Wykł.6_Świat RNA_2014

Świat małych RNA

Czym są małe RNA?

•Małe RNA to populacja cząsteczek RNA o długości 21 to 24 nt, które generalnie powodują wyciszanie genów (gene silencing)

•Małe RNA przyczyniają się do potranskrypcyjnego wyciszania genów (post-transcriptional gene

silencing-PTGS) poprzez negatywne działanie na

translację lub stabilność mRNA

•Małe RNA przyczyniają się do transkrypcyjnego wyciszania genów (transcriptional gene

silencing-TGS) poprzez epigenetyczne modyfikacje

chromatyny

AAAAA

RNA Pol

Podstawa wyciszania przez RNA –

białka Dicer i Argonaute

Wyciszanie przez RNA

opiera się na dwóch

podstawowych reakcjach:

a) Dwuniciowy RNA (dsRNA) jest

rozcinany przez Dicer i jego

homologi na krótkie dwuniciowe

RNA.

b) Te małe RNA asocjują następnie

z białkami rodziny ARGONAUTE i

powodują wyciszenie.

DICER

AGO

Dicer i białka podobne do Dicer

From MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A.N., Cande, W.., Adams, P.D., and Doudna, J.A. (2006) Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311: 195 -198. Reprinted with permission from AAAS. Photo credit: Heidi

Struktura Dicer’a pozwala mu „mierzyć” RNA, który rozcina. Podobnie jak kucharz szatkujący marchewkę, Dicer tnie RNA na równe

fragmenty.

W biogenezie siRNA i miRNA, Dicer lub białka podobne do Dicer (Dicer-like – DCL proteins) rozcinają dsRNA lub RNA ze spinką (hairpin) na fragmenty ~ 21 – 25 nt.

Białka Argonaute

Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: EMBO J. Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M., and Benning, C. (1998) AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO J. 17: 170–180. Copyright 1998; Reprinted from Song, J.-J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor, L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305: 1434 – 1437. with permission of AAAS.

Białka ARGONAUTE wiążą małe RNA i ich cele

Mutant Arabidopsis ago1 i ośmiornica Argonauta argo

Białka ARGONAUTE nazwano tak ze względu na wygląd

mutanta Arabidopsis

argonaute1 ; ago1 ma

promieniście rozłożone liście przez co przypomina

ośmiornicę o nazwie

Wyciszanie przez RNA – obraz ogólny

MicroRNA

siRNA

siRNA – Ochrona genomu

siRNA chronią genom poprzez:

• Supresję atakujących komórkę wirusów

• Wyciszanie źródeł wadliwych transkryptów

• Wyciszanie transpozonów i elementów

powtarzających się

Oprócz tego, siRNA utrzymują niektóre geny

w stanie epigenetycznie wyciszonym

Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Nature. Lam, E., Kato, _{N., and Lawton, M. (2001)}

Wyciszanie genów indukowane

przez wirusy – obraz ogólny

AGO

Większość wirusów roślin to RNA wirusy,

które replikują się poprzez dwuniciowe

formy pośrednie.

DCL

Wirusowy ssRNA Wirusowy dsRNA

Kodowana przez wirusa RNA-zależna RNA polimeraza

AGO

Dwuniciowy RNA jest rozcinany przez DCL

wytwarzając siRNA, które asocjują z AGO wyciszając replikację i

Rośliny mogą obronić się przed

infekcją wirusem i nabyć oporności

Młodsze liście

wytwarzane przez roślinę zakażoną wirusem mogą być pozbawione infekcji, co wskazuje, że rosnąca roślina obroniła się przed infekcją.

Najstarsze Najmłodsze

Inokulacja wirusem

Małe RNA korelują z indukowanym przez infekcję

wirusem wyciszeniem genów

Mały RNA homologiczny do wirusowego RNA występuje w liściachinokulowanych i

odległych młodych liściach

(systemic leaf), ale nie w liściach inokulowanych roztworem bez wirusa (mock), Inokulowany liść Młody liść (syst.leaf) Dni po inokulacji

From Ratcliff, F., Henderson, B.D., and Baulcombe, D.C. (1997) A similarity between viral defense and gene silencing in plants. Science 276: 1558–1560. Reprinted with permission from AAAS.

