Verschillende processen voor de kontinue zuivering van ß-galactosidase uit E.coli

•

•

•

•

•

·

-•

•

•

•

•

adres:

•

Nr: 2621

laboratorium voor Chemische Technologie

Verslag behorende

bij het fabrieksvoorontwerp

van

A.P.Balt & M. Roukema

onderwerp:

Vlili .... Ç3.:::GALACTOSIDASE. .... UIT .. E. •. COLI ... .

Alex Balt 015-571746 v.Hasseltln. 581 Delft Menno Roukema 015-618320 B.Toussaintpl. 243 Delft opdrachtdatum : 7-1-1985 verslagdatum : 8-3-1985

---'--'---'-='-"'-.:_---~----•

i

.

•

•

•

•

•

•

•

'

.

•

•

•

Samenva tting

Inhet bakterie Eschirichia Coli ML 308 bestaat 3% van de proteïnen uit ~-galactosidase.Dit enzym is ook wel bekend als lactase. Voor de zuivering van di t ~ -galactosidase worden vier processen bestudeerd.De kenmerkende deelstap-pen zijn: I Uitzouting van enzym en proteïn

2 Extraktie van het enzym A Gel chromatografie

B Affiniteit chromatografie.

De vier processen worden gevormd door stap I gevolgd door stap A,IB,2A en 2B. ~~~ 10 J{'2.(.l "f2.6'

«'/' " "

Voorde stappen I en 2 plaatsvinden moet eerst het

~-galactosidase uit het bakterie,waarin het gemaakt wordt,

verwijderd worden.

De E-Coli stroom van 1000 l/hr wordt geproduceerd in een fermentor van 5 m3.De verblijf tijd is 4 uur.De samen-stelling van de stroom is weergegeven in tabel I.

Tabel I: samenstelling van de fermentor stroom. Fermentor stroom

bevattende;

2.8% cellen (nat gewicht) proteïnen (ex~RNA/DNA)

RNA en DNA

vaste stof (celwanden) ~-galactosidase 1000 l/hr 28.' kg

3.9

kg 2.0 kg : 1.0 kg 0.13 kg Na de fermentatie volgt een koeling

)

De stroom van 1000 l/hr wordt met een centrifuge geconcen-treerd tot 180 l/hr.De bakteri~n in deze stroom worden door een high pressure homogenizer gemangeld.Hierdoor kunnen de intracellulaire proteïnen vrijkomen.In stap I worden nu

-2-)

1t.-V)"2 ..,

eerst de celresten en het RNA verwjjderd. Vervolgens worden ~ .. r""'·

~ .

---...::..-.-~-galactosida~e en een deel van de proteïnen door uitzouting

neergeslagen.~e neerslag wordt afgecentrifugeerd en in

66

1 opgelo st. \

7

In ~ 2 w?rden poly-ethyleen glycol (PEG) en kalium-fosfaat aan de 'stroom toegevoegd.Deze chemicali~n brengen een fasenscheid\i.ng tot stand.Di t ~ sys'teem heeft de eigen-schap dat

~ -gal

~

ctosidase

voornamelijk in de lichterePEG-fase oplost en de cel\ esten allemaal in de fosfaat-fase.Het

meren--I

•

•

,

.

'

.

I I I I

'

.

•

•

•

•

•

I

'

.

. _ - -- _._

-deel van de proteïnen akkumuleerd in de fosfaat-fase.ln een

bezinktank worden beide fasen gescheiden.Een ~-galactosidase

bevattende PEG-stroom

resultee

~~

Beide processen worden gevolgd door een ultra-filtratie.

Deze concentreert de stromen tot 10 l/hr.Bovendien vindt

nog een afscheiding plaats van lichte proteïnen.

Hierna volgt of gel chromatografie of affiniteit chroma-tografie.De eerste wordt gekenmerkt door scheiding op mole-kuulgrootteDe tweede door een scheiding op biochemische

eigenschappen.

Typische rendementen en concentratie's voor de vier pro-cessen staan in tabel 2.Hierbij is ook de bij het proces behorende prijs vermeld.

Tabel 2: Typische rendementen voor de verschillende pro-cessen.

proces opbrengst pr,:s)t.

nr. :stap enzym in opl.

kg/hr kg/hr

1

%

zuiver -heid

%

f ' f " I/gram I/gram r ' I IA 0.0712

y\

')'

(

2 _{IB 0.0712} .264 .593 . .096 .593 21.3 42.6 128 3.7 138 3.6

e,rl-r

\

3 2A 0.0604 .055 ~,,/ 4 2B 0.0604 .Q20 u' \

, =prijs per gram ~-galactosidase

"

_{, =prlJS per gram produkt} ..

.503 52.3 .503 75.0 155 177 6.2 6.2

In processen IB en 2B wordt het produkt gewonnen in 1.8 1.

In processen IA en 2A is dit in 2.5 1.

-4-•

•

•

•

•

.

e

:

.

•

•

'

.

2 3 4 .1 .2

5

.1 .2 6 .1 .2 7 .1 .2 .3 .4

.5

.6 8 .1 .2 .3 .4

.5

9 .1 .2 .3 Inhoudsopgave Hoofdstuk Samenvatting Inhoudsopgave Konklusies en aanbevelingen Konklusies Aanbevelingen Probleemstelling en situatie Probleemstelling ~-galactosidase produktie Ui tgangspunten en gegevens Uitgangspunten Inherente gegevens

De produktie van

0

-galactosidase

pagina 2 6 8 10 12 14 16 18 Verwerking van de fermentatiestroom 22

Zuivering van ~-galactosidase in een waterig twee fasen systeem

Zuivering dmv.precipitatie Affiniteitschromatografie

Zuivering met gelchromatografie Het totale proces

32

42

48

54

58

Stappen in de zuivering van intracellulaire enzymen

Enzyme bevr~ding

Precipitatie

64 70

Twee fasen extraktie 78

Chromatografie 80

Vast-vloeistof scheiding 84

Vergel~king van de kosten van verschillende produkten

Opzet pr~svergel~k 88

Berekening van de kosten 90

Reali.te i tswaard e vande prijzen 94

10 Gebruikte symbolen en literatuur .1 Symbolen

.2 Literatuur

98 100

Appendix A Bereiding van het affiniteitsgel

a

APV Gaulin homogenisator M~ 15

C. Het industriele gist proces voor ~-galactosidase

n

Ultrafiltratie ~embranen

Bi'i'ysische eigenschappen van het ~t-22 koelmiddel

F. }I'lowsheet

-6-•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

q

4. Konkl usies en aanbevelingen 4.1 l:onkl usies

In dit fabrieksvoorontwerp wordt de produktie van het

enzym, ~ -Galactosidase, ui t E. Coli behandelt .Het bakterie

wordt geproduceerd in een kontinue fermentorvan 5 m3 .Na

oogsten en disrupt ie van de bakterieën kan een eerste

zuivering,met precipitat ie of t\\leefasenextraktie, worden

toegepast . Om redelijk tot hoogzuivere produlcten te krijgen

wordt een tweede zuivering,met gel- of

affiniteitschroma-t ografie,ui tgevoerd.

- De ekonomische haalbaarheid van het proces is gering.De

pro~l is t~ot voor de hooggezuiverde

produk-t en.De ruwe en gewone produkten mogen niet worden toegepast

voedsel,dat vrijwel de gehele markt is.

-De hoge kosten val1. de fermentat ie, van bakterieën tov.

gis ten, \'rerkt sterk door in de produ..1ctprijs.

De kost en voor affiniteitschromatografie zijn ook erg hoog

maar er ktmnen zeerzuivere produkten mee geproduceerd

worden • Deze zijn goedkoop tov. industriele enzymen.

-De disruptie van de bakterieën in een kontinu proces van

deze grootte,kan zeer goed met hoge druk homogenizatie.

- De eerste zuivering kan het beste worden uitgevoerd door

extraktie met PEG en fosfaat.De chemikaliekosten zijn iets

r:oger dan bij prcipi ta tie ,maar de investering lager en de

zuivering in ~~n stap is erg hoog.

- Bij een eerste zuivering met precipitatie is een

vooraf-gaande verlaging van de viskositeit,door RNA verwijdering,

en celrest verwijdering noodzakelijk.Mangaansulfaat geeft redelijke resultaten.

De e~'1zymprecipi tatie is goed uitte voeren met

ammonium-sulfaat ,Alleen posit ieve uitzouting geeft een lage zuivering.

