Energieoverdracht van aangeslagen moleculen in waterige oplossing

VAN AANGESLAGEN MOLECULEN

IN WATERIGE OPLOSSING

VAN AANGESLAGEN MOLECULEN

IN WATERIGE OPLOSSING

PROEFSCHRIFT

TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE TECHNISCHE WETENSCHAPPEN AAN DE TECHNISCHE HOGESCHOOL TE DELFT OP GEZAG VAN DE RECTOR MAGNIFICUS IR. H. J. DE WIJS, HOOGLERAAR IN DE AFDELING DER MIJNBOUW-KUNDE, VOOR EEN COMMISSIE UIT DE SENAAT TE VERDEDIGEN OP WOENSDAG 26 MEI 1965

DES NAMIDDAGS TE 4 UUR

DOOR JENTJE POSTHUMA SCHEIKUNDIG INGENIEUR GEBOREN TE FOLSGARE

/ ^ ^ SJLSO

H o o f d s t u k \. Algemene inleiding 9

Lichtabsorptie en energieafgifte 9

1. Energieafgifte door straling 10 2. Energieafgifte in de vorm van warmte 13

3. Energieafgifte in de vorm van chemische

energie 14 4. Energieoverdracht aan andere moleculen 15

De triplettoe stand 17

1. Fosforescentie 17 2. F y s i s c h e achtergrond van de triplettoestand 20

3. Energieovergangen tussen singlet- en

triplet-niveaus 21 4. Experimentele bevestiging van de

triplet-toestand 23 5. Desactivering van de triplettoestand 26

6« Methoden voor de bestudering van de

triplet-toestand bij fotochemische r e a c t i e s 29

Fotochemie van rihoflavine 3 0

1. Chemische structuur en fysische eigenschappen 31

2. Fotochemische reacties 32 3. De betekenis van rihoflavine bij fotodynamische

reacties 37

Chemilumines centie 4 1

H o o f d s t u k 2. De fotochemische afbraak van pimaricine

gesen-sibiliseerd door riboflavine en lumichroom 43

1. Een radicaalmechanisme 45 2. Een oxydatie-reductiemechanisme 48

3. Directe energieoverdracht 49 H o o f d s t u k 3. Gesensibiliseerde isomerisatie van

stilbeen-derivaten en kaneelzuur 57 1. Door lumichroom gesensibiliseerde isomerisatie

3. Proeven met andere sensibilisatoren en

energieacceptoren 64 H o o f d s t u k 4. Metingen aan het lumichroom met behulp van de

ilitstechniek 68 1. Inleiding 68 2. Apparatuur en uitvoering van de proeven 70

Q. fotografische opstelling 70 b. foto-electrische opstelling 76 3. Resultaten en d i s c u s s i e 79 H o o f d s t u k 5. Fosforescentiemetingen 85 1. Inleiding 85 2. Experimenteel gedeelte 87 3. Resultaten en d i s c u s s i e 89 H o o f d s t u k 6. Algemeen experimenteel gedeelte 91

1. Lichtbronnen 91 2. F i l t e r s 93 3. Bestralingsopstelling 95

4. Fluorescentiemetingen 97 5. Ontgassing van de oplossingen 97

6. Chemicaliën 97 7. Bereidingsmethoden 97

Samenvatting 100 Summary 102

De literatuurverwijzing betreffende het artikel van

Tumerman c.s. bij stelling nr. III en IX en op pag, 105

(nr, 82) moet worden gelezen als:

L.A. Tximerman, Y.V, Morozov, Y.I. Naberukhin, Biofizika 6

(1961)

556.

Hoofdstuk 1

ALGEMENE INLEIDING

Lichtabsorptie en energieafgifte

Wanneer een molecuul wordt gebracht in een veld van electromag-n e t i s c h e stralielectromag-ng vaelectromag-n alle mogelijke golfleelectromag-ngteelectromag-n, daelectromag-n blijkt dat het slechts straling van zeer bepaalde golflengte kan absorberen. Dit is een gevolg van het feit dat een molecuul maar een beperkt aantal energietoestanden kan aannemen, afhankelijk van zijn electronencon-figuratie, vibratie- en rotatietoestand. Bij absorptie van electromag-netische straling gaat het molecuul over naar een hoger energieni-veau. Het beperkte aantal energieovergangen geeft aanleiding tot een voor het molecuul karakteristiek absorptiespectrum.

Volgens de kwantentheorie wordt de straling geabsorbeerd in zo-genaamde kwanten met een energie: 'E = hv=~f-, waarbij h = constante van Planck, v = Ae frekwentie van de straling, c = de lichtsnelheid en A = de golflengte van de straling. Absorptie kan s l e c h t s plaats vinden als de energie van een kwant gelijk is aan het verschil van twee energietoestanden van het molecuul. De aard van de overgangen ten-gevolge van de absorptie is afhankelijk van de golflengte en dus van de energie van de gebruikte straling. Het gebied van het electromagne-t i s c h e specelectromagne-trum daelectromagne-t van belang is voor onze beschouwingen in dielectromagne-t proefschrift ligt tussen de golflengten 200 m^i en 300 ii. Beginnende met straling van een lange golflengte zien we achtereenvolgens de volgende overgangen in het molecuul o p t r e d e n ' .

30 — 300>x — verre infrarood \

3 — 30ft — midden infrarood > rotatie- en vibratieovergangen 780 - 3000m^ - nabije infrarood j

380 - 780mpi - zichtbaar

200 - 380m/i - nabije ultraviolet

De energieën welke worden opgenomen bij de absorptie van zicht-baar en ultraviolet licht bedragen ongeveer 36 kcal (bij 800 m/i) tot

143kcal (bij 200 m^.) per grammolecuul, indien elk molecuul een kwant absorbeert. Voor vibratieveranderingen in het infrarood is energie nodig van '^ 5 kcal/mol en voor rotatieveranderingen in het verre infra-rood s l e c h t s een fractie van een k c a l / m o l . Vergelijken we deze ener-gieën. met de chemiscjie bindingsenergieën van de moleculen, dan

blijkt dat ze van dezelfde grootteorde zijn. Het is dan ook niet t e verwonderen dat ultraviolet en zichtbaar licht chemische reacties teweeg kunnen brengen.

Wat gebeurt er nu in een molecuul dat een foton van zichtbaar of ultraviolet licht heeft geabsorbeerd. In het aldus aangeslagen molecuul is een electron in een baan gebracht met een hogere energie. In het algemeen bestaat een dergelijke toestand maar zeer kort (± 10*^ s e c ) . Het molecuul zal zijn energie op de een of andere manier weer afgeven. Deze afgifte kan geschieden op verschillende manieren, namelijk in de vorm van:

1. straling (fluorescentie en fosforescentie) 2. warmte

3. chemische energie 4 . energieoverdracht

Deze processen concurreren met elkaar en het hangt van de structuur van het molecuul en van de omstandigheden af welke de belangrijkste zijn. De desactiveringsmogelijkheden van het aangeslagen molecuul kunnen het best worden beschreven aan de hand van de potentiaal-curve van een tweeatomig molecuul. Voor meeratomige moleculen is een meerdimensionaal diagram nodig, maar het principe i s hetzelfde. 1. Energieafgifte door straling

a. F l u o r e s c e n t i e

F i g . 1 toont de potentiaalcurve van een willekeurig tweeatomig molecuul. Hierin is de potentiële energie (E) van het molecuul uitge-zet tegen de afstand (R) tussen de beide atoomkernen, waarbij een van de atomen als gefixeerd is gedacht op de verticale as.

Curve A stelt de grondtoestand voor terwijl curve A* geldt voor de aangeslagen toestand. Tengevolge van de vibraties van de atomen ten opzichte van elkaar kan het molecuul op beide krommen verschillende energieniveaus innemen ( 1 , 2, 3, 4, e t c ) . Als het molecuul b.v. vi-breert op het niveau 2 van kromme A don betekent dit dat de atoom-kernen een trilling uitvoeren om de evenwichtstoestand B, waarbij de potentiële energie varieert langs de lijn CBD. Bij kamertemperatuur bevinden de meeste moleculen zich op het onderste vibratieniveau O (nulpuntsenergie), zodat voornamelijk uit dit niveau de electronische excitatie door licht kan plaats vinden.

Als een molecuul wordt aangeslagen, kan men volgens het Franck-Condon-principe"^ de overgang aangeven met een verticale pijl, zodat de potentiële energie direct na de excitatie wordt weergegeven door het punt F . Het Franck-Condonprincipe zegt namelijk dat de atoomkernen tijdens de overgang praktisch niet van plaats veranderen. De benodigde tijd voor een vibratie is ongeveer 10"'^ s e c , terwijl een electronische overgang maar 10" s e c . duurt.

