P
Po olliim mo orrffiizzm m IIllee6 65 55 5V Va all g
geen nu u eerrbbB B--2 2 u u k ko ob biieett zz rra ak kiieem m jja ajjn niik ka a
w
w o ok krreessiiee m meen no op pa au uzza alln nyym m
T
Thhee IIllee6 65 55 5V Vaall ppoollyym moorrpphhiissm m ooff eerrbbB B--2 2 ggeennee iinn m meennooppaauussaall w woom meenn w
wiitthh oovvaarriiaann ccaanncceerr
H
Haannnnaa RRoommaannoowwiicczz--MMaakkoowwsskkaa11,, BBeeaattaa SSmmoollaarrzz11,, TToommaasszz PPeerrttyyññsskkii22
Podwy¿szony poziom ekspresji genu erbB-2 obserwuje siê w 10 do 50% przypadków ra- ka jajnika. Wysoki poziom erbB-2 jest zwi¹zany ze z³ym rokowaniem dla pacjentki i krótkim okresem wolnym od nawrotu tej choroby. Znaczenie dla wystêpowania i progresji nowotwo- rów mo¿e mieæ nie tylko poziom ekspresji genu erbB-2, ale tak¿e zmiany w aktywnoœci re- ceptora erbB-2. Wgenie erbB-2 w pozycji 1980 zidentyfikowano polimorfizm G/A, którego konsekwencj¹ jest podstawienie Ile/Val w kodonie 655 w obrêbie domeny transb³onowej, co mo¿e mieæ wp³yw na aktywnoœæ receptora.
Materia³y i metody: Wpracy przedstawiono rozk³ad genotypów oraz czêstoœæ alleli po- limorfizmu Ile655Val genu erbB-2 u chorych na raka jajnika. Materia³ do badañ stanowi³y próbki nowotworów od pacjentek w wieku menopauzalnym, utrwalone w parafinie. Polimor- fizm Ile655Val genu erbB-2 by³ okreœlany przez reakcjê ³añcuchow¹ polimerazy (PCR) z za- stosowaniem starterów allelospecyficznych.
Wyniki: Nie wykazano statystycznie istotnych ró¿nic (p >0,05) w rozk³adzie genotypów i czêstoœci alleli polimorfizmu Ile655Val genu erbB-2 miêdzy grup¹ pacjentek i grup¹ kon- troln¹. Ponadto nie stwierdzono statystycznie istotnych ró¿nic (p >0,05) w rozk³adzie geno- typów i czêstoœci alleli polimorfizmu Ile655Val miêdzy grupami pacjentek z nowotworami o ró¿nym stopniu zaawansowania wg FIGO.
Wnioski: Otrzymane wyniki sugeruj¹, ¿e polimorfizm Ile655Val w genie erbB-2 mo¿e nie byæ zwi¹zany z wystêpowaniem oraz progresj¹ nowotworów jajnika, jednak dla weryfikacji konieczne jest rozszerzenie grupy badanej.
S³owa kluczowe: gen erbB-2, polimorfizm genowy, rak jajnika, menopauza
(Przegl¹d Menopauzalny 2003, 1:28–31)
Amplifikacjê oraz wzmo¿on¹ ekspresjê genu erbB-2 stwierdza siê w wielu typach nowotworów. U pacjen- tek z nowotworami sutka i jajnika podwy¿szony po-
ziom erbB-2 zwi¹zany jest z krótkim okresem prze¿y- cia pacjentek oraz krótkim okresem bez nawrotu choro- by [1, 3, 9]. Wykazano tak¿e korelacjê miêdzy podwy¿-
1
1 PPrraaccoowwnniiaa BBiioollooggiiii MMoolleekkuullaarrnneejj,, ZZaakk³³aadd PPaattoommoorrffoollooggiiii KKlliinniicczznneejj,, IInnssttyyttuutt CCeennttrruumm ZZddrroowwiiaa MMaattkkii P
Poollkkii ww ££ooddzzii,, kkiieerroowwnniikk:: pprrooff.. ddrr hhaabb.. nn.. mmeedd.. AAnnddrrzzeejj KKuulliigg
2
2 KKlliinniikkaa GGiinneekkoollooggiiii ii CChhoorróóbb MMeennooppaauuzzyy,, IInnssttyyttuutt CCeennttrruumm ZZddrroowwiiaa MMaattkkii PPoollkkii ww ££ooddzzii,,
szonym poziomem bia³ka erbB-2 i stopniem z³oœliwo- œci nowotworu, z uwzglêdnieniem jego zdolnoœci do przerzutowania [10, 11].