Infekcja wirusem powoduje

systemiczną akumulację siRNA

DCL Liść inokulowany Odległy liść AGO

Wyciszenie może się

rozprzestrzeniać systemicznie

poprzez floem

Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Nature Copyright 1997. Voinnet, O., and Baulcombe, D. (1997) Systemic silencing in gene silencing. Nature 389: 553.

Inokulowany liść Systemiczne wyciszenie

Sygnałem systemicznym jest siRNA

Mutanty w wytwarzaniu siRNA są bardziej podatne na

infekcje wirusowe

From Deleris, A., Gallego-Bartolome, J., Bao, J., Kasschau, K., Carrington, J.C., and Voinnet, O. (2006) Hierarchical action and inhibition of plant dicer-like proteins in antiviral defense. Science 313: 68–71. Reprinted with permission from AAAS.

Dzikie rośliny Arabidopsis inokulowane TRV Podwójny mutant dcl2-dcl4 inokulowany TRV Wyciszanie wirusa TRV w dzikich roślinach Arabidopsis zapobiega występowaniu symptomów choroby. Mutanty pozbawione aktywności Dicer są niezdolne do powstrzymania infekcji.

Wirusy maja białka supresorowe, które zapobiegają

wyciszeniu RNA

DCL

RdRP

DCL

Poprzez zakłócenie procesu

wyciszania RNA wirusowe białka supresorowe zakłócają mechanizm obrony rośliny przed wirusami.

Supresory mogą działać na każdym etapie wytwarzania i funkcjonowania siRNA.

Małe RNA chronią także rośliny

przed patogenami bakteryjnymi

Reprinted from Navarro, L., Jay, F., Nomura, K., He, S.Y., and Voinnet, O. (2008) Suppression of the microRNA pathway by bacterial effector proteins. (2008) Science 321: 964-967. Reprinted with permission from AAAS.

Rośliny dzikie (La-er) i mutanty w

wytwarzaniu małych RNA (dcl1-9 and

Wyciszanie indukowane przez

wirusy - podsumowanie

• Wyciszanie genów za pośrednictwem RNA jest ważnym

narzędziem w obronie roślin przed patogenami.

• siRNA zakłócają replikację wirusów.

• siRNA działają systemicznie wspomagając obronę przed

wirusami i oporność roślin.

• Większość wirusów wytwarza białka supresorowe

procesu wyciszania RNA. Białka te stanowią ważne

narzędzie w badaniu szlaków wyciszania RNA.

Wyciszanie transgenów

• Transgeny wprowadzone do roślin są często wyciszane

przez szlak siRNA.

• Wyciszenie może być zaindukowane przez:

• Bardzo wysoki poziom ekspresji

• dsRNA pochdzące z transgenu

• Nietypowe RNA kodowane przez transgen

• Transgeny są wyciszane potranskrypcyjnie i

Wyciszanie indukowane przez

transgeny

Photo credits: Martha Hawes, University of Arizona.

W latach 1980-tych opracowano

metodę wprowadzania genów do

genomów roślinnych za pomocą

bakterii Agrobacterium

tumefaciens. Wprowadzone geny

noszą nazwe transgenów.

Komórka roślinna Jądro DNA Agrobacterium tumefaciens na powierzchni komórki

Indukowane przez transgeny

wyciszanie potranskrypcyjne

Doświadczenia nad

modyfikacją koloru kwiatów

petuni dostarczyły pierwszych

dowodów na wyciszanie RNA.

Manipulacje ekspresją syntazy chalkonowej w celu modyfikacji

pigmentacji kwiatów

Dzika roślina petuni wytwarza

purpurowe barwniki antocjanowe

Syntaza chalkonowa (CHS) jest enzymem działającym na początku szlaku syntezy antocjanów

Photo credit Richard Jorgensen; Aksamit-Stachurska et al. BMC Biotechnology 2008 8:25 doi:10.1186/1472-6750-8-25

Antocjany

Syntaza chalkonow a (CHS)

Spodziewane – produkcja sensownego RNA syntazy

chalkonowej (CHS) zwiększy pigmentację...

Sensowny RNA Sense construct: PRO ORF Gen własny mRNA Transgen mRNA Translacja białka mRNA mRNA

..

a produkcja antysensownego RNA zablokuje

pigmentację

Dodatkowa translacja białka

Konstrukt antysensowny:

Transgen

Tworzy się dupleks sens-antysens, który hamuje translację

Nieoczekiwanie, zarówno antysensowny jak i

sensowny konstrukt hamował wytwarzanie pigmentu

Photo credit Richard Jorgensen

Rośliny z transgenem CHS

CaMV 35S pro : CHS CaMV 35S pro : CHS

Sens Antysens

Wyciszone tkanki nie wyrażają ani własnego ani

wprowadzonego genu CHS

Napoli, C., Lemieux, C., and Jorgensen, R. (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2: 279–289.

