena rąk, właściwa antysep-tyka i asepantysep-tyka w postępowaniu z chorym, dezynfekcja na-rzędzi i innych powierzchni stykających się bezpośrednio

lub pośrednio z pacjentem (powierzchni ogólnych oraz po-wietrza) to kluczowe elementy zapobiegania tego typu za-każeniom. W związku z tym zgodne z procedurami i skru-pulatne monitorowanie stanu mikrobiologicznego zanie-czyszczenia krytycznych punktów kontrolnych w tych ob-szarach oraz wdrożenie czynności zapobiegawczych/inter-wencyjnych jest równie ważne jak koniecznie wdrożona do-raźna terapia.

BIOSURFAKTANTY  PRZYSZŁOŚĆ

W ZASTOSOWANIU KLINICZNYM

I NIEKLINICZNYM, W ŚRODOWISKU

SZPITALNYM ORAZ POZA NIM

Biosurfaktanty (ang. biological surface active agents), czy-li związki powierzchniowo czynne (ZPC) pochodzenia bio-logicznego, swoją rosnącą popularność zawdzięczają przede wszystkim niższej toksyczności, większej podatności na bio-degradację i silniejszej aktywności biologicznej, w porówna-niu z ich syntetycznymi odpowiednikami. Ich ważnym atu-tem jest również zachowana aktywność w wysokich atu- tempe-raturach i w szerokim zakresie wartości pH, bez utraty cen-nych właściwości fizykochemiczcen-nych. Charakterystyczną cechą wszystkich ZPC jest amfifilowa budowa cząsteczek – każda z nich składa się z części hydrofobowej (ogon) oraz hydrofilowej (głowa). Właśnie dzięki takiej strukturze bio-surfaktanty mogą brać udział w procesach zachodzących na granicy faz, np. obniżać napięcie powierzchniowe czy stabi-lizować emulsje i piany [2, 36, 39]. W związku z tym sur-faktanty/biosurfaktanty są z powodzeniem stosowane w róż-nych gałęziach przemysłu, m.in.: w rolnictwie i bioremedia-cji (do eliminai bioremedia-cji metali ciężkich i produktów ropopochod-nych z wody i gleby), w przemyśle petrochemicznym, spo-żywczym, kosmetycznym i farmaceutycznym [9, 27, 47, 58, 60]. Ich ważnym zastosowaniem w kontekście profilaktyki zakażeń jest niewątpliwie udział w formulacji wielu środków dezynfekcyjnych stosowanych nie tylko w obszarze medycz-nym, lecz także weterynaryjnym oraz w gospodarstwie do-mowym. Warte uwagi jest także używanie biosurfaktantów w nanotechnologii, szczególnie w obszarze zielonej synte-zy nanocząstek o działaniu przeciwdrobnoustrojowym – jo-nów srebra i innych metali/tlenków metali. W tym ujęciu za-znacza się głównie rola stabilizująca surfaktyny Bacillus sub-tilis czy ramnolipidu Pseudomonas aeruginosa w stosunku do fazy ciekłej syntezowanych nanocząstek [44].

Producentami biosurfaktantów są głównie drobno-ustroje, choć znane są także surfaktanty roślinne i zwierzę-ce. U mikroorganizmów związki te pełnią szereg istotnych funkcji fizjologicznych, wpływając na metabolizm, ruch czy formowanie biofilmu [3, 50]. Ze względu na budowę che-miczną oraz wielkość cząsteczek mikrobiologiczne surfak-tanty dzieli się na:

(3)

t HMJLPMJQJEZoSBNOPMJQJEZ TPGPSPMJQJEZ MJQJEZNBOOP-zyloerytritolu, lipidy trehalozy, lipidy celobiozy; t MJQPQFQUZEZJڀMJQPQSPUFJOZ

t GPTGPMJQJEZ LXBTZUVT[D[PXFJڀMJQJEZPCPKʒUOF t CJPTVSGBLUBOUZ[P˃POF OQHMJLPQSPUFJOZ

t CJPTVSGBLUBOUZ TQFDKBMOF OQ TLBEOJLJ ĕNCSJJ Jڀ PUP-czek [39, 44].

Ze względu na swoje właściwości niektóre surfaktan-ty pochodzenia mikrobiologicznego – glikolipidy (soforo-lipidy), cykliczne lipopeptydy, polimyksyny i gramicydyny – znalazły zastosowanie jako antybiotyki o mniej lub bar-dziej wybiórczym zakresie działania przeciwbakteryjnego. Z kolei surfaktyna została przebadana pod względem wła-ściwości przeciwwirusowych, a ituryna – przeciwgrzybi-czych. Szczególne znaczenie w kontekście rozwoju alterna-tywnych sposobów terapii i profilaktyki zakażeń mają jed-nak biosurfaktanty o szerokim zakresie właściwości prze-ciwdrobnoustrojowych, wśród których przeważają gliko-lipidy i lipopeptydy [36, 39]. Mechanizm ich biobójcze-go działania polega na zwiększaniu przepuszczalności bło-ny komórkowej drobnoustrojów, co prowadzi do tworze-nia w niej porów, a w efekcie dochodzi do lizy całej komór-ki [17, 51]. Przykładowo w badaniach Janka i wsp. opisano właściwości przeciwdrobnoustrojowe nowo odkrytego lipi-du trehalozy prolipi-dukowanego przez szczep Rhodococcus fa-scians BD8 [24]. Dokonano prób zastosowania tego biosur-faktantu w modyfikacji biomateriałów do zastosowań me-dycznych w celu utrudnienia adhezji drobnoustrojów. Po-nieważ wiadomo, że od adhezji zaczyna się proces zasiedla-nia biomateriałów i tworzezasiedla-nia na ich powierzchni struktur biofilmu, zainteresowanie tym produktem jest w pełni uza-sadnione. Wykazano in vitro, że wstępne opłaszczenie pły-tek polistyrenowych oraz silikonowych cewników urolo-gicznych biosurfaktantem produkowanym przez R. fascians spowodowało istotne zahamowanie adhezji zarówno bak-terii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych, a także droż-dżaków Candida albicans. Najsilniejszy efekt hamujący od-notowano w przypadku C. albicans i Escherichia coli (spa-dek odpowiednio o 95% i 70% przy zastosowaniu biosur-faktantu w stężeniu 0,5 mg/ml) [24]. Podobny zakres ba-dań przedstawili Satpute i wsp., potwierdzając przeciwadhe-zyjne/przeciwbiofilmowe działanie surfaktantu Lactobacil-lus acidophiLactobacil-lus (surlaktyna) wobec ważnych przedstawicie-li patogenów Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, w odnie-sieniu do kilku różnych rodzajów powierzchni o znaczeniu biomedycznym [49]. Z kolei Coronel-León i wsp. udowod-nili, że opłaszczenie polistyrenu lichenizyną Bacillus liche-niformis AL1.1 hamowało adhezję MRSA (ang. methicillin--resistant Staphylococcus aureus) o 40–68% oraz C. albicans – o 30–74% [15]. Przypuszcza się, że właściwości przeciw-adhezyjne tych substancji wynikają z oddziaływań elektro-statycznych pomiędzy powierzchnią opłaszczoną biosur-faktantem a komórkami drobnoustrojów [13, 21, 25, 43].