;.roepassing van centrifuges voor de afscheiding van

precipitaten is mogelijk. Het verschil met vooral cross-flow

filtratie is moeilijk.

0-De tweede zuivering met affiniteitschromatografie is

"""I.~

x~· duidelijk de best e.Gelchromatografie is veel goedkoper,

- 1;-;~ (l

~' I maar is onafhankelijk van enzymsoorten.

\-.V·

~

-8-•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-10-Lj,2, Aanbevelingen

-Gebruik van gisten ipv.bakterie§n heft een aantal problemen

op.De fermentatie kosten zijn lager(tot lOx).l oepassing in

d 1 k 'k A d ' . t d ' .. ,~ ç~..-\ .~u...

voe se vaa wel mogel~ . . ~N verwij erlng nle no 19. ~ , .~

- - r---

d

""~~""

De disruptie is eenvoudi~. ~~

-Het is heter om naar ~roo tschalige grove zuivering te kijken da~ naar ee~ kleinschali~e zeer goede zuivering.

Het beschrever~ proces heeft een redelijke schaal voor

produktie van het matig __ gezuiverde produkt,maar is te

groo t voor het hooggszuiverde produkt.

-Om een betere vergelijking te kunnen maken,onderling of

met industrie§le produkten,zullen meer gegevens gevonden

moeten worden over:het gedrag van de belangrijkste

proteine-soorten tijdens precipitatie en extraktie.de grootte van

de gevormde precipitaten en celresten.een betere indruk van de viskositeit van proteinen-oplossingen.

-Voor een betere kosten indruk moet vooral naar de

fermen-tatie gekeken worden. Daarnaast zijn vooral de arbeidskosten en investeringskosten voor verbetering vatbaar.

-Produktie van hoogzuivere enzymen is vaak onnodig. Van een

enzym is zo weinig nodig dat verontreinigingen onbelangrijk zijn,behalve als het schadelijk is.

RNA verwijdering kan vermeden worden door filtratie of

verdunning.

Voor enzymproduktie zijn batchprocessen de meest gebruikte.

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

5.

Probleemstelling en situatie 5.1. Probleemstelling

Bij het produceren van enzymen kan de nadruk op twee ~

procesdelen worden gelegd.Ten eerste op het fermentatie deel en ten tweede op de zuivering van het enzym.In dit vooront-werp zal de fermentatie stroom als gegeven worden beschouwd. Gekeken zal worden naar het tweede procesdeel.Deze tweede richting staat ook wel bekend als Down Stream Processing.

E~n van de eerste moeilijkheden die men tegenkomt is dat het enzym intracellulair is.De celwand van de bakterie dient kapotgemaakt te worden.Er ontstaat een oplossing met oae celwanden,proteïnen,RNA,DNA en het gewenste enzym.

In de traditionele route worden de celwanden verwijdert. Pas na dit gebeurt is worden de proteïenen en het enzym opgezuiverd.

Een nieuwe techniek is de twee fasen extraktie.Hier worden

ti'

r

beide stappen ineen

gedaan.Het

~

ordt

nu in fase I

~ t

.l tl~;r: geëxtraheerd en de proteïnen en ·celwanden in fase 2.Door

~d~ nu de twee fasen te scheiden is een zuivering bereikt.

Een derde ,nog theoretische methode,is adsorptie van het enzym.Dit wordt gevolgd door een desorpvie in een vol-gende kolom.Hiermee zou een grote zuiverheid mee bereikt kunnen vlOrden •

Om deze drie technieken te kunnen plaatsen qua

ekono-mische haalbaarheid dienen eerstde andere technieken

uit-gerekend te zijn. Ondertussen k~gelijk tussen de

tw~ processen gemaakt te worden.

In de traditionele route wordt een verdere zuivering behaald door gel chromatografie.Dit is een scheiding op molekuulgrote.

Een nieuwe techniek is de scheiding op biochemische eigenschappen:de affiniteit chromatografie.

Ook de chromatografische technieken worden technologisch en ekonomisch vergeleken. De vergelijking vindt zowel plaats na het traditionel proces als na het twee fasen extraktie proces,dus vier processen totaal.

-I

I

'

I

.

•

•

•

•

•

•

•

•

•

:

.

5.2. ~ -galactosidase produktie

De wereld produktie voor ~-galactosidase is niet groot. Schattingen voor de totale produktie lopen in de tientallen

tonnen.De totale produkie willen de producenten niet nauw-keuriger geven.De grootste producent van ~ -galactosidase is Gist-Brocades met een geschat marktaandeel van 60-70

%.

De tweede producent is NOVO die in de orde van 20-30

%

van de totale produktie voor zijn rekening neemt.De toepas-singen van de door Gist-Brocades en NOVO geproduceerde

~-galactosidase liggen bijna alleen in de zuivel industrie.

(l.'.})

Er zijn grote verschillen tussen de processen van deze producenten en ons proces.Het ~-galactosidase in ons proces is afkomstig uit een bakterie terwijl deze producenten

gist als uitgangsstof gebruiken.Er zijn twee redenen geweest om bakterien als gronstof te gebruiken. Ten eerste is de

~-galactosidase inhpud van een bakterie groterW~.Dit heeft

tot gevolg dat de uiteindelijke zuiverheid van het enzym veel groter was. Wil men de ~-galactosidase inhoud van een gist vergroten dan kan dit met genetische technieken. Hierover is in de literatuur niets bekend.Dit alles heeft tot gevolg dat wij gekozen hebben voor een proces waarin op middelgrote schaal zeer zuiver~-galactosidase

gepro-duceert '\.lordt.De gist route staat kort vermeld in appendixC J. Het enzym ~-galactosidase is ook wel bekend als lactase of 0-D-galactoside lactohydrolase.Het hydrolyseert lactose in glucose en galactose~:p~2) .De werking is schematisch

weergegeven in fig: 1.

Lactose komt oae voor in melk. Lactose verwijdering wordt

t oegepast:

-14--voor mensen die lactose niet kunnen verdragen,lactose intolerant.

-om kristalvorming in bv. soft-ijs te vermijden.

-om de zoe theid van melk en weiprodukten te verhogen. -om het betere voedingsstof glucose te krijgen.

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

6. Uitgangs punten en gegevens 6.1. Uitgangspunten

Gekozen is de zuivering in een continue proces te doen plaatsvinden (13, 10) .Di t met dienverstande dat er bij de chro-matgrafie ook batch stappen aanwezig zijn.Een voordeel van een continue proces is dat door de ~tere _, procestijd de denaturatie van de enzymen vrijwel afwezig zal zijn

('8).

Om het ,continue, twee fasen extraktie proces in het gehele proces te kunnen plaatsen is het eenvoudiger als dit deeel ook continue is.In een 5 m3 fermentor wordt een bakterie stroom van 1000 l/hr geproduceerd.De samenstelling v~n deze stroom is in tabel I gegeven (zie 3).De verblijf tijd van de bakterien wordt op 4 uur gesteld.Dit omdat de groei va~ de cellen dan in de laat-Iogarithmische fase is (/8).

Het proces zal gedurende vijf dagen in de week gebruikt worden.Er is tijd nodig om apparatuur te repareren maar vooral schoon te maken.Dit betekent dat er ong. 25 man personeel nodig is.Te weten vier ploegen van vijf man en vijf man extra personeel(adm.staf etc.).Ultra filtratie apparatuur en bezinktanks zijn gevoelig voor het ophopen

-16-van kleine deeltjes.Een tweede voordeel -16-van een vijf daagse produktie week is de flexibiliteit.Met het door ons gebruikte processchema kan eenvoudig een ander enzym gezuiverd worden. Door het gebruik van meerdere chromatografische kolommen

kan. ook de produktie vrij eenvoudig aan een verminderde vraag aangepast worden.

Door de vele verschillende technieken kan het produkt ook in verschillende zuiverheden verkocht worden.Dit b.v. :na de ultra filtratiejna gel chromatografie of na affini-teit chromatografie.

De aard van .het proces maakt dat de gehele produktstroom geloost moet worde. ers uit tabel I is te zien dat in 1000 l/hr slechts 12 gram per uur aanwezig is.Het uiteinde-lijke produkt word in 1.8 I geconcentreerd.Di:t:.heeft tot gevolg dat de fab iek ca. 1900 inwoners equivalenten

•

•

•

6.3. Inherente gegevens

De werking van ~-galactosidase op lactose is al beschreven in

5.2 ••

Een van de problemen die men tegenkomt bij de beschrij-ving van een enzymzuiveringsproces is het gebruik van units. Een unit is een maat voor de aktiviteit van de enzym-oplossing. Deze unit wordt als volgt gedefinieerd:

18

-"een uni t

HYdrOlisee~.