RNA transgenu

RNA

własnego genu

Purpurow

e kwiaty Białe _kwiaty To zjawisko, w którym zarówno _{wprowadzony, jak i własny gen}

ulegają wyciszeniu, nazwano kosupresją.

Kosupresja jest rezultatem

wytwarzania siRNA

De Paoli, E., Dorantes-Acosta, A., Zhai, J., Accerbi, M., Jeong, D.-H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and Green, P.J. (2009). Distinct extremely abundant siRNAs associated with cosuppression in petunia. RNA 15:

1965–1970. PRO ORF Dzika mRNA mRNA Translacja białka Własny gen Sens RNA Sense construct

Transgeniczna z kosupresją Kosupresja

PRO ORF

Własny gen mRNA

AGO AAAA AGO AAAA AGO

siRNA jest wytwarzany

Najsilniejszym induktorem wyciszania RNA jest

dwuniciowy RNA, co wykazano w badaniach na C.

elegans

Derived The Nobel Committee based on Fire, A. et al., (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.

Senowny RNA Antysensowny RNA Dwuniciowy RNA

Brak efektu Brak efektu Nieskoordynowane skurcze

Sensowny, antysensowny i dwuniciowy RNA homologiczny do genu unc-22 wprowadzono do C. elegans. Wyciszenie

unc-22 powoduje utrate

kontroli nad mięśniami, stąd nazwa unc od

Transkrypcyjne wyciszanie genów

Małe RNA mogą inicjować wyciszanie DNA poprzez kowalencyjne modyfikacje DNA lub zasocjowanych z nim histonów, zakłócając w ten sposób transkrypcję.

Transkrypcja Ta forma wyciszania występuje często na stabilnie wyciszonym DNA i dotyczy np. centromerów i transpozonów, ale

niekiedy dotyczy także genów.

DNA Białka

histonowe

Transkrypcyjne wyciszanie genów

Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed plants. EMBO J. 8: 643-649.

CaMV 35S pro : KAN CaMV 35S pro : HYG Transkrypcyjne wyciszanie genów ujawniły doświadczenia, w których do roślin poprzez krzyżówki genetyczne wprowadzono więcej niż jeden transgen.

Ekspresja genu, który niesie oporność na antybiotyk kanamycynę

Ekspresja genu, który niesie oporność na antybiotyk higromycynę

siRNA mogą wskazywać DNA do wyciszenia poprzez

metylację cytozyny lub za pośrednictwem enzymów

modyfikujących histony

~

~

DNA może być kowalencyjnie

modyfikowany przez metylację cytozyny

dokonywaną przez DNA-metylotransferazy .

Metylacja DNA

Dokładne mechanizmy, za pomocą których siRNA wskazują DNA do wyciszenia nie są znane, ale wiadomo, że wymagają działania dwóch specyficznych dla roślin kompleksów RNA-polimeraz: RNA Polimerazy IV (Pol IV) i RNA Polimerazy V (Pol V).

AGO _DNA

methyltransferase

Rośliny zawierają dodatkowe kompleksy RNA

polimeraz, które biorą udział w wyciszaniu

Kompleks Występowanie Funkcja

RNA Polimeraza I Wszystkie eukariota Produkcja rRNA

RNA Polimeraza II Wszystkie eukariota Produkcja mRNA, microRNA RNA Polimeraza III Wszystkie eukariota Produkcja tRNA, 5S rRNA RNA Polimeraza IV Rośliny lądowe Produkcja siRNA

RNA Polimeraza V Rośliny nasienne Rekrutacja AGO do DNA DNA

RNA

RNA

Większość siRNAs wytwarzana jest z

transpozonów i powtarzalnego DNA

Kasschau, K.D., Fahlgren, N., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie, J.S., Givan, S.A., and Carrington, J.C. (2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs. PLoS Biol 5(3): e57.

Większość komórkowych siRNA pochodzi z transpozonów i innych powtarzalnych sekwencji. U Arabidopsis, (schemat powyżej) sekwencje te występują z wielką częstością w pericentromerycznych rejonach chromosomów.