Bia³ko erbB-2 o masie cz¹steczkowej 185 kDa zali- czane jest do rodziny receptorów b³onowych o aktywno- œci kinazy tyrozynowej klasy I, do której zaklasyfikowa- ne s¹ tak¿e 3 inne receptory: EGFR (ang. epidermal growth factor receptor; HER1/erbB-1), erbB-3 (HER3) oraz erbB-4 (HER4) [4, 5]. Bia³ko erbB-2 w swojej strukturze zawiera domenê zewn¹trzkomórkow¹, wi¹¿¹- c¹ ligand, domenê transb³onow¹ oraz domenê cytopla- zmatyczn¹ o aktywnoœci kinazy tyrozynowej zaanga¿o- wan¹ w transdukcjê sygna³u [13].
Receptor erbB-2 nie jest bezpoœrednio aktywowany przez czynniki wzrostu, takie jak EGF (ang. epidermal growth factor), ale do jego stymulacji dochodzi po przy³¹czeniu siê tych czynników do innych receptorów nale¿¹cych do rodziny receptorów erbB. Sugeruje to, ¿e receptor erbB-2 pe³ni funkcjê koreceptora bêd¹c zaan- ga¿owanym w interakcje receptor-receptor [15].
Zwiêkszona zdolnoœæ nowotworu do inwazyjnoœci i przerzutowania zwi¹zana z podwy¿szonym poziomem bia³ka erbB-2 mo¿e wynikaæ ze wzmo¿onej ruchliwoœci komórki aktywowanej przez ten receptor. Wykazano, ¿e w komórce prawid³owej bia³ko erbB-2 zlokalizowane jest w wypustkach cytoplazmatycznych, takich jak mi- krokosmki, lamelipodia i pseudopodia, które s¹ niezbêd- ne dla procesów migracji komórki [7]. Podobn¹ lokaliza- cjê bia³ka erbB-2 zaobserwowano w mikrokosmkach i wypustkach cytoplazmatycznych komórek nowotworo- wych sutka. W komórkach tych po ekspozycji na czynni- ki chemotaktyczne obserwowano zmiany morfologiczne wypustek i mikrokosmków, którym towarzyszy³a agre- gacja bia³ka erbB-2 [8]. Potwierdzeniem udzia³u recepto- ra erbB-2 w ruchliwoœci komórek by³o zidentyfikowanie czynnika ruchliwoœci (ang. motility factor), który po zwi¹zaniu siê z receptorem erbB-2 powodowa³ pofa³do- wanie b³ony cytoplazmatycznej oraz stymulacjê do che- motaksji [6].
Ze wzglêdu na tak du¿e znacznie bia³ka erbB-2 w progresji nowotworów, istotnym wydaje siê badanie znaczenia zmiennoœci genetycznej genu erbB-2 zarów- no dla poziomu ekspresji, jak i dla funkcjonalnoœci re- ceptora erbB-2 oraz okreœlenie ich konsekwencji dla rozwoju chorób nowotworowych. W genie erbB-2 w re- gionie koduj¹cym domenê transb³onow¹ zidentyfiko- wano polimorfizm G/A, którego konsekwencj¹ jest podstawienie Ile/Val w kodonie 655 [12]. W pracy przedstawiono rozk³ad genotypów oraz czêstoœci alleli polimorfizmu Ile655Val genu erbB-2 u pacjentek z no- wotworem jajnika.
M
Ma atteerriia a³³ ii m meetto od dyy
Pacjenci. Materia³ do badañ stanowi³y próbki pobra- ne z nowotworów jajnika pochodz¹cych od 50 pacjen- tek w wieku menopauzalnym. Próbki nowotworów by-
³y utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie. Sto- pieñ zaawansowania nowotworów by³ oceniany wg kla- syfikacji FIGO (ang. International Federation of Gynaecology and Obstetrics). Grupê kontroln¹ stanowi-
³y próbki krwi pobrane od 50 dobranych wiekowo ko- biet, u których nie stwierdzono choroby nowotworowej.