0 fmol

o-nitrofenyl-~-D-galactoside

tot o-nitrofenol bij een gespecifeerde pH en temperatuur" ~~4~

Deze definitie verschilt ook nog van de door Gist-Brocades

•

gegeven definitie .Deze verschilt op zijn beurt weer van de definitie van NOVO etc ••

Units dient men echter te meten.Het door ons beschreven

proces is een proces op papier. Wij bL~nen dus niet de zuiver-heid van de oplossing in units weergeven.Bovendien is de

•

iJfÎ'

(

~-~alactosidase

hoeveelheid in een bakterie alleen bekend in

~)~!

gr~~en,niet

in units.Pas na de disruptie komt het enzym vr1J

if~' en is er dan pas sprake van een aktiviteit van de oplossing. Een andere moeilijkheid is de aanwezigheid van inhibitors.

• Dit zijn bv. vrije metalen en ionogeen of vrije calcium.Promotors zijn magnesiu..rn,mangaan en kalium.Zo kan,zonder dat het aantal grammen ~-galactosidase veranderd ,de aktiviteit wel veranderen.

Verder dient men sterk toe te zien op de afwezigheid van • lucht in de oplossing ( 9 ) .Di t om twee redenen. Ten eerste kan

door de grote oppervlakte spanning tussen een luchtbel en een

•

•

•

•

.

enzym het enzym gekraakt worden. Ten tweede is bepaalde appa-ratuur niet bestand tegen het voorkomen van luchtbellen in de oplossing.

Een extra moeilijkh.eid is de verand:::ring van fysische groot-heden tijdens het proces.Door koncentrat±e,verdunning,toevoeging van chemicali~n etc zullen viscositeit en dichtheid sterk ver-anderen.

De enzymeigenschappen zijn gegeven in fig.2 .De samenstelling van de aangenomen fermentorstroom zijn vermeld · in tabel3 , De eigenschappen van de meeste stromen en daarin voorkomende vaste stoffen zijn gegeven in tabel 4 •

De oplosbaarheden van de gebruikte chemikalie~n zijn terug te vinden in tabel S • In fig. 3,4 zijn de eigenschappen van het

twee-fasen systeem apart vermeld.

" I

o

.

'

.

, ~ .

•

'

.

! i

•

•

•

•

•

•

•

Tabel 3 Samenstelling van de fermentorstroom

-stroom fermentor uit

bevattende;

1000 l/hr 37°C -2.8% cellen,nat gewicht

.7~ bakterie~n,droog

waarin van nat gewicht; 14 ;b pro t e inen ( exkl. RNA)

7 ;6 RNA/DNA .45 >b ~ -Galactosidase 4 ;G celwand ed. -mediüm 28 kg 7 kg 1.5% glycerol + sporen

Tabel 4 : Dichtheden,en viskositeiten van de verschillende

s~romen,en de specifieke grootte van vaste stoffen •• o:rnschrjjving dichtheid(kg/m3 ) viskositeit(mPas) spec.0um) - fermentor medi"cun bakterie~n. -na disruptie medium resten

-2-fasenextraktie

1010 1080 1020 1080(-1020) PEG stroom 1015 fosfaat stroom 1009 topstroom 1026 bodemstroom 1070 mengsel 1045 -RNA+celrest vervlJijdering l'insulfaat 90% 1500 precipitaat 1080 na centrifuge 1020 -enzymprecipitatie alllfl 0 n i l LTIl-sulfaat 90% precipitaat na centrifuge 1080 1020 1.6 8 !) 2 2

.5

.3

.3

-.5

Ta1Jel 5 Oplosbaarheden van de gebruikte chemikalien(20

°

C

)

st of oplosbaarheid(g/lOOccwater)

167 33

one indig (ge lijk ge s t e ld aanK₂HPO 4) .

65

t~

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

7. De produktie van @-galactosidase

7.1. Ver\'1erking van de fermentatie stroom

7.1.1.

inleiding

Voordat aan de eigenlijke enzymscheiding kan worden begon-nen zal de celstroom,uit de fermentor,een aantal voorbewer-kingen moeten ondergaan.

In een kontinue fermen tor wordt ge1/verkt met vrij verdunde

celsuspensies.Om de stromen in het verdere proces in de hand te houden wordt de suspensie gekoncentreerd.Hierna wordt het

~

~ intracellUlaire enzym bevrijd.Uit de vele mogelijkheden is

\Y gekozen voor disruptie onder hoge druk,vooral vanwege de

t;~ .

M kontinuiteit.

Om afbraak en denaturatie van het enzym te vermijden wordt na de ferment or en in de reflux van de homogenisator

gekoeld.

7.1.2.

Cel oogsten

Voor het koncentreren van de celsuspensie wordt meestal gebruik gemaakt van een disk-centrifuge met een kontinue afvoer van de slurrie via de nozzles.

De grootte van de centrifuge wordt gegeven door het

equi-valente oppervlakI'en de doorzet Q.

Z.

kan op twee manieren

o

berekend worden (2~,~ ,~2),uit de maten van de centrifuge:

2Ttn.(

r~-rr) .~2

2

=

3g tana (1)

waarin: n = aantal disks

r = straal (binnen/buiten) van de disk . (m)

(,.)= _{de hoeksnelheid waarmee de disks draaien(s-l)}

e= de hoek die. de disk maakt met de vertikaal(o)

en uit de stroom- en cel gegevens:

~=

2 e v_g

waarin: e

=

de effektiviteit van het

oppervlak. Voor een disk

v _g

=

de sedimentatiesnelheid aanwezige centrifuge van de cell (2) equivalente is dit

45%.

oiv. de -(m/s) -2'2.-I I I I

•

•

'

.

•

•

•

I

.

I

•

•

-'24-v

_g

=

toe

.d~O

.g

/

dJ

'1-(

IS •

7J

(3)

óe

= dichtheidsverschil tussen cel en de

vloei-stof (kg m- 3 )

waarin:

d

50= de diameter van de cel die voor 50%

afgescheiden wordt (m)

'Y)

= de viscosi tei t van de vloeistof (Pa. s)

~

de zwaartekrachts versnelling (m.s-2)

Het

gece~Ugeerde

medium wordt afgetapt vlak naast de

invoerfvrijwel in het centrum van de centrifuge.De slurrie wordt op het breedset gedeelte van de centrifuge afgetapt. Door de centrifugale kracht heerst hier een hoge druk:

waarin r n ?- 2' 2 '

e

tJ"',

CT

-r .,)' P

=

11 U n 2

de straal van de centrifuge bij de nozzle is. Om de uitkomende stroom in de hand te houdenfzodat niet alles hieruit komtfwordt gebruik gemaakt van zeer kleine openingenfde nozzles.De stroom wordt gegeven door:

waarin: n = nozzle index

N = aantal nozzles (S-24)

"

c = nozzle afhankelijke constante (hier c= :S5) Met de gevens uit 6.2. en de aangenomen waarden ~~)

, -2

n= 70 r.= 5 10 m voor de centrifuge

e

= 400

toerental = 100 omw./s kan berekend worden dat:

1 10-2m rn=ru+ 3 (5) v g= 2.4 lo-Sm/s

L

=10600 m2 dn= 3.S 10-4m

ru=.12 m Pn= 2.24 MPa bij N~=S

Stroomgegevens staan vermeld in tabe16 .Hierbij valt op dat een gedeelte van de cellen al kapot zijn gegaan.Dit is een gevolg van de nozzle afvoer (18).

Tabel

6

:Stroomgegevens van de centrifuge

Soort stroom Q cellen proteïnen ~-galacto.

nat gewicht sidase

l/hr

?6

kg g ingaande stroom 1000 2.8

3.9

130 gekoncentreerde suspensie afvalstroom ISO 8'20 14.8 .17 3.7 .2 123 7

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

7.1.3. Disruptie met een hoge druk homogenisator.

In een hoge druk homegenisator wordt de celsuspensie

onder hoge druk door een ventiel geperst.Dit ventiel(fig.~ )

bestaat uit hardstalen of wolfraamcarbide onderdelen:valve seat,impact ring en de valve.Deze valve is beweegbaar en er kan worden ingesteld welke druk deze opent (45,~

).