Zmiana fizykochemicznych warunków środowiska pod wpływem działania biosurfaktantów może utrudniać roz-wój populacji biofilmowych również poprzez zmniejszanie żywotności drobnoustrojów [18, 36]. Haque i wsp. opisali właściwości przeciwbiofilmowe soforolipidu produkowane-go przez Starmerella bombicola MTCC1910 [22]. Biosurfak-tant ten hamuje ekspresję genów odpowiedzialnych za pro-dukcję istotnych czynników wirulencji C. albicans, takich jak: HWP1, ALS1, ALS3, ECE1 i SAP4, biorących udział między innymi w tworzeniu strzępek, adhezji tych grzy-bów do powierzchni abiotycznych i komórek, wiązaniu bia-łek zewnątrzkomórkowej macierzy gospodarza, agregacji i tworzeniu biofilmu. Natomiast Liu i wsp. wykazali skutecz-ność surfaktyny Bacillus subtilis w usuwaniu dojrzałego bio-filmu S. aureus z powierzchni polistyrenowych, szklanych i stalowych [30]. Opisano także inny mechanizm działania tej substancji, który polega na zakłócaniu produkcji polisa-charydowej adhezyny międzykomórkowej (PIA/PNAG) po-przez hamowanie ekspresji genów icaA i icaD, co prowa-dzi do destabilizacji struktury biofilmu. Ponadto stwierdzo-no w tych badaniach, iż surfaktyna może również regulo-wać aktywność autoinduktora 2 (AI-2), powodując zabu-rzenia komunikacji typu quorum sensing między komór-kami drobnoustrojów tworzących biofilm [30]. Warto jed-nak zwrócić uwagę, iż nie wszystkie szczepy gronkowców produkują adhezynę PIA/PNAG, a jej funkcje struktural-ne w tworzeniu macierzy biofilmu (ang. extracellular poly-meric substance – EPS) przejmują inne polisacharydy i biał-ka wydzielnicze lub/i związane z komóri biał-kami tych bakterii [46]. W przypadku takich szczepów surfaktyna B. subtilis może więc nie wykazywać swojego potencjału przeciwbio-filmowego. To sugeruje ostrożność co do uogólniania po-zytywnej opinii o przeciwbiofilmowych możliwościach bio-surfaktantów. Jemil i wsp. udowodnili jednak, że lipopepty-dy produkowane przez Bacillus methylotrophicus DCS1 były tak samo skuteczne w hamowaniu tworzenia biofilmu testo-wanych drobnoustrojów, jak i w jego usuwaniu [25]. Zasto-sowanie tych związków w stężeniu 1 mg/ml spowodowało in vitro znaczącą eliminację biofilmów: C. albicans (89,5%), S. aureus (77%), Salmonella Typhimurium (75%), Bacil-lus cereus (74,8%) i Klebsiella pneumoniae (50,3%) [25]. Na podstawie wielu badań opisujących właściwości przeciwbio-filmowe biosurfaktantów można stwierdzić, że mechanizm ich działania jest złożony i może polegać zarówno na zabu-rzaniu integralności macierzy biofilmu (EPS), hamowaniu produkcji polimerów wchodzących w jej skład, jak i na mo-dyfikacji właściwości adhezyjnych komórek drobnoustro-jów tworzących mikrokolonie [17, 40, 50]. Jednak, pomimo wzrastającej liczby doniesień naukowych opisujących prze-ciwdrobnoustrojową/przeciwbiofilmową aktywność biosur-faktantów in vitro, faktyczne ich zastosowanie w przemyśle biomedycznym i instytucjach zdrowia jest wciąż niewiel-kie [48]. Główną przeszkodą jest fakt, iż biosurfaktanty są

(4)

produkowane jako mieszaniny kongenerów, których pro-porcje są różne, zależnie od mikroorganizmu i warunków wzrostu, w tym składu podłoża hodowlanego. Trudno więc dokonać standaryzacji uzyskanych preparatów, jakiej wy-maga się od wyrobów do zastosowań medycznych. Ponad-to sPonad-topień skuteczności danego biosurfaktantu i jego me-chanizm działania może być różny, w zależności od zało-żonych warunków doświadczalnych, w tym użytych szcze-pów czy metodologii badawczej. Potrzebne jest więc opra-cowanie jednolitych procedur przygotowania/badania bio-surfaktantów w celu otrzymania spójnych wyników powala-jących na poszerzenie zakresu możliwości ich zastosowania [36]. Mimo powyższych uwag dyskusyjnych/krytycznych, w podsumowaniu można powiedzieć, że w obszarze biome-dycznym surfaktanty mikrobiologiczne:

t CʒEʇNPHZCZʉXڀQS[ZT[PʯDJTUPTPXBOFKBLPQS[FDJX-adhezyjne powłoki biologiczne materiałów medycz-nych wprowadzamedycz-nych do organizmu człowieka; t NP˃OBKFCʒE[JFSØXOJF˃XʇD[ZʉXڀTLBEQSFQBSBUØX

probiotycznych stosowanych w infekcjach przewodu pokarmowego, układu moczowo-płciowego i zakażeń dolnego odcinka układu oddechowego.

