Biodegradable magnesium matrix composites for bone fixation devices

Delft University of Technology

Biodegradable magnesium matrix composites for bone fixation devices

Naddaf Dezfuli, Sina

DOI

10.4233/uuid:2c127d9b-17ab-449e-8e16-f93b10f55158

Publication date

2018

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Citation (APA)

Naddaf Dezfuli, S. (2018). Biodegradable magnesium matrix composites for bone fixation devices.

https://doi.org/10.4233/uuid:2c127d9b-17ab-449e-8e16-f93b10f55158

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Biodegradable m a g n e s i u m matrix

c o m p o s i t e s for bone fixation d e v i c e s

Propositions

Accompanying the thesis By Sina NaddafDezfuli

1. Future research projects should focus on in-vivo behavior of existing iVIg-based composites before attempting t o design and fabricate new ones.

2. Having a daily routine is important t o be productive and breaking one is important to be inventive.

3. A mandatory educational program for PhDs w o u l d improve their knowledge and skills more than an elective educational program. 4. PhD candidates should not be evaluated based on the number but

on the quality of their publications.

5. Ambition is the key element of being a renowned scholar. 6. Project-based research improves technology but does not do justice

t o curiosity-driven science.

7. Open-access journal publishers should shift their library t o a block-chain based platform t o make their articles available t o everyone everywhere.

8. Morality is a result of human experience of immorality.

9. The only way t o intellectually compete w i t h Al in the future is to integrate our brain w i t h Al.

These propositions are regarded as opposable and defendable, and have been approved as such by the supervisor and promoter. Dr. Jie Zhou and Prof dr. F.C.Tvan der Helm.

Biodegradable magnesium matrix composites

for bone fixation devices

Biodegradable magnesium matrix composites

for bone fixation devices

P r o e f s c h r i f t

ter verl<rijging van de graad van doctor aan de Technische Universiteit

Delft, op gezag de Rector IVlagnificus Prof.dr.ir. T.H.J.J. van der Hagen

voorzitter van het College voor Promoties, in het openbaar te verdedigen

op woensdag 13 juni 2018 om 10.00 uur

d o o r

Sina NADDAF DEZFULI

Master of Science in Biomaterials

Sharif University of Technology, Teheran, Iran

Dit proefschrift is goedgekeurd door de promotoren:

Prof. dr. F.C.T. van der Helm

Dr. J. Zhou

Samenstelling promotiecommissie:

Rector Magnificus,

Prof.dr. F.C.T. van der Helm,

Dr. J. Zhou,

TU Delft, voorzitter

TU Delft, promotor

TU Delft, promotor

Onafhankelijke leden:

Prof dr. K. Ito,

Prof dr. A.A. Zadpoor,

Prof.dr. R.G.H.H. Nelissen,

Prof dr.ir. J. Sietsma,

Prof dr.ir. H.A. Terryn,

Prof.dr.ir. H.H. Weinans,

TU Eindhoven

TU Delft

LUMC Leiden

TU Delft

VU Brussel/TU Delft

TU Delft, reservelid

This research was funded by The Netherlands Organization for Health

Research and Development (ZonMw) under the project 1163500004.

ISBN: 978-94-6186-938-8

Keywords: magnesium, composite, degradation, mechanical properties,

biocompatibility

Book and cover design: Sina NADDAF DEZFULI

Copyright © 2018 by Sina NADDAF DEZFULI

All rights reserved. No part of this book may be reproduce by any means,

or transmitted w i t h o u t the written permission of the author.

Table of contents

1. Introduction 1

1 . 1 . B a c l < g r o u n d 2 1.2. P r o b l e m s t a t e m e n t a n d h y p o t h e s i s 3 1.3. O b j e c t i v e s 5 1.4. O u t l i n e 5

2. Influence of HEPES buffer on the local pH and formation of surface layer

during in vitro degradation of magnesium in DMEM 7

2 . 1 . I n t r o d u c t i o n 9 2 . 2 . M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 1 1

2.3. R e s u l t s a n d d i s c u s s i o n 13

2 . 4 . C o n c l u s i o n s 2 1

3. Advanced bredlgite-containing magnesium-matrix composites for

biodegradable bone implant application 23

3 . 1 . I n t r o d u c t i o n 25 3 . 2 . M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 2 7

3 . 3 . R e s u l t s a n d d i s c u s s i o n 3 1

3 . 4 . C o n c l u s i o n s 5 4

4. Fabrication of novel magnesium-matrix composites and their mechanical

properties prior to and during in vitro degradation 57

4 . 1 . I n t r o d u c t i o n 5 9 4 . 2 . M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 6 0

4 . 3 . R e s u l t s a n d d i s c u s s i o n 6 4

4 . 4 . C o n c l u s i o n s 8 5

5. Biodegradation and mechanical behavior of an advanced bioceramic

containing Mg matrix composite synthesized through in-situ solid-state

oxidation 87

5 . 1 . I n t r o d u c t i o n 8 9 5 . 2 . M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 9 0 5 . 3 . R e s u l t s 9 6 5 . 4 . D i s c u s s i o n I l l 5.5. C o n c l u s i o n s 1 1 5

6. General Conclusions and Discussion 117

6 . 1 . G e n e r a l c o n c l u s i o n s 1 1 8

References

Summary

Curriculum Vitae

List of publications

Acl<nowledgments

1.1. Background

B o n e r e l a t e d d i s e a s e s s u c h as o s t e o p o r o s i s a f f e c t m i l l i o n s o f p e o p l e w o r l d w i d e , c a u s i n g m o r e t h a n 9 m i l l i o n f r a c t u r e s a n n u a l l y , w h i c h m e a n s a n o s t e o p o r o t i c f r a c t u r e e v e r y 3 s e c o n d s [ 1 ] . In 2 0 1 0 , a b o u t 3 0 m i l l i o n w o m e n a n d 7.5 m i l l i o n m e n in t h e E u r o p e a n U n i o n a n d t h e U n i t e d S t a t e s h a d o s t e o p o r o s i s [ 2 - 4 ] . By 2 0 5 0 , o s t e o p o r o s i s a n d its a s s o c i a t e d f r a g i l i t y f r a c t u r e s s u c h h i p a n d v e r t e b r a l f r a c t u r e s in m e n a n d w o m e n a r e e x p e c t e d t o i n c r e a s e b y 3 1 0 % a n d 2 4 0 % c o m p a r e d t o y e a r 1 9 9 0 , r e s p e c t i v e l y [ 5 ] . O s t e o p o r o s i s - r e l a t e d f r a g i l i t y f r a c t u r e s i m p o s e a m a j o r p u b l i c h e a l t h b u r d e n in i n d u s t r i a l a n d d e v e l o p e d c o u n t r i e s . In 2 0 1 0 , f o r e x a m p l e , p u b l i c h e a l t h b u r d e n r e l a t e d t o f r a g i l i t y f r a c t u r e s In B e l g i u m , N e t h e r l a n d s a n d G e r m a n y w a s a b o u t € 1 0 b i l l i o n , w h i c h is e s t i m a t e d t o i n c r e a s e by 2 5 % in 2 0 2 5 , e x c e e d i n g € 12 b i l l i o n [ 6 ] . N u m e r o u s b o n e f r a c t u r e s n e e d t o b e t r e a t e d by u s i n g e i t h e r p e r m a n e n t o r t e m p o r a r y ( b i o d e g r a d a b l e ) f i x t u r e s . For l o a d - b e a r i n g a p p l i c a t i o n s , m e t a l l i c m a t e r i a l s p l a y a n i m p o r t a n t r o l e as b i o m a t e r i a l s t o p r o v i d e n e c e s s a r y s u p p o r t f o r t h e d a m a g e d b o n e t i s s u e t o r e p a i r a n d r e m o d e l i t s e l f [ 7 ] . C o m p a r e d t o t h e i r c e r a m i c - a n d p o l y m e r - b a s e d c o u n t e r p a r t s , m e t a l l i c b i o m a t e r i a l s a r e m o r e s u i t a b l e c h o i c e s d u e t o t h e i r e x c e l l e n t c o m b i n a t i o n o f h i g h m e c h a n i c a l s t r e n g t h a n d f r a c t u r e t o u g h n e s s [ 7 ] . C o m m o n l y u s e d p e r m a n e n t m e t a l - b a s e d b i o m a t e r i a l s i n c l u d e s t a i n l e s s s t e e l s , t i t a n i u m a n d c o b a l t - c h r o m i u m a l l o y s , w h i c h a r e n e a r l y i n e r t in v i v o , m e a n i n g t h a t t h e y d o n o t a c t i v e l y i n t e r a c t w i t h b i o l o g i c a l s y s t e m s a n d t h e y r e m a i n as p e r m a n e n t f i x t u r e s . A l t h o u g h s o m e a n i m a l a n d c l i n i c a l s t u d i e s s u g g e s t t h e e f f e c t i v e n e s s o f t h e s e m a t e r i a l s f o r o r t h o p e d i c a p p l i c a t i o n s [ 8 - 1 0 ] , o t h e r r e t r i e v a l s t u d i e s d e m o n s t r a t e d s e v e r cases o f c o r r o s i o n , g e n e r a t i n g t o x i c m e t a l i o n s in t h e v i c i n i t y o f t h e s e i m p l a n t s , w h i c h e n a b l e s i n f l a m m a t o r y c a s c a d e s o f t h e b o d y , i n v o l v i n g m a c r o p h a g e s in t h e p r o c e s s , c a u s i n g b o n e r e s o r p t i o n a n d o s t e o l y s i s , w h i c h u l t i m a t e l y r e s u l t s in i m p l a n t l o o s e n i n g a n d t i s s u e loss [ 1 1 - 1 6 ] . T h e r e b y , p e r m a n e n t f i x t u r e s m u s t b e r e m o v e d by a s e c o n d s u r g i c a l p r o c e d u r e a f t e r t h e t i s s u e has h e a l e d s u f f i c i e n t l y . D u r i n g t h e p a s t 2 0 y e a r s , o r t h o p e d i c i m p l a n t s , b a s e d o n b i o d e g r a d a b l e m e t a l s [ 1 7 ] , h a v e b e e n d e v e l o p e d a n d s t u d i e d as p o t e n t i a l a l t e r n a t i v e s t o p e r m a n e n t f i x t u r e s , h o p i n g t o a c h i e v e t h e d e s i r e d a b i l i t y o f p r o v i d i n g t e m p o r a r y s u p p o r t f o r f r a c t u r e d b o n e a n d s i m u l t a n e o u s l y , d i s s o l v i n g a t a r a t e t h a t m a t c h e s n e w t i s s u e f o r m a t i o n [ 1 8 ] . M a g n e s i u m has b e c o m e p o p u l a r as a b i o d e g r a d a b l e i m p l a n t m a t e r i a l d u e t o its b i o d e g r a d a b l e n a t u r e , h i g h s t r e n g t h - t o - d e n s i t y r a t i o , a n d m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s s i m i l a r t o t h o s e o f t h e h u m a n b o n e , w h i c h m a k e s i t s u p e r i o r t o e x i s t i n g b i o d e g r a d a b l e m a t e r i a l s s u c h as p o l y m e r s a n d c e r a m i c s in l o a d - b e a r i n g a p p l i c a t i o n s [ 1 9 ] .

