[2007/Nr 2] Rozdział natywnych fenolokwasów pszenicy metodą RP-HPLC-DAD

Magdalena Karamac´, Agnieszka Kosin´ska

ROZDZIAŁ NATYWNYCH FENOLOKWASO

´

W PSZENICY

METODA˛ RP-HPLC-DAD

Zakład Analizy Z

˙

˙

˙

Kierownik: doc. dr hab. R. Amarowicz

Z ziarniako´w pszenicy otrzymano ekstrakt zwia˛zko´w fenolowych stosuja˛c ekstrakcje˛ 80% metanolem i niskocis´nieniowa˛ chromatografie˛ kolumnowa˛ na z˙elu RP-18. Zwia˛zki fenolowe zawarte w tak otrzymanym ekstrakcie analizowano naste˛pnie jakos´ciowo metoda˛ RP-HPLC-DAD w systemie gradientowym. Otrzymany chromatogram charak-teryzował sie˛ obecnos´cia˛ 8 gło´wnych piko´w. Jeden z nich pochodził od kwasu sinapowe-go. Widma UV-DAD pozwalaja˛ stwierdzic´, z˙e pozostałe zwia˛zki fenolowe były pochod-nymi kwasu sinapowego.

Hasła kluczowe: pszenica, fenolokwasy, RP-HPLC-DAD.

Key words: wheat, phenolic acids, RP-HPLC-DAD.

Fenolokwasy stanowia˛ grupe˛ zwia˛zko´w fenolowych typowa˛ dla ziarniako´w zbo´z˙

(1). Aktywnos´c´ przeciwutleniaja˛ca fenolokwaso´w jest dobrze udokumentowana

w literaturze naukowej (2 – 5). Ekstrakty zwia˛zko´w fenolowych uzyskiwanych ze

zbo´z˙ wykazywały włas´ciwos´ci przeciwutleniaja˛ce i przeciwrodnikowe – w

bada-niach wykorzystywano ro´z˙ne metody – zmiatanie DPPH i ABTS, siłe˛ redukcyjna˛,

układ emulsyjny z

β

-karotenem i kwasem linolenowym (6 – 9). Biora˛c pod uwage˛

przytoczone powyz˙ej dane oraz uwzgle˛dniaja˛c duz˙e spoz˙ycie produkto´w

zboz˙o-wych waz˙ne sa˛ badania dotycza˛ce fenolokwaso´w zbo´z˙.

W ziarniakach fenolokwasy tylko w niewielkich ilos´ciach wyste˛puja˛ w wolnej

postaci (10 – 12). Wie˛kszos´c´ ich spotykana jest w postaci estro´w, w mniejszej ilos´ci

zwia˛zane sa˛ z cukrami (10 – 12). Fenolokwasy ekstrahuje sie˛ z ziarniako´w zbo´z˙

roztworem alkoholu. Po destylacji i liofilizacji otrzymuje sie˛ surowy ekstrakt

zwia˛zko´w fenolowych i cukrowco´w (10). Po zawieszeniu nawaz˙ki ekstraktu

w wodzie zakwaszonej do pH 2 wolne fenolokwasy ekstrahowane sa˛ do eteru

etylowego lub octanu etylu. Pozostałe w fazie wodnej fenolokwasy uwalniane sa˛

z estro´w na drodze hydrolizy zasadowej i ekstrahowane do eteru etylowego lub

octanu etylu. W trzeciej fazie analizy stosuje sie˛ hydrolize˛ kwasowa˛, a uwolnione

z glikozydo´w fenolokwasy ponownie ekstrahowane sa˛ w układzie ciecz-ciecz. Trzy

uzyskane w powyz˙szy sposo´b frakcje analizowane sa˛ naste˛pnie bezpos´rednio

metoda˛ HPLC (10) lub po sililacji metoda˛ GC (13).