Wprawdzie ogromny potencjał komercyjnego zastoso-wania biosurfaktantów jest w tym punkcie czasowym nadal ograniczony ze względu na wysoki poziom kosztów ich izo-lacji i oczyszczania, ale to wydaje się być możliwe do po-konania dzięki postępowi wiedzy oraz technik preparatyw-nych i badawczych.

ROŚLINNE OLEJKI ETERYCZNE JAKO

PRODUKTY LECZNICZE, WYROBY MEDYCZNE

I PRODUKTY BIOBÓJCZE

Rośliny, podobnie jak organizmy zwierzęce, wykształci-ły w drodze ewolucji mechanizmy pozwalające na unika-nie efektów ataku mikroorganizmów, oparte na wytwarza-niu substancji będących zazwyczaj produktami metaboli-zmu wtórnego. W obrębie tej grupy bardzo ważne są olejki eteryczne, pod względem chemicznym złożone mieszaniny substancji, z których przynajmniej jedna (ale zwykle wię-cej) wykazuje działanie przeciwdrobnoustrojowe. Uważa się, iż mechanizm ich działania może być częściowo zależ-ny od ich lipofilności/hydrofobowości, umożliwiając łatwe wbudowywanie i uszkadzanie dwuwarstwy lipidowej bło-ny komórkowej drobnoustrojów i/lub upośledzenie działa-nia istotnych dla przeżycia drobnoustrojów systemów en-zymatycznych oraz przebiegu ich szlaków metabolicznych [35, 52]. Ze względu na wielokierunkowe działanie olej-ki eteryczne oraz ich składniolej-ki znajdują od wielu lat empi-ryczne zastosowanie w przemyśle spożywczym (jako natu-ralne substancje smakowe, aromatyzujące oraz działające konserwująco i sanityzująco), w przemyśle kosmetycznym,

perfumeryjnym oraz farmaceutycznym (jako składniki kremów, tabletek, maści, syropów, mieszanek ziołowych, stosowanych w terapiach wspomagających leczenie różno-rodnych schorzeń). W związku z powyższym, reprezentu-jąc różnorodne właściwości biologiczne, olejki eteryczne mogą być zaklasyfikowane jako produkty lecznicze, wyro-by medyczne oraz produkty biobójcze. Wyżej wymienione preparaty, zwykle złożone, zawierające olejki lub ich skład-niki, są cenne, bo są dobrze tolerowane i często wzmacnia-ją działanie równocześnie zastosowanych klasycznych che-mioterapeutyków [12, 26].

W odniesieniu do zwalczania biofilmów drobnoustrojów nie sposób nie wspomnieć o zastosowaniu olejków: w uzu-pełniającym leczeniu mikrourazów i ran, w infekcjach dróg moczowych, układu oddechowego, w stomatologii oraz w infekcyjnych i innych schorzeniach dermatologicznych [11, 29, 31, 38, 45]. Swoją długą historię etnomedyczną w ta-kim zastosowaniu ma np. olejek eteryczny z liści drzewa her-bacianego (Melaleuca alternifolia, TTO). Wchodzi on od lat w skład m.in. różnorodnych zasypek antyseptycznych. Ostatnio proponowany jest też w postaci płynów antysep-tycznych o formulacji nanocząstek zawierających TTO, sto-sowanych w celu zwalczania patologicznych biofilmów oko-łozębowych [16]. W literaturze można także znaleźć inte-resujące wyniki badań poświęconych przeciwbiofilmowe-mu działaniu innych olejków eterycznych oraz wielu izolo-wanych z nich składników, z których najczęściej jest badany eugenol [34]. W badaniach własnych wykazano np. aktyw-ność bójczą olejków eterycznych pozyskanych nie tylko z li-ści drzewa herbacianego, lecz także z kwiatów lawendy (La-vandula angustifolia), z owocni cytrynowca zwyczajnego (Ci-trus limon) oraz ziela melisy lekarskiej (Melissa officinalis), użytych wobec hodowli rozproszonej i biofilmowej S. aureus oraz E. coli [7]. Innych przykładów na zastosowanie olejków jest wiele, np. znany jest szereg niekonwencjonalnych opa-trunków, które dotąd znalazły uznanie tylko w eksperymen-talnej opiece paliatywnej chorych z zainfekowanymi owrzo-dzeniami, w tym pacjentów onkologicznych. Są to np. opa-trunki zawierające miód Manuka czy olejek z nasion kozie-radki oraz procedury typu aromaterapia ran z udziałem in-nych olejków eteryczin-nych zawierających aktywne frakcje lot-ne [8, 19, 28, 37]. W tym aspekcie nie tylko ważlot-ne jest bez-pośrednie działanie przeciwdrobnoustrojowe, lecz także ak-tywność immunomodulująca w stosunku do niesprawnych mechanizmów naprawczych w ranie przewlekle zakażonej. Przykładowo składniki olejku TTO, takie jak: terpinen-4-ol, 1,8-cyneol, alfa-terpineol, obniżają produkcję TNF (ang. tu-mor necrosis factor), interleukiny 1 (IL-1), IL-8, IL-10 i pro-staglandyny E2 oraz hamują wytwarzanie przez monocyty reaktywnych form tlenu (RFT) [41]. Z kolei olejek tymianko-wy znacznie zmniejsza obrzęk oraz napływ leukocytów pod-czas zakażenia rany, a olejek rozmarynowy nasila proces an-giogenezy, epitelializacji oraz stymuluje obkurczanie się rany

(5)

u pacjentów z cukrzycą [1]. Obszerne dane dotyczące za-stosowania olejków w infekcjach dermatologicznych moż-na zmoż-naleźć w opracowaniu Orchard i van Vuuren [38]. Kilka olejków eterycznych uzyskało formalne zezwolenie na zasto-sowanie medyczne, jako skuteczne i bezpieczne antyseptyki. Na tej podstawie np. Warnke i wsp., jako jedni z pierwszych, wykorzystali wybrane olejki eteryczne o przyjemnym zapa-chu (TTO, eukaliptusowy, cytrynowy, cytronelowy, koniczy-nowy, tymiankowy) do leczenia infekcji u pacjentów z nie-operacyjnym rakiem płaskonabłonkowym szyi i głowy, cier-piących na zakażenia owrzodzeń nowotworowych bakteria-mi beztlenowybakteria-mi [62]. W badaniach skomponowano (w for-mie sprayu, na bazie 40% alkoholu etylowego) i wykazano w próbach klinicznych zadowalające działanie antyseptyczne oraz przeciwzapalne zastosowanej mieszanki [62].