Izolowanie DNA. DNA z krwi oraz materia³u no- wotworowego izolowano z u¿yciem komercyjnie do- stêpnego zestawu QI Amp Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy) zgodnie z zaleceniami producenta.
Okreœlanie polimorfizmu Ile655Val. Polimorfizm Ile655Val genu erbB-2 by³ okreœlany poprzez reakcjê PCR ze starterami allelospecyficznymi (ASA): starter G 5’-GCA GGA GAG CAG AGA GCC-3’ specyficzny dla allela G starter A 5’-GCA GGA GAG CAG AGA GCC-3 specyficzny dla allela A ka¿dy w oddzielnej re- akcji PCR, razem ze starterem D: 5’-AGG ATT CCA ACG ACC ACC A-3’. Dla zweryfikowania amplifikacji DNA przy braku odpowiedniego allelu w genomowym DNA przeprowadzano amplifikacjê startera D ze starte- rem komplementarnym do sekwencji le¿¹cej powy¿ej miejsca polimorficznego starter U 5’-CTT CAG CA- AACG TAC CAT GC-3’. Amplifikacjê przeprowadzano w 25 µl mieszaniny reakcyjnej o nastêpuj¹cym sk³adzie:
50 ng genomowego DNA, 10 pmol ka¿dego z starterów, 200 mmoli ka¿dego dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 20 mM Tri- s-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 U polimerazy Taq.
W nastêpuj¹cych warunkach ter- micznych: 1 minuta 950C, a na- stêpnie 30 cykli: 30 sekund 950C, 30 sekund 590C, 30 sekund 720C, nastêpnie 7 minut 720C. Po amplifikacji 5µl mieszaniny re- akcyjnej rozdzielano w 8% ¿elu poliakryloamidowym i wizuali- zowano siê przy u¿yciu bromku etydyny (0,5 mg/ml) w œwietle ultrafioletowym (ryc. 1.).
Analiza statystyczna. Reje- strowana liczba ka¿dego z ge- notypów by³a porównywana z liczb¹ oczekiwan¹ na podsta- wie prawa Hardy’ego-Wein- berga z u¿yciem testu χ2. Istot- noœæ ró¿nic pomiêdzy czêsto-
Tab. I. Polimorfizm Ile655Val genu erbB-2. Rozk³ad genotypów oraz czêstoœæ alleli w grupie pacjentek z rakiem jajnika oraz grupie kontrolnej
Pacjentki z rakiem jajnika (n = 50) Grupa kontrolna (n = 50)
Genotyp Liczebnoœæ Czêstoœæ Liczebnoœæ Czêstoœæ
Ile/Ile 33 0,66 36 0,72
Ile/Val 12 0,24 11 0,22
Val/Val 5 0,10 3 0,06
χχ2 4,521* 2,429*
Ile 78 0,78 83 0,83
Val 22 0,22 17 0,17
p>0,05, rozk³ad zgodny z prawem Hardy-Weinberga
Ryc. 1. Przyk³adowy elektroferrogram rozdzia³u produktów amplifikacji. Œcie¿ki 1, 4, 7 – produkty amplifikacji obszaru kontrolnego, œcie¿ki 2, 5, 8 – produkty am- plifikacji ze starterem allelospecyficznym G, œcie¿ki 3, 6, 9 – produkty amplifikacji ze starterem allelospecyficznym A, œcie¿ka W – wzorzec mas cz¹steczkowych
←
←501 pz
←
←489 pz
←
←404 pz
←
←331 pz
←
←242 pz
←
←190 pz
←
←147 pz
←
←110 pz
1 2 3 4 5 6 7 8 9 W A/A G/G G/A
œciami alleli i genotypów dla poszczególnych grup oceniana by³a testem χ2.
W Wyyn niik kii
Stwierdzono brak statystycznie istotnych ró¿nic (p
>0,05) w rozk³adzie genotypów i czêstoœci alleli poli- morfizmu Ile655Val genu erbB-2 miêdzy grup¹ pacjen- tek i grup¹ kontroln¹ (tab. I.). Ponadto wykazano brak statystycznie istotnych ró¿nic (p >0,05) w rozk³adzie genotypów i czêstoœci alleli polimorfizmu Ile655Val miêdzy grupami pacjentek z nowotworami o ró¿nym stopniu zaawansowania wg FIGO (tab. II.). Rozk³ady genotypów w obu grupach by³y zgodne z prawem Har- dy’ego-Weinberga (p >0,05).