Bij de gebruikte drukken (100-1000 bar) vindt disruptie plaats door afschuifspanningen,botsingen met hoge snelheden en zeer snelle drukverlaging.Vooral het laatste,dat zelfs kavi tatie tot gevolg heeft (4,6), zorgt voor het klappen van de cellen.De celresten bestaan daarom voornamelijk uit cel-wanden ( 4 ,/~).

De hoeveelhei vrijkomende proteïne kan worden berekend met (6/10,~5): Rm 2.9 Hierin is: log (R -R )

=

K.N.P m (6)

de maximale hoeveelheid te bevrIjden proteïne de bevrijde hoeveelheid proteïne

N

=

het aantal disruptie stappen P

=

de werkdruk

K

=

konstante afhankelijk van druk, temperatuur

ensoort cel

Bij een druk van 550 bar is de konstante K,voor E.Coli

ML 308 uit een kontinue kulture, 3.5 10-9 Pa- 2 • 9 (18).

Hiermee blijkt dat één disruptie stap, ekonomisch gezien, te lage opbrengsten geeft.Er wordt daarom met een reflux gewerkt.Deze reflux,320 l/hr,moet gekoeld worden tot 5°C, om denaturatie van het enzym te voorkomen.In de homogenisatie treed t een temperatuur verhoging op van 17°C (Lj,' 8 ,'10) •

Met de gegevens uit 6.2. kan via een iteratie berekend

worden dat 73

%

_{van de proteïnen en 8ó% van het} ~-galactosidase

bevrijdt wordt.De verdere stroomgegevens zijn vermeld in tabe11.

Een apparaat dat geschikt is voor toepassing in het proces is de APV-Gaulin

Me

15,zie appendix B

•

•

•

•

•

•

•

'

.

•

•

•

•

Tabel

1

:Stroomgegevens van de hoge druk homogenisator:

ingaande stroom uitgaande stroom reflux

Q (l/hr) 180 130 320 cellen (kg) 22 7.1 20 proteïnen(kg) .6(3.1) 2.7(1.0) 4.8(1.8) DNA/RNA (kg) .3(1.6) 1.4(.5) 2.5(.9) ~-galacto-sidase (:g) _{27(96) 98(25) 175(44)} celresten(kg) .2 .9 1.5

'l!

(Pa.s) 2 E-3 8 E-3 8 E-3

temperatuur (OC) _{5 22}

, de getallen tussen haakjes z~n de niet vr~e hoeveelheden.

7.1.4. Koeling

Zolang het enzym nog in de bakterie is kan de bakterie

het ~-galactosidase weer afbreken.Dit zal alleen gebeuren als het bakterie buiten de fermentor op een hoge tempeTatuur is,boven de 15°C.Dit is slechts op twee plaatsen het geval: na de fermentor (T=37°C) en na de disruptie (T=22°C).

;~ Na de disruptie is de temperatuur door de grote energie

I ..

J{,A,V""J toevoer gestegen met 17-GC .Gekoeld wordt in beide gevallen

~

-

tot 5

~.Na d

~ ~

ordt

geen gebruik gemaakt van de

bakterien,ook niet van de niet gedisrupteerde bakterien. Verder in het proces is dus geen koeling meer nodig.

~-Galactosidase zelf heeft pas last van temperatuur

denatu-'ratie bove de 55°C (2'?,40.,Ljl).

De koeling wordt uitgevoerd met een compressor-koel machine,zie figuur 6.Koelmiddel is hier het Freon R-22,

CHCIF2 (30 ).Dit wordt gebruikt vanwege de grote warmte

op-name kapaciteit,AH=-210 kJ/kg.De c van de fermentor stroom

wordt gelijk genomen aan die van

w~ter:cp=4.l2

103 J/(kg.K).

Uit figuur t blijkt een warmtebalans over een stuk pijp

met extern koelmiddel met een konstante temperatuur:

-28-,

r/>.

e·

c •

TI

=

~

·e·

c • TI _{+ U. (T-Tm) • 2 r. dL} (:z)

v p

L

v

P

L+dL f

waarin: U = warmte overdrachts

koeffici~nt

'

(w/m2X)

T~= koelmiddel temperatuur ' (K)

uitwerken van deze massabalans geeft:

Ti-Tm U.A

(s)

In ( )

=

..,-~-Tu-Tm _{f/Jv·e· c p}

A = oppervlak waardoor warmteoverdracht

Plaatsvind

~(m2)

•

•

•

•

•

•

•

-

.

•

•

'

.

•

(K) (K)

Ti = temperatuur van de ingaande stroom Tu= temperatuur van de uitga&~de stroom

e·

v •d

₄

als Re= 1) ') 10 dan geldt voor de warmte overdrac,htscoëf

-fici~nt h: l

À

h =

D~l

.. -027 Re·8pr· 33 Re= getal van Reynolds waarin:

-10-Pr= getal van Prandtl,in dit temperatuur interval Pr=lO À= warmtegeleidingsko~ffici~nt van water (W/mK)

w

de totale warmteoverdrachtsko~ffici~nt U is te berekenen met:

d

U-l = h -1+ wall (10)

Awall waarin:

dwall= wanddikte (m)

J\vall= warmtegeleidingsko~ffici~nt van de wand (W/mK) met de volgende konstanten:

,

-4

I'wall =3.87 10

Àw =.606

W/mK W/mK

De pijp diameter wordt berekend met een diametertabel van de American Society of Heating,Refrigeration and Air

Conditioning (21Q).Deze is in figuur

8

weergegeven.De

beno-digde oppervlakken kunnen nu berekend worden.De R-22

koel-o

temperatuur is op -3 C gesteld.Ook is in de uitkomsten tabel,

tabel 9 de voor de koeling benodigde hoeveelheid R-22 berekend. Tabel

B

:gegevens over de koeling na. de ferment or

en na de disruptie stap.

koeling na

de fermentor ingaande produktstroom

(l/hr)

inwendige diameter pijp

(m) uitwendige diam. wanddikte pijp Re T. l h U pijp oppervlak pijp Cm) (m) ( oe)

(W/m2K)

CW/m2K) (m2 ) 180 2.09 10-2 2.67 " 2.87 10-3 9999.5 37 2657 2035 .932 benodigde R-22 stroom(m3/s)1.298 10-4 pijp lengte L Cm) 14.2 • -__ 3°C Als T_u=5 C en Tm koeling na de disruptie 320 6.833 10-3 1.03 10-2 1.73 - 10-3 9985 22 8127 5201 .0826 2.261 10-4 3.85 - - _ _ _ _ 1

I

.

!

e

•

•

•

•

•

•

•

•

•

7.2.

Zuivering van @-galactosidase in een waterig twee

fasen systeem.

Na de disruptie stap met de high pressure homogenizer veranderen de fysische constanten van de stroom sterk.De celresten zijn nog kleiner dan de cellen terwijl de

visco-. -3

siteit van de oplossing stijgt van 1.7 10 Pa.s. tot

8.0~a.s •• Dit maakt een vast-vloeistof scheiding zeer

moei-lijk.

De laatste jaren zijn de extraktie technieken voor

enzym-isolatie processen sterk toegenomen.Dit h~eft als voordeel

dat een vI eistof-vloeistof scheiding kan volgen. Deze vindt plaats in it proces met een bezinktank.Dit kan makkelijk door het d chtheids verschilóe=44 kg/m~ •

Vloeist f-vloeistof scheiding in een waterig t',vee- of meer fase ysteem voor enzym isolatie is zeer uitgebreid beschreven door Albertsson (2. ).Door twee of meer polymeren met water e mengen,of één polymeer en een anorganisch zout ,kan men en twee of meer fasen systeem vormen.Dit door de zg."onvere igbaarheids verschijnselen" (eng. incompatibility

phenomena) praktisch waargenomen verschijnsel waar

theo-retisch we nig of geen onderzoek na gedaan is.Cellen en cel-onderd len zoals celwanden en sub-cellulaire deeltjes

hebben de eiging zich ongelijk in beide fasen te verdelen.

Ook prote! en en andere makromolekulen kunnen zo gescheiden worden.Ano ganische molekuIen zullen zich gelijk over beide fasen verd

Er is n g een ander voordeel aan de waterige twee fasen extraktie. e chemicali~n die gebruikt worden in de be : stu-deerde sys emen zijn commercieel tegen lage kosten beschik-baar.