W kontekście rosnącej lekooporności drobnoustrojów na szczególną uwagę zasługuje intensywnie badana możli-wość wykorzystania produktów roślinnych jako czynników modulujących oporność drobnoustrojów lub obniżających ich wirulencję. Jak się okazuje, wiele związków roślinnych, w tym olejków, ma zdolność oddziaływania na wybrane struktury i mechanizmy odpowiedzialne za reprezentowany fenotyp oporności bakterii oraz grzybów na leki. Niezwykle interesujący nurt badań światowych to także poszukiwanie wspomnianego wcześniej możliwego synergizmu pomiędzy olejkami eterycznymi a antybiotykami lub innymi biocyda-mi [6]. Może on skutkować nie tylko wyraźnym zahamo-waniem wzrostu nawet wielolekoopornych drobnoustrojów, lecz także możliwością uzyskania efektu odległego w czasie, tzw. efektu poantybiotykowego (ang. post-antibiotic effect – PAE). Nie bez znaczenia jest również możliwe jednocze-sne ujawnienie się aktywności immunomodulującej zasto-sowanych fitozwiązków.

Niewątpliwie do ważnego trendu badań należy opraco-wanie optymalnych formulacji preparatów zawierających olejki, takich które zapewniają ich łatwą penetrację do ce-lowej struktury, w tym biofilmu. Przykładowo zapropono-wano ich nanoenkapsulację zmniejszającą lotność dane-go olejku, a więc zapobiegającą utracie stężenia niektórych aktywnych biologicznie składników. W rezultacie można było w ten sposób osiągnąć poprawę stabilności, zwiększe-nie rozpuszczalności w wodzie oraz utrzymazwiększe-nie skutecz-ności terapeutycznej preparatów na bazie olejków eterycz-nych przygotowaeterycz-nych w postaci nano- lub mikroemulsji [5]. Wspomniane wcześniej nanocząstki zawierające TTO to też przykład nowatorskiej formulacji olejku, produktu o bardzo dawno znanej i uznanej aktywności przeciwdrobnoustrojo-wej [16]. Podobną strategię formulacji produktu zastosowali Barik i Singh, którzy opracowali stabilną nanoemulsję bioak-tywnych związków z olejku eterycznego Gaultheria fragran-tissima (eugenol i salicylan metylu) [4]. W ich badaniach, skoncentrowanych na profilaktyce zakażeń pokarmowych, wykazano znacznie wyższą aktywność przeciwbakteryjną

i obniżającą wirulencję E. coli O157:H7 nanoemulsji, w po-równaniu do preparatów wyjściowych. Uzyskano w rezul-tacie istotnie zmniejszoną ekspresję genów, między innymi kodujących curli, fimbrie typu I, toksyny Shiga, autoinduk-tory quorum sensing, które warunkują adhezję i tworzenie biofilmu oraz decydują o patogenności tych bakterii. Otrzy-mane nanoemulsje wkomponowane w hydrożel i zastoso-wane do pokrycia powierzchni szkła, polistyrenu, a nawet próbek mięsa skutecznie hamowały (80%) tworzenie depo-zytu biofilmowego enterokrwotocznych E. coli [4]. Pozosta-jąc w nurcie zastosowania olejków eterycznych w przemyśle spożywczym, można wspomnieć o publikacji przeglądowej autorstwa Huang i wsp., poświęconej powłokom polimero-wym o wykończeniu przeciwdrobnoustrojopolimero-wym, mającym potencjalne zastosowanie w opakowaniach jednostkowych i zbiorczych żywności [23].

Sanityzujące działanie olejków eterycznych wykazano również w badaniach Valeriano i wsp., w których ocenia-no działanie przeciwbiofilmowe roztworów dezynfekują-cych na bazie olejków z mięty pieprzowej (Mentha piperi-ta) i trawy cytrynowej (Cymbopogon citratus) [57]. Obiek-tem badań były ważne patogeny z rodziny Enterobacteriace-ae – Salmonella enterica serotyp enteritidis – a efekt sanity-zujący oceniano na powierzchni ze stali nierdzewnej, symu-lującej powierzchnie przemysłowe stosowane w przetwór-stwie spożywczym. Opracowane roztwory dezynfekujące uznano za wysokiej jakości naturalne alternatywy dla stoso-wania konwencjonalnych środków odkażających w przemy-śle spożywczym. Ważne miejsce w niniejszej pracy zajmuje omówienie w podobnym kontekście wykorzystania nie tyl-ko olejków eterycznych i ich składników, lecz także przed-stawicieli grupy naturalnych enzybiotyków oraz biosurfak-tantów [57]. Biorąc pod uwagę fakt, że prewencja zakażeń pokarmowych jest ważnym zadaniem w ochronie zdrowia, wyżej wymienione osiągnięcia mikrobiologii należy uznać za bardzo ważne.

Przedstawione powyżej nurty badawcze dotyczące przy-datności olejków eterycznych w szeroko pojętym zwalcza-niu patogenów człowieka potwierdzają ich potencjał pro-filaktyczny i terapeutyczny nie tylko w dziedzinie medycy-ny, lecz także w innych obszarach ściśle związanych z ży-ciem człowieka. Dalszy rozwój standardów alternatywne-go postępowania za pomocą kombinacji substancji, któ-re nie generują oporności na leki, jest wyzwaniem współ-czesnej medycyny i epidemiologii. Można mieć nadzie-ję, że produkty typu ekstrakty roślinne, olejki eteryczne i ich składniki, pod koniecznym warunkiem standaryzacji i dokonania charakterystyki farmakologicznej oraz oce-ny bezpieczeństwa stosowania, będą wkrótce mogły stano-wić cenną alternatywę lub ważny element klasycznego po-stępowania profilaktycznego i terapeutycznego. Ciekawe, krytyczne opracowanie na powyższy temat opublikowali Wińska i wsp. [63].