2

1.2. Problem s t a t e m e n t and hypothesis

D e s p i t e n u m e r o u s a d v a n t a g e s o f IVlg-based m a t e r i a l s , e x t r e m e l y h i g h d e g r a d a t i o n r a t e o f c o m m e r c i a l l y p u r e m a g n e s i u m in t h e p h y s i o l o g i c a l e n v i r o n m e n t i m p o s e s s e v e r e l i m i t a t i o n s in c l i n i c a l a p p l i c a t i o n s . M a g n e s i u m d i s s o l v e s r e a d i l y in a q u e o u s s o l u t i o n s , e s p e c i a l l y t h o s e c o n t a i n i n g c h l o r i d e i o n , l e a d i n g t o r a p i d r e l e a s e o f h y d r o g e n gas a n d r e s u l t i n g in t h e f o r m a t i o n o f s u b c u t a n e o u s b u b b l e s a n d d e t e r i o r a t i o n o f t h e m e c h a n i c a l i n t e g r i t y o f t h e i m p l a n t b e f o r e c o m p l e t e h e a l i n g o f i n j u r e d b o n e t i s s u e [ 1 7 ] . C o m m o n l y k n o w n m a g n e s i u m a l l o y s , i n c l u d i n g A Z 3 1 , A Z 9 1 a n d W/E43, h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d f o r b o n e i m p l a n t a p p l i c a t i o n s as a l t e r n a t i v e s t o m o n o l i t h i c m a g n e s i u m m e t a l , b e c a u s e o f t h e i r r e l a t i v e l y l o w e r d e g r a d a t i o n r a t e s a n d h i g h e r m e c h a n i c a l s t r e n g t h s . It has b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t all t h e a b o v e m e n t i o n e d a l l o y s w e r e in d i r e c t c o n t a c t w i t h t h e s u r r o u n d i n g b o n e t i s s u e a f t e r i m p l a n t a t i o n , a n d b o n e m a s s s u r r o u n d i n g t h e i m p l a n t s w a s f o u n d t o b e e n h a n c e d d u r i n g d e g r a d a t i o n [ 2 0 ] . D e s p i t e t h e e n c o u r a g i n g p r e l i m i n a r y o u t c o m e s o f t h e i n - v i v o s t u d i e s o n g u i n e a p i g s , i t has b e e n s h o w n t h a t c o m m o n a l l o y i n g e l e m e n t s o f m a g n e s i u m s u c h as a l u m i n u m m i g h t h a v e l a t e n t t o x i c e f f e c t s o n t h e h u m a n b o d y , c a u s i n g n e u r o l o g i c a l d i s o r d e r o r e v e n c a n c e r [ 2 1 , 2 2 ] . M a g n e s i u m - b a s e d c o m p o s i t e s , h a v i n g b i o a c t i v e c e r a m i c p a r t i c l e s i n c o r p o r a t e d i n t o t h e m o n o l i t h i c m a g n e s i u m m a t r i x c o u l d b e a n e x c e l l e n t a l t e r n a t i v e t o t h e i r a l l o y e d c o u n t e r p a r t s . As a n e w g e n e r a t i o n o f b i o m a t e r i a l s , m a g n e s i u m - b a s e d c o m p o s i t e s c a n p r o v i d e a c o m b i n a t i o n o f u n i q u e c h a r a c t e r i s t i c s i n c l u d i n g a d j u s t a b l e m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s (i.e., s t r e n g t h , d u c t i l i t y a n d e l a s t i c m o d u l u s ) , c o r r o s i o n r e s i s t a n c e a n d b i o a c t i v i t y b y t h e a p p r o p r i a t e s e l e c t i o n o f t h e r e i n f o r c e m e n t m a t e r i a l w i t h o u t t h e n e e d o f u s i n g a l l o y i n g e l e m e n t s so as t o a v o i d a n y k n o w n o r u n c e r t a i n c l i n i c a l s i d e e f f e c t s [ 2 3 - 2 5 ] . T h e s u p e r i o r b i o a c t i v i t y o f m a g n e s i u m - b a s e d c o m p o s i t e s as c o m p a r e d w i t h t h e i r a l l o y e d c o u n t e r p a r t s has b e e n p r o v e n i n p r e v i o u s s t u d i e s b y d e m o n s t r a t i n g t h e a b i l i t y o f t h e c o m p o s i t e s t o i n d u c e t h e f o r m a t i o n o f b i o a c t i v e c a l c i u m - a n d p h o s p h a t e - c o n t a i n i n g c o m p o u n d s , w h i c h l e a d s t o e n h a n c e d p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f o s t e o b l a s t i c cells [ 2 6 , 2 7 ] . When c h o o s i n g a c e r a m i c r e i n f o r c e m e n t , it is c r i t i c a l l y i m p o r t a n t t o c o n s i d e r a n d f u l f i l l t h e basic, a n d a t t h e s a m e t i m e , e s s e n t i a l r e q u i r e m e n t s o f a b i o c e r a m i c p h a s e in m a g n e s i u m m a t r i x c o m p o s i t e s f o r o r t h o p e d i c p u r p o s e s , w h i c h a r e b i o c o m p a t i b i l i t y , b i o d e g r a d a b i l i t y , b i o a c t i v i t y a n d m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s . T o d a t e , m o s t o f t h e c h o s e n b i o c e r a m i c s , s u c h as h y d r o x y l a p p e t i t e ( H A ) a n d 15-Tricalcium p h o s p h a t e (15-TCP) h a v e o n e o r m o r e d e f i c i e n c i e s . For e x a m p l e , HA is a o s t e o c o n d u c t i v e c e r a m i c h o w e v e r , o f t e n r e g a r d e d as a p e r m a n e n t b i o m a t e r i a l b e c a u s e it p o o r l y r e s o r b s in t h e b o d y , l i m i t i n g t h e p r o c e s s o f b i o m a t e r i a l i n t e g r a t i o n vi/ith t h e s u r r o u n d i n g b o n e t i s s u e , e s p e c i a l l y w i t h i n a f e w w e e k s a f t e r i m p l a n t a t i o n .