Ilość małych RNA Ilość transpozonów/ retrotranspozonó w Chromosom Centromer

siRNA - podsumowanie

Szlak siRNA wycisza obce DNA, transpozony i sekwencje powtarzalne.

U roślin, siRNA są wytwarzane przez białka podobne do Dicer

rozcinające dsRNA na 24 nt siRNA.

siRNA asocjuja z białkami AGO, z którymi tworzą kompleksy

wyciszające.

Kompleksy wyciszające mogą działać potranskrypcyjnie na docelowe

RNA, przecinając je lub zakłócając ich translację.

Kompleksy wyciszające mogą również działać na chromatynę,

wyciszając docelowe DNA przez metylację lub modyfikacje

zasocjowanych z nim histonów.

microRNA - miRNA

• miRNA prawdopodobnie wyewoluowały z siRNA, oba te rodzaje

małych RNA są wytwarzane i obrabiane w podobny sposób.

• U roślin występuje niewielka liczba silnie konserwowanych miRNA

oraz duża liczba nie konserwowanych miRNA.

• miRNA są kodowane przez specyficzne geny MIR, ale same

działają na inne geny – sa czynnikami regulatorowymi działającymi

w trans.

• U roślin miRNA regulują przede wszystkim rozwój i odpowiedzi

fizjologiczne

microRNA - miRNA

AAAn RNA Pol II

microRNA przecinają mRNA lub zakłócają ich translację

DCL Gen MIR RNA Pol II mRNA AAAn AGO AGO AAAn AAAn AGO Zakłócanie translacji Przecina nie mRNA

miRNA i siRNA podlegają obróbce przez

pokrewne, ale odmienne białka DCL

Reprinted from Margis, R., Fusaro, A.F., Smith, N.A., Curtin, S.J., Watson, J.M., Finnegan, E.J., and Waterhouse, P.M. (2006) The evolution and diversification of Dicers in plants FEBS Lett. 580: 2442-2450 with permission from Elsevier.

W roślinach występuje 4 lub więcej białek DCL , więcej niż w jakichkolwiek innych organizmach. Zwiększona różnorodność i liczba białek DCL ma prawdopodobnie związek z rozbudowanym systemem ochrony przed patogenami .

AtDCL1 wytwarza miRNA

AtDCL2 - 4 wytwarza siRNA

DCL4

miRNA i siRNA asocjują z kilkoma białkami

AGO

miRNA, ale także z niektórymi siRNA AGO4 preferencyjnie asocjuje z siRNA i pośredniczy w metylalcji docelowego DNA. W Arabidopsis występuje 10 białek AGO. Nie są zbyt dobrze

zcharaktery-zowane. Ich funkcje częściowo się

nakładają

Geny MIR są transkrybowane jako długie RNA,

które są przekształcane w miRNA

•miRNA sa kodoane przez geny MIR

•Pierwotny transkrypt miRNA (pri-miRNA) składa się w strukturę

dwuniciową, która podlega obróbce przez DCL1

• Łańcuch miRNA* jest degradowany

DCL 3' 5' miRNA miRNA* 3' 5' pri-miRNA miRNA MIR gene Cel miRNA

Cele niektórych konserwowanych miRNA

Rodzina genowa

miRNA Cel (rodzina genów) Funkcja

156 Czynniki transkrypcyjne

SPL Czas rozwoju

160 Czynniki transkrypcyjne

ARF Odpowiedź na auksynę, rozwój 165 Czynniki transkrypcyjne

HD-ZIPIII Rozwój, polarność 172 Czynniki transkrypcyjne

AP2 Czas rozwoju, tożsamość organów kwiatowych 390 TAS3 (tasiRNA), działa na

czynniki transkrypcyjne ARF Odpowiedź na auksynę, rozwój 395 Transporter siarczanów Pobieranie siarczanów 399 Ubikwitynacja białek Pobieranie fosforanu

Adapted from Willmann, M.R., and Poethig, R.S. (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 10: 503–511..

miRNA u roślin wykazują odległe

podobieństwa do swoich celów

Reprinted from Willmann, M.R., and Poethig, R.S. (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 10: 503–511 with permission from Elsevier.

Duplikakcja genu

Uważa się, że miRNA u roślin powstały ze swoich sekwencji docelowych w wyniku duplikacji genów, odwróconej duplikacji i dywergencji.