(6)

BAKTERIOFAGI I INNE ENZYBIOTYKI

W PRAKTYCE MEDYCZNEJ I PRZEMYSŁOWEJ

Badania nad zastosowaniem fagoterapii – alternatyw-nej dla antybiotyków strategii zwalczania zakażeń powo-dowanych przez wielolekooporne drobnoustroje – zyskały w ostatnich dekadach dużą popularność na całym świecie. Warto pamiętać, że mija już 100 lat od początków ich te-stowania jako opcji terapeutycznej w erze przedantybioty-kowej (Francja, 1919). Mimo to w większości krajów status fagoterapii to wciąż eksperyment medyczny, którego sku-teczność eradykacyjna, szczególnie w odniesieniu do po-pulacji biofilmowej zaangażowanej w większość tzw. trud-nych infekcji, jest niewystarczająca [20, 33, 42, 55]. Bak-teriofagi mają wprawdzie wiele cech, które czynią je teo-retycznie użytecznym narzędziem terapeutycznym, ale ich zastosowanie w powyższym celu nie jest pozbawione po-ważnych wad. Wśród nich istotna jest konieczność wcze-śniejszej identyfikacji czynnika/czynników etiologicznych zakażenia i określenie ich fagowrażliwości. W tym przy-padku pewnym rozwiązaniem jest zastosowanie koktajli fagowych, fagów o szerokim zakresie gospodarzy lub czą-stek modyfikowanych genetycznie w celu jego poszerzenia. Nie można też pominąć w rozważaniach dotyczących zalet i wad fagoterapii problemu złożonych interakcji egzogen-nych fagów z układem odpornościowym gospodarza. Czę-sto końcowy efekt terapeutyczny, wskutek faktu jego po-mijania, jest trudny do przewidzenia i oszacowania ska-li sukcesu. Chociaż w kontrolowanych badaniach in vitro uzyskiwano pozytywne rezultaty działania przeciwbiofil-mowego bakteriofagów, okazuje się, że ich zastosowanie in vivo, jako jedynego środka terapeutycznego, nie jest i ra-czej nie może być w pełni skuteczne. Wymienia się w tym kontekście szereg poważnych przyczyn, których przezwy-ciężenie z racji dobrze już poznanej fizjologii biofilmu jest praktycznie niemożliwe. W celu zadziałania bakteriofagów niezbędne jest bowiem dotarcie do celu ataku (powierzch-ni osłon komórki drobnoustroju), rozpozna(powierzch-nie swoistych receptorów, wniknięcie do jego wnętrza i zrealizowanie cy-klu litycznego. W badaniach wykazano, że lista przeszkód na drodze przebiegu powyższego cyklu w odniesieniu do biofilmu jest długa i obejmuje:

t PHSBOJD[FOJF EZGV[KJ GBHØX QS[F[ &14 CJPĕMNV Hʒ-stość biomasy oraz jej strukturę przestrzenną; t PCOJ˃FOJF NJBOB GBHØX Xڀ XZOJLV JDI BETPSQDKJ EP

martwych komórek oraz produktów ich rozpadu obecnych w biofilmie;

t PCOJ˃FOJFUFNQBNFUBCPMJ[NVEPDFMPXZDILPNØSFL MJ-mitujące pozytywny skutek działania fagów wskutek spo-wolnienia lub zatrzymania przebiegu cyklu litycznego; t

VKBXOJFOJFTJʒXڀCJPĕMNJFTVCQPQVMBDKJCBLUFSJJPQPS-nych na dane fagi i ich szybki przerost całej struktury;

t TQBEFL MJD[CZ Jڀ QPXJOPXBDUXB SFDFQUPSØX EMB GBHØX na powierzchni najbardziej wyeksponowanych komó-rek w biofilmie wskutek wpływu wzrostu stężenia au-toinduktorów systemu quorum sensing [42].

Optymizm odnośnie skuteczności bakteriofagoterapii zakażeń typu biofilmowego nieco osłabł, chociaż wcześniej pokładano w jej zastosowaniu wielkie nadzieje. Niestety brak jest przekonujących dowodów dotyczących sukcesów terapeutycznych pochodzących z właściwie kontrolowanych i odpowiednio licznych prób klinicznych [14, 20]. Jako ak-tualne i perspektywiczne działania, mające na celu wzmoże-nie aktywności bakteriofagów kontrolujących biofilm, wy-mienia się szereg przedsięwzięć modyfikujących i napra-wiających ich zastosowanie. Rekomenduje się: mechanicz-ne oczyszczanie miejsca depozytu biofilmu przed aplikacją fagów terapeutycznych, wdrożenie terapii złożonej z fagów i konwencjonalnych antyseptyków/antybiotyków/prepara-tów enzymatycznych (depolimeraz, holin, endolizyn), za-stosowanie koktajlu fagów o rozszerzonym profilu gospoda-rzy, wykorzystanie zdobyczy inżynierii genetycznej w celu ulepszenia/wzbogacenia zakresu właściwości biologicznych fagów danego typu. Wspomniane wdrożenie terapii kom-binowanej fagów i innych produktów przeciwdrobnoustro-jowych jest prawdopodobnie najbardziej perspektywiczne [53]. Z uwagi na dostępność obszernych opracowań litera-turowych w powyższym zakresie oraz ograniczony plan ni-niejszej publikacji, temat ten nie będzie dalej rozwijany. Au-torzy zachęcają jednak do lektury artykułów publikowanych w niedawno powołanym czasopiśmie PHAGE: Therapy, Ap-plications, and Research. Należy zwrócić uwagę na podej-mowane próby mające na celu opracowanie innych skutecz-nych metod zwalczania biofilmu bakteryjnego z udziałem nie całych bakteriofagów, ale m.in. pochodzących od nich produktów białkowych. To od ich wykazanego wcześniej i scharakteryzowanego później działania litycznego wzglę-dem organizmów docelowych gospodarzy rozpoczęła się kariera depolimeraz osłon komórki, holin i lizyn [10].

Holiny to niskocząsteczkowe hydrofobowe białka fagów, które naruszając płynność i integralność błony cytoplazma-tycznej, umożliwiają endolizynom dostęp do peptydoglika-nu w celu jego trawienia/naruszenia struktury. Lizyny/dolizyny, nie tylko fagowe, wykazują różną aktywność en-zymatyczną, są to:

t /BDFUZMPNVSBNJOJEB[Z MJ[P[ZNMVCMJUZD[OBUSBOTHMJ-kozylaza) i endo-β-N-acetyloglukozamidazy – rozcina-jące wiązanie β-1,4-glikozydowe w peptydoglikanie; t FOEPQFQUZEB[ZoUOʇDFNPTULJQFQUZEPXF

t BNJEB[Z /BDFUZMPNVSBNZMP-BMBOJOPXF o PEDJ-nającej wiązanie amidowe między L-alaniną a resztą N-acetylomuramylową.