Daar de minima voor A en A* in de regel niet recht boven elkaar liggen, komt het molecuul bij excitatie meestal terecht op een hoger vibratieniveau (in fig. 1 niveau 2). Vanuit dit niveau vindt praktisch altijd een zeer snelle warmteafgifte plaats door botsingen met het oplosmiddel ("vibrational relaxation"). Binnen circa 10"' ' s e c . wordt ge-woonlijk het onderste vibratieniveau van de aangeslagen toestand be-reikt. Wanneer het molecuul vervolgens niet op andere wijze wordt gedesactiveerd, geeft het na 10"^— 10"^ s e c . de electronische energie af in de vorm van fluorescentielicht. Omdat voor de fluorescentie eveneens het Franck-Condonprincipe geldt i s deze ook aan te geven met een verticale pijl. De lengte van de pijl is echter kleiner dan die bij de absorptie, hetgeen betekent dat een kleiner kwant wórdt afge-geven dan werd geabsorbeerd. De golflengte van het fluorescentie-licht is dus doorgaans langer dan die van het geabsorbeerde fluorescentie-licht (Regel van Stokes).

Indien het Franck-Condonprincipe volkomen exact zou gelden, moesten beide spectra bestaan uit nauwe banden. Er treden echter ook zogenaamde niet-verticale overgangen op, zodat ook een aantal naburige vibratietoestanden wordt aangeslagen, echter met een kleine-re waarschijnlijkheid. Om dezelfde kleine-reden bestaat ook het fluokleine-rescen- fluorescen-tiespectrum uit een aantal banden. De maximumintensiteit vinden we echter altijd bij de golflengte overeenkomend met genoemde " v e r t i -c a l e " overgang. Fig. 2 illustreert het tot stand komen van absorptie-en fluoreseabsorptie-entiespectrum.

obsorptit fluorascntic

F i g . 2. Het ontstaan van absorptie- en fluorescentiespectrum (naar REID ).

Bij A zijn de vibratieniveaus van de grondtoestand, bij A* die van de aangeslagen toestand aangegeven. Bovenaan in de figuur is de inten-s i t e i t van de inten-spectra uitgezet tegen de golflengte (A) van de overgan-gen. De betreffende overgangen zijn door pijlen loodrecht onder de maxima aangeduid. Absorptie- en fluorescentiespectrum zijn dikwijls bij benadering eikaars spiegelbeeld. Bovendien treedt bij de golf-lengte van de O-O-overgang — d.i. de overgang van het onderste vibra-tieniveau van de grondtoestand naar het onderste niveau van de aan-geslagen toestand en omgekeerd — vaak een overlapping van de spec-tra op.

Een belangrijke grootheid bij fluorescentieprocessen is tenslotte de kwantenopbrengst ( $ ) . Dit i s het aantal als fluorescentie uitge-zonden kwanten per geabsorbeerd kwant. Als het molecuul niet door andere concurrerende processen werd gedesactiveerd zou $ de waarde 1 moeten hebben. In de praktijk is fluorescentie een zeldzaam ver-schijnsel terwijl bovendien s l e c h t s in enkele gevallen een hoge O i s waargenomen. Als voorbeeld van een stof met $ = 1 kan rubreen in hexaan worden genoemd^.

b. F o s f o r e s c e n t i e

Deze tweede mogelijkheid van energieafgifte in de vorm van licht verschilt van de fluorescentie in verschillende opzichten. Een zeer globaal onderscheid wordt door F Ö R S T E R ® gemaakt. Hij noemt alle emissie welke binnen 10"'* s e c . na de excitatie is verdwenen fluores-centie; langer durende uitzending van licht wordt door hem als fosfor-e s c fosfor-e n t i fosfor-e aangfosfor-eduid. PERRIN nfosfor-efosfor-emt dfosfor-e tfosfor-empfosfor-eratuurafhankfosfor-elijkhfosfor-eid als maat. De meest bruikbare en algemeen aanvaarde definitie, s p e c i -aal voor de luminescentie van organische verbindingen in oplossing, komt van L E W I S en K A S H A ^ , die onderscheid maken op b a s i s van het mechanisme van de e m i s s i e . Dit mechanisme zal bij de behandeling van triplettoestanden in moleculen nader worden besproken.

2. Energieafgifte in de vorm van warmte (stralingsloze overgang) In vele gevallen wordt een molecuul, hoewel dit het vermogen tot fluorescentie bezit, van zijn excitatieënergie beroofd voor het tot fluorescentie kan komen. Een van de belangrijkste oorzaken hiervan is de zogenaamde " i n t e r n a l c o n v e r s i o n " . Deze stralingsloze terugkeer naar de grondtoestand is het gevolg van het feit dat de potentiaal-curven van grond- en aangeslagen toestand (bij meeratomige moleculen de potentiaaloppervlakken) elkaar snijden of raken. Fig. 3 illustreert een dergelijke overgang.

• R

F i g . 3. Potentiaalcurven voor een tweeatomig molecuul bij " i n t e r n a l c o n v e r s i o n " .

Het geêxciteerde molecuul valt in e e r s t e instantie trapsgewijs terug tot de lagere vibratieniveaus. Op het moment dat de hoogte van het

snijpunt S is bereikt, kan het molecuul zonder energieverlies overgaan op de curve van de grondtoestand, zodat de electronische energie wordt omgezet in vibratie energie van de grondtoestand. Tenslotte volgt weer trapsgewijs stralingsloze overgang naar het onderste vibratieniveau. Voorbeelden van moleculen met een efficiënte " i n t e r -nal c o n v e r s i o n " zijn nitroverbindingen en p-hydroxybenzofenon^. De " i n t e r n a l c o n v e r s i o n " kan soms ook worden geïnduceerd door moleculen van het oplosmiddel, die tijdens botsingen de potentiaal-curve van het opgeloste molecuul kunnen veranderen. In dat geval varieert b.v. de fluorescentieopbrengst met het oplosmiddel. Tenslotte vindt dè desactivering van hogere aangeslagen toestanden tot de laagste aangeslagen toestand vrijwel uitsluitend plaats via het me-chanisme van de "internal c o n v e r s i o n " . Dit is een gevolg van het feit dat de betreffende potentiaalcurven onderling op kleinere afstand van elkaar liggen en de kans dat ze elkaar snijden dus groter is dan bij de l a a g s t e aangeslagen toestand en de grondtoestand. Tot nu toe zijn s l e c h t s zeer weinig uitzonderingen op bovengenoemde regel bekend. Van azuleen is beschreven dat fluorescentie plaats vindt vanuit een hogere aangeslagen toestand ' ° .

3. Energieafgifte in de vorm van chemische energie

In sommige gevallen kan de absorptie van een lichtkwant leiden tot een chemische verandering in het molecuul b.v. d i s s o c i a t i e . Dis-s o c i a t i e iDis-s mogelijk alDis-s de opgenomen energie zo groot i Dis-s dat het aangeslagen molecuul met zijn potentiële energie hoger komt dan het horizontale stuk in de potentiaalcurve A, (fig. 4)

A :

• n

Het verschijnsel zal dus kunnen optreden bij bestraling met licht uit het kortgolvige deel van het spectrum. Ook wanneer de potentiaal-curve geen minimum bezit, zoals potentiaal-curve A,, geeft lichtabsorptie aan-leiding tot d i s s o c i a t i e . Bij d i s s o c i a t i e verdwijnt de vibratiestructuur uit het spectrum, omdat de energie boven de dissociatieênergie niet meer g.ekwantiseerd i s . In de meeste gevallen wordt in de chromofore groep, d.i. de groep in het molecuul welke het licht absorbeert, bij d i s s o c i a t i e een binding verbroken. Soms echter verplaatst de excita-tieënergie zich naar een andere binding zoals in aceton, waar de carbonylgroep het licht absorbeert, maar de C-C-binding wordt ver-broken. Een geval waarbij hetzelfde verschijnsel plaats vindt in een biologisch belangrijke stof is beschreven door B Ü C H E R en K A S P E R S ' ' . Deze onderzoekers bestudeerden de reeds lang bekende reactie van de afsplitsing van koolmonoxyde uit het myoglobine-CO-complex onder invloed van licht. Daarbij bleek, dat licht geabsorbeerd door het eiwitgedeelte, leidt tot koolmonoxydeafsplitsing in de haeminegroep met een kwantenopbrengst 1.