Przytoczony tok analityczny daje wprawdzie ilos´ciowy obraz fenolokwaso´w

zawartych w ziarniaku lecz nie dostarcza informacji na temat samych postaci

w jakiej wyste˛puja˛ fenolokwasy. Poniewaz˙ aktywnos´c´ biologiczna formy zwia˛zanej

– np. włas´ciwos´ci przeciwutleniaja˛ce – moga˛ sie˛ ro´z˙nic´ od aktywnos´ci wolnych

fenolokwaso´w waz˙ne wydaje sie˛ oznaczanie włas´nie poszczego´lnych form

natyw-nych. Do tego niezbe˛dne jest oczywis´cie otrzymanie ich w postaci czystych

zwia˛zko´w i ustalenie metodami spektroskopowymi ich struktury chemicznej.

Prezentowana praca, kto´rej celem była analiza natywnych pochodnych

fenolowk-waso´w z ziarniako´w pszenicy metoda˛ HPLC w układzie odwro´conych faz z

detek-cja˛ fotodiodowa˛, stanowi wste˛p do takich włas´nie badan´.

MATERIAŁ I METODY

Materiał do badan´ – ziarniaki pszenicy odmiany Alba – otrzymano z Katedry Biochemii Uniwersytetu Warmin´skiego-Mazurskiego w Olsztynie.

Zmielona˛ pro´bke˛ ziarniako´w o masie 40 g przesypana˛ do kolby okra˛głodennej obj. 500 cm3_zalano

80% (v/v) roztworem metanolu przy stosunku materiału stałego do solwentu 1:8 (w/v) (14). Naste˛pnie szczelnie zamknie˛ta˛ kolbe˛ umieszczono w łaz´ni wodnej z wytrza˛saniem. Ekstrakcje˛ prowadzono przez 15 min. w temp. 60°C. Po schłodzeniu metanolowy supernatant filtrowano przez bibułe˛ Whatman 1. Pozostały na sa˛czku materiał przenoszono z powrotem do kolbki. Ekstrakcje˛ przeprowadzono trzykrot-nie, a uzyskane przesa˛cza ła˛czono. Z tak uzyskanego materiału oddestylowano metanol w wyparce rotacyjnej w temp. 40°C, pozostała˛ zas´ wode˛ usunie˛to na drodze liofilizacji.

Mase˛ 1 g liofilizatu zawieszono w 10 cm3

wody destylowanej i naniesiono na kolumne˛ chromato-graficzna˛ (2× 15 cm) wypełniona˛ z˙elem RP-18 (20 – 43 μm, Merck), kto´ra˛ poprzednio przemyto trzema obje˛tos´ciami wody. Cukrowce obecne w ekstrakcie wymyto z kolumny woda˛ destylowana˛. Do wymycia zas´ zwia˛zko´w fenolowych zastosowano 200 cm3 _{czystego metanolu. Eluat zage˛szczono do sucha}

w wyparce rotacyjnej.

Jakos´ciowa˛ analize˛ natywnych pochodnych fenolokwaso´w przeprowadzono metoda˛ HPLC. Warunki analizy: system chromatograficzny firmy Shimadzu składał sie˛ z 2 pomp LC 10AD, detektora fotodiodowego SPD-M 10A, systemu kontroluja˛cego SCL 10A i kolumny LiChrospher 100 RP-18 (4

× 250 mm, 5 μm; Merck). Zastosowano rozdział w gradiencie:

faza A: acetonitryl – kwas octowy – woda (5;2;93, v/v/v); faza B: acetonitryl – kwas octowy – woda (80;2;18, v/v/v). gradient: faza B od 0 do 100% w cia˛gu 50 min.

Pre˛dkos´c´ przepływu wynosiła 1 cm3_{/min., obje˛tos´c´ nanoszonej pro´by 0,02 cm}3_{, dł. fali przy detekcji}

320 nm.

WYNIKI I DYSKUSJA

Chromatogram rozdziału natywnych zwia˛zko´w fenolowych wyekstrahowanych z ziarniako´w pszenicy przedstawiono na ryc. 1. Na chromatogramie zanotowano obecnos´c´ 8 gło´wnych piko´w (1 – 8). Ich czasy retencji wynosiły odpowiednio: 1 – 8,17 min.; 2 – 12,18 min.; 3 – 13,00 min.; 4 – 14,10 min.; 5 – 14,65 min.; 6 – 16,98 min.; 7 – 28,25 min.; 8 – 41,35 min. Widma UV-DAD (ryc. 2) zwia˛zko´w fenolowych zarejestrowanych jako piki 1 – 8 były typowe dla fenolokwaso´w i charakteryzowały sie˛ maksimami absorpcji przy dł. fali 328 nm (1), 327 nm (2), 326 nm (3, 4), 324 nm (8) i 322 nm (5, 6, 7). Na widmach 3 i 5 zanotowano drugie maksim przy 277 i 276 nm; punkt przegie˛cia (ramie˛) przy 276 nm widoczne było w widmie 6.