Oprócz dwóch ostatnich, pozostałe można zaliczyć do depolimeraz polisacharydów. Wśród nich są oczywiście te

(7)

fagowe produkty białkowe ostatecznie degradujące ścianę bakteryjną zainfekowanej komórki w cyklu litycznym [32].

Tak jak się spodziewano, znajomość mechanizmów lizy od zewnątrz i od wewnątrz (ang. lysis in or out) bakterii realizowanych podczas fagowego cyklu replikacji stała się ważną inspiracją do podjęcia nowatorskich kierunków ba-dawczych, poszukujących nowych produktów przeciwbak-teryjnych (podobnych do lizyn fagowych). Wkrótce do tej samej kategorii zaklasyfikowano szerszą grupę wcześniej znanych produktów pochodzenia bakteryjnego oraz tych wywodzących się z komórek ssaków – nazywając je łącznie enzybiotykami (pochodna kombinacji słów enzym i anty-biotyk) [54, 59]. Trzeba jednak zaznaczyć, że nie we wszyst-kich przypadkach ich działanie polega, jak sugeruje nazwa, na klasycznej aktywności enzymatycznej. Aktualnie wydzie-lone główne klasy enzybiotyków to: bakteriocyny, lizyny/en-dolizyny, autolizyny, lizozymy, inne potencjalne enzybiotyki (defensyny i katelicydyny) [59]. Kilka przykładów produk-tów z tej grupy (wtedy nie nazwanych enzybiotykami) wy-mieniono i pokrótce scharakteryzowano w pierwszej części niniejszego opracowania.

Licznych przedstawicieli klasy enzybiotyków uzna-no w ostatnich latach za perspektywiczny zasób środków przeciwdrobnoustrojowych. Ocena możliwości ich tera-peutycznego zastosowania w medycynie i weterynarii oraz w postępowaniu prewencyjnym i eliminacyjnym w innych obszarach działań medycznych, w różnych gałęziach prze-mysłu i w szeroko pojętej dezynfekcji itp., to główne tren-dy aktualnie prowadzonych badań. Enzybiotyki mają sze-reg zalet: cechują się zdolnością degradacji składników ściany komórkowej bakterii, charakteryzują się szybkim i unikalnym sposobem działania, wysoką specyficznością w niszczeniu patogenów oraz niskim prawdopodobień-stwem rozwoju oporności organizmów docelowych. Nie-które z nich wykazują aktywność bójczą nie tylko wobec bakterii, lecz także wobec grzybów, wirusów czy pasoży-tów. Ponadto dowodzi się, że są one skuteczne wobec poje-dynczych komórek organizmów docelowych, ale także wy-kazują efektywność przeciwbiofilmową. Potwierdzeniem tego jest fakt, że w ciągu ostatnich kilku lat pojawiły się na rynku pierwsze komercyjne produkty do pielęgnacji i od-każania oparte na niektórych enzybiotykach, a wiele in-nych preparatów (bakteriocyny) jest stosowain-nych od wie-lu lat w przemyśle, np. spożywczym [54]. Daje się jednak zauważyć ostrożne prognozowanie odnośnie samodzielne-go ich stosowania. Podobnie więc, jak w przypadku kla-sycznej fagoterapii, zadowalająca skuteczność enzybioty-ków, szczególnie pochodzących z bakteriofagów skutecz-nych wobec biofilmów, wymaga uznania zastosowań łączą-cych aktywność tych produktów i klasycznych antybioty-ków lub/i peptydów przeciwdrobnoustrojowych penetru-jących do wnętrza komórek docelowych [61].

Dostępne portale internetowe – m.in.: EnzyBase: a novel database for enzybiotic studies; phiBIOTICS: catalogue of therapeutic enzybiotics, relevant research studies and prac-tical applications; GMEnzy: a geneprac-tically modified enzybio-tic database; ANTISTAPHYBASE: database of antimicro-bial peptides (AMPs) and essential oils (EOs) against methi-cillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Staphylo-coccus aureus; LAMP: a database linking antimicrobial pep-tides – to tylko niektóre bazy danych odgrywające kluczową rolę w rozpowszechnianiu stanu wiedzy na temat enzybio-tyków i perspektyw w opracowaniu nowych leków przeciw-drobnoustrojowych. Referencje przydatne w ich znalezieniu w sieci web kryją się w ich nazwach.

PODSUMOWANIE

Z treści powyższego opracowania niezbicie wynika, że naturalne związki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym wywodzące się z różnorodnych źródeł posiadają ogrom-ny potencjał terapeutyczogrom-ny. Produktów – tych odkrytych i wstępnie zbadanych oraz jeszcze nieznanych – jest tak wie-le, że można mieć nadzieję na znalezienie wśród nich cen-nych leków. Należałoby jednak uściślić, że na obecną chwilę ten potencjał jest wykorzystany w niewielkim ułamku moż-liwości. Wynika to z wciąż jeszcze istniejących ograniczeń w zastosowaniu właściwych modeli badawczych, dających możliwość wiarygodnej oceny skuteczności produktu lub jego kombinacji z innym, wobec organizmów docelowych/ biofilmów, osadzonych w mikrośrodowisku zbliżonym do realnie istniejącego w organizmie gospodarza.

KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.

PIŚMIENNICTWO

1. Abu-Al-Basal MA. Healing potential of Rosmarinus oﬃcinalis L. on full-thickness excision cutaneous wounds in alloxan-induced-diabetic BALB/c mice. J Ethno-pharmacol 2010;131(2):443–450.

2. Akbari S, Abdurahman NH, Yunus RM, Fayaz F, Alara OR. Biosurfactants – a new frontier for social and environmental safety: a mini review. Biotechnol Res In-novation 2018;2:81–90.