3

w h i c h c o u l d l e a d t o t h e f o r m a t i o n o f f i b r o u s t i s s u e a r o u n d t h e i m p l a n t , b e i n g s u s c e p t i b l e t o l o n g - t e r m f a i l u r e [ 2 8 ] . 15-TCP o n t h e o t h e r h a n d r e s o r b s m u c h f a s t e r t h a n HA b u t p a r t i a l l y c o n v e r t s t o HA w h e n i m p l a n t e d in t h e b o d y [ 2 9 ] , l e a v i n g s l o w l y a b s o r b i n g f r a g m e n t s o f H A a t i m p l a n t a t i o n s i t e . M o r e o v e r , HA a n d f5-TCP b o t h a r e n o t o s t e o i n d u c t i v e , m e a n i n g t h a t t h e y c a n n o t i n d u c e t h e p r o c e s s o f n e w b o n e f o r m a t i o n , m a i n l y b e c a u s e t h e y lack s i l i c o n t h a t is d i r e c t l y i n v o l v e d in t h e m i n e r a l i z a t i o n p r o c e s s o f b o n e g r o w t h [ 3 0 ] . T h e b i o c e r a m i c o f c h o i c e in o u r r e s e a r c h ( B r e d i g i t e - C a 7 M g S i 4 0 1 6 ) is a b i o d e g r a d a b l e S i - c o n t a i n i n g c e r a m i c in t h e CaO M g O Si02 f a m i l y , w i t h a p r o v e n s t i m u l a t i n g e f f e c t o n o s t e o b l a s t p r o l i f e r a t i o n [ 3 1 , 3 2 ] a n d m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s c l o s e t o t h o s e o f c o r t i c a l b o n e [ 3 3 ] . T h e s u p e r i o r b i o a c t i v i t y a n d m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s o f b r e d i g i t e c o m p a r e d t o t r a d i t i o n a l l y u s e d c a l c i u m - p h o s p h a t e - b a s e d c o m p o u n d s m a k e s i t a m o r e s u i t a b l e o p t i o n f o r o r t h o p e d i c a p p l i c a t i o n s , w h e r e m e c h a n i c a l l o a d is a p p l i e d o n t h e i m p l a n t [ 3 3 ] . A d d i t i o n a l l y , b r e d i g i t e has a p o t e n t i a l a b i l i t y t o f o r m a c h e m i c a l b o n d i n g w i t h t h e m a g n e s i u m m a t r i x [ 2 4 ] , w h i c h d i f f e r e n t i a t e s t h e b i o c e r a m i c s in t h e C a O - S i 0 2 - M g O s y s t e m f r o m t h e o t h e r m a g n e s i u m - m a t r i x c o m p o s i t e s t h a t h a v e so f a r b e e n s t u d i e d p o t e n t i a l l y f o r o r t h o p e d i c a p p l i c a t i o n s . F a b r i c a t i o n m e t h o d o f b i o c e r a m i c - r e i n f o r c e d m a g n e s i u m m a t r i x c o m p o s i t e s is as c r i t i c a l l y i m p o r t a n t as t h e c h o i c e o f a s u i t a b l e r e i n f o r c e m e n t . T o d a t e , m o s t o f t h e m a g n e s i u m - b a s e d c o m p o s i t e s h a v e b e e n m a n u f a c t u r e d b y p o w d e r m e t a l l u r g y m e t h o d s [ 2 3 , 3 4 ] . P o w d e r m e t a l l u r g y is a u n i q u e l o w - t e m p e r a t u r e m a n u f a c t u r i n g p r o c e s s , w h i c h a l l o w s e f f e c t i v e c o n t r o l o v e r f a b r i c a t i o n p a r a m e t e r s , c o n s e r v e s e n e r g y a n d e n a b l e s h o m o g e n o u s d i s p e r s i o n o f r e i n f o r c i n g p a r t i c l e s in t h e m e t a l l i c m a t r i x , t h e r e b y i m p r o v i n g t h e m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s as w e l l as t h e c o r r o s i o n r e s i s t a n c e . H o w e v e r , m o s t o f p o w d e r m e t a l l u r g y p r o c e s s e d M g - m a t r i x c o m p o s i t e s s u f f e r f r o m e x c e s s i v e p o r o s i t y a n d i n t e r - p a r t i c l e f r a c t u r e u n d e r l o a d i n g [ 2 3 , 3 5 ] - a n issue t h a t w e a t t e m p t e d t o a d d r e s s in t h i s r e s e a r c h . This issue is o f c r i t i c a l i m p o r t a n c e b e c a u s e p o r o s i t y a n d m e c h a n i c a l c r a c k s c o u l d l e a d t o i n t e n s e l o c a l i z e d c o r r o s i o n a n d p r e m a t u r e m e c h a n i c a l f a i l u r e , p r o d u c i n g b r o k e n p i e c e s a n d d e b r i s , d a m a g i n g t h e s u r r o u n d i n g t i s s u e a n d i n c r e a s i n g t h e risk o f c l i n i c a l c o m p l i c a t i o n s [ 1 9 ] . For l o a d - b e a r i n g b i o d e g r a d a b l e i m p l a n t s , it is c o n s i d e r e d i d e a l if t h e m e c h a n i c a l s t r e n g t h o f t h e f a b r i c a t e d m a t e r i a l g r a d u a l l y d e c r e a s e s as b o n e d e f e c t s a r e r e p l a c e d b y n e w t i s s u e . In t h i s p r o c e s s , t h e f a b r i c a t e d M g - b r e d i g i t e c o m p o s i t e s h o u l d b e a b l e t o w i t h s t a n d t h e a p p l i e d m e c h a n i c a l l o a d s d u r i n g t h e h e a l i n g p r o c e s s (3 - 6 m o n t h s ) . T o a c h i e v e m e c h a n i c a l f u n c t i o n as l o n g as c l i n i c a l l y r e q u i r e d , t h e r e is a s t r o n g n e e d t o u n d e r s t a n d t h e d e g r a d a t i o n m e c h a n i s m s in r e l a t i o n t o t h e g r a d u a l losses o f t h e m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s o f m a g n e s i u m - b r e d i g i t e c o m p o s i t e s in o r d e r t o d r a w a c o m p r e h e n s i v e o u t l o o k o n t h e c o m p o s i t e ' s b e h a v i o r d u r i n g t h e c o u r s e o f d e g r a d a t i o n . 4

1.3. Objectives of the research

T a k i n g thie a b o v e m e n t i o n e d issues a b o u t t h e c u r r e n t IVlg-based c o m p o s i t e s i n t o a c c o u n t , o u r m a i n o b j e c t i v e w a s f i r s t t o f a b r i c a t e b i o d e g r a d a b l e m a g n e s i u m - b a s e d c o m p o s i t e s u s i n g a p o w d e r m e t a l l u r g y m e t h o d w i t h c a r e f u l s e l e c t i o n o f t h e b i o c e r a m i c p a r t o f t h e c o m p o s i t e s as a r e i n f o r c i n g p h a s e t o s a t i s f y t h e a b o v e m e n t i o n e d r e q u i r e m e n t s , a n d t h e n a i m i n g a t o p t i m i z i n g t h e p r o c e s s p a r a m e t e r s f o r p o w d e r m e t a l l u r g y m a g n e s i u m - b a s e d c o m p o s i t e s t o l i m i t t h e p r o b l e m o f e x c e s s i v e p o r o s i t y a n d a v o i d p r e m a t u r e i n t e r p a r t i c l e f r a c t u r e , w h i l e i m p r o v i n g t h e d e g r a d a t i o n b e h a v i o r . S u b s e q u e n t l y , w e a i m e d a t d e t e r m i n i n g t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e d e g r a d a t i o n b e h a v i o r a n d t h e loss o f t h e m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s o f m a g n e s i u m - b r e d i g i t e c o m p o s i t e s . When b i o a c t i v e p a r t i c l e s a r e a d d e d t o t h e m a g n e s i u m m a t r i x t o p r o d u c e m a g n e s i u m m a t r i x c o m p o s i t e s , t h e y p a r t i c i p a t e in c h e m i c a l r e a c t i o n s , in a d d i t i o n t o m a g n e s i u m , b y c o n t i n u o u s l y r e l e a s i n g b i o a c t i v e a g e n t s i n t o t h e s u r r o u n d i n g s , w h i c h w i l l i d e a l l y r e s u l t in f o r m i n g a p r o t e c t i v e l a y e r a n d s t i m u l a t i n g a p p e t i t e f o r m a t i o n t h r o u g h o u t t h e w h o l e c o u r s e o f d e g r a d a t i o n [ 3 6 ] . T o c l a r i f y t h e u n d e r l y i n g r o l e s o f e a c h p a r t o f t h e c o m p o s i t e ( m a g n e s i u m + b r e d i g i t e ) , w e f i r s t i n v e s t i g a t e d t h e m e c h a n i s m s a f f e c t i n g t h e d e g r a d a t i o n o f m o n o l i t h i c m a g n e s i u m in a p s e u d o - p h y s i o l o g i c a l s o l u t i o n a n d t h e n , t h e c o m p o s i t e as a w h o l e w a s i n v e s t i g a t e d w i t h p a r t i c u l a r a t t e n t i o n t o u n d e r s t a n d i n g t h e r o l e t h a t s i l i c o n -c o n t a i n i n g b r e d i g i t e p l a y e d i n -c o r r o s i o n a n d b i o a -c t i v i t y m e -c h a n i s m s .

1.4. Outline of the research

This t h e s i s t r i e s t o a d d r e s s t h e c u r r e n t issues r e g a r d i n g t h e a p p l i c a b i l i t y o f b i o d e g r a d a b l e m a g n e s i u m - b a s e d c o m p o s i t e s f o r s u c c e s s f u l c l i n i c a l t r i a l s . In t h i s r e g a r d , c h a p t e r 2 e x p l o r e s t h e d e g r a d a t i o n b e h a v i o r o f p o w d e r m e t a l l u r g y p r o c e s s e d m o n o l i t h i c m a g n e s i u m in a p s e u d o - p h y s i o l o g i c a l s o l u t i o n . C h a p t e r 3 e x p l o r e s t h e d e g r a d a t i o n b e h a v i o r o f m a g n e s i u m - b r e d i g i t e c o m p o s i t e s , w i t h p a r t i c u l a r a t t e n t i o n t o t h e r o l e o f t h e b r e d i g i t e b i o c e r a m i c in d e g r a d a t i o n a n d b i o a c t i v i t y m e c h a n i s m s . C h a p t e r 4 a t t e m p t s t o e s t a b l i s h a c l e a r c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e c o r r o s i o n m o d e a n d r a t e , a n d t h e loss o f t h e m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s d u r i n g d e g r a d a t i o n in a p e s u e d o -p h y s i o l o g i c a l s o l u t i o n . 5

C h a p t e r 5 a i m s a t a d d r e s s i n g t h e c o m m o n issues o f m a g n e s i u m - b a s e d c o m p o s i t e s , i.e., i n t e r p a r t i c l e f r a c t u r e u n d e r l o a d i n g a n d i n t e n s e l o c a l i z e d c o r r o s i o n , b y e x p l o r i n g t h e f e a s i b i l i t y o f e s t a b l i s h i n g a c h e m i c a l b o n d i n g b e t w e e n p o w d e r p a r t i c l e s , as a n a d d i t i o n a l b o n d i n g m e c h a n i s m t o t h e m e c h a n i c a l i n t e r l o c k i n g . C h a p t e r 6 c r i t i c a l l y e x a m i n e s t h e f i n d i n g s in t h e l i g h t o f t h e p r e v i o u s c h a p t e r s a n d p r o v i d e s p r a c t i c a l g u i d e l i n e s f o r f u r t h e r r e s e a r c h o n t h e s u b j e c t .