Stwierdzone w niniejszej pracy duz˙e zro´z˙nicowanie czaso´w retencji piko´w na chromatogramie wskazuje, z˙e fenolokwasy w ziarniakach pszenicy wyste˛puja˛ w postaci zwia˛zko´w bardzo ro´z˙nia˛cych sie˛ pod wzgle˛dem polarnos´ci. Nastrzykuja˛c na kolumne˛ standard kwasu sinapowego i poro´wnuja˛c uzyskany czas retencji oraz widmo UV-DAD z wynikami analizy HPLC ekstraktu stwierdzono, z˙e pik nr 7 pochodzi włas´nie od kwasu sinapowego. Poniewaz˙ w chromatografii kolumnowej w układzie odwro´conych faz analizowane zwia˛zki sa˛ wymywane z kolumny w kierunku maleja˛cej polarnos´ci wycia˛gna˛c´ moz˙na wniosek, z˙e wie˛kszos´c´ natywnych zwia˛zko´w fenolowych w ziarniakach pszenicy stanowia˛ pochodne kwasu sinapowego charakteryzuja˛ce sie˛ wie˛ksza˛ polarnos´cia˛ niz˙ kwas sinapowy.

Wydaje sie˛, z˙e zwia˛zki te nie sa˛ raczej glikozydami kwasu sinapowego. Dane literaturowe (11, 12) wskazuja˛, z˙e niewielka tylko ilos´c´ fenolokwaso´w wyste˛puje w tej włas´nie postaci. Zwia˛zki te nie sa˛ ro´wniez˙ kwasem sinapowym zestryfikowanym alkoholem etylowym lub metylowym. Grupa alkilowa w cza˛steczce estru zmniejsza bowiem polarnos´c´ zwia˛zku w poro´wnaniu z fenolokwasem i na chromatogramie czas retencji takiego zwia˛zku jest wie˛kszy niz˙ w przypadku fenolokwasu. Biora˛c pod uwage˛ te˛ włas´ciwos´c´ moz˙na przypuszczac´, z˙e jedynie zwia˛zek daja˛cy na chromatogramie pik 8 byc´ moz˙e takim włas´nie zwia˛zkiem.

Ryc. 1. Chromatogram rozdziału RP-HPLC-DAD natywnych fenolokwaso´w. Fig. 1. RP-HPLC-DAD chromatogram of native phenolic acids.

Pochodne kwasu sinapowego daja˛ce piki 1 – 6 nie sa˛ w swej naturze ro´wniez˙ depsydami lub deptydami. W tego typu powia˛zaniach uczestnicza˛ bowiem grupy hydroksylowe piers´cienia aromatycz-nego, co oczywis´cie zmniejsza polarnos´c´ zwia˛zku. Wysoka polarnos´c´ zwia˛zko´w daja˛cych piki 1 – 6 wynika najprawdopodobniej z polarnos´ci zwia˛zku, kto´ry wia˛z˙e sie˛ z kwasem sinapowym poprzez jego grupe˛ karboksylowa˛. Za taka˛ hipoteza˛ przemawiac´ moz˙e duz˙a szerokos´c´ piku 1 na chromatogramie. Takim włas´nie szerokim pikiem w wysokosprawnej chromatografii kolumnowej cieczowej w układzie odwro´conych faz (RP-HPLC) i w micelarnej chromatografii elektrokinetycznej (MEKC) charakteryzuje sie˛ sinapina (15), kto´ra jest kwasem sinapowym zestryfikowanym cholina˛.

WNIOSKI

W ziarniakach pszenicy wie˛kszos´c´ kwasu sinapowego wyste˛puje w postaci

polarnych poła˛czen´ estrowych z nieznanymi zwia˛zkami naturalnymi. Zastosowanie

semipreparatywnej RP-HPLC w układzie gradientowym pozwoli uzyskac´ czyste

substancje do badan´ spektroskopowych.