3. Banat IM, De Rienzo MA, Quinn GA. Microbial bioﬁlms: biosurfactants as anti-bioﬁlm agents. Appl Microbiol Biotechnol 2014;98(24):9915–9929. 4. Barik PSK, Singh BN. Nanoemulsion-loaded hydrogel coatings for inhibition of

bacterial virulence and bioﬁlm formation on solid surfaces. Sci Rep 2019;9:6520. 5. Bilia AR, Guccione C, Isacchi B, Righeschi C, Firenzuoli F, Bergonzi MC. Essen-tial oils loaded in nanosystems: a developing strategy for a successful thera-peutic approach. Evid Based Complement Alternat Med 2014;2014:651593. 6. Budzyńska A, Różalska S, Sadowska B, Różalska B. Candida

albicans/Staphylo-coccus aureus dual-species bioﬁlm as a target for the combination of essential

oils and ﬂuconazole or mupirocin. Mycopathologia 2017;182(11–12):989–995. 7. Budzyńska A, Więckowska-Szakiel M, Sadowska B, Kalemba D, Różalska B. An-tibioﬁlm activity of selected plant essential oils and their major components. Pol J Microbiol 2011;60(1):35–41.

8. Burlando B, Cornara L. Honey in dermatology and skin care: a review. J Cosmet Dermatol 2013;12(4):306–313.

(8)

crobial biosurfactants as additives for food industries. Biotechnol Prog 2013;29(5):1097–1108.

10. Chan BK, Abedon ST. Bacteriophages and their enzymes in bioﬁlm control. Curr Pharm Des 2015;21(1):85–99.

11. Charles CH, Mostler KM, Bartels LL et al. Comparative antiplaque and anti-gingivitis eﬀectiveness of a chlorhexidine and an essential oil mouthrinse: 6-month clinical. J Clin Peridontol 2002;31(10):878–884.

12. Chouhan S, Sharma K, Guleria S. Antimicrobial activity of some essential oils- -present status and future perspectives. Medicines 2017;4(3).

13. Ciandrini E, Campana R, Casettari L et al. Characterization of biosurfactants produced by Lactobacillus spp. and their activity against oral streptococci bio-ﬁlm. Appl Microbiol Biotechnol 2016;100(15):6767–6777.

14. ClinicalTrials; www.clinical.trials.gov

15. Coronel-León J, Marqués AM, Bastida J, Manresa A. Optimizing the production of the biosurfactant lichenysin and its application in bioﬁlm control. J Appl Microbiol 2016;120(1):99–111.

16. de Souza ME, Clerici DJ, Verdi CM et al. Antimicrobial activity of Melaleuca

alternifo-lia nanoparticles in polymicrobial bioﬁlm in situ. Microb Pathog 2017;113:432–437.

17. Díaz De Rienzo MA, Stevenson P, Marchant R, Banat IM. Antibacterial proper-ties of biosurfactants against selected Gram-positive and -negative bacteria. FEMS Microbiol Lett 2016;363(2):fnv224.

18. Fracchia L, Banat JJ, Cavallo M, Ceresa C, Banat IM. Potential therapeu-tic applications of microbial surface-active compounds. Bioengineering 2015;2(3):144–162.

19. Fujiwara T, Hosokawa K, Kubo T. Comparative study of antibacterial eﬀects and bacterial retentivity of wound dressings. Eplasty 2013;13:e5.

20. Furfaro LL, Payne MS, Chang BJ. Bacteriophage therapy: clinical trials and re-gulatory hurdles. Front Cell Infect Microbiol 2018;8:376.

21. Gudiña JE, Fernandes EC, Teixeira JE, Rodriges LR. Antimicrobial and an-ti-adhesive activities of cell-bound biosurfactant from Lactobacillus agilis CCUG31450. RSC Adv 2015;5:90960.

22. Haque F, Alfatah M, Ganesan K, Bhattacharyya MS. Inhibitory eﬀect of sopho-rolipid on Candida albicans bioﬁlm formation and hyphal growth. Sci Rep 2016;6:23575.

23. Huang T, Qian Y, Wei J, Zhou C. Polymeric antimicrobial food packing and its applications. Polymers 2019;11(3):560.

24. Janek T, Krasowska A, Czyżnikowska Ż, Łukaszewicz M. Trehalose lipid biosurfac-tant reduces adhesion of microbial pathogens to polystyrene and silicone surfa-ces: an experimental and computational approach. Front Microbiol 2018;9:2441. 25. Jemil N, Ayed HB, Manresa A, Nasri M, Hmidet N. Antioxidant properties, anti-microbial and anti-adhesive activities of DCS1 lipopeptides from Bacillus

me-thylotrophicus DCS1. BMC Microbiol 2017;17:144.

26. Karadağlıoğlu Öİ, Ulusoy N, Başer KHC, Hanoğlu A, Şık İ. Antibacterial activities of herbal toothpastes combined with essential oils against Streptococcus

mu-tans. Pathogens 2019;8(1).

27. Karlapudi AP, Venkateswarulu TC, Tammineedi J et al. Role of biosurfactants in bioremediation of oil pollution – a review. Petroleum 2018;4(3):241–249. 28. Kiełtyka-Dadasiewicz A, Gorzel M. Terapie alternatywne. Aromaterapia –

su-rowce i zabiegi. EJMT 2014;1(2):72–79.

29. Lagha R, Abdallah FB, AL-Sarhan BO, Al-Sadany Y. Antibacterial and bioﬁlm in-hibitory activity of medicinal plant essential oils against Escherichia coli isola-ted from UTI patients. Molecules 2019;24(6):1161.

30. Liu J, Li W, Zhu X et al. Surfactin eﬀectively inhibits Staphylococcus aureus adhesion and bioﬁlm formation on surfaces. Appl Microbiol Biotechnol 2019;103(11):4565–4574.

31. Lu L, Hu W, Tian Z et al. Developing natural products as potential anti-bioﬁlm agents. Chin Med 2019;14:11.

32. Maszewska A. Fagowe depolimerazy polisacharydów – charakterystyka i za-stosowanie. Postepy Hig Med Dośw (online) 2015;69:690–702.

33. McCallin S, Sacher JC, Zheng J, Chan BK. Current state of compassionate pha-ge therapy. Viruses 2019;11(4):343.

34. Millezi AF, Costa KAD, Oliveira JM, Lopes SP, Pereira MO, Piccoli RS. Antibacte-rial and anti-bioﬁlm activity of cinnamon essential oil and eugenol. Ciênc Ru-ral 2019;49(01):e20180314.