6

CHAPTER

Influence of HEPES buffer on the local pH and

formation of surface layer during in vitro

degradation of magnesium in DMEM

This c h a p t e r is p u b l i s h e d a s : N a d d a f D e z f u l i , S., H u a n , Z., M o l , J . M . C . , C h a n g , J., Z h o u , J., 2 0 1 4 . I n f l u e n c e o f HEPES b u f f e r o n t h e l o c a l p H a n d f o r m a t i o n o f s u r f a c e l a y e r d u r i n g in v i t r o d e g r a d a t i o n o f m a g n e s i u m in D M E M . P r o g r e s s in N a t u r a l S c i e n c e : M a t e r i a l s I n t e r n a t i o n a l 2 4 , 5 3 1 -5 3 8 . 7

Abstract

T h e h u m a n b o d y is a b u f f e r e d e n v i r o n m e n t w h e r e pH is e f f e c t i v e i y m a i n t a i n e d . HEPES is a b i o l o g i c a l b u f f e r o f t e n u s e d t o m i m i c t h e b u f f e r i n g a c t i v i t y o f t h e b o d y in in v i t r o s t u d i e s o n t h e d e g r a d a t i o n b e h a v i o r o f m a g n e s i u m . H o w e v e r , t h e i n f l u e n c e o f HEPES o n t h e d e g r a d a t i o n b e h a v i o r o f m a g n e s i u m in t h e D M E M p s e u d o -p h y s i o l o g i c a l s o l u t i o n has n o t y e t b e e n d e t e r m i n e d . T h e r e s e a r c h a i m e d a t e l u c i d a t i n g t h e d e g r a d a t i o n m e c h a n i s m s o f m a g n e s i u m in D M E M w i t h a n d w i t h o u t HEPES. T h e m o r p h o l o g i e s a n d c o m p o s i t i o n s o f s u r f a c e layers f o r m e d d u r i n g in v i t r o d e g r a d a t i o n t e s t s f o r 15 - 3 6 0 0 s w e r e c h a r a c t e r i z e d . T h e e f f e c t o f HEPES o n t h e e l e c t r o c h e m i c a l b e h a v i o r a n d c o r r o s i o n t e n d e n c y w a s d e t e r m i n e d b y p e r f o r m i n g e l e c t r o c h e m i c a l t e s t s . HEPES i n d e e d r e t a i n e d t h e l o c a l p H , l e a d i n g t o i n t e n s e i n t e r g r a n u l a r / i n t e r p a r t i c l e c o r r o s i o n o f m a g n e s i u m m a d e f r o m p o w d e r a n d a n i n c r e a s e d d e g r a d a t i o n r a t e . T h i s w a s a t t r i b u t e d t o a n i n t e r c o n n e c t e d n e t w o r k o f cracl<s f o r m e d a t t h e o r i g i n a l p o w d e r p a r t i c l e b o u n d a r i e s a n d g r a i n b o u n d a r i e s in t h e s u r f a c e l a y e r , w h i c h p r o v i d e d p a t h w a y s f o r t h e c o r r o s i v e m e d i u m t o i n t e r a c t c o n t i n u o u s l y w i t h t h e i n t e r n a l s u r f a c e s a n d p r o m o t e d f u r t h e r d i s s o l u t i o n . S u r f a c e a n a l y s i s r e v e a l e d s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d a m o u n t s o f p r e c i p i t a t e d c a l c i u m p h o s p h a t e s d u e t o t h e b u f f e r i n g a c t i v i t y o f HEPES s o t h a t m a g n e s i u m b e c a m e less w e l l p r o t e c t e d in t h e b u f f e r e d e n v i r o n m e n t .

8

2.1. Introduction

B i o d e g r a d a b l e c e r a m i c s o r p o l y m e r s a r e n o t r e a l l y s u i t a b l e i m p l a n t m a t e r i a l s f o r a p p l i c a t i o n s a t t h e l o a d - b e a r i n g s i t e s o f t h e h u m a n b o d y , b e c a u s e o f a lack o f s u f f i c i e n t m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s [ 3 7 , 3 8 ] , a n d t h e r e f o r e t h e y a r e o f t e n u s e d t o f i l l u p t h e c a v i t i e s o f t h e d a m a g e d b o n e t i s s u e [ 3 9 ] . M o r e s u i t a b l e b i o d e g r a d a b l e m a t e r i a l s f o r t h e r e p a i r o f l o a d - b e a r i n g d e f e c t s a r e t h e m e t a l l i c o n e s t h a t h a v e h i g h e r f r a c t u r e t o u g h n e s s a n d d u c t i l i t y t h a n b i o - c e r a m i c s a n d h i g h e r s t r e n g t h a n d e l a s t i c m o d u l u s t h a n b i o - p o l y m e r s . M a g n e s i u m a n d its a l l o y s r e p r e s e n t t h e m o s t i n t e r e s t i n g b i o d e g r a d a b l e m a t e r i a l s . T h e s e m a t e r i a l s p o s s e s s d e n s i t i e s a n d e l a s t i c m o d u l i c l o s e r t o t h o s e o f t h e h u m a n b o n e t h a n o t h e r m e t a l l i c b i o m a t e r i a l s f o r p e r m a n e n t i m p l a n t s s u c h as s t a i n l e s s s t e e l , c o b a l t - c h r o m i u m a l l o y s a n d t i t a n i u m a l l o y s [ 4 0 ] , w h i c h m a k e s t h e m p r o m i s i n g c a n d i d a t e s f o r o r t h o p e d i c a p p l i c a t i o n s a t t h e l o a d - b e a r i n g s i t e s o f t h e h u m a n b o d y [ 4 1 , 4 2 ] . H o w e v e r , a d v a n c e s t o w a r d s t h e c l i n i c a l a p p l i c a t i o n s o f t h e s e m a t e r i a l s h a v e b e e n s e r i o u s l y h a m p e r e d b y t o o r a p i d d e g r a d a t i o n a n d p r e m a t u r e loss o f m e c h a n i c a l i n t e g r i t y in p h y s i o l o g i c a l e n v i r o n m e n t s . A l t h o u g h a g r e a t d e a l o f r e s e a r c h has b e e n d i r e c t e d t o w a r d u n d e r s t a n d i n g t h e i r c o r r o s i o n b e h a v i o r a n d s e e k i n g m e a s u r e s t o s l o w d o w n d e g r a d a t i o n , t h e u n d e r l y i n g c o r r o s i o n m e c h a n i s m s o f m a g n e s i u m a n d its a l l o y s in r e l a t i o n t o c o m p l e x p h y s i o l o g i c a l m e d i a u n d e r in vitro a n d in vivo t e s t c o n d i t i o n s h a v e n o t b e e n f u l l y u n d e r s t o o d . C l e a r l y , f u r t h e r e f f o r t s a r e n e e d e d t o r e v e a l t h e n a t u r e o f t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n m a g n e s i u m a n d p h y s i o l o g i c a l m e d i a . In in vitro s t u d i e s o n t h e d e g r a d a t i o n b e h a v i o r o f m a g n e s i u m a n d its a l l o y s , t h e c h o i c e o f a s u i t a b l e t e s t m e d i u m is o f c r i t i c a l i m p o r t a n c e . M a n y t y p e s o f p s e u d o -p h y s i o l o g i c a l s o l u t i o n s t h a t m i m i c t h e c o m -p o s i t i o n o f b o d y f l u i d s , s u c h as 0.9 w t . % NaCI s o l u t i o n , c o n v e n t i o n a l s i m u l a t e d b o d y f l u i d (c-SBF), r e v i s e d s i m u l a t e d b o d y f l u i d (r-SBF), H a n k ' s b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n , D u l b e c c o ' s m o d i f i e d Eagle's m e d i u m ( D M E M ) a n d p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e (PBS) h a v e b e e n u s e d . A m o n g t h e s e , D M E M is o n e o f t h e c e l l c u l t u r e s o l u t i o n s t h a t has b e e n p r o v e n t o p r o d u c e a n a p p r o p r i a t e p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n f o r in vitro d e g r a d a t i o n t e s t s o f m a g n e s i u m [ 4 3 - 4 5 ] . M a j o r i n o r g a n i c s a l t s in D M E M , s u c h as s o d i u m b i c a r b o n a t e , t u r n m a g n e s i u m i o n s i n t o m a g n e s i u m c a r b o n a t e s , r e s u l t i n g in s u r f a c e p a s s i v a t i o n [ 4 6 ] . C a r b o n d i o x i d e a l s o t r i g g e r s t h e f o r m a t i o n o f m a g n e s i u m c a r b o n a t e s . In t h e p r e s e n c e o f c a r b o n d i o x i d e in a q u e o u s s o l u t i o n s , c a r b o n i c a c i d f o r m s , w h i c h is t h e i n g r e d i e n t f o r M g C O s f o r m a t i o n [ 4 6 - 4 8 ] . T h e f o r m a t i o n o f a c a r b o n a t e d l a y e r is t h o u g h t t o e n c o u r a g e f u r t h e r p r e c i p i t a t i o n o f t h e m o s t i m p o r t a n t i n o r g a n i c c o n s t i t u e n t s o f b i o l o g i c a l h a r d t i s s u e s - c a l c i u m p h o s p h a t e p h a s e s [ 4 7 ] , w h i c h is o f b i o l o g i c a l a n d m e d i c a l s i g n i f i c a n c e . 9