Vergele en met het traditionele proces is het tijdsbeslag kleiner,de kosten zijn lager en de zuivering is groter.

Zuiveri g van~ -galactosidase in een twee fasen systeem

is bestude rd door Veide et al. (39).Zij maakten gebruik van een po y ethyleen glycol (PEG) polymeer fase en een

anorganisc e fase van ~HPO~en ~PO~ .De anorganische

fase kan v rder gekarakteriseerd worden door de

K~HP~/KH~ O~ verhouding.Deze is door ons gekozen op

9.55.

Het gebrui te PEG was een PEG 6000,dwz. een PEG met

-•

•

•

•

\

•

•

•

•

•

•

•

kuulgewich van 6000.De lichte fase is de PEG fase en de

zware fase is de fosfaat fase •

fase sysyteem wordt weergegeven in een

fase-I van deze fase-diagrammen zijn gemeten door

Albertsson (2 ).Een voorbeeld staat in figuur ~ •

Onder de g kromde lijn zal er geen fase ontmenging zlJn •

kromde lijn zal wel fase ontmenging optreden.

-34-De samenst lling van de topfase en de bodemfase wordt gegeven

volgens de nodenlijnen.Dit zijn de rechte lijnen die twee

punten op

nen volgen

stelling i

punt van d Punt C is

e kromme verbinden.De samen stelling is te bereke~

de bekende hefboomregel.Stel de bruto

samen-gegeven door punt A.Het punt B is nu het

snij-nodenlijn en de kromme in het PEG-rijke gedeelte.

et snijpunt van de nodenlijn en de kromme in het

PEG-arme d el.Dit alles is ook weergegeven in figuur 10.

De samenstelling van de topfase is AC/BC en de samenstelling

van de bo emfase is AB/BC.

Een op imale fasensamenstelling is gevonden door Veide et

al. (3~). eze samenstelling is 10% fosfaat (in de eerder

genoemde erhouding)en 6.3% PEG.Dit alles in

gewichtsprocen-ten. Zoals in

6.2.

is vermeld zijn beide fasen goed

oplos-ter.Ook is in 6.2. de samenstelling van topfase

en bodemf se na de scheiding gegeven.

Een va de oorzaken die het moeilijk zo niet onmogelijk

maakt het fase gedrag op voorgand te voorspellen is de celconcen ratie.Uit de tabel in 7.1. is te zien dat het

celpercen age 13.7% is.Door toevoeging van de fosfaat - en

PEG strom n daalt deze tot 9.4%.De fosfaat- en PEG stromen

worden al vloeistof toegevoegd.Beide hebben een '80%

verza-diging.Di heeft als voordeel dat het fosfaat en het PEG niet eers in de produktstroom hoeven op te lossen.De door Veide gev

r-. .l

gebruikt

geschetst

nden verb . ·ftijd van 10 min. kan dus ook hier

en in tabel ~ zijn de stromen

en wordt de grootte van deze stromen gegeven.

vloeistof stroom van 260 l/hr en een verblijf tijd

, I I r1et ee van 10 mi zijn dat het fosfa Hiermee i

• volgt dat het mengvat zo gedimensioneerd moet I

et vloeistof volume 43.4 1 is.De tijd nodig om

r;-J17./

t en het PEG op te lossen is op 15 min. gesteld. ~

I I

I

e

I

e

e

e

e

e

e

i

e

I

I

e

I i

'7

'"

Tabel 9 : grootte van de in figuur 11 voorkomende stromen

alsmede karakter van deze stromen.

stroom soort

stroom-nr. stroom grootte: kg/hr L_I gedisrupteerde celstroom 182.7 1₂₁ waterstroom om PEG op te lossen 17.14 1₂₂ vaste PEG 17.14 L3I waterstroom om fosfaat op te lossen 27.93 132 K~HPO~ stroom(vast) 24.63 L33 KH4P~stroom (vast) 2.58

Luit twee fasen mengsel 272.12

resp. 11.4 1 en 8.1 I.Voor het mengvat van de twee fasen extraktie wordt een snelle meng er gebruikt.Dispergatie is niet nodig,goede menging wel. Zoals al eerder is vermeld mag er geen lucht in het systeem geroerd worden.

Al eerder is gebleken

dai

de effektiviteit van de extrak-tie van de celconcentraextrak-tie afhankelijk is.De door Veide gemeten waarden zijn ïn tabel 10 weergegeven.

Tabel 10 :experimenteel gevonden fase-samenstellingen

en scheidingsparameters voor verschillende celconcentraties.

Concen- Recovery of

trarion of j3-galac- Recovery of Recovery of Recovery of

disinte- Volume of tosidase proteins in RNA in DNA in

gTated cells~ top ph ase in top phase top phase top phase top phasc

["1o(w/w» (mL) (~o) (%) (%) (%)

4 760 90 7 4 <0.1

8 835- 100 S 1 <0.1

12 720 77 6 2 <0.1

Deze metingen wer,Çien uitgevoerd met een 2.8 liter sy§lteem.

De door ons gebruikte gegevens zijn die van de 12% celcon- ~

~

centratie.De hie'rmee berekende stroomsamenstelling is ver-meld in tabel " •

De scheiding van de twee fasen vindt plaats in een bezink-tank.De relatief kleine stroom en de snelle bezinksnelheid

ma~ijk een centrifuge te gebruiken.De

schei-ding met een bezinktank is beschreven door Kula et al.(24).

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

Tabel

I'

:stroomsamenstelling na de twee fasen extraktie.

topstroom bodemstroom stroomgrote m3_{/hr 6.692 lÓ-}

z

·

_1.902 10-1 waarvan (%) : PEG 10.2 4.6 fosfaat 8.7 11.2 water 81.1 84.2 bevattende (kg) ~-galactosidase .0755 .0225 proteïnen .162 2.538

RNA

&

DNA .0288 1.44

Het bezinktijds diagram is in figuur 12 weergegeven.Hieruit

is af te lezen dat bij een bezinktijd van 90 min. de schei-ding optimaal is.De stroom van 260 llhr en de verblijf tijd van 90 min. lev.ert een bezinktankvolume op van 390 liter. De invoer van de vloeistofstroom dient zo te zijn dat het scheidingsevenwicht niet verstoord word.Om een grote

op-hoping van celresten in de fosfaatfase op de bodem tegen

te gaan ~r~de aftap in de bodem geplaatst(ipv. in de

zij-/ kant) .De bezinktank inklusief aftapkanalen is in figuur 13

geschetst.

Langdurige operatie zal het noodzakelijk maken de .tank schoon te maken.Celresten op de bodem en verbindingen die

zich aan het grensvlak van de twee fasen verzamelen dienen verwijderd te worden(23).De tank kan anders verstoppen.

Zoals af te lezen uit de bezinktijds diagram (fig. i1.)is

het rendement van de bezinktank 100

%

De samenstelling zoals in tabel " blijft hetzelfde.

•

Na de bezinktank blijkt dat de produktstroom nog groot .

is (66.92 1).De chromatografische stappen aan het eind van

het proces hebben een praktisch maximum kapaciteit van

10 l/hr.Dekosten zouden anders te hoog worden.

Ook is de fosfaat- en PEG- xoncentratie nog hoog.Dit kan in de gel chromatografie problemen geven.

Om molekulen met een laag molekuulgewicht te verwijderen maken we gebruik van een zg. ultra filtratie.Door een goede

keuze van het te gebruiken filter kunnen vrijwel alle PEG

fosfaat en enige proteïnen verwijderd worden. Tevens wordt

de stroom geconcentreerd tot 10 I/hr.

•

•

•

•

..

•

•

•

•

•

,

•

Ultra filtratie is een onder druk bedreven proces.De scheiding geschiedt op een molekulaire schaal.De typische werking is als volgt:een vloeistof die kleine opgeloste molekuIen bevat wordt door een poreus membraam geperst.

Grote molekulen,colloIden en gesuspendeerde deeltjes kunnen niet door de porie~n.

Ultra filtratie scheiding loopt van 2 tot 20 nm •• Worden

de porie~n groter dan heeft men te maken met mikrofiltratie.