4. Energieoverdracht aan andere moleculen

Als een aangeslagen molecuul botst met een ander molecuul voor-dat de hiervoor genoemde intramoleculaire desactiveringen hebben kunnen optreden, dan bestaat de mogelijkheid tot energieoverdracht. We kennen twee soorten energieoverdracht, a) de fysische en b) de chemische.

a. Bij de fysische overdracht wordt de energie van het aangeslagen molecuul — in dit geval donormolecuul genoemd — overgedragen aan het tweede molecuul, het acceptormolecuul. Het aangeslagen mole-cuul keert daarbij terug naar de grondtoestand en tegelijkertijd wordt de acceptor in de aangeslagen toestand gebracht. Dit l a a t s t e molecuul is daarna natuurlijk onderhevig aan alle reeds genoemde d e s a c t i -veringsprocessen zoals fluorescentie, fosforescentie, stralingsloze desactivering en chemische verandering. De hier genoemde fysische overdracht van electronische energie in oplossing is weer te verde-len in twee typen, te weten de overdracht via de inductieve resonan-t i e ^ ' ' ^ ("long range dipole-dipole resonan-transfer", " r e s o n a n c e resonan-transfer") en die via " c h a r g e transfer". Eventuele complexvorming terwijl beide moleculen nog in de grondtoestand verkeren zal buiten beschouwing worden gelaten, daar in dat geval het complex absorbeert zodat dan meer sprake is van een intramoleculair proces. De inductieve reso-nantie is slechts waarschijnlijk a l s het fluorescentiespectrum van de donor (hier de lichtabsorberende stof) het absorptiespectrum van de

acceptor voldoende overlapt en de gemiddelde afstand van de mole-culen kleiner is dan 50-100 A. Botsing i s niet noodzakelijk, behalve bij overdracht door tripletmoleculen (zie pag. 27) De kwantenop-brengst van de overdracht is omgekeerd evenredig met de zesde macht van de afstand tussen de moleculen, zodat de concentratie van de deelnemende stoffen voldoende hoog moet zijn. Bij een oplossing die circa 3,5 x 10"^ M aan acriflavine en rhodamine B i s , wordt het licht dat geabsorbeerd werd door de eerste stof, door de laatstgenoemde verbinding als fluorescentie weer uitgezonden met het voor rhodamine B karakteristieke fluoreseentiespectrum^. Uiteraard kan dit soort overdracht ook plaats vinden bij gelijke moleculen, hetgeen mede de oorzaak i s van de zogenaamde " s e l f q u e n c h i n g " in geconcentreerde oplossingen van kleurstoffen. Het proces van de inductieve resonantie is vaak moeilijk te onderscheiden van dat van de absorptie en reab-sorptie. In het l a a t s t e geval wordt in tegenstelling tot de stralings-loze overdracht bij de inductieve resonantie, het geabsorbeerde kwant eerst uitgezonden als fluorescentie en vervolgens door een tweede molecuul weer geabsorbeerd. Voor een overzicht over het mechanisme van de inductieve resonantie en de mogelijkheden om het te onder-scheiden van andere vormen van energieoverdracht kan worden

verwe-zen naar een artikel van F Ö R S T E R .

Een geheel ander type energieoverdracht is de overdracht via een " c h a r g e transfer" ("electron transfer") in de aangeslagen toestand. Volgens BOWEN^ gaat bij dit proces een electron over van het aan-geslagen molecuul naar het tweede molecuul of omgekeerd. Welke richting het electron kiest is afhankelijk van de redoxpotentialen van de aangeslagen moleculen. Vervolgens keert het electron weer terug naar het oorspronkelijke molecuul, waarbij de energie wordt afgegeven aan het oplosmiddel of aan de energieacceptor. De over-dracht zou voorkomen bij de quenching van de fluorescentie van sommige organische moleculen als uranine, kinine en rhodamine door de electronendonors J ' , Br' en CNS'. (Onder quenching wordt verstaan het verminderen van de kwantenopbrengst van een emissie of foto-chemische reactie door een concurrerend proces; een stof, die quen-ching veroorzaakt wordt quencher genoemd.) "Charge transfer" in de andere richting zou optreden bij de fluorescentiequenching door elec-tronenacceptoren zoals J O ' , NO' en S^O" bij andere moleculen

1 \ 1 T 4 0

(anthranilzuur, «-naftol) ^,

b. Onder chemische energieoverdracht kunnen we verstaan het over-dragen van excitatieënergie door een chemische reactie met een tweede molecuul. Dit kan zijn een molecuul van het oplosmiddel, van een andere opgeloste stof of van de verbinding zelf. Voorbeelden van

dit soort reactie zijn: oxydatie-reductie r e a c t i e s , dimerisaties, poly-merisaties, reacties met zuurstof e t c

De triplettoestand

1. Fosforescentie

De eerste waarnemingen betreffende de zogenaamde triplettoe-stand, zonder dat men deze als zodanig herkende, werden gedaan door middel van experimenten over fosforescentie. Behalve de reeds ge-noemde fluorescentie bezitten vele aangeslagen organische moleculen namelijk het vermogen tot een tweede emissie, de fosforescentie. Deze e m i s s i e onderscheidt zich o.a. van de fluorescentie dooï een langere levensduur^ (> 10"^ s e c ) , welke zich uit in de vorm van nalichten van de bestraalde oplossing.

Het verschijnsel werd voor het e e r s t waargenomen in 1888 door

W I E D E M A N N ' ^ ' ' ^ . Voor de waarneming waren echter speciale voor-zorgsmaatregelen noodzakelijk. Het bleek namelijk dat de beweging der moleculen moest worden geremd, want het verschijnsel trad naar voren als het medium star werd gemaakt, terwijl vaak lage tempera-turen (-80 tot -180°C) nodig waren. Om een star medium te krijgen werden verschillende technieken toegepast. W I E D E M A N N l o s t e de stoffen op in een gelatineoplossing, welke hij vervolgens droogde. TIEDE was de eerste die een oplossing maakte in gesmolten boor-zuur. Bij afkoeling stolde een dergelijke smelt tot een doorzichtig g l a s . In plaats van boorzuur kan ook suiker worden genomen . Soms i s gebruik gemaakt van glycerol ,mengsels van glycerol en water , propyleenglycol en water^°, of van aether, isopentaan en alcohol°.

K A U T S K Y en HIRSCH^''^^ lieten de kleurstof absorberen aan s i l i -cagel, papier of aluminiumoxyde om zodoende de moleculen tegen botsingen te beschermen. Een zeer recente ontwikkeling op het gebied van de starre media is de toepassing van polymethylmethacrylaat^'^'^^ en polyvinylalcohol^^.

Hoewel in de meeste gevallen èn het medium star moest zijn èn de temperatuur laag, slaagde B O U D I N ^ ^ erin bij eosine in glycerol ook bij kamertemperatuur een zwakke emissie, zij het met een be-trekkelijk korte levensduur, aan te tonen. Later vonden KAUTSKY C S . bij diverse kleurstoffen een nalichten in niet visceuze oplos-middelen (aceton, water, isopropylalcohol). Nauwkeuriger metingen van fosforescentiespectra in aethanol bij 20°C zijn pas in de l a a t s t e jaren gedaan door BACKSTRÖM c s . ^ ^ en P A R K E R ^ ^ aan respectieve-lijk diacetyl en eosine en proflavine. Behalve in de glasachtige

media bleek het altijd noodzakelijk de zuurstof uit de oplossing te verwijderen, omdat deze de fosforescentie dooft (quenching door zuurstof).

Over het mechanisme van de fosforescentie van organische mole-culen is reeds in 1935 een theorie opgesteld door J A B L O N S K I - " ^ ' ^ ' .

Deze onderzoeker nam aan dat de fosforescerende moleculen een metastabiele toestand bezitten met een betrekkelijk lange levensduur en een lagere energie dan de normale, bij het absorptiemaximum be-horende aangeslagen toestand. De fosforescentie zou dan uit deze metastabiele toestand plaats vinden, J A B L O N S K I stelde een schema op dat in fig. 5 is weergegeven. Volgens dit schema kan een molecuul

(s, absorptie { S n ) N " ^ fluorescentie en a-fosforescentie • M ( T , ) P-f osforescentie F i g . 5 . J a b l o n s k i - d l a g r a m .

dat aangeslagen is tot het niveau F (fluorescerende toestand) twee dingen doen. Het kan na ongeveer l O ' ^ s e c . terugkeren naar de grond-toestand N (normale grond-toestand), het lichtkwant wordt dan uitgezonden a l s fluorescentie, of het kan overgaan in een metastabiele toestand M. Na enige tijd keert het molecuul hieruit eveneens terug naar de grondtoestand. Het licht dat dan wordt uitgezonden is van een langere golflengte en heeft een gemiddelde levensduur langer dan circa 10"* s e c . Men heeft het ^-fosforescentie genoemd. Naast deze twee emis-sieprocessen bestaat namelijk nog een derde, de a-fosforescentie of vertraagde fluorescentie ("delayed fluorescence"). Deze berust op het volgende mechanisme. Bevindt een molecuul zich inde metastabiele toestand, dan kan het daaruit door opneming van thermische energie weer teruggaan naar F, omdat vrijwel altijd het energieverschil t u s s e n

M en F maar klein i s . Vervolgens kan het dan weer terugkeren naar de grondtoestand onder uitzending van fluorescentielicht van dezelfde golflengte als de normale fluorescentie, maar het is duidelijk dat er een vergrote levensduur wordt geconstateerd. Deze levensduur is af-hankelijk van de tijd dat het molecuul in de metastabiele toestand heeft verkeerd. Op grond van het bovenstaande is het begrijpelijk dat de a-fosforescentie temperatuurafhankelijk is, daar immers de verhou-ding tussen het aantal moleculen in de n i v e a u s F en M wordt bepaald door een Bolzmann-verdeling^^. De daarbij behorende activerings-energie komt volgens L E W I S , L I P K I N en M A G E L ' ^ ^ bij fluoresceihe in boorzuurglas goed overeen met het verschil in energie tussen de beide niveaus als dit wordt berekend uit het verschil in golflengte van de a- en /S -fosforescentie (8 kcal/mol).