D
Dyyssk ku ussjja a
Amplifikacjê lub podwy¿szony poziom ekspresji ge- nu erbB-2 obserwuje siê w 10 do 50% przypadków raka jajnika. Wiadomo, ¿e wysoki poziom erbB-2 jest zwi¹za- ny ze z³ym rokowaniem dla pacjentki i krótkim okresem wolnym od nawrotu tej choroby [1, 14]. Znaczenie dla wystêpowania b¹dŸ progresji nowotworów mo¿e mieæ nie tylko poziom ekspresji genu erbB-2, ale tak¿e zmiany w aktywnoœci receptora erbB-2. W genie erbB-2 w pozy- cji 1980 zidentyfikowano polimorfizm G/A, którego kon-
sekwencj¹ jest podstawienie Ile/Val w kodonie 655 w ob- rêbie domeny transb³onowej receptora [12]. Obecnie nie jest jasne, jakie konsekwencje ma podstawienie Ile/Val w kodonie 655 dla funkcjonowania receptora erbB-2.
Stwierdzono jednak, ¿e wariant Val jest zwi¹zany ze zwiêkszonym ryzykiem wystêpowania nowotworów sut- ka co sugeruje, ¿e polimorfizm ten mo¿e mieæ wp³yw na aktywnoœæ biologiczn¹ receptora erbB-2 [2, 16].
Celem naszej pracy by³o okreœlenie znaczenia poli- morfizmu Ile655Val genu erbB-2 dla wystêpowania i progresji nowotworów jajnika. Wykazanie dodatniej korelacji miêdzy wystêpowanie allelu Val i progresj¹ no- wotworów jajnika, pozwoli³oby na zastosowanie poli- morfizmu Ile655Val jako czynnika rokowniczego w tych nowotworach. Nie wykazano statystycznie istotnych ró¿nic w czêstoœciach wystêpowania alleli Ile i Val miê- dzy grup¹ badan¹ i kontroln¹ (p >0,05). Uzyskane wyni- ki wskazuj¹, ¿e polimorfizm Ile/Val mo¿e nie byæ zwi¹- zany z wystêpowaniem nowotworów jajnika. Ponadto nie stwierdzono statystycznie istotnej ró¿nicy w rozk³a- dzie genotypów i czêstoœci alleli Ile i Val miêdzy grupa- mi pacjentek z nowotworami o ró¿nym stopniu zaawan- sowania, co sugeruje brak zale¿noœci miêdzy polimorfi- zmem Ile/Val i progresj¹ nowotworów jajnika. Poniewa¿
obserwuje siê zwi¹zek pomiêdzy wariantem Val i zwiêk- szonym ryzykiem wyst¹pienia raka sutka konieczne jest rozszerzenie grupy badanych pacjentek z rakiem jajnika w celu weryfikacji otrzymanych wyników.
Tab. II. Polimorfizm Ile655Val genu erbB-2. Rozk³ad genotypów oraz czêstoœæ alleli w grupie pacjentek z rakiem jajnika w ró¿nym stopniu zaawansowania wg FIGO
Pacjentki z rakiem jajnika (n = 50)
I (n=12) II (n=25) III (n=13)
Genotyp Liczebnoœæ Czêstoœæ Liczebnoœæ Czêstoœæ Liczebnoœæ Czêstoœæ
Ile/Ile 8 0,66 17 0,68 8 0,61
Ile/Val 3 0,25 6 0,24 3 0,23
Val/Val 1 0,08 2 0,08 2 0,15
Ile 19 0,78 40 0,80 19 0,73
Val 5 0,22 10 0,20 7 0,27
Summary
Introduction: The high level of erbB-2 gene expression is observed in 10–50% cases of ovarian cancer. The high level of erbB-2 predicts poor prognosis for patients. The signifi- cance for appearance and cancer progression may have not only high level of erbB-2 expres- sion but changes in its receptor activation. The Ile655Val polymorphism in position 1980 lo- cated at 655 codon of erbB-2 gene may have functional significance in regulation of recep- tor activation.