Ryc. 2. Widma UV-DAD natywnych fenolokwaso´w rozdzielonych metoda˛ RP-HPLC-DAD 1-8 – jak na ryc. 1.

M. K a r a m a c´, A. K o s i n´ s k a SEPARATION OF NATIVE PHENOLIC ACIDS

OF WHEAT BY RP-HPLC-DAD S u m m a r y

Extract of phenolic compounds was obtained from wheat grains using 80% methanol and purified by RP-18 low pressure column chromatography. The extract was then analysed by RP-HPLC-DAD in gradient system. The resultant chromatogram was characterized by the presence of 8 main peaks. One of them originated from sinapic acid. The UV-DAD spectra confirmed that other phenolic constituents present in wheat were the derivatives of sinapic acid. In general, the polarity of those compounds was higher than that of sinapic acid.

PIS

´

1. White P.J., Xing Y.: Antioxidants from cereals and legumes. Shahidi F. (ed.): Natural Antioxidants. Chemistry, Health Effects, and Applications. AOCS Press, Champaign, Illinois, 1995; 25-63. – 2.

Brand-Williams W., Cuvelier M.E., Berset C.: Use of a free radical method to evaluate antioxidant

activity. Lebensm.-Wiss.Technol., 1995; 28: 25-30. – 3. Graf E.: Antioxidant activity of ferulic acid. Free Rad. Biol. Med., 1992; 13: 435-448. – 4. Karamac´ M., Kosin´ska A., Pegg R.B.: Comparision of radical – scavenging activities for selected phenolic acids. Pol. J. Food Nutr. Sci., 2005; 55: 165-170. – 5.

Karamac´ M., Bucin´ski A., Pegg R.B., Amarowicz R.: Antioxidant and antiradical activity of ferulates.

Czech J. Food Sci., 2005; 23: 64-68. – 6. Karamac´ M., Amarowicz R., Weidner S., Shahidi F.: Antioxidant activity of rye caryopses and embryos extracts. Czech J. Food Sci., 2002; 20: 209-214. – 7.

Karamac´ M., Amarowicz R., Weidner S., Abe S., Shahidi F.: 2004. Antioxidant activity of triticale

caryopses and embryos extracts. Food Sci. Biotechnol., 2004; 13: 421-424. – 8. Amarowicz R., Karamac´

M., Weidner S., Abe S., Shahidi F.: Antioxidant activity of wheat caryopses and embryos extracts. J.

Food Lipids, 2002; 9: 201-210. – 9. Zielin´ski H., Kozłowska H.: Antioxidant activity and total phenolics in selected cereal grains and their different morphological fractions. J. Agric. Food Chem., 2000; 48: 2008-2016. – 10. Amarowicz R., Weidner S.: Content of phenolic acids in rye caryopses determined using HPLC-DAD method. Czech J. Food Sci., 2001; 19: 201-203.

11. Weidner S., Amarowicz R., Karamac´ M., Da˛browski K.: Phenolic acids in caryopses of two cultivars of wheat, rye and triticale that display different resistance to preharvest sprouting. Eur. Food Res. Technol., 1999; 210: 109-113. – 12. Weidner S., Amarowicz R., Karamac´ M., Fra˛czek E.: Changes in endogenous phenolic acids during development of Secale cereale caryopses and after treatment of unripe rye grains. Plant Physiol. Biochem., 2000; 38: 595-602. – 13. Weidner S., Paprocka J.,

Łukaszewicz D.: Changes in free, esterified and glycosidic phenolic acids in cereal grains during the

after-ripening. Seed Sci.Technol., 1996; 24: 107-114. – 14. Amarowicz R., Piskuła M., Honke J.,

Rudnicka B., Troszyn´ska A., Kozłowska H.: Extraction of phenolic compounds from lentil (Lens culinaris) with various solvents. Pol. J. Food Nutr. Sci., 1995; 45: 53-62. – 15. Amarowicz R., Kołodziejczyk P., Pegg R.B.: Chromatographic separation of phenolic compounds from rapeseed by

a Sephadex LH-20 column with ethanol as the mobile phase. Liquit Chromat. Relat. Techn., 2003; 13: 2157-2165.