As s o o n as m a g n e s i u m is in c o n t a c t w i t h i a s i m u l a t e d p h y s i o l o g i c a l s o l u t i o n , c o r r o s i o n tal<es p l a c e , l e a d i n g t o t h e c h a n g e s in t h e c h e m i s t r y o f t h e m a g n e s i u m s u r f a c e a n d t h e s u r r o u n d i n g s o l u t i o n . It has b e e n o b s e r v e d d u r i n g in vitro i m m e r s i o n t e s t s t h a t c o r r o s i o n o f m a g n e s i u m l e a d s t o t h e l o c a l f o r m a t i o n o f h y d r o x y l i o n s a n d t h e i r l e a c h i n g i n t o t h e s u r r o u n d i n g s o l u t i o n , w h i c h a l t e r s t h e p H o f t h e s o l u t i o n t h r o u g h l o c a l a l k a l i z a t i o n [ 1 9 ] . In t h e h u m a n b o d y , h o w e v e r , p H c a n n o t i n c r e a s e s i g n i f i c a n t l y , as it is a c t i v e l y r e g u l a t e d t h r o u g h v a r i o u s b i o c h e m i c a l r e a c t i o n s [ 4 9 ] . T h e r e f o r e , t h e a d d i t i o n o f a b u f f e r t o t h e i m m e r s i o n s o l u t i o n p r o v i d e s m a g n e s i u m w i t h a r e a l i s t i c d e g r a d a t i o n e n v i r o n m e n t , as it c l o s e l y m i m i c s t h e in vivo s i t u a t i o n . In t h e in vivo s i t u a t i o n , t h e p H o f b o d y f l u i d s is r e g u l a t e d 3 9 % b y t h e r e s p i r a t o r y s y s t e m , i.e., t h e C O a / b i c a r b o n a t e s y s t e m , a n d 6 1 % by b i o c h e m i c a l b u f f e r s , e . g . , p r o t e i n s ( e x c l u d i n g t h e k i d n e y s t h a t h a v e a l o n g - t e r m b u f f e r i n g e f f e c t o n p H ) . In o t h e r w o r d s , t h e b i o c h e m i c a l b u f f e r s p l a y a d o m i n a n t r o l e in r e g u l a t i n g t h e p H o f t h e p h y s i o l o g i c a l e n v i r o n m e n t s in t h e b o d y , r e l a t i v e t o t h e b i c a r b o n a t e b u f f e r i n g s y s t e m [ 5 0 ] . T h u s , t o m i m i c t h e in vivo e n v i r o n m e n t s , t h e b u f f e r c h o s e n f o r in vitro t e s t s s h o u l d h a v e a g r e a t e r b u f f e r i n g c a p a c i t y t h a n t h e C O a / b i c a r b o n a t e s y s t e m . In p r e c e d i n g in vitro d e g r a d a t i o n t e s t s o f m a g n e s i u m a n d its a l l o y s , d i f f e r e n t b u f f e r i n g a g e n t s o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s h a v e b e e n a d d e d t o d i f f e r e n t p s e u d o -p h y s i o l o g i c a l s o l u t i o n s . As t h e c o r r o s i o n b e h a v i o r o f m a g n e s i u m a n d its a l l o y s is h i g h l y s e n s i t i v e t o t h e a g g r e s s i v e e n v i r o n m e n t , t h e t y p e a n d c o n c e n t r a t i o n o f b u f f e r i n g a g e n t s c a n d r a m a t i c a l l y c h a n g e t h e i r d e g r a d a t i o n b e h a v i o r . D u e t o t h e u s e o f d i f f e r e n t p s e u d o - p h y s i o l o g i c a l s o l u t i o n s a n d b u f f e r i n g a g e n t s , m a n y i n c o n s i s t e n t r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d f r o m in vitro a n d in vivo s t u d i e s o n t h e d e g r a d a t i o n b e h a v i o r o f m a g n e s i u m a n d its a l l o y s , w h i c h m a k e s t h e c o m p a r i s o n s b e t w e e n in

vitro t e s t r e s u l t s a n d b e t w e e n in vitro a n d in vivo t e s t r e s u l t s d i f f i c u l t . H C I - c o n t a i n i n g

b u f f e r s y s t e m s , f o r e x a m p l e , h a v e s h o w n t h e i r a b i l i t i e s t o i n t r o d u c e c h l o r i d e i o n s i n t o t h e s o l u t i o n , w h i c h in t u r n a t t a c k t h e s u r f a c e l a y e r o f m a g n e s i u m [ 5 1 ] . P h o s p h a t e - b a s e d b u f f e r s a l t e r t h e c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e c o r r o s i o n l a y e r , as t h e y p r o v i d e p h o s p h a t e i o n s in a q u e o u s s o l u t i o n s , t h e r e b y p r o d u c i n g i n s o l u b l e salts w i t h m a g n e s i u m ions a n d e v e n t u a l l y p r e c i p i t a t i n g o n t h e s u r f a c e [ 4 8 , 5 2 ] . In a d d i t i o n , p h o s p h a t e - b a s e d b u f f e r s c o n t r i b u t e t o r e g u l a t i n g t h e p H o f t h e b o d y , a l t h o u g h t h i s c o n t r i b u t i o n is o f t e n n e g l e c t e d d u e t o t h e i r s m a l l c o n c e n t r a t i o n s in t h e b l o o d p l a s m a [ 5 0 ] . HEPES ( N - 2 - H y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - N ' - 2 - e t h a n e s u l f o n i c A c i d ) is o n e o f G o o d ' s b i o l o g i c a l b u f f e r s t h a t o f f e r s a g r e a t e r b u f f e r i n g c a p a c i t y t h a n t h e b i c a r b o n a t e b u f f e r s [ 5 3 ] a n d t h u s c o u l d b e a s u i t a b l e c a n d i d a t e t o b e c o u p l e d w i t h t h e b i c a r b o n a t e b u f f e r s t h a t a r e p r e s e n t in D M E M . HEPES is w a t e r - s o l u b l e a n d a t m o s p h e r e - i n d e p e n d e n t . It has s h o w n t o h a v e n e g l i g i b l e a f f i n i t y t o m e t a l l i c i o n s f o u n d in t h e b l o o d p l a s m a [ 5 4 ] . P r e v i o u s s t u d i e s h a v e p r o v i d e d a basic u n d e r s t a n d i n g o f i h e i n f l u e r i L e o f HEPES o n t h e d e g r a d a t i o n o f m a g n e s i u m in 1 0

s o d i u m c i i l o r i d e s o l u t i o n s [ 5 5 , 5 6 ] , b u t t h i s u n d e r s t a n d i n g m a y n o t n e c e s s a r i l y b e a p p l i c a b l e t o t h e D M E M s o l u t i o n , b e c a u s e o f t h e d i f f e r e n c e s in t h e s u r f a c e l a y e r f o r m e d as a r e s u l t o f t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n m a g n e s i u m a n d t h e t e s t s o l u t i o n . A b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e i n f l u e n c e o f HEPES b u f f e r i n g o n t h e d e g r a d a t i o n b e h a v i o r o f m a g n e s i u m in t h e D M E M cell c u l t u r e m e d i u m is o f f u n d a m e n t a l i m p o r t a n c e f o r u n d e r s t a n d i n g t h e c o r r e l a t i o n s b e t w e e n t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s o b t a i n e d f r o m in vitro a n d in vivo t e s t s , b e c a u s e b o d y f l u i d s t h e m s e l v e s a r e a b u f f e r e d e n v i r o n m e n t . T h e p r e s e n t r e s e a r c h a i m e d a t e l u c i d a t i n g t h e c o r r o s i o n m e c h a n i s m s o f p u r e m a g n e s i u m in t h e D M E M s o l u t i o n s w i t h a n d w i t h o u t t h e HEPES b u f f e r . D e g r a d a t i o n t e s t s in a p s e u d o - p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n ( E l e c t r o l y t e = D M E M ; T = 3 7 °C; p H = 7 . 4 5 ) f o r 15 s a n d f o r u p t o 3 6 0 0 s w e r e p e r f o r m e d . T h e m o r p h o l o g i e s a n d c o m p o s i t i o n s o f s u r f a c e l a y e r s f o r m e d w e r e c h a r a c t e r i z e d a n d t h e i r c o r r e l a t i o n s w i t h t h e d e g r a d a t i o n r a t e w e r e d e t e r m i n e d . P o t e n t i o d y n a m i c P o l a r i z a t i o n (PDP) a n d O p e n C i r c u i t P o t e n t i a l (OCP) t e s t s w e r e c a r r i e d o u t t o e v a l u a t e t h e i n f l u e n c e o f t h e HEPES b u f f e r in D M E M o n t h e e l e c t r o c h e m i c a l b e h a v i o r a n d c o r r o s i o n t e n d e n c y o f m a g n e s i u m .

2.2. Materials and m e t h o d s

2 . 2 . 1 . M a t e r i a l

M a g n e s i u m p o w d e r ( o f 9 9 . 9 8 % p u r i t y ) w i t h a m e d i u m p a r t i c l e size o f 9 0 p m w a s u n i - a x i a l l y p r e s s e d in a c y l i n d r i c a l d i e a t 3 5 0 °C a n d u n d e r a p r e s s u r e o f 5 0 0 M P a t o y i e l d f u l l y c o n s o l i d a t e d s p e c i m e n s f o r t h e r e s e a r c h , i n s t e a d o f c a s t m a g n e s i u m s p e c i m e n s w i t h i n e v i t a b l e p o r o s i t y t h a t w o u l d a f f e c t c o r r o s i o n b e h a v i o r . C o m p a c t e d m a g n e s i u m p e l l e t s w i t h a d i a m e t e r o f 13 m m w e r e c u t i n t o slices w i t h a t h i c k n e s s o f 8 m m . A c o p p e r w i r e w i t h a w a t e r p r o o f i s o l a t i o n l a y e r w a s a t t a c h e d t o t h e s l i c e s . T h e c o n d u c t i v e s p e c i m e n s w e r e t h e n m o u n t e d in a n e p o x y r e s i n w i t h o n l y t h e t o p s u r f a c e b e i n g e x p o s e d t o t h e i m m e r s i o n m e d i a f o r d e g r a d a t i o n t e s t s . T h e m o u n t e d s p e c i m e n s w e r e t h e n g r o u n d u s i n g SIC g r i n d i n g p a p e r t o 2 4 0 0 g r i t a n d u l t r a s o n i c a l l y c l e a n e d in a c e t o n e f o r 3 m i n .