Resumerend vinden we dus drie stralingsprocessen bij organische moleculen in oplossing:

1°. fluorescentie, korte levensduur.

2 . a-fosforescentie of vertraagde fluorescentie, temperatuurafhanke-lijk, hetzelfde spectrum als de fluorescentie, lange levensduur. 3 ° . /3-fosforescentie, niet temperatuurafhankelijk bij lage temperatuur,

langere golflengte dan de fluorescentie, lange levensduur.

Een enkele maal vindt men in de literatuur een andere terminologie voor de fosforescentieprocessen. Zo noemt P R I N G S H E I M ^ het onder 2 genoemde proces fosforescentie en de /S-fosforescentie " s l o w f l u o r e s c e n c e " . De oorzaak van deze tegenstrijdigheid ligt in defi-n i t i e . PRINGSHEIM defi-noemt defi-namelijk alleedefi-n de temperatuurafhadefi-nkelijke e m i s s i e fosforescentie.

Na de aanname van een metastabiele toestand bij de fosforescen-tie i s men deze verder gaan onderzoeken. Een van de eerste beves-tigingen van het bestaan ervan werd verkregen door LEWIS, LIPKIN en MAGEL"'^ in 1941. Zij wisten door sterke belichting meer dan 80% van de fluorescei'ne in boorzuurglas in een dergelijke toestand te brengen en vervolgens het absorptiespectrum te meten. Dit spectrum, dat is weergegeven in fig. 6 was, ten opzichte van het oorspronkelijke spectrum, duidelijk naar langere golflengte verschoven. Het oor-spronkelijke spectrum keerde na uitschakelen van de lichtbron volle-dig terug.

In 1944 konden LEWIS en KASHA^ het zeer aannemelijk maken dat de metastabiele "phosphorescent s t a t e " identiek moest zijn met de zogenaamde " t r i p l e t s t a t e " . In de volgende paragraaf zal daarom iets nader worden ingegaan op de fysische achtergrond van deze triplettoestand.

6 x 1 0 " *

normol» spectrum

\ spectrum bij belichting

•• \ 1

o l -^i> , , . «00 500 f 00 700 «00

golflengte ( m u )

F i g . 6. Absorptiespectrum van de normale en de metastabiele toestand van 33 fluorescelne in boorzuurglas (naar LEWIS, LIPKIN en MAGEL ).

2. Fysische achtergrond van de triplettoestand

Een electron in een molecuul bezit tengevolge van de draaiing om zijn as een magnetisch impulsmoment. Bij de meeste organische moleculen in de grondtoestand is van dit spinimpulsmoment niets te merken omdat elk electron in zijn baan gepaard i s met een tweede waarvan de spin tegengesteld is aan die van het e e r s t e . Het totale spinimpulsmoment i s - d u s nul. Deze toestand van het molecuul wordt singlet- of singulettoestand (S) genoemd, daar het spectroscopisch bezien leidt tot een enkelvoudig niveau, dat niet wordt beïnvloed door een uitwendig magnetisch veld (diamagnetisch molecuul). Wordt een dergelijk molecuul aangeslagen dan gaat een electron naar een baan met een hogere energie, waardoor een situatie ontstaat met twee

on-gepaarde electronen.

We kunnen nu twee gevallen onderscheiden.

a. De spin van het electron is gelijk gebleven, dus tegengesteld aan die van het achtergebleven electron, zodat ook de aangeslagen toe-stand een singlet i s . Deze singlet-singlet — of S-S -overgangen hebben een grote waarschijnlijkheid, verlopen dus gemakkelijk; dit resul-teert in een hoge extinctiecoëfficiënt I (e = 10^ - 10^) en een korte levensduur (10"^ - 10"^ s e c ) .

b. De spin van het electron kan tijdens de overgang ook omkeren, zodat deze parallel wordt aan die van de oorspronkelijke partner in de grondtoestand. Het gevolg is dus een molecuul met twee ongepaarde electronen dat nu echter wel een magnetisch spinimpulsmoment heeft.

Het is daardoor paramagnetisch. Dit aangeslagen molecuul heeft drie verschillende oriêntatiemogelijkheden in een uitwendig magnetisch veld. Hierbij horen drie onderling zeer weinig verschillende energie-niveaus, die bij spectroscopische metingen met ultraviolet of zicht-baar licht als één niveau kunnen worden beschouwd. Naar aanleiding van deze opsplitsing heeft deze toestand de naam triplettoestand (T) gekregen. De rechtstreekse overgang van de grondtoestand naar de triplettoestand vereist dus een spinomkering. Deze i s echter kwanten-mechanisch verboden volgens de zogenaamde " s p i n conservation r u l e " , d.w.z. zij vindt met een zeer geringe waarschijnlijkheid p l a a t s . Absorptiebanden tengevolge van deze overgangen zijn in de meeste spectra dan ook niet te vinden. Slechts wanneer het molecuul zware atomen bevat zoals Br en J, treedt door spin-baankoppeling (d.i. koppe-ling tussen het magnetisch moment tengevolge van de spin van het electron en het moment tengevolge van de baanbeweging van het electron) enige absorptie op, maar ook dan nog met een zeer lage extinctiecoëfficiënt [e = 0.01—0,1). Andere factoren die de spin-baan-koppeling bevorderen zijn paramagnetische stoffen en sterke magne-tische velden.

Niettemin is gebleken dat vele organische moleculen zonder zware atomen na absorptie toch voor een niet gering deel kunnen overgaan in de triplettoestand en wel op precies dezelfde wijze als door JABLONSKI was beschreven voor de metastabiele toestand. In het Jablonski-diagram zijn daarom de letters van de singlet- en triplet-toestanden reeds aangegeven (fig. 5). Behalve door de letters S en T worden singlet- en triplettoestand van een stof A ook wel aangegeven als respectievelijk ' A en ^A.

Welke processen als gevolg van de aanname van de triplettoestand in een molecuul kunnen optreden, zal in het nu volgende worden samengevat aan de hand van fig. 7.

3. Energieovergangen tussen singlet- en tripletniveaus

Van de absorptieprocessen zijn de singlet-singletovergangen, dus SQ—S , S. —S etc. verreweg de belangrijkste omdat het toegestane overgangen zijn. De overeenkomstige singlet-tripletabsorpties (S.—T , SQ—T etc.) zijn door hun verboden karakter meestal te verwaarlozen (onderbroken pijlen).

De desactiveringsprocessen in het aangeslagen molecuul kunnen zowel onder uitzending van licht als stralingsloos verlopen. Bij ex-citatie tot een hoger energieniveau vindt altijd eerst snel stralings-loze terugval plaats tot de laagste vibratietoestand van het onderste

aangeslagen niveau. (Voor de enige uitzondering op deze regel: zie lit. 9,10) Dit is dus S voor de singlet- en T, voor de tripletniveaus. Vanuit deze toestand concurreren stralings- en stralingsloze proces-sen met elkaar.

S;(2'singl«0

Fig. 7. Electronische overgangen in een molecuul tussen singlet- en triplet-niveaus. De rechte pijlen stellen stralingsovergangen voor, de ge-kronkelde stralingsloze overgangen. In de rechthoeken geven de pijl-tjes de spinrichting van de betrokken electronen aan. Voor de over-zichtelijkheid is van elk energieniveau s l e c h t s één vibratieniveau aangegeven.