Tylko niektóre miRNA zapewniają przewagę selekcyjną i są

zachowywane i duplikowane.

tasiRNAs

tasiRNA są kodowane przez geny TAS transkrybowane przez RNA Pol II

Transkrypt jest celem dla miRNA i zostaje rozcięty

Rozcięty transkrypt jest kopiowany do dsRNA przez RNA zależną RNA

polimerazę (RDR6)

(dalszy ciąg na następnym przezroczu)

tasiRNAs – trans-acting siRNAS

Kodowane przez geny TAS

Biogeneza tasiRNA

DICER dsRNA jest rozcinany przez DCL4

na serię krótszych dsRNA,

uwalniając z jednego genu TAS wiele cząsteczek tasiRNA.

Arabidopsis zawiera cztery rodziny genów TAS

•Celami dla TAS1 i TAS2 tasiRNA sa geny kodujące białka z

powtórzeniami pentapeptydowymi. •Celem dla TAS3 tasiRNA są

czynniki transkrypcyjne ARF (auxin response factors).

•Celem dla TAS4 tasiRNA sa czynniki transkrypcyjne MYB.

Z każdego genu TAS powstaje szereg ‘przesuniętych w fazie’

tasiRNA

Reprinted from Allen, E., Xie, Z., Gustafson, A M., and Carrington, J.C. (2005) microRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell 121: 207-221, with permission from Elsevier.

Miejsce wycięcia miRNA w pierwotnym transkrypcie

tasiRNA mogą być wytwarzane z

dowolnej nici

DCL4 porusza się wzdłuż RNA

mierząc i rozcianając go.

Mutacje wpływające na tasiRNA wpływają na przejście

fazowe

Reprinted from Fahlgren, N., Montgomery, T.A., Howell, M.D., Allen, E., Dvorak, S.K., Alexander, A.L., and Carrington, J.C. (2006) Regulation of AUXIN RESPONSE FACTOR3 by TAS3 ta-siRNA affects developmental timing and patterning in Arabidopsis. Curr. Biol. 16: 939–944 with permission from Elsevier.

Mutacja rdr6-15 eliminuje wytwarzanie tasiRNA

zip-1 eliminuje

wytwarzanie TAS3 tasiRNA

Obie mutacje oraz mutacje dcl4 i tas3, przyspieszają

nat-siRNAs

Redrawn from Katiyar-Agarwal, S., Morgan, R., Dahlbeck, D., Borsani, O., Villegas Jr. A., Zhu, J.-K., Staskawicz, B.J., and Jin, H. (2006) A pathogen-inducible endogenous siRNA in plant immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 18002–18007.

Nat-siRNAs – Natural cis-acting siRNAs

Wytwarzane z zachodzących na siebie transkryptów. Udział w adaptacji do stresów abiotycznych i biotycznych

AGO AGO Zachodzące geny ds. RNA z komplementarnych transkryptów Wyciszeni e

Zastosowania technologii małych

RNA

Huang, G., Allen, R., Davis, E.L., Baum, T.J., and Hussey, R.S. (2006) Engineering broad root-knot resistance in transgenic plants by RNAi silencing of a conserved and essential root-knot nematode parasitism gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 14302–14306.

Wyciszanie genów służy do eliminacji alergenów z

orzeszków ziemnych.

Wyciszanie genów służy do usuwania szkodliwych związków z nasion bawełny, co pozwala na ich zastosowanie jako pokarmu.

DNA tworzące siRNA lub miRNA mogą być stabilnie wprowadzane do genomów roślin w celu selektywnego wyciszenia genów. Kontrola zainfekowana przez pasożytniczegio nicienia Oporność indukowana RNAi

Rośliny wyrażające dsRNA

odpowiadające wybranym genom nicienia sa odporne na infekcje. Wchlonietę przez nicienia dsRNA indukuje wyciszenie jego genów.

Podsumowanie

Małe RNA biorą udział w regulacji aktywności i ochronie genomu; specyficzność ich działania wyciszającego opiera się na parowaniu zasad.

Celami dla siRNA sa bogate w sekwnecje powtarzalne rejony heterochromatyny, transpozony, wirusy i inne patogeny.

Celami dla miRNAs i tasiRNAs sa genby regulatorowe wpływające za czasowy i przestrzenny wzór rozwoju, homeostazę pokarmową i