2.2.2. D e g r a d a t i o n tests

A c o r r o s i o n cell o p e r a t i n g a t 3 7 °C w a s u s e d t o c a r r y o u t all t h e d e g r a d a t i o n t e s t s . T h e t e m p e r a t u r e o f t h e c e l l w a s m a i n t a i n e d u s i n g a t h e r m o s t a t i c w a t e r b a t h . D M E M

11

( D 1 1 4 5 , S i g m a - A l d r i c h ) w a s u s e d as t h e base i m m e r s i o n m e d i u m . HEPES ( 3 9 1 3 3 8 , C a l b i o c h e m ) w a s a d d e d t o DIVIEM t o r e a c h a c o n c e n t r a t i o n o f 2 5 mlVl ( r e f e r r e d t o as t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n h e r e a f t e r ) t o d e t e r m i n e t h e i n f l u e n c e o f t h e b u f f e r i n g a g e n t o n t h e d e g r a d a t i o n b e h a v i o r o f m a g n e s i u m . T h e r a t i o o f s o l u t i o n v o l u m e t o s p e c i m e n s u r f a c e a r e a (SV/SA) w a s 3 7 8 m l / c m ^ b e i n g m u c h l a r g e r t h a n t h e c r i t i c a l v a l u e o f 6 7 m l / c m ^ [ 5 7 ] in o r d e r t o p r e v e n t i o n s in t h e s o l u t i o n f r o m a c c u m u l a t i o n a n d t h e b u l k s o l u t i o n f r o m a l k a l i z a t i o n . Local p H c h a n g e s d u r i n g t h e i m m e r s i o n t e s t s w e r e r e g i s t e r e d b y u s i n g a m i c r o p H m e t e r (S220 S e v e n C o m p a c t , M e t t l e r T o l e d o ) p l a c e d a p p r o x i m a t e l y 1 m m a b o v e t h e s p e c i m e n s u r f a c e . A n o t h e r p H m e t e r w a s p l a c e d o v e r a l a t e r a l d i s t a n c e o f 9 0 m m a w a y f r o m t h e s p e c i m e n s u r f a c e t o m e a s u r e t h e b u l k p H , c o n s i d e r i n g t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e b u l k p H m i g h t n o t b e r e p r e s e n t a t i v e o f t h e p H a t t h e s p e c i m e n s u r f a c e a n d m i g h t v a r y b y s e v e r a l p H u n i t s [ 1 9 , 5 8 ] . D a t a l o g g i n g w a s c a r r i e d o u t e v e r y 6 0 s.

2.2.3. Surface analysis

M a g n e s i u m s p e c i m e n s w e r e i m m e r s e d in t h e D M E M s o l u t i o n a n d in t h e HEPES-b u f f e r e d s o l u t i o n f o r 1 5 , 3 0 0 a n d 3 6 0 0 s t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f t h e HEPES-b u f f e r o n t h e m o r p h o l o g y a n d c o m p o s i t i o n o f s u r f a c e l a y e r f o r m e d . A t t h e s e t i m e p o i n t s , s p e c i m e n s w e r e r e m o v e d f r o m t h e s o l u t i o n s , r i n s e d in e t h a n o l f o r 3 0 s a n d t h e n a i r d r i e d . T h e m o r p h o l o g i e s a n d c h e m i c a l c o m p o s i t i o n s o f s u r f a c e l a y e r s f o r m e d w e r e c h a r a c t e r i z e d u s i n g a J E O L J S M - 6 5 0 0 F S c a n n i n g E l e c t r o n M i c r o s c o p e (SEM) w o r k i n g a t a n a c c e l e r a t i n g v o l t a g e o f 15 kV a n d e q u i p p e d w i t h a n E n e r g y D i s p e r s i v e S p e c t r o m e t e r (EDS).

2.2.4. E l e c t r o c h e m i c a l tests

T h e t h r e e e l e c t r o d e c o n f i g u r a t i o n w a s a d o p t e d t o p e r f o r m t h e p o l a r i z a t i o n t e s t s . A S a t u r a t e d C a l o m e l E l e c t r o d e (SCE) w a s u s e d as t h e r e f e r e n c e e l e c t r o d e a n d a p l a t i n u m m e s h as t h e c u r r e n t e l e c t r o d e . T h e e l e c t r o c h e m i c a l a c t i v i t y o f m a g n e s i u m s p e c i m e n s in t h e D M E M s o l u t i o n s w i t h a n d w i t h o u t HEPES a t 3 7 °C w e r e d e t e r m i n e d by m e a s u r i n g t h e O p e n C i r c u i t P o t e n t i a l (OCP) d u r i n g i m m e r s i o n u s i n g a S o l a r t r o n 1 2 5 0 / 1 2 5 5 p o t e n t i o s t a t . P o t e n t i o d y n a m i c P o l a r i z a t i o n (PDP) t e s t s w e r e p e r f o r m e d i m m e d i a t e l y a f t e r t h e OCP t e s t s a t a n i n i t i a l p o t e n t i a l o f - 0 . 2 V vs OCP i n c r e a s i n g t o + 0 . 5 V vs OCP a t a s c a n r a t e o f 0.2 m V / s . 1 2

2.3.

Results and discussion

2 . 3 . 1 . Effect o f HEPES o n t h e M g ( 0 H ) 2 layer f o r m e d

Fig. 1 s h o w s t h e m o r p h o l o g i e s o f s p e c i m e n s u r f a c e s a f t e r i m m e r s i o n i n t h e HEPES-b u f f e r e d s o l u t i o n f o r 1 5 , 3 0 0 a n d 3 6 0 0 s. A f t e r i m m e r s i o n f o r 15 s, t h e o r i g i n a l g r i n d i n g m a r k s w e r e s t i l l v i s i b l e , i n d i c a t i n g t h a t t h e i n i t i a l s u r f a c e l a y e r w a s y e t v e r y t h i n a t t h i s s t a g e (Fig. l a ) . In t h e s u r f a c e l a y e r , t h e o r i g i n a l p o w d e r p a r t i c l e b o u n d a r i e s a n d g r a i n b o u n d a r i e s , i n d i c a t e d b y w h i t e a r r o w s in Fig. l a ( b a c k s c a t t e r e d i m a g e ) , w e r e o u t l i n e d . O b s e r v a t i o n o f t h e s q u a r e b o x in Fig. l a a t a h i g h e r m a g n i f i c a t i o n r e v e a l e d t h a t a n a n o s t r u c t u r e d l a y e r w i t h g r a i n sizes b e t w e e n 1 0 - 1 0 0 n m w a s f o r m e d o n t h e s u r f a c e a n d t h e s u r f a c e l a y e r c o n t a i n e d n a n o - s i z e d c r a c k s w i t h l e n g t h s o f less t h a n 1 0 0 n m . EDS p o i n t scans s h o w e d t h e p r e s e n c e o f t h e e l e m e n t s o f m a g n e s i u m a n d o x y g e n o n t h e s u r f a c e , s u g g e s t i n g t h a t t h e n a n o -s t r u c t u r e d l a y e r w a -s m a i n l y c o m p o -s e d o f M g O / M g ( O H ) 2 . A f t e r i m m e r s i o n f o r 3 0 0 s, t h e t h i c k n e s s o f t h e s u r f a c e l a y e r s l i g h t l y i n c r e a s e d a n d l a r g e r c r a c k s ( w i t h a m a x i m u m l e n g t h o f 1 p m ) a p p e a r e d m o s t l y a t t h e g r a i n b o u n d a r i e s (Fig. l b ) . O b v i o u s l y , s u c h a c r a c k e d s u r f a c e l a y e r c o u l d n o t e f f e c t i v e l y p r o t e c t t h e s u r f a c e f r o m f u r t h e r c o r r o s i o n , b e c a u s e in e f f e c t it p r o v i d e d p a t h w a y s f o r t h e i m m e r s i o n s o l u t i o n t o s t a y in d i r e c t c o n t a c t w i t h t h e m a g n e s i u m s u r f a c e a n d t h u s a c c e l e r a t e d t h e d e g r a d a t i o n [ 5 9 ] . As a r e s u l t , t h e d i s s o l u t i o n o f m a g n e s i u m c o n t i n u e d , i n s p i t e o f t h e f o r m a t i o n o f t h e s u r f a c e l a y e r . D u r i n g f u r t h e r i m m e r s i o n t e s t s t i l l t h e f i n a l t i m e p o i n t ( 3 6 0 0 s ) , t h e s e c r a c k s s i g n i f i c a n t l y g r e w a l m o s t 5 0 0 t i m e s ( u p t o a m a x i m u m l e n g t h o f 5 0 p m ) f r o m t h e i r i n i t i a l sizes. T h e s e g r o w n s u r f a c e c r a c k s w e r e m o s t l y d e v e l o p e d a l o n g t h e o r i g i n a l p o w d e r p a r t i c l e b o u n d a r i e s a n d g r a i n b o u n d a r i e s w h e r e a n i n t e r c o n n e c t e d n e t w o r k o f c r a c k s t h r o u g h o u t t h e s u r f a c e w a s f o r m e d (Fig. 2 a ) . A u n g a n d Z h o u [ 6 0 ] c o n s i d e r e d t h e f o r m a t i o n o f s u r f a c e c r a c k s as a n i n d i c a t i o n o f a h i g h e r d i s s o l u t i o n r a t e in s o m e r e g i o n s o n t h e s u r f a c e . A g r a i n b o u n d a r y c a n b e r e g a r d e d as a n a r e a o f d e f e c t s in t h e c r y s t a l s t r u c t u r e w i t h a c o n f i g u r a t i o n o f d i s l o c a t i o n s . It is w e l l k n o w n t h a t a n o d i c m e t a l d i s s o l u t i o n w o u l d b e a c c e l e r a t e d i n t h e v i c i n i t y o f d i s l o c a t i o n s [ 6 1 ] . D u r i n g t h e i m m e r s i o n t e s t s o f m a g n e s i u m m a d e f r o m p o w d e r , t h e o r i g i n a l p o w d e r p a r t i c l e b o u n d a r i e s a n d g r a i n b o u n d a r i e s b e c a m e a n o d e a n d p r e f e r e n t i a l l y c o r r o d e d , b u i l d i n g u p l o c a l g a l v a n i c c o u p l i n g w i t h t h e s u r r o u n d i n g g r a i n s . S u b s e q u e n t l y , m a g n e s i u m g r a i n s b e c a m e c a t h o d e r e l a t i v e t o t h e o r i g i n a l p o w d e r p a r t i c l e b o u n d a r i e s a n d g r a i n b o u n d a r i e s a n d g a l v a n i c a l l y p r o t e c t e d (Fig. 2 a ) . This e x p l a n a t i o n is y e t t o b e c o n f i r m e d b y u s i n g t h e e l e c t r o c h e m i c a l m i c r o c e l l t e c h n i q u e a n d s c a n n i n g v i b r a t i n g e l e c t r o d e t e c h n i q u e t o r e v e a l l o c a l g a l v a n i c c o u p l i n g b e t w e e n t h e i n t e r n a l s t r u c t u r a l b o u n d a r i e s a n d n e i g h b o r i n g g r a i n i n t e r i o r o n a m i c r o s c a l e .