In de e e r s t e p l a a t s vinden we de fluorescentie (S,—S.), met daar-n a a s t de overeedaar-nkomstige stralidaar-ngsloze "idaar-nterdaar-nal c o daar-n v e r s i o daar-n " (ge-kronkelde pijlen). Het tweede proces dat concurreert met de fluores-centie is de stralingsloze overgang naar de triplet (S,—T,). Op het eerste gezicht zou men verwachten dat dit door de noodzakelijke spinomkering veel langzamer verloopt dan het fluorescentieproces. Deze S-T-overgang i s echter een stralingsloos proces, dat een gevolg is van de kruising van potentiaalcurven, zoals bij de " i n t e r a l con-v e r s i o n " , maar nu tussen S en T in p l a a t s con-van tussen twee s i n g l e t s . KASHA^.^ noemt het bedoelde proces "intersystem c r o s s i n g " (fig. 8). Het zou zonder spinomkering 1 0 " ' ' — 1 0 " ' ^ s e c duren, maar door de verboden spinomkering wordt het circa 10''— 10 maal langer. Daar-mee heeft het ongeveer dezelfde waarschijnlijkheid gekregen als het

fluorescentieproces. Dit blijkt b.v. uit het feit dat een stof als ben-zofenon bij 77°K in een star milieu fosforesceert met een kwantenop-brengst van 0.6^^. Bevindt een molecuul zich in de laagste triplet, dan kan het dus gaan fosforesceren (T.—S ) of eventueel stralings-loos desactiveren. De hiervoor benodigde spinomkering leidt tot de ' l a n g e levensduur van de triplet. Door de opneming van kinetische energie kan het molecuul ook weer terugkeren naar de eerste singlet (T,—S.) en vervolgens dus vertraagde fluorescentie geven. Een spe-ciale vorm van vertraagde fluorescentie zal elders worden beschreven. Welke .manier om terug te keren naar de grondtoestand het molecuul kiest, hangt o.a. af van de structuur van het molecuul, de temperatuur en de viscositeit van de oplossing.

> R

F i g . 8 Potentiaalcurven voor een tweeatomig molecuul bij "intersystem C r o s s i n g " .

Tenslotte bestaat er onder bepaalde omstandigheden, die de triplet behoeden voor desactivering, of onder invloed van hoge lichtintensi-teiten (flitsfotolyse), een mogelijkheid tot ophoping van moleculen in de triplettoestand. In dat geval kunnen ook de toegepaste triplet-tripletabsorpties (T,—T , T,—T e t c ) , welke evenals de S-S-absorp-tie hoge extincS-S-absorp-tiecoëfficiënten bezitten, belangrijk worden.

4. Experimentele bevestiging van de triplettoestand

Na de verschijning van de publicatie van LEWIS en KASHA , waar-in zij de fosforescentie van organische moleculen waar-in oplosswaar-ing

be-schreven als een emissie uit de l a a g s t e triplettoestand, zijn vele ex-perimentele aanwijzingen gevonden die deze theorie bevestigen, zo-dat zij tegenwoordig algemeen wordt aanvaard. Enkele van de belang-rijkste feiten zullen hier worden vermeld.

a. P a r a m a g n e t i s m e v a n d e t r i p l e t t o e s t a n d

De verwachte paramagnetische eigenschappen van moleculen in de triplettoestand zijn het e e r s t aangetoond door LEWIS en CALVIN^^ in 1945. Zij wisten met behulp van een hoge drukkwiklamp meer dan 85% van de in boorzuur opgeloste fluoresceinemoleculen in de triplet te brengen en met een Theorellbalans de magnetische susceptibiliteit te meten. In het donker verdween het paramagnetisme weer. Tien jaar later is door E V A N S ^ ^ ook paramagnetisme gevonden bij andere or-ganische moleculen. Zo bleek b.v. bij trifenyleen (9,10 - benzfe-nanthreen) dat de curve van de fosforescentieafneming precies samen-viel met die van het fotomagnetisme. Tenslotte is het paramagnetische karaktervan de triplettoestand eveneens bevestigd door HUTCHINSON

en MAGNUM^^ met behulp van electronenspinresonantie.

b. L e v e n s d u u r v a n d e f o s f o r e s c e n t i e e n s i n g l e t - t r i p l e t-a b s o r p t i e

De rechtstreekse terugkeer van de moleculen uit de triplettoestand is een monomoleculair proces, zodat de intensiteit van de fosfor-escentie met de tijd afneemt volgens:

- t / r

I = L e , waarbij I de intensiteit is op het tijdstip t, I de intensiteit op het moment dat men de exciterende lichtbron uitschakelt en r de gemiddelde levensduur. Dit l a a t s t e is de tijd die nodig is om de intensiteit tot l / e maal de oorspronkelijke waarde te laten afnemen. De meting van de levensduur geschiedt met een fosforescoop waarvan de werking in hoofdstuk 5 zal worden uiteengezet. Als met de fos-forescoop een exponentieel verval wordt gemeten i s dit op zichzelf al een belangrijke aanwijzing dat men met een triplet heeft te doen. De levensduur hangt echter ook samen met de S-T-absorptie omdat daarbij dezelfde spinomkering plaats vindt. Deze samenhang komt (ruwweg) hierop neer dat de geïntegreerde S-T-absorptie fedv omge-keerd evenredig is met de levensduur van de fosforescentie (zie voor de volledige formule: ^). Kwantitatieve berekeningen gaan alleen op als de ingestraalde energie geheel als straling wordt afgegeven.

Berekeningen hierover zijn uitgevoerd door LEWIS en KASHA en Mc CLURE^°. De l a a t s t e vond bij verschillende aromatische ver-bindingen een redelijke overeenkomst tussen de experimenteel be-paalde fosforescentielevensduur en die berekend uit de geïntegreerde

S-T-absorptie. Het meten van dergelijke S-T-absorptiebanden is vaak niet eenvoudig vanwege de lage molaire extincties (f = 0,1—0,01). Men moet zeer zuivere stoffen, geconcentreerde oplossingen en lange cuvetlengten gebruiken. Mc CLURE vond eveneens dat bij moleculen met zware atomen als substituent, zoals fluor-, chloor-, broom- en joodnaftaleen, de levensduur van de fosforescentie afnam in de richting F, Cl, Br, J en dat de S-T-absorptie hiermee evenredig toe-nam. Later zijn veel meer van dergelijke voorbeelden gevonden, waar-van de S-T-absorptie waar-van dijoodtyrosine'' wordt genoemd omdat deze biochemisch belang zou kunnen hebben.

Vaak is het niet nodig dat de zware atomen zich in het molecuul zelf bevinden. KASHA**^ toonde aan dat bij a - chloornaftaleen na toevoegen van aethyljodide (1:2) een singlet-tripletabsorptie optreedt bij langere golflengte dan het S_—S,-maximum. Dit was zelfs met het oog waar te nemen, want bij menging werd het mengsel van de beide ongekleurde vloeistoffen geel. Ook bromoforra is wel als oplosmiddel gebruikt om S-T-absorpties te meten ^^, Zoals reeds is opgemerkt wordt de invloed van zware atomen op de spinomkering toegeschreven aan een vergroting van de spin-baankoppeling'^^.

Een andere manier om de spinomkering te versnellen is het toe-voegen van paramagnetische stoffen. Zo werd door EVANS'''' het S-T-absorptiespectrum van benzeen gemeten onder een O - of NO-druk tot 100 atmosfeer. Beide g a s s e n zijn namelijk paramagnetisch in de grondtoestand (0_ wegens een tripletconfiguratie in de grondtoestand). Ook de paramagnetische metaalionen Cu"'"'", Ni"'""'", Co"'""'", Cr"'"'*'"'", Fe"*""*" en Mn"*""*" vergemakkelijken de S-T-overgangen''^''^^. Bij een aantal aminozuren is het S-T-spectrum, geïnduceerd door zuurstof, opgenomen door S L I F K I N ' * ' ' .

Tot nu toe i s het s l e c h t s WILKINSON en S M I T H ' ' ^ gelukt met behulp van een intensieve flits stoffen zonder zware atomen recht-s t r e e k recht-s voor een aantoonbaar gedeelte in de triplet te brengen. c T r i p l e t - t r i p l e t a b s o r p t i e

Een belangrijke mogelijkheid voor het aantonen van triplettoe-standen geeft het reeds genoemde triplet-tripletabsorptiespectrum. De eersten die een dergelijk spectrum wisten op te nemen waren LEWIS, LIPKIN en MAGEL (fig. 6, pag 2 0 ) . Zij voerden de metingen nog uit in het glasachtige boorzuur. Later zijn vele experimenten ge-daan met de zogenaamde flits-fotolyse waarbij met een zeer inten-sieve lichtflits zoveel moleculen worden aangeslagen dat de mole-culen door de relatief lange levensduur van de triplet grotendeels in deze toestand worden opgehoopt. Het absorptiespectrum wordt dan met behulp van een tweede korte flits opgenomen; het verdwijnen van

de triplet kan met een stationaire lichtbron worden gemeten. De methode zal uitvoerig worden beschreven in hoofdstuk 4. Zij is zeer universeel toe te p a s s e n . Vooral in vloeibare oplossingen is dit van belang, daar fosforescentiemetingen dan meestal falen.