Over de porieMn valt nog het volgende te zeggen:porie~n

komen voor in twee vormen,met rechte kanalen (isotroop) en met taps uitlopende kanalen (anisotroop).Zie figuur'~

De anisotrope kanalen hebben het voordeel dat een deeltje dat de poriemond gepasseerd is niet in het kanaal zal blijven steken.Dit maakt een grotere stroom en een langere levens-duur mogelijk.Soms word rond de poriemond een lading aange- .

bracht.Dit maakt het mogelijk specifieker te scheiden. Deze techniek hebben wij niet gebruikt.

Een beschrijving in formules is de volgende :('2'2)

Als puur water door het membraam geperst word geldt volgens

de wet van Darcy: _{K AP}

m

met:

V

J=A • = _{• 11}

= membraam hydraulische permeabiliteit drukverschil over het membraam

v

= verwijderde volume A

=

membraam oppervlak (t r) (PSI) (m3) (m2)

Zoals in figuur ,ç te zien is zal de toestand bij een oplos-sing anders zijn.Gesuspendeerde deeltjes en grote molekuIen zullen zich bij de filter verzamelen en een gel laag vormen. De gel laag heeft een eigen weerstand.Dit veroorzaakt een extra weerstandsterm in

(1):

met:

\

Kg= gel membraam hydraulische permeabiliteit

Het is gebruikelijk om de K en K niet te bepalen.De _{m g} fabrikanten meten voor het te gebruiken membraam . bij een druk van 100 PSI de flow door het membraam J

(mis).

Verder wordt het membraam nog gekarakteriseerd door een zg. "cut off" parameter.Dit is het maximaal door te laten mole-kuulgewicht.

•

•

•

•

•

•

'

.

Het door ons gebruikte filter had een "cut off" parameter

van 300 000 en een J=ll 1/(m2min) , (1o).Het door ons gekozen

ultra filtratie systeem is in figuur

16

getekend.De pijp

heeft een diameter van 25 rom.De lengte is dan te berekenen met: Vb= Vo- J.A.t A

=

l{" .d.L t = '1\ d2 .L Hi ruit volgt:

4

~

L= 12.24 m A= .96 m2

Hierbij is uitgegaan van een stroom die geconcentreerd moest

,

worden van V

o

=

66.92 liter tot Vb

= 10 liter.Door het kiezen

-

41.-van een "cut off" parameter 41.-van 300 000 zal ook 15% 41.-van de proteInen verwijderd worden.Destroomsamenstelling na de

ultra-

"-filtratie stap is vermeld in tabell2 .Eigenschappen van

andere filter eenheden zijn gegeven in appendix F.Af te lezen is dat het door ons gebruikte filter qua doorzet en qua

"cut offll _{parameter de beste is.}

Tabel I~ :stroomsamenstelling na de ultra filtratie.

Stroomgrootte bevattende:

~-galactosidase

proteInen

RNA

&

DNA

(l/hr) (kg) (kg) (kg) 7.3. Zuiveringdmv.precipitatie 10 .0755 .138 .0288 • 7.3.1 Inleiding

Zuivering met uitzouting is een van de oudste technieken in

de enzymscheiding.Om iets te zeggen over de werking moet nog

• steeds op metingen uit de praktijk worden afgegaan,omdat te

weinig gegevens over enzymen uit een cel bekend zijn.

(l

Het produkt wordt verkregen met positieve

uitzouting,alhoe-wel negatieve uitzouting aantrekkelijker is.Dit omdat bij

• positieve uitzouting voorafgaande verwijdering van celresten

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

en RNA en DNA nodig is (r,f2,lB,'lS',y'l) ·om vervuiling tegen te gaan, storing te vermijden en de viscositeit te verlagen.

Om het produkt geschikt te maken voor chromatografische toepassingen wordt het na de uitzouting opgelost en met ultra filtratie geconcentreerd tot een aanvaardbaar volume. 7.3.2. ffifA en celrest verwijdering

De verwijdering van celresten kan alleen goed plaatsvinden met centrifugatie als eerst de viscositeit verlaagd wordt door RNA verwijdering.Deze verwijdering gebeurd door de pro-duktstroom snel te mengen met 90% mangaansulfaat oplossing tot 0.1 N.Hierna wordt in een langzaam geroerde tank met ver-blijf tijd van 5 min. ,het RNA neerslag gevormd

(20).

De menging moet snel gebeuren omdal al bij 0.5 M een duidelijke denaturatie van het enzym optreedt.De celresten kunnen nu

tegelijker tijd met het RNA neerslagin een centrifuge verwij-dert worden. De toepassingen van mangaansulfaat is geen uit-zouting op basis van ionensterkte.Het is een komplexvorming

tussen het positieve mangaan en de negatievfosfaat 'groepen

in het RNA (12) .Het neerslag, bestaande uitcelresten en

onge-veer 50% van het RNA,wordt uit de stroom verwijderd met een

disk-centrifuge.Vanwege de kleine hoeveelheid «5%) wordt

een intermittend losser gebruikt.Met de gegevens uit 6.2 de berekening ui t 7.1. en een d~O=O. 3

J'

m ('9) wordt de

sedimentatiesnelheid v =1.5 10- m/s.Net het debiet van 185 l/hr geeft dit een van 35.

~

103 m2.Net deze

Q/ï..

volgt een

ren-dement van 96% ('lO,s). Om de grootte van de sedimentatie, .

stroom te berekenen wordt uitgegaan lost op het moment dat het neerslag genadert is.Hiervoor geldt:

van een hele losser die

waarin: m

het disk-pakket halverwege m.Vc

Q=

₌

I 2 2

vS·~5 (rd-{rd-t(rd~ru))).

= hoeveelheid af te voeren neerslag = inhoud van de centrifuge

inhoud van de neerslag ruimte straal ter plaatse van de inlaat = straal van het disk pakket

(kg/hr)

(m

3)

(m

3)

(m)

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

Net de aannamen n= 100 165 omw/s r .=

1

-2 /

volgt dat ru=ll 10 m en Qs= 19 1 hr

De gegevens over de Rif A verwijdering staan in tabel 13 •

Tabell3 :stroomgegevens van de RNA verwijdering •

soort stroom Q prote- RNA ~-galact- cel

!nen tosidase rest

-l/hr kg kg g kg ingaande l1nSO 4 5.1 ingaand produkt 180 _{2.7 1.4 98 2.6} centrifuge in 185 2.7 .8 98 3.2 centrifuge uit 166 _{2.5 .7 96 .09} centrifuge afval-stroom 19 .2 .1 2 3.1

7.3.3. Uitzouten van ~-galactosidase met ammoniumsulfaat

Het-uitzouten van ÇJ-galactosidase uit de stroom,waarin

zich allerlei prote!nen bevinden,blijkt goed te gaanmet sulfaat.Hierin blijkt ammoniumsulfaat de beste vanwege de prijs, stabiliserende invloed op het enzym,de oplosbaarheid en de hoge effektiviteit.

[) Kontinue precipitatie is mogelijk en geeft bij een

ver- -46-mPas 5 8 2 2

- \ blijf tijd van 5 min betere resultaten dan batch precipitatie " met een cyclustijd van 15-60 min. (I~ 5) .Door ook te kiezen

voor centrifugatie van het neerslag blijft het proces kontinue.

0-Galactosidase is een groot enzym en zal al bij redelijke zoutconcentraties (30-40%) uit de oplossing verdreven worden.

Zodoende is het niet mogelijk om alleen een negatieve preci-pitatie uit te voeren ( 20%) omdat het produkt te verontreinigd

blijft.Hiervoor moetg~bruik worden gemaakt van een ander zout

of een negatieve precipitatie gevolgd door een positieve precipitatie.

Ui t ~.s;,2o) blijkt dat bij een zoutconcentratie van 35% ~-ga­

lactosidase voor 98%,proteInen voor 31% en vrijwel geen

achter-gebleven RNA uitge~outen wordt.Hogere koncentraties geven in

verhouding meer prote!nen en lagere een te lage ~-galactosidase

opbrengst.

Net als bij de RNA verwijdering wordt een 90% ammonium-sulfaat oplossing snel gemengd en vervolgens in een tank

-•

•

•

•

•

•

I

•

•

•

•

•

•

langzaam geroerd.Om het gevormde precipitaat zo min mogelijk te beschadigen zijn speciale roerders ontwikkeld (15).

De grootte van het precipi taa t ligt tussen de 0.5"um en 5"um (5 ) .De centrifuge berekend met een d

50=0.5 m heeft volgens (5, '20) een rendement van 95%.De sedimentatiesnelheid

v = 3.4

10~9m/s

en het hierbij behorende equivalente oppervlak

g 3 2

=23.5 10 m.