35. Mittal RP, Rana A, Jaitak V. Essential oils: an impending substitute of synthetic antimicrobial agents to overcome antimicrobial resistance. Curr Drug Targets 2019;20(6):605–624.

36. Naughton PJ, Marchant R, Naughton V, Banat IM. Microbial biosurfactants: cur-rent trends and applications in agricultural and biomedical industries. J Appl Microbiol 2019;127(1):12–28.

unds. Molecules 2018;23(9).

38. Orchard A, van Vuuren S. Commercial essential oils as potential antimi-crobials to treat skin diseases. Evid Based Complement Alternat Med 2017;2017:4517971.

39. Paraszkiewicz K, Kuśmierska A. Biosurfaktanty drobnoustrojów. J Health Stud Med 2017;1:57–75.

40. Paraszkiewicz K, Moryl M, Płaza G, Bhagat D, K Satpute S, Bernat P. Surfactants of microbial origin as antibioﬁlm agents. Int J Environ Health Res 2019;11:1–20. 41. Pazyar N, Yaghoobi R, Bagherani N, Kazerouni A. A review of applications of tea

tree oil in dermatology. Int J Dermatol 2013;52(7):784–790.

42. Pires DP, Melo LDR, Vilas Boas D, Sillankorva S, Azeredo J. Phage therapy as an alternative or complementary strategies to prevent and control bioﬁlm-rela-ted infections. Curr Opin Microbiol 2017;39:48–56.

43. Pontes C, Alves M, Santos C et al. Can sophorolipids prevent bioﬁlm formation on silicone catheter tubes? Int J Pharm 2016;513(1–2):697–708.

44. Prasad B, Kaur HP, Kaur S. Potential biomedical and pharmaceutical applications of microbial surfactants. World J Pharm Pharmaceut Sci 2015;4(4):1557–1575. 45. Quintas V, Prada-López I, Carreira MJ, Suárez-Quintanilla D, Balsa-Castro C,

To-más I. In situ antibacterial activity of essential oils with and without alcohol on oral bioﬁlm: a randomized clinical trial. Front Microbiol 2017;8:2162. 46. Rohde H, Burandt EC, Siemssen N et al. Polysaccharide intercellular adhesin or

protein factors in bioﬁlm accumulation of Staphylococcus epidermidis and

Sta-phylococcus aureus isolated from prosthetic hip and knee joint infections.

Bio-materials 2007;28(9):1711–1720.

47. Sachdev DP, Cameotra SS. Biosurfactants in agriculture. Appl Microbiol Bio-technol 2013;97(3):1005–1016.

48. Santos DK, Ruﬁno RD, Luna JM, Santos VA, Sarubbo LA. Biosurfactants: multi-functional biomolecules of the 21st_{century. Int J Mol Sci 2016;17(3):401.}

49. Satpute SK, Mone NS, Das P, Banat IM, Banpurkar AG. Inhibition of pathogenic bacterial bioﬁlms on PDMS based implants by L. acidophilus derived biosur-factant. BMC Microbiol 2019;19(1):39.

50. Satputea SK, Banpurkar AG, Banat IM, Sangshetti JN, Patil RH, Gade WN. Mul-tiple roles of biosurfactants in bioﬁlms. Curr Pharm Des 2016;22(11):429–448. 51. Sotirova AV, Spasova DI, Galabova N, Karpenko E, Shulga A. Rhamnolipid-bio-surfactant permeabilizing eﬀects on Gram-positive and Gram-negative bacte-rial strains. Curr Microbiol 2008;56(6):639–644.

52. Swamy MK, Akhtar MS, Sinniah UR. Antimicrobial properties of plant essential oils against human pathogens and their mode of action: an updated review. Evid Based Complement Alternat Med 2016;216:3012462.

53. Tagliaferri TL, Jansen M, Horz HP. Fighting pathogenic bacteria on two fronts: pha-ges and antibiotics as combined strategy. Front Cell Infect Microbiol 2019;9:22. 54. Tiwari R, Dhama K, Chakraborty S, Kapoor S. Enzybiotics. New weapon in the

army of antimicrobials: a review. Asian J Anim Vet Adv 2014;9(3):144–163. 55. Tyldesley HC, Salisbury AM, Chen R, Mullin M, Percival SL. Surfactants

and their role in bioﬁlm management in chronic wounds. Wounds Intern 2019;10(1):20–24.

56. Urząd Rejestracji Produktów Leczniczych, Wyrobów Medycznych i Produktów Biobójczych; www.urpl.gov.pl

57. Valeriano C, Coutinho de Oliviera L, Malﬁtano de Carvalho SM, das Graças Car-doso M, Alves E, Hilsdorf Piccoli R. The sanitizing action of essential oil-based solutions against Salmonella enterica serotype Enteritidis S64 bioﬁlm forma-tion on AISI 304 stainless steel. Food Control 2012;25(2):673–677.

58. Varvaresou A, Iakovou K. Biosurfactants in cosmetics and biopharmaceuticals. Lett Appl Microbiol 2015;61(3):214–223.

59. Vázquez R, Garcia E, Garcia P. Phage Lysins for ﬁghting bacterial respiratory infections: a new generation of antimicrobials. Front Immunol 2018;9:2252. 60. Vecino X, Cruz JM, Moldes AB, Rodriguez LR et al. Biosurfactants in cosmetic

formulations: trends and challenges. Crit Rev Biotechnol 2017;37(7):911–923. 61. Wang Z, Kong L, Liu Y et al. A phage lysin fused to a cell-penetrating peptide

kills intracellular methicillin-resistant Staphylococcus aureus in keratinocytes and has potential as a treatment for skin infections in mice. Appl Environ Mi-crobiol 2018;84(12):e00380–18.

62. Warnke PH, Sherry E, Russo PA et al. Antibacterial essential oils in malodo-rous cancer patients: clinical observations in 30 patients. Phytomedicine 2006;13(7):463–467.

63. Wińska K, Mączka W, Łyczko J, Grabarczyk M, Czubaszek A, Szumny A. Es-sential oils as antimicrobial agents – myth or real alternative? Molecules 2019;24:2130.