5. Desactivering van de triplettoestand a. I n t r a m o l e c u l a i r e d e s a c t i v e r i n g

De desactivering van de triplettoestand geschiedt analoog aan die van de singlettoestand. De energie kan dus weer worden afgegeven in de vorm van straling, warmte en chemische energie. De eerste twee mogelijkheden zijn in het voorgaande reeds besproken. Van de chemische reacties zal in verband met het in hoofdstuk 3 beschreven werk alleen iets worden gezegd van de cis-trans-isomerisaties. Over dit onderwerp is onlangs een overzicht gepubliceerd door HAMMOND en TURRO"*^.

Het is gebleken dat bij belichting van vele verbindingen, waarbij een c i s - en een transvorm mogelijk zijn, een isomerisatie optreedt volgens:

\ X X ^ ^ H

Het bereikte evenwicht ligt in de regel geheel anders dan dat bij thermische isomerisati-es. De ligging hangt o.a. af van de golflengte van het gebruikte licht en van de moleculaire extinctie van de compo-nenten bij die golflengte.

Het mechanisme is nog niet geheel opgehelderd. Soms is gesug-gereerd dat de isomerisatie plaats vindt door overgang van de aange-slagen singlet in de l a a g s t e triplet van het molecuul en dat beide isomeren een gemeenschappelijke triplet zouden hebben. In de onder-zochte gevallen i s echter gebleken dat de trans-cis-isomerisatie bij stilbeenderivaten en bij azobenzeen temperatuurafhankelijk i s , ter-wijl de cis-trans-isomerisatie onafhankelijk is van de temperatuur. Hieruit is geconcludeerd dat er een zekere activeringsenergie nodig is om van de trans-singlettoestand naar de gemeenschappelijke triplet te komen. Een andere opvatting is dat de isomeren verschillende triplets hebben, waarbij voor de overgang van de trans-triplet naar de cis-triplet activeringsenergie nodig i s .

Wel is komen vast te staan dat zowel cis-trans-isomerisatie als het omgekeerde mogelijk is via de triplettoestand als het molecuul

rechtstreeks, dus niet via de singlet, in zijn laagste triplet wordt gebracht, G R A B O W S K I en B Y L I N A ^ ° hebben dit aangetoond bij 1,2-dichlooraethyleen door bestraling met licht overeenkomend met het golflengtegebied van de met zuurstof geïnduceerde S-T-absorptieband.

H A M M O N D en S A L T I E L ^ ' bereikten bij stilbeen de excitatie tot de triplet en de daarop volgende isomerisatie door middel van energie-overdracht van een ander molecuul naar het stilbeen.

b. I n t e r m o l e c u l a i r e d e s a c t i v e r i n g

Voor de energieoverdracht in biologische systemen en voor de r e a c t i e s in dit proefschrift beschreven is de intermoleculaire d e s -activering belangrijker dan de intramoleculaire. Bij moleculen in de triplettoestand is het optreden van intermoleculaire processen veel waarschijnlijker dan bij die in de singlet daar immers de langere levensduur de kans op botsing met andere moleculen veel groter maakt, zodat ook de kans op energieoverdracht aanzienlijker wordt. Hoe kan nu een aangeslagen tripletraolecuul intermoleculair worden gedesactiveerd?

Dit is mogelijk op de volgende manieren:

1°. Botsing met moleculen met zware atomen, waardoor de spin-baankoppeling wordt vergroot en het molecuul dientengevolge stralings-loos naar de grondtoestand terugkeert (zie pag.25).

2? Paramagnetische ^ e n c h i n g

Bij deze wij;ze van desactivering wordt de spinomkering gekata-lyseerd door een paramagnetisch atoom of molecuul (zie pag. 25 ), dat geen energie opneemt, maar alleen de stralingsloze T,—S -over-gang bevordert. Over het mechanisme van deze paramagnetische quenching is men het nog niet geheel eens •43'52,53_

3? Triplet-tripletoverdracht

De beide onder 1° en 2° genoemde processen bestonden uit af-gifte van energie aan het oplosmiddel onder invloed van een zoge-naamde quencher welke zelf geen energie opneemt. Als deze quencher echter een geschikt tripletniveau heeft, d.w.z. gelijk of lager dan dat van de licht absorberende stof, dan bestaat de mogelijkheid tot overdracht van de electronische energie via een stralingsloos p r o c e s . Tijdens dit proces wordt dan de quencher in de triplettoestand ge-bracht. Deze energieoverdracht is mogelijk omdat aan de " s p i n con-servation r u l e " wordt^ voldaan. Deze regel eist dat de totale spin van het systeem tijdens de overdracht gelijk blijft^'^.

Het eerste voorbeeld van een dergelijke overdracht is beschreven door T E R E N I N en E R M O L A E V ^ ' ' . Zij belichtten in bevroren g l a s -achtige oplossing benzaldehyde en naftaleen in een langgolvige absorptieband van het benzaldehyde zodat het licht alleen door deze

verbinding kon worden geabsorbeerd. Toch bleek het naphtaleen te fosforesceren, hetgeen mogelijk was door de lagere triplet van nafta-leen, hoewel de l a a g s t e singlet van naftaleen hoger ligt dan die van benzaldehyde.

benzaldehyde*(triplet) + naftaleen (singlet) -> benzaldehyde(singlet) + naftaleen *(triplet) In het juist genoemde proces wordt benzaldehyde de energiedonor de tweede stof acceptor genoemd. We hebben hier te doen met een g e s e n s i b i l i s e e r d e fosforescentie door een gekoppelde overgang t u s -sen de beide moleculen. Het mechanisme is analoog aan dat van de inductieve resonantie. Fosforescentiespectrum van de donor en de S.—T,—absorptie van de acceptor dienen elkaar voldoende te over-lappen. In tegenstelling tot bij de singlet-singlet-overdracht schijnt een kortere afstand tussen de moleculen noodzakelijk te zijn. Deze moet zijn van de orde van de normale botsingsafstanden in vloeibare o p l o s s i n g ^ ^ " ^ ' . Bij sterke overlapping i s het proces dan zo efficiënt dat elke botsing tot energieoverdracht leidt. ERMOLAEV en T E R E N I N ^ ^

wisten ook bij andere systemen een dergelijke overdracht aan te to^ nen.

In vloeibare oplossingen bij kamertemperatuur zijn triplet-triplet-overdrachten aangetoond door B A C K S T R Ö M en S A N D R O S ^ ^ door middel van fosforescentieproeven en door PORTER en wiLKlNSON^° met behulp van flits-fotolyse. Voorbeelden van dit soort overdracht waarbij de acceptor tenslotte een chemische verandering ondergaat zijn beschreven door HAMMOND c . s . . Het betreft de g e s e n s i b i l i s e e r -de c i s - t r a n s - i s o m e r i s a t i e van o.a. piperylenen^', stilbeen^^ en azobenzeen ^^ (zie voor overzi cht^^).

Een zeer interessant geval van tripletdesactivering, dat niet verward mag worden met de hier beschreven triplet-tripletoverdracht is de "triplet-tripletannihilation". Twee aangeslagen tripletmoleculen botsen hierbij en hun energie wordt, waarschijnlijk via een aangesla-gen dimeer of via inductieve resonantie, gelocaliseerd op een van de beide moleculen volgens: ^ P * + ^P* -» ' P * + P . De letter P is hier gebruikt omdat het verschijnsel voor het eerst werd waargenomen bij pyreen door STEVENS en H U T T O N ^ ' * . Het resultaat is dus dat een van de beide moleculen overgaat in ' een aangeslagen singlettoestand en kan gaan fluoresceren. Deze fluorescentie is vertraagd doordat er triplettoestanden bij betrokken zijn en wordt door PARKER P-type fluorescentie genoemd. Het emissie spectrum is identiek met dat van de normale fluorescentie en de a-fosforescentie. Ter onderscheiding van de " P - t y p e f l u o r e s c e n c e " noemt PARKER de a-fosforescentie,

welke ontstaat door thermische activering van de triplet, " E - t y p e f l u o r e s c e n c e " . De letter E i s afkomstig van eosine dat een typische vertegenwoordiger is van verbindingen met dit soort vertraagde fluor-e s c fluor-e n t i fluor-e . Expfluor-erimfluor-entfluor-efluor-el zijn bfluor-eidfluor-e typfluor-en vfluor-ertraagdfluor-e fosforfluor-escfluor-entifluor-e te onderscheiden naar: 1°. temperatuureffect, 2°. verband t u s s e n absorptie e n de intensiteit van de e m i s s i e .