13

In c o n t r a s t , a f t e r i m m e r s i o n t e s t s in DIVIEM w i t h o u t t h e b u f f e r f o r 3 6 0 0 s, t h e o r i g i n a l p o w d e r p a r t i c l e s c o u l d s t i l l b e i d e n t i f i e d u s i n g S E M b a c k s c a t t e r e d i m a g i n g . T h e s e a r e h i g h l i g h t e d in Fig. 2 b f o r c o m p a r i s o n w i t h t h e s u r f a c e m o r p h o l o g y a f t e r i m m e r s i o n in t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n a l s o f o r 3 6 0 0 s (Fig. 2 a ) . F r o m t h e c o m p a r i s o n , i t is c l e a r t h a t in D M E M w i t h o u t HEPES, i n t e r p a r t i c l e a n d i n t e r g r a n u l a r c o r r o s i o n d i d n o t t a k e p l a c e a n d t h e s u r f a c e w a s less e l e c t r o c h e m i c a l l y a c t i v e . It also s u g g e s t s t h a t t h e d e g r a d a t i o n o f m a g n e s i u m in t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n w o u l d p r o c e e d c o n s i d e r a b l y f a s t e r t h a n t h a t in D M E M . It is w e l l k n o w n t h a t t h e p H o f a s o l u t i o n s t r o n g l y i n f l u e n c e s t h e n a t u r e a n d s t a b i l i t y o f t h e p r o t e c t i v e h y d r o x i d e l a y e r [ 4 7 , 5 1 ] . T h e h y d r o x i d e l a y e r is m o r e s t a b l e in a n a l k a l i n e s o l u t i o n [ 1 6 ] . T h e h i g h e r d e g r a d a t i o n r a t e o f m a g n e s i u m in t h e HEPES-b u f f e r e d s o l u t i o n c o u l d HEPES-b e a s s o c i a t e d w i t h t h e l i m i t e d a l k a l i z a t i o n o f t h e s o l u t i o n o n a c c o u n t o f t h e b u f f e r i n g a c t i v i t y o f HEPES. D u r i n g t h e i m m e r s i o n t e s t s , t h e b u l k p H o f b o t h o f t h e e l e c t r o l y t e s ( D M E M a n d H E P E S - b u f f e r e d D M E M ) r e m a i n e d c o n s t a n t a t 7 . 4 5 , c o n f i r m i n g t h a t t h e v e r y l a r g e SV/SA r a t i o i n d e e d p r e v e n t e d t h e s o l u t i o n s f r o m b u l k a l k a l i z a t i o n , as o b s e r v e d b y Y a n g a n d Z h a n g [ 5 7 ] . O f m o r e i n t e r e s t w e r e t h e c h a n g e s o f t h e l o c a l p H . It w a s f o u n d t h a t w h i l e t h e b u l k p H r e m a i n e d s t a b l e d u r i n g t h e i m m e r s i o n t e s t s , t h e l o c a l p H c h a n g e d t o a l k a l i n e v a l u e s , as s h o w n in Fig. 3. T h e l o c a l p H o f D M E M c o n t i n u o u s l y i n c r e a s e d f r o m 7 . 4 5 t o 7 . 6 5 in 3 6 0 0 s, e x c e e d i n g t h e pH r a n g e o f 7.4 - 7 . 6 in t h e n o r m a l p h y s i o l o g i c a l e n v i r o n m e n t s , w h i l e o n l y a s h o r t p o s i t i v e s h i f t w i t h a m a x i m u m p H v a l u e o f 7 . 5 5 in t h e l o c a l p H o f t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n o c c u r r e d a n d q u i c k l y t h e l o c a l p H r e t u r n e d t o t h e i n i t i a l v a l u e o f 7 . 4 5 . It d e m o n s t r a t e d t h a t t h e l o c a l a l k a l i z a t i o n i n d e e d t o o k p l a c e d e s p i t e t h e l a r g e SV/SA r a t i o a n d t h e a l k a l i z a t i o n r e m a i n e d l o c a l t h r o u g h o u t t h e t e s t s w i t h o u t a f f e c t i n g t h e p H o f t h e w h o l e s o l u t i o n . It is lil<ely t h a t t h e l o c a l p H m e a s u r e m e n t s a r e a f f e c t e d b y t h e d i s t a n c e b e t w e e n t h e p H e l e c t r o d e p l a c e m e n t a n d t h e c o r r o d i n g s u r f a c e . In o t h e r w o r d s , t h e l o c a l p H m e a s u r e m e n t s o f t h e s o l u t i o n a t c l o s e r s p o t s , e . g . , a f e w m i c r o m e t e r s a w a y f r o m t h e s u r f a c e , m i g h t h a v e s h o w n e v e n h i g h e r v a l u e s [ 1 9 ] . T h e e x a c t c o r r e l a t i o n o f t h e l o c a l p H w i t h t h e d i s t a n c e f r o m t h e m a g n e s i u m s u r f a c e , y e t t o b e e s t a b l i s h e d b y m e a n s o f p H m i c r o s e n s o r s , is o f m a j o r s i g n i f i c a n c e , b e c a u s e it is t h e m i c r o e n v i r o n m e n t a t t h e s o l i d -l i q u i d i n t e r f a c e t h a t m a i n -l y d e t e r m i n e s t h e c o r r o s i o n b e h a v i o r o f m a g n e s i u m . F r o m Fig. 3, i t is c l e a r t h a t t h e l o c a l a l k a l i z a t i o n w a s less s e v e r e f o r m a g n e s i u m in t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n t h a n in D M E M . T h i s s u g g e s t s t h a t HEPES n e u t r a l i z e d a n e x c e s s n u m b e r o f local 0 H ' i o n s in t h e s o l u t i o n a n d p r o v i d e d a n e u t r a l e n v i r o n m e n t , w h i c h w o u l d e n h a n c e t h e d e g r a d a t i o n r a t e . O t h e r r e s e a r c h e r s p r o p o s e d t h a t a c o m p l e x m i g h t h a v e f o r m e d b e t w e e n M g ^ ' " a n d HEPES, w h i c h e f f e c t i v e l y r e m o v e d M g c a t i o n s f r o m t h e s o l u t i o n , t h e r e b y d i s t u r b i n g t h e e q u i l i b r i u m a n d l e a d i n g t o f u i L l i e r d i s s u l u L i o n [ 4 7 ] , a l t l i o u g l i s u c h a c o m p l e x p r o b a b l y w o u l d n o t f o r m a t t h e 1 4

p h y s i o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n o f M g ^ ' ^ i o n s [ 4 7 ] , T h e r e f o r e , t h e l o w e r l o c a l p H i n t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n m i g h t h a v e h a d a d o m i n a n t e f f e c t o n t h e d e g r a d a t i o n o f m a g n e s i u m . In t h e p r e s e n t i m m e r s i o n e x p e r i m e n t s , a d d i n g HEPES t o D M E M i n c r e a s e d t h e d e g r a d a t i o n r a t e o f m a g n e s i u m t h r o u g h i n t e n s e d i s s o l u t i o n a t t h e o r i g i n a l p o w e r p a r t i c l e b o u n d a r i e s a n d g r a i n b o u n d a r i e s , c a u s i n g t h e f o r m a t i o n o f i n i t i a l l y n a n o - s i z e d a n d t h e n m i c r o - s i z e d c r a c k s in t h e s u r f a c e l a y e r , as t h e d e g r a d a t i o n p r o c e e d e d f u r t h e r . T h e h i e r a r c h y o f t h e c r a c k s b u i l t u p a n o p e n s t r u c t u r e o f t h e s u r f a c e l a y e r , w h i c h a l l o w e d t h e i m m e r s i o n s o l u t i o n t o s t a y in d i r e c t c o n t a c t w i t h t h e m a g n e s i u m s u r f a c e , t h e r e b y p r o m o t i n g f u r t h e r d e g r a d a t i o n . As a r e s u l t , t h e m a g n e s i u m s u r f a c e b e c a m e less p r o t e c t e d a n d e x h i b i t e d a s t r o n g e r t e n d e n c y o f c o r r o s i o n in t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n . Fig. 1 S u r f a c e m o r p h o l o g i e s o f m a g n e s i u m s p e c i m e n s a f t e r i m m e r s i o n in t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n f o r (a) 1 5 , ( b ) 3 0 0 a n d (c) 3 6 0 0 s. Black a r r o w s in Fig. l a s h o w t h e p r e s e n c e o f n a n o - s i z e d cracl<s in t h e i n i t i a l s u r f a c e l a y e r , w h i l e w h i t e a r r o w s i n d i c a t e t h e f o r m a t i o n (Fig. l a ) a n d g r o w t h o f c r a c k s (Fig. l b a n d c) in t h e s u r f a c e l a y e r a l o n g t h e o r i g i n a l p o w d e r p a r t i c l e b o u n d a r i e s a n d g r a i n b o u n d a r i e s .