Een indruk van de centrifuge en de precipitaat stroom wordt verkregen met de berekening uit 7.1.2.:

-2 met n=lOO ,toerental= 150 Der s. _~ r.=5 10 _{1 .} ~

volgt dat r

u=10.5 10-2m en een precipitaat stroom van 6 I/hr. De verdere stroomgegevens staan in tabel 14 .De uit de

centri-fuge komende slurrie wordt voor verdere bewerking geschikt gemaakt door eerst te verdunnen met water tot 66 . liter door het op te lossen en vervolgens in te dikken met ultrafiltratie tot 10 l/hr

Tabel 14 :Stroomgegevens na de uitzoutingsstap met ammoniumsulfaat

soort stroom Q prote!nen RNA \?>-galac to . 'neer.-

_-ry

sidase . . slag l/hr kg kg g kg rnPa. s. ingaand produkt _{166 2.5 .7 96 .09 2} (NH4)2S04 in 105 -, f centrifuge in 301 1.7(.8) .7 2(94) .96 2 centrifuge afval .05 -stroom 295 1.7(.1) .7 2 2 produktstroom 6 (.7) 0 (94) .91 7.4. Affiniteits chromatografie

Na de koncentratie stap met de ultra filtratie kan het

produkt verkocht worden. Ook kan beslote worden tot een verdere zuivering met een chromatografische stap.Een van de in opkomst zijnde chromatografische technieken is de affiniteits chro-matografie.Het principe van de affiniteits chromatografie berust hierop:enzymen(of biopolymeren in het algemeen) hebben zg "bindende groepen" die specifiek en reversibel

kunnen reageren met een ligand.Dit ligand kan aan een onoplos-bare matrix gekoppeld worden.Nu kan het gewenste enzym uit

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

I

I

•

i.

I

de vloeistof fase geabsorbeerd worden.Di t principe is in figuur Ft weergegeven (21 ).

Uit metingen aan een ligand blijkt dat menvaak niet alleen met een biospecifieke binding te maken heeft.Een deel van de gewonnen proteInen zal ook door hydrofobische binding

geabsorbeerd worden. (21 ,44)Dit is een a-specifieke absorp-tie door koolstof ketens.

De affiniteits gels zijn met bepaalde liganden in de

handelgebracht (bv. door Pharmacia).De mogelijkheid bestaat om deze zeer dure gels zelf te maken. Voor een uitgebreide beschrijving hiervan wordt verwezen naar appendix A.

Voor de absorptie van~-galactosidase uit de produkt-stroom gebruikt men p-aminofenyl-~-D-thiogalactopyranoside

(3 ,~T,~4).Dit ligand wordt gekoppeld aan een sepharose

4B

gel. Zoals al duidelijk gewordenis uit de eerder gegeven beschrijving zal men een eluens nodig hebben om de pro te-Inen van het ligand los te koppelen.

Voor de verbreking van de ~ -galactosi dase ligand absorptie binding wordt een 0.1 M boraat oplossing gebruikt. Voor de verbreking van de proteInen ligand binding wordt eenO.05 M fosfaat oplossing gebruikt.(33)

Het ligand gekoppelde gel wordt in een 1.8 liter kolom gebracht.Deze heeft ,de afmetingen van 15 cm diameter bij 10 cm hoogte (31).De kolom wordt aangesloten aan dè buffervaten zoals in figuur t8 is geschetst.De tijd bediende kleppen

worden bediend door een tijdklok waarvan de schakel~

cyclus in tabel/5 is weergegeven.De totale cyclus duurt twee uur. klep A B C D E F .TabellS' funktie

:tijdklok schema voor de bediening van de kleppen zoals ge~chetstin figuur IB.

openschakeltijd produktstroom buffer 112 1 buffer buffer zuiver produkt afvalstroom (min. ) 0-50 50-90 90-105 105-120 100-128 8-100

-50-•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

De keuze van de gel legt ook de maximum stroom in de kolom vast.Deze is hier 60 ml min-l •

De uit de ultra filtratie komende produktstroom is lOl/hr. Bij deze produktstroom,kolomafmetingen en maxim1.UTI lineaire vloeistof snelheid is te berekenen dat meerdere kolommen nodig zijn.

Een ander aspekt dat leidt tot de keuze voor meerdere kolommen is de korte levensduur van het ligand-gel systeem. Door verontreinigingen in de stroom wordt ook het ligand en het gel vervuilt.De levensduur van een kolomvulling is dan ook slechts 50 cy~li of één week.

Gekozen is voor de plaatsing van 10 kolommen. Hiervan worden er 7 tegelijk gebruikt voor enzym zuivering.De be-nodigde stromen en de berekende lineaire vloeistof snelheid

zijn in tabel 16 vermeld.

Tabel 16 : stroomgegevens bufferoplossingen en kolomgegevens.

een kolom zeven kolommen kolomvolume (liter)

kolomafmetingen -(cm) produktstroom (l/hr) buffer 1 stroom (l/hr) buffer 2 stroom (l/hr) lino vloeistof

snel-(ml/min) heid -afval stroom zuiver produkt (l/hr) (l/hr) 1.8 15 x 10 1.43 1.59 .43 57.2 1.17 .26 buffer 1 : 0.1 M boraat oplossing buffer 2 : 0.05M fosfaat oplossing.

10.2 15 x 10 (7x) 10 11.1 3.0 57.2 8.2 1.8

Volgens Robinsin et al.(33) geldt het volgende gemidd~lde

rendement in

Met de uit

dé uit de kolom stromende produktstroom:

~ (~-galactosi

dase)

=

80%

~(proteInen)

=

12%

) (RNA & DNA)

=

12%

de ultrafiltratie komende stroom en stroom-gegevens is nu dé samenstelling van de gezuiverde produkt-stroom te berekenen.Deze is weergegeven in tabel '1 voor het twee fasen extraktie proces en .- voor het uitzoutings proces.B~j een lineaire vloeistof snelheid~van

57.2 mI/min en een produktopvangtijd van 28 min is het produkt opgelost in 1.8 liter oplossing van buffer 2.

•

._-_

.. _._--..•.. _ . _ . _

-tabel

'

7

stroomgegevens en opbrengsten van de zuivering met

affiniteit chromatografie.

I

.

na twee fasen extraktie na uitzouting

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

ingaande stroom (l/hr) 10 bevattende

C

:g): -galactosidase proteïnen DNA

&

RNA uitgaande stroom (l/hr) 60.4 20.1

3.5

1.8

7.5 . .. Zuivering met gel chromatografie

10

. .71.2

96.0

1.8

Om na een ultra filtratie de stroom nog verder te

zui-veren en koncentreren wordt een gel chromatografische stap gebruikt.Deze gel chromatografie is een scheiding op

mole-kuul grootte ,figuur tg .(I~)De zuiveringsgraad is niet

groot voor proteïne splitsing (29).Voor zoutafsplitsing

is deze techniek echter zeer goed.Om toch no'g een redelijke

proteïnen scheiding te krijj ;n dient de verblijf tijd zeer

lang te zijn.Dit resultee~ in een zeer groot kolomvolume

bij een lage vloeistof snelheid.De grootte van de gel kor-rels is bepalend voor de retentie van de macromolekuIen.

Het materiaal (sephadex) wordt gekarakteriseerd door

een getal a: SephadexG-a.Dit getal geeft een

vergelijkings-mogeli jkheid v:oor de afscheidingsgrootte van de

macromoleku-len.

Wij hebben gekozen voor een sephadex G-200.Dit in een

kolom van pharmacia,zie figuur 20 • ('1.9) .De scheiding is

dan volgens Steers (11)ZO dat het overblijvende produkt

80% ~ -galactosidase en 33%. van de proteïnen bevat. Tevens

is het rendement voor RNA/DNA 33%.De eigenschappen van

de kolom zijn ge&~ven in tabel 19 .De uiteindelijke

zuiver-heden van de gel chromatografie na twee fasen extraktie en uitzouting staan in tabel/9

De totale elutietijd is zeven uur.Aangezien het monster-volume 10 liter is zijn er 7 kolommen nodig.Hierbij wordt nog één extra geplaatst.Er dient namelijk regelmatig met

KOH gespoeld te worden om verontreingingen te verwijderen.