De intensiteit van de E-type vertraagde fluorescentie neemt ex-ponentieel af met l / T (T = absolute temperatuur) en is recht evenredig met de lichtabsorptie. De intensiteit van de P-type fluorescentie be-zit dit verband niet en i s evenredig met het kwadraat van de absorptie. Dit l a a t s t e type vertraagde fluorescentie is daarom belangrijker bij hoge lichtintensiteiten.

4? Chemische reactie van het tripletmolecuul met een andere stof Behalve een fysische desactivering van de triplettoestand door een tweede molecuul kan ook een chemische r e a c t i e optreden met allerlei andere moleculen. Talloze voorbeelden van dit soort reacties zijn beschreven in de literatuur. Ze zijn te verdelen in een aantal groepen, te weten: dimerisaties, polymerisaties, a d d i t i e r e a c t i e s , fotoreducties en foto-oxydaties, waaronder r e a c t i e s met moleculaire zuurstof. Vele van deze processen zijn uitvoerig beschreven in het reeds genoemde overzicht van H A M M O N D en T U R R O ' ' ^ . Slechts op enkele voor het onderzoek belangrijke reacties zal nader worden ingegaan.

6. Methoden voor de bestudering van de triplettoestand bij fotoche-mische reacties

a. F o s f o r e s c e n t i e m e t i n g e n e n s i n g l e t t r i p l e t a b s o r p -t i e m e -t i n g e n

De fosforescentiemetingen zijn vooral in de e e r s t e tijd, na de identificatie van de triplettoestand door L E W I S en cALviN^®, veel toegepast. Het is meer een indirecte methode om r e a c t i e s , waarin de triplet een rol s p e e l t te bestuderen. Fosforescentie wordt immers meestal bestudeerd in vaste oplossing. De resultaten hiervan zijn dan niet zonder meer te vergelijken met het gedrag in vloeibare op-lossing, doch wel kon belangrijke informatie worden verkregen over de ligging van de tripletniveaus. Nadat door P A R K E R ^ ^ een methode is ontwikkeld die fosforescentiemetingen in vloeibare oplossing mogelijk maakt, zijn de toepassingsmogelijkheden sterk vergroot, Voordelen van deze metingen in vloeibare milieus en bij kamertem-peratuur zijn: 1° relatief lage tripletconcentraties kunnen worden aangetoond en 2° tamelijk veel kan worden geconcludeerd omtrent

de verschillende fosforescentieprocessen n a a s t elkaar. Een nadeel is dat betrekkelijk weinig stoffen fosforesceren of dit doen in een moeilijk toegankelijk deel van het spectrum .

Het omgekeerde proces, de S^—T.-absorptie, kan ook gegevens opleveren over de ligging van de niveaus. De mogelijkheden zijn echter tamelijk beperkt doordat vele stoffen niet voldoende oplossen om een redelijke absorptie te geven.

b . M e t i n g v a n d e t r i p l e t - t r i p l e t a b s o r p t i e d o o r m i d d e l v a n f l i t s - f o t o l y s e

Deze methode zal uitvoerig worden besproken in hoofdstuk 4. c. B e s t u d e r i n g v a n d e k i n e t i c a v a n d e r e a c t i e s

De bestudering van de kinetica van de reactie kan indirect aan-wijzingen geven over het gedrag van tripletmoleculen in oplossing. Wanneer voor een of meer reagerende stoffen een goede bepalings-methode bestaat kan b.v. uit het verloop van de reactie onder invloed van tripletquenchers vaak iets worden geconcludeerd. Vooral O S T E R

c,s,®^'^^ maken veel gebruik van deze techniek. Een nadeel is het indirecte karakter omdat men niet rechtstreeks het gedrag van kort-levende tussenproducten kan meten.

d, E l e c t r o n e n s p i n r e s o n a n t i e

De electronenspinresonantie maakt gebruik van het paramagne-t i s c h e karakparamagne-ter van de paramagne-tripleparamagne-tparamagne-toesparamagne-tand. De verschillende orienparamagne-terings- orienterings-mogelijkheden van een triplet in een magnetisch veld zijn de oorzaak van een absorptie van microgolven. Voor metingen in biologische systemen wordt de detectie bemoeilijkt door water, dat nu juist altijd in deze systemen aanwezig i s . Voor een overzicht van het principe en het t o e p a s s e n van de techniek wordt verwezen naar het artikel

van B L O I S en W E A V E R ^ ^ .

Fotochemie van riboflavine

Behalve door de belangrijke rol welke riboflavine (Vitamine B ) als electronenoverdrager speelt bij de ademhaling, omdat het immers in vele flavoproteïnen voorkomt, is het door zijn fotochemische eigen-schappen de l a a t s t e jaren eveneens sterk in de belangstelling geko-men.

De biologische gevolgen van de fotochemische activiteit van ribo-flavine zijn reeds lang bekend. Zo is deze activiteit genoemd als de oorzaak van de slechte geur van melk wanneer deze in het licht heeft

gestaan"^. Het relatief hoge gehalte van riboflavine van bier doet vermoeden dat het licht hierop ook zijn invloed zal hebben^^. Hoewel de rol van het riboflavine bij het proces van het zien nog duister i s , neemt men wel aan dat het erbij betrokken i s ' ° . Aanwijzingen hier-voor zijn de relatief hoge concentraties van riboflavine in de retina bij vele zoogdieren en vele vissen .

Sommige botanici beschouwen riboflavine als de sensibilisator bij de fototropie van plantendelen,d.i. de (niet omkeerbare) kromming van planten onder invloed van licht. Het actiespectrum van dit proces vertoont namelijk een zekere gelijkenis met het absorptiespectrum van riboflavine. GALSTON^^'^'^ gaf twee mogelijke mechanismen van dit verschijnsel. In de e e r s t e plaats kon hij in vitro aantonen dat de fotoöxydatie van het groeihormoon auxine (3-indolazijnzuur) door riboflavine en riboflavinehoudende enzymen werd g e s e n s i b i l i -seerd. De vermindering van het auxinegehalte aan de lichtkant zou de kromming kunnen veroorzaken. De tweede mogelijkheid i s dat ribofla-vine de fotoïnactivering van een auxine producerend enzym sensibili-seert. Het probleem is echter nog niet opgehelderd^'*.

Bij de bioluminescentie van sommige bacteriën schijnt riboflavine eveneens noodzakelijk te zijn^^. Chemiluminescentie i s gevonden bij de oxydatie van riboflavine met waterstofperoxyde ° .

1. Chemische structuur en fysische eigenschappen

De structuur van riboflavine is opgehelderd door K U H N C.SJ'^ en

K A R R E R C S . ^ ^ .

OH OH OH H j C — C — C — C — C H , O H

' l H H H '

Riboflavine (6,7-dimethyl-9-(D-l'-ribityl)-isoalloxazine).

Bij biochemische reacties speelt riboflavine meestal niet als zo-danig een rol, doch in de vorm van FMN (flavinemononucleotide) of FAD (flavineadeninedinucleotide). Het absorptiespectrum vertoont vier maxima (223, 268, 373 en 445 m/i, zie fig. 9). De fluorescentie bij

bij 534 mji. Volgens OSTER^^ is de kwantenopbrengst bij pH = 7 ge-lijk aan 0,26. Bij FAD i s dit getal veel lager; W E B E R ^ ° toonde aan dat dit een gevolg is van het feit dat het adenosinegedeelte de fluo-rescentie onderdrukt.

In vaste media bezit riboflavine een fosforescentie, die voor het eerst werd waargenomen door D H E R E en C A S T E L L I ^ ' . De emissie in ijs daarentegen i s kortlevend en moet volgens TUMERMAN c.s.^^ worden toegeschreven aan fluorescentie van dimeren. Deze zouden worden gevormd door uitvriezen van de oplossing. Toevoeging van natriumchloride gaf weer een langlevende emissie (zie ook ^ ^ ) .

2. Fotochemische reacties

Riboflavine is in water weinig s t a b i e l bij bestraling met zichtbaar of ultraviolet licht. In tegenwoordigheid van lucht wordt het dan irreversibel afgebroken. Bij belichting in zuur of neutraal milieu ontstaat voornamelijk lumichroom (6,7-dimethylalloxazine), in alkalisch milieu vindt de afbraak grotendeels plaats tot lumiflavine (6,7,9-trimethyl-isoalloxazine).

c

Lumillavinc

Het absorptiespectrum van lumiflavine verschilt weinig van dat van riboflavine. Lumichroom (in water) daarentegen, heeft een geheel afwijkend spectrum met maxima bij 219, 261, 355 en 380 m/i (zie fig. 9), in chloroform bij 260, 350 en 385 m/i. De fluorescentie i s over-eenkomstig hiermee opgeschoven naar kortere golflengte (maximum: 480 m/l) evenals de fosforescentie (max.: 570 m/t, zie hoofdstuk 5).