Fig. 2 S u r f a c e m o r p h o l o g i e s o f s p e c i m e n s a f t e r i m m e r s i o n in (a) t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n a n d (b) t h e D M E M s o l u t i o n f o r 3 6 0 0 s. Black a n d w h i t e a r r o w s i n Fig. 2a s h o w a n i n t e r c o n n e c t e d n e t w o r k o f c r a c k s a l o n g t h e g r a i n b o u n d a r i e s a n d o r i g i n a l p o w d e r p a r t i c l e b o u n d a r i e s , r e s p e c t i v e l y .

•DMEM with HEPES — DMEM

/ ^ . 7 } / -0 5-0-0 1-0-0-0 15-0-0 2-0-0-0 25-0-0 3-0-0-0 Time (Sec) 3500 4000 Fig. 3 Local p H v a r i a t i o n s w i t h t i m e d u r i n g i m m e r s i o n t e s t s in t h e D M E M s o l u t i o n a n d i n t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n .

2.3.2. Effect o f HEPES o n t h e p r e c i p i t a t i o n o f calcium p h o s p h a t e s

A f t e r i m m e r s i o n in D M E M f o r 3 6 0 0 s, c o l o n i e s o f a g g l o m e r a t e d s p h e r i c a l p r e c i p i t a t e s w e r e o b s e r v e d o n s p e c i m e n s u r f a c e s (Fig. 2 b ) . EDS line s c a n a n a l y s i s

r e v e a l e d t h a t t h e s p h e r i c a l p r e c i p i t a t e s c o n t a i n e d t h e e l e m e n t s o f c a l c i u m a n d p h o s p h o r u s (Fig. 4 ) . P h y s i o l o g i c a l s o l u t i o n s a r e k n o w n f o r i n d u c i n g t h e f o r m a t i o n o f c a l c i u m p h o s p h a t e p r e c i p i t a t e s o n t h e m a g n e s i u m s u r f a c e o w i n g t o s u p e r -s a t u r a t i o n [ 6 2 ] . T h e -s e p r e c i p i t a t e -s a r e t h o u g h t t o b e m a i n l y a m o r p h o u -s c a l c i u m p h o s p h a t e p h a s e s a g g l o m e r a t e d t o f o r m s p h e r i c a l p a r t i c l e s [ 6 3 ] . T h e c a l c u l a t e d C a / P r a t i o o f s p h e r i c a l p r e c i p i t a t e s w a s a r o u n d o n e , m e a n i n g t h a t t h e s e p r e c i p i t a t e s w e r e d e f i c i e n t in c a l c i u m . T h e c o n t r i b u t i o n o f m a g n e s i u m c a t i o n s in t h e D M E M s o l u t i o n t o s p h e r i c a l a g g l o m e r a t e s m i g h t b e t h e c a u s e f o r t h e c a l c i u m d e f i c i e n c y , as m a g n e s i u m c a t i o n s c o u l d r e a c t w i t h c a l c i u m a n d p h o s p h a t e i o n s in t h e s o l u t i o n t o f o r m i n s o l u b l e p r e c i p i t a t e s [ 5 7 ] . T h e s e p r e c i p i t a t e s h a v e s h o w n t o i m p r o v e t h e b i o c o m p a t i b i l i t y a n d o s t e o c o n d u c t i v i t y o f m a g n e s i u m - b a s e d i m p l a n t s , in c o m p a r i s o n w i t h h y d r o x y a p a t i t e [ 6 4 ] . By c o n t r a s t , t h e s u r f a c e s o f s p e c i m e n s a f t e r i m m e r s i o n in t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n f o r 3 6 0 0 s s h o w e d n o v i s i b l e c a l c i u m p h o s p h a t e p r e c i p i t a t e s (Fig. 2 a ) . It is g e n e r a l l y a c k n o w l e d g e d t h a t t h e a l k a l i z a t i o n o f t h e s o l u t i o n as a r e s u l t o f a n i n c r e a s e in O H " c o n c e n t r a t i o n t h r o u g h r e d u c t i o n r e a c t i o n s a t t h e s p e c i m e n s u r f a c e e n c o u r a g e s t h e p r e c i p i t a t i o n o f c a l c i u m p h o s p h a t e p h a s e s [ 5 7 , 6 5 ] . T h e r e f o r e , t h e l o w e r l o c a l p H a l m o s t w i t h o u t s o l u t i o n a l k a l i z a t i o n , c a u s e d b y t h e HEPES b u f f e r , m u s t h a v e p r e v e n t e d t h e c a l c i u m p h o s p h a t e p r e c i p i t a t i o n f r o m t a k i n g p l a c e . T h e Tris b u f f e r , o f t e n u s e d t o r e g u l a t e t h e p H o f t h e s i m u l a t e d b o d y f l u i d (SBF), is n o t o r i o u s f o r l i m i t i n g t h e p r e c i p i t a t i o n o f c a l c i u m p h o s p h a t e s [ 6 6 ] . It is b e l i e v e d t h a t t h e Tris b u f f e r l o w e r s t h e l o c a l p H a n d a l s o f o r m s s o l u b l e c o m p l e x e s w i t h c a l c i u m i o n s , w h i c h f u r t h e r r e d u c e s t h e c o n c e n t r a t i o n o f f r e e Ca^"^ r e q u i r e d t o f o r m c a l c i u m p h o s p h a t e p r e c i p i t a t e s [ 5 6 ] . In t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n u s e d in t h e p r e s e n t s t u d y , h o w e v e r , s u c h c o m p l e x e s w i t h c a l c i u m i o n s w o u l d u n l i k e l y f o r m [ 6 7 ] . T h u s , t h e t e n d e n c y o f t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n t o p r e c i p i t a t e c a l c i u m p h o s p h a t e s w a s r e d u c e d , as t h e local p H o f t h e s o l u t i o n w a s m a i n t a i n e d a t a l o w e r l e v e l b y t h e b u f f e r [ 6 8 ] . 1 7

Fig. 4 EDS l i n e s c a n o n m a g n e s i u m s p e c i m e n s u r f a c e a f t e r i m m e r s i o n in DIVIEM f o r 3 6 0 0 s. W h i t e s p h e r i c a l p a r t i c l e s ( l e f t i m a g e ) w e r e c a l c i u m p h o s p h a t e a g g l o m e r a t e s p r e c i p i t a t e d d i r e c t l y f r o m t h e s o l u t i o n .

2.3.3. Corrosion b e h a v i o r o f m a g n e s i u m d u r i n g PDP and OCP tests

T h e c o r r o s i o n t e n d e n c i e s o f m a g n e s i u m in t h e D M E M w i t h a n d w i t h o u t t h e HEPES b u f f e r w a s d e t e r m i n e d b y p e r f o r m i n g OCP t e s t s f o r 3 6 0 0 s (Fig. 5 a ) . T h e OCP v a l u e o f m a g n e s i u m in D M E M w a s c o n s i d e r a b l y e l e v a t e d t o m o r e p o s i t i v e v a l u e s , s h o r t l y a f t e r i m m e r s i o n ( f r o m - 1 . 7 6 V t o - 1 . 6 2 V a f t e r 5 0 0 s) a n d i n c r e a s e d w i t h t i m e ( - 1 . 5 4 V a f t e r 3 6 0 0 s ) , i n d i c a t i n g t h e i m m e d i a t e f o r m a t i o n a n d m a t u r a t i o n o f t h e p r o t e c t i v e l a y e r . S u c h a s t r o n g s h i f t t o p o s i t i v e v a l u e s w a s h o w e v e r n o t o b s e r v e d f o r m a g n e s i u m in t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n ; OCP i n c r e a s e d s m o o t h l y a n d g r a d u a l l y f r o m - 1 . 8 6 V t o - 1 . 8 3 V a f t e r 3 6 0 0 s. A f t e r 5 0 0 s, t h e OCP v a l u e o f m a g n e s i u m in t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n w a s 2 0 0 m V s m a l l e r t h a n t h a t in t h e D M E M s o l u t i o n a n d a f t e r 3 6 0 0 s t h e d i f f e r e n c e b e c a m e e v e n l a r g e r ( 3 0 0 m V ) . It s u g g e s t e d t h a t m a g n e s i u m s u r f a c e w a s b e t t e r p r o t e c t e d by a h y d r o x i d e l a y e r in D M E M a t t h e e a r l y s t a g e o f i m m e r s i o n a n d t h e i n i t i a l l y f o r m e d l a y e r w a s m o r e r a p i d l y m a t u r e d , as c o m p a r e d t o t h a t in t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n [ 5 5 ] . T h i s is in l i n e w i t h t h e o b s e r v a t i o n s o f t h e s u r f a c e l a y e r o f m a g n e s i u m in t h e p r e s e n c e o f HEPES (Figs. 1 a n d 2 ) , w h e r e c r a c k s a p p e a r e d s u c h t h a t t h e s u r f a c e w a s c o n t i n u o u s l y e x p o s e d t o t h e i m m e r s i o n s o l u t i o n . T h e m u l t i p l e f l u c t u a t i o n s o f t h e OCP c u r v e o f m a g n e s i u m in D M E M (Fig. 5a) c o u l d b e a n i n d i c a t i o n o f m e t a s t a b l e s u r f a c e b r e a k d o w n . A p r e v i o u s s t u d y c o n d u c t e d by Xin a n d C h u [ 6 9 ] o n t h e e f f e c t o f t h e TRIS b u f f e r o n m a g n e s i u m c o r r o s i o n s h o w e d a s i m i l a r i n d i c a t i o n f o r p i t t i n g a t t h e e a r l y s t a g e s o f i m m e r s i o n . H o w e v e r , s u c h a n i n d i c a t i o n w a s a b s e n t in t h e OCP c u r v e o f m a g n e s i u m in t h e H E P E S - b u f f e r e d s o l u t i o n , as s h o w n in Fig. 5 a . 1 8