5'i-•

•

•

•

•

•

•

•

/

-I

Tabel I,g : gel chromatografie kolom eigenschappen •

kolom bed hoogte bed volume monster volume lineaire vloeistof snelheid vloeisofstroom (cm)

(1)

(1)

(cm/hr) (l/hr) KS 370/15x4 KS 360/15x4 64 10 11.25 12.0 Deze kolom is afkomstig van pharmacia.

Tabel 19 :stroomgegevens en opbrengsten van de

zuiver-ing met f;e;L c~r~.!!!f3:to$rafie~

ingaande stroom (l/hr) bevattende (kg):

~-galactosidase

proteInen RNA

&

DNA

uitgaande stroom (l/hr) _{- _.}

_-

-na twee fasen 10 .0604 .0440 .011 2.5 na uitzouting

..

\ 10 .0712 .264

De levensduur van deze kolomvullingen is ongeveer ljaar •

-•

•

I

I

.

•

•

•

•

•

•

7;6 Het totale proces

Alle procesonderdelen achter elkaar geschakeld levert 'het

/7

~ele processchema op.Dit processchema is getekend voor de twee

hoofdprodukten,gelchromatografie na precipitatie en

affini-

~-~---~ teitschromatografie na extraktie.Hoe het schema er utt ziet

voor de andere produkten is eenvoudig omschakelen of aftappen.

Eet processchema is getekend in fig. '21 • Omschrjjving van

de stromen gebeurd in tabel '2.0 en van de apperaten in tabel 2' •

•

•

•

•

•

•

e

-

e

•

•

•

•

•

-60-Tabe12o: Omschrijving en enige gegevens van de in het processchema aangegeven apperatuur.

Vaten en rranken omschrijving flow(l/hr) volume opmerking ~loeist. ~oerder)

R.

l

V6 Vl O VII V12 V13 VIS V17 V20 ~.~21 V22 :]:23 T24

ko~tinue bakterie fermentatie opslag 90% mangaan sulfaat

opslarr 90% ammoniumsulfaat

opsla; 80% PZG

~~erslagvorming van :-mA

Uitzo~tin~ van -Galact osidase tWEe fase~ extraktie mixer

opslag 80% fosfaat buffer

fasenscheiding PbG-fosfaat oplossen enzym neerslag buffervat -opslag ·.05 M f osfaat opl. opslag .1 Mboraatoplossing Kol o ITLm en gelchromatografie 8x affiniteitschromatografie 10x Centrifuges 1114 T.a5 oogsten cellen afscheiding celrest+RHA winnen enzymneerslag

Koelers

H2 koeling bakterieen

H

5

koeling disruptiereflux Ul trafiltrat ie tU9 koncentratie voor chromo 1000· 5.1 105 32.4 185 275 260 45.6 260 100 10 3.0 11.1 1.4 1.4 1000 185 275 1000 320 100

I-17 snelle menging voor precipitatie

Homogenizator

H4 bevrijding van enzym 500

40 luchtdispersie 8.1 15.5 23 43.4 11.4 390 25 10 (bed) 65 1.8 oplossen stof oplossen stof oplossen stof langzaam ~eer langzaam dispersie oplossen stof oplossen produkt (levensduur) 1 jaar 1 week

spe c • -0 Pp..;... _->.( d.;...l;..:...· s_c_h--::a;-r ... g ... e-<}_

11 ~3 m~' nozzle 36-E3

m~

intermittant 24 E3 m 2 opp. m_

.9

.08 11 (koelstof ) Freon-R22

"

"

. mem br •. ...:o;..J:p:.J;p:::..:.=---:d::.:r::.,u:=k~ _ _ _ 1 m~ 7 bar mengtijd 15 s werkdruk 550 bar

•

•

Tabel '2.1 :Samenstelling van de stromen in het processchema

•

Nr. stroom samenstelling in kg opmerkingen

l/hr proteine HNA _{(j-Cfg) cellen(nat)}

1 320 4.$(1.8) 2.5(

.9)

175(44) ~O_ 37

o

e

medium:1015kg/m3 2 1000 (3.9) (2.0) (130) 28

•

3 1000 idem 5

oe

cellen ;1080

"

4 820 . ( .2) _{( .1) ( 7~ 1.4 afval} 5 180 _{.6 (3.1~ .3~1.6)} 27(96 22 6 500 5.4(4.9 2.8 2.5) 202{lLj.O ) 42 7 500 _7.5~2.3) 3.9(1.4) 274(68) 27.1 22

oe

8mPas 8 130 2.7 1.0) 1.4( .5) 98(25) 7.1 (produkt)

•

a _{5.1 3 • 6I'.~ mangaansulfaat} -' 10 105 90% armnoni umsulfaa t 11 32.4 80% PEG 12 45.6 80% fosfaat buffer vaste stof 13 185 2.7 ~ .8(.7) 98 3.1 ?J

=

2mPas • H-1 NnS 04

•

14 301 1.7 (" .. 8) .7 .. 2(96) ,96 35% amm.sulfaat 15 260 2.7 1.5 98 2.4 10%fosfaat~6.3% PEG 16 295 1.7 .7 2 .05 35% allm.sulfaat,afval 17 19 .2 .1(.7) 2 3.0 afval 18 6 (.7) (94) .91 slurrie,35% amm.sulf. 19 190 2.5 1.4 22 2.4 ll~ fosfaat, 4.6% PEG

•

20 67 .16 .03 76 8.7% fosfaat,lO% PEG 21 60 water 22 166 2.5 .7 96 .09 .UIl in NnS04 23 66 .• 7 94 .1 ~3%amm. sulf.

24 56 N'4~·~amm. sulf • afval

25 10 .7 94 .1 -amm.sulf. (produkt)

•

26 57

.02

fosfaat+PEG afval

27 10 .14 .03 76 -fosfaat of PEG(produkt)

28 10 .7 94 .1 1 kolom wordt om 7uur

deze stroom kan ook 31 zijn. gevuld

29 3. .05H fosfaat

30 11 .1 H boraat

•

31 10 .14 .03 76

dezestroom kan verwisseld worden met 28

32 7.5

.44

23

afval

33 2.5 .26 71 produkt

34

33.4

.12 .03 16 fosfaat+boraat afval

•

35 1.3 .02 .004 60 .o5N fosfaat produkt

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

8. Processtappen in de zuivering van intracellulaire enzymen

8.1. Enzym bevrijding

8.1.1. Inleiding

De meeste interressante enzymen worden in de cel,die ze

produceert,vastgehoude.Voor de winning van een enzym is het

dan ook nodig om de cel kapot te maken.De hiervoor te

gebruiken methodes zijn te verdelen in chemische - en

fysische bevrijding.

8.1.2. Chemische bevrijding

Vele manieren om een enzym chemisch te bevrijden zijn

mogelijk (1A_12)'lS'/3~_/i2.) .De belangrijkste zijn,het oplossen

van de celwanden met detergenten,het afbreken van de wand

met enzymen,het aantasten van de wand met loog en het

open-breken van, de cel dmv. osmotische schok.

De toepassingsmogelijkheden van deze methoden zijn

af-hankelijk van het soort cel en de sohaalgroo~te.Dierlijke cellen zijn goed kapot te maken,gisten redelijk maar op grote schaal alleen met loog.Bakteri~n en schimmels zijn op redelijke schaal al veel te kostbaar of moeilijk.

Bij het gebruik van detergenten bestaat het gevaar voor ina!ctivering van het enzym en problemen bij opzuivering

met twee fasen extraktie of precipitatie.Het gebruik van

enzymen op grote schaal is erg duur,zeker voor de stevigere

cellen als bakteri~n en schimmels.De behandeling van cellen

met \~ter(osmotische schok) is alleen effektief voor de zwakste cellen,en zorgt zelfs dan voor grote processtromen.

-64-De autolyse van gisten met loog ,.,ordt kommercieel toegepast(App.D)

(11 ).Door de benodigdelange procestijd (afhankelijk van pH

en temperatuur tot 24 uur) wordt veel gevraagd van de stabi

-li tei tvan het enzym tov. loog en interne afbraak. - _. H~t

bevrijden van ~-galactosidase uit E.Coli is niet goed moge-lijk met chemische bevrijding vanwege de stevige celwand,

-snelle interne afbraak en de schaalgrootte.

?

---8.1.3. Fysische bevrijding

Ook bij fysische bevrijding zlJn vele mogelijkheden (1.9,12,15,.3lf,41)

de belangrijkste zijn:het breken van de cel met schokgolven