P
Piiœœmmiieennnniiccttwwoo
1. Afify AM, Werness BA, Mark HF. HER-2/neu oncogene amplification in stage I and stage III ovarian papillary serous carcinoma. Exp Mol Pathol 1999; 66: 163-9.
2. Ameyaw MM, Tayeb M, Thornton N, et al. Ethnic variation in the HER- 2 codon 655 genetic polymorphism previously associated with breast cancer.
J Hum Genet 2002; 47: 172-5.
3. Anbazhagan R, Gelber RD, Bettelheim R, et al. Association of c-erbB-2 expression and S-phase fraction in the prognosis of node positive breast can- cer. Ann Oncol 1991; 2: 47-53.
4. Carpenter G. Receptors for epidermals growth factor and other polypepty- de mitogens. Annu Rev Biochem 1987; 56: 881-914.
5. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985; 230: 1132-9.
6. De Potter CR, Schelfhout AM. The neu-protein and breast cancer. Vir- chows Archiv 1995; 426: 107-15.
7. De Potter CR, Qutacker J, Maertens G, et al. The subcellular location of the neu protein in human normal and neoplastic cells. Int J Cancer 1989;
44: 969-74.
8. De Potter CR, Qutacker J. The p185erbB2protein is localized on cell orga- nelles involved in cell motylity. Clin Exp Metastasis 1993; 11: 462-72.
9. Gullick WJ, Berger MS, et al. Expression of the c-erbB-2 protein in normal and transformed cells. Int J Cancer 1987; 40: 246-54.
10. Kapitanoviæ S, Radoœeviæ S, Kapitanoviæ M., et al. The expression of p185HER-2/neucorrelates whit the stage of disease and survival in colorectal can- cer. Gastroenterology 1997; 112: 1103-13.
11. Kay EW, Mulcahy H, Walsh CB, et al. Cytoplasmatic c-erbB-2 protein expression correlates whit survival in Dukes’B colorectal carcinoma. Histo- pathology 1994; 25: 455-61.
12. Papewalis J, Nikitin A, Yu, Rajewsky MF. G to A polymorphism at amino acid codon 655 of the human erbB-2/HER2 gene. Nucleic Acids Res 1991; 19: 5452.
13. Schechter AL, Stern DF, Vaidyanathan L, et al. The neu oncogene: an erb-B-related gene encoding a 185 000-Mr tumor antigen. Nature 1985;
312: 513-6.
14. Seki A, Yoshinouchi M, Seki N, et al. Detection of c-erbB-2 and FGF-3 (INT-2) gene amplification in epithelial ovarian cancer. Int J Oncol 2000;
17: 103-6.
15. Tzahar E, Yarden Y. The ErbB-2/HER2 oncogenic receptor of adenocarci- nomas: from orphanhood to multiple stromal ligands. Biochim Biophys Ac- ta 1998: 1377: M25-M37.
16. Xie D, Shu XO, Deng Z, et al. Population-based, case-control study of HER2 genetic polymorphism and breast cancer risk. J Natl Cancer Inst 2000; 92: 412-7.
A
Addrreess ddoo kkoorreessppoonnddeennccjjii
dr n. med. Hanna Romanowicz-Makowska Pracownia Biologii Molekularnej Zak³adu Patomorfologii Klinicznej ICZMP ul. Rzgowska 281/289
93-338 £ódŸ
Materials and methods: In these studies the distribution of genotypes and frequency of alleles of the Ile655Val polymorphism of erbB-2 gene in samples of ovarian cancer was in- vestigated. Paraffin embedded tumour tissues were obtained from menopausal women with ovarian cancer. The genotypes of Ile655Val polymorphism were determined by PCR ampli- fication using the allele specific primers.
Results: The distribution of the genotypes of the Ile655Val polymorphism did not differ significantly (p >0.05) between patients and control. Additionally, there were no significant differences (p >0.05) in genotype distributions and allele frequencies between subgroups as- signed to histological stage (FIGO).
Conclusion: The obtained results suggest that the Ile655Val polymorphism of erbB-2 ge- ne may not be linked with appearance and development of ovarian cancer. Further studies, conducted on a larger population, are required to clarify this point.
Key words: erbB-2 gene, gene polymorphism, ovarian cancer, menopause