Het mechanisme van deze aerobe fotolyse is onderzocht door KUHN c s . ^ ^ en KARRER cs.^**. Laatstgenoemde auteurs postuleer-den dat de e e r s t e stap bij de fotolyse van riboflavine in neutraal milieu b e s t a a t uit een oxydatie van de hydroxylgroep aan het 2'-kool-stofatoom van de zijketen tot een ketogroep. Zij kwamen tot deze

conclusie op grond van het feit dat bij verhindering van de vorming van een ketogroep, door acetylering van de hydroxylgroep of ver-vanging van de waterstof aan het 2'-koolstofatoom door andere groepen, de fotolyse sterk wordt geremd, H A L W E R ^ ^ kon deze experimenten

bevestigen, maar vond bovendien dat bij fotolyse in zuur milieu, waarbij evenals in neutraal milieu afbraak plaats vindt tot lumichroom, juist snellere fotolyse optreedt als de vorming van een ketogroep op de 2'-plaats op bovengenoemde wijze wordt verhinderd. Op grond van de waarneming dat toevoegen van een buffer de fotolyse eveneens versnelt, stelde HALWER het volgende mechanisme op. De 2'-hy-droxylgroep verliest een proton en aan de stikstof op de 9-plaats van de isoalloxazinering wordt een proton geaddeerd. Vervolgens wordt de zijketen afgesplitst. De vorming van een ketogroep op de 2'-plaats zou volgens dit mechanisme dus een secundair proces zijn. Verder is over de aerobe fotolyse van riboflavine weinig bekend.

De anaerobe fotolyse heeft echter geleid tot veel uitgebreidere onderzoekingen. De reden hiervan is het unieke feit dat riboflavine in anaëroob milieu bij belichting fotoreductie ondergaat zonder de aanwezigheid van een reductiemiddel. Kleurstoffen zijn veelal alleen in s t a a t tot fotoreductie in tegenwoordigheid van een geschikte elec-tronendonor zoals ascorbinezuur, thio-ureura, thioglycolzuur, fenyl-hydrazine, gluthathion, allylthio-ureum, glucose en metaalzouten, echter niet zonder meer^^.

Riboflavine blijkt een dergelijke electronendonor bij de fotoreduc-tie echter niet nodig te hebben. Bij de anaerobe belichting verdwijnen de absorptiemaxima en de fluorescentie grotendeels. Bij heroxydatie keren deze eigenschappen gedeeltelijk weer terug. Gebruikt men wel een electronendonor zoals het veel toegepaste verseen (EDTA, aethyleendiaminetetraazijnzuur), dan krijgt men een veel snellere fotoreductie, terwijl bovendien na oxydatie met luchtzuurstof het riboflavine vrijwel volledig terugkeert.

Hoewel B R D I C K A ^ ^ reeds in 1942 met behulp van polarografie deze fotoreductie van het riboflavine zonder reductiemiddel zag als een intramoleculair proces, waarbij dehydrogenering van het 2'-C-atoom van de riboseketen op zou treden, is er jarenlang een strijd geweest over dit mechanisme. NicKERSON c.s.^^"^° en VERNON^' wilden de fotoreductie met en zonder reductiemiddel samenbrengen in één mechanisme. Volgens deze auteurs zou het geêxciteerde ribofla-vine water kunnen splitsen volgens:

R b + 2 HgO ^ Rb.2H20 ^-i' RbHj + HgO^ (1)

RbHj + O2 - Rb + 2 OH- - Rb + H2O2 (2) Rb+ HgO + A-» Rb.HgO.A ^4: RbH2 + AO (3),

waarbij Rb = riboflavine of FMN, A = activator b.v. verseen of methio-nine, A0 = geoxydeerde activator en RbH, = gereduceerde activator. De voornaamste feiten, waarop deze hypothese berustte, waren:

1°, Bij anaerobe belichting van riboflavine of FMN wordt waterstof-peroxyde gevormd volgens reactie (1).

2 . Katalase remt de fotoreductie.

3 ° . Methioninesulfoxyde wordt gevormd bij de anaerobe belichting van riboflavine en methionine. Het zuurstofatoom voor de sulfoxyde-vorming zou moeten worden geleverd door water.

4 ° . De reactie zou niet optreden in watervrije aethanol.

In een aantal volgende publicaties van o s T E R c s . ^ ^ , M O O R E c.s.^2, RADDA en CALVIN^^ en S M I T H en M E T Z L E R ^ " * i s aange-toond dat het mechanisme van de watersplitsing niet juist kan zijn. In de eerste p l a a t s is de vorming van waterstofperoxyde aangevochten, omdat NICKERSON en STRAUSS^^ nooit experimentele details hebben gegeven over de bepaling van deze stof. Hoewel V E R N O N daaren-tegen duidelijk zijn bepalingsmethode heeft aangegeven, moet aan de juistheid ervan worden getwijfeld. Deze bepaling berustte namelijk op de vorming van aceetaldehyde uit alcohol en (het te meten) water-stofperoxyde met behulp van k a t a l a s e . Het gevormde aceetaldehyde werd aangetoond door middel van een door alcoholdehydrogenase gekatalyseerde oxydatie van NADH.. Met deze methode toont men echter ook op andere wijze gevormde aldehyden aan en het ontstaan van formaldehyde bij de anaerobe fotoreductie van riboflavine en FMN was reeds bekend,

Het tweede door NiCKERSON e s , gevonden feit dat k a t a l a s e de fotoreductie zou remmen, kon eveneens niet worden bevestigd ^ ^ ' ^ ^ , Wat de vorming van het sulfoxyde betreft bij de fotoreductie van ribo-flavine, kan de functie van het water als zuurstofdonor nog moeilijk worden ontkend, maar op grond van de nog te beschrijven argumentefn ten gunste van een ander mechanisme moet het waarschijnlijk als een secundair proces worden beschouwd. Het sulfoxyde is p a s na toelating van O aangetoond.

Een andere benadering van het probleem was die van MOORE c s , ^ ^ . Zij voerden de fotoreductie uit in zwaar water. Hierbij bleek dat de snelheid gelijk was aan die in water. Vergeleken met andere fotochemische reacties waarin een stof met water reageert had men in zwaar water een kleinere reactiesnelheid moeten vinden.

Tenslotte vonden RADDA en CALVIN^^ ook nog dat riboflavine en lumiflavine in droge aethanol tot anaerobe fotoreductie in staat waren door oxydatie van de alcohol, zodat er van de argumenten van NICKERSON c . s . ^ ^ ' ^ ° nog maar weinig overblijft.

T5e t~egenwoordige opvatting over de fotoreductie van riboflavine is dat er twee mechanismen in het spel zijn, welke scherp gescheiden dienen te worden gehouden, namelijk voor de reactie met en zonder reductiemiddel. Het eenvoudigste geval i s dat waarbij een electronen-donor aanwezig is zoals verseen, methionine of alcohol. Indien dit het geval i s , dan reduceert deze electronendonor het aangeslagen riboflavine volgens:

Rb* + AHg - RbHg + A .

Toelating van zuurstof resulteert dan in: RbH2 + O2 -• Rb + H2O2. De laatste stof i s inderdaad gevonden. Het riboflavine dient uit-sluitend als sensibilisator voor de oxydatie van AH2 en de cyclus kan vele malen worden herhaald zonder dat er grote hoeveelheden riboflavine irreversibel verdwijnen. Men neemt algemeen aan dat de plaats van het molecuul waar het riboflavine gereduceerd wordt de alloxazinering is en dat de waterstof terecht komt aan de stikstof op de 1- en de 4-pIaats. Een ander reductiemiddel dat veel wordt toege-past i s het NADHg,

Het mechanisme voor de fotoreductie van riboflavine zonder reductiemiddel is veel ingewikkelder. Het is nu wel bewezen dat de waterstof welke nodig is voor de ontkleuring, dus voor de reductie van de chromofore isoalloxazinering, afkomstig is van het 2'-C-atoom van de zijketen. Argumenten hiervoor zijn:

1°. dat het lumiflavine, dat een zijketen heeft met s l e c h t s één kool-stofatoom, deze fotoreductie niet ondergaat.

2 . de remming van de reactie als de hydroxylgroep op de 2'-plaats wordt geacetyleerd of vervangen is door een alkylgroep.

3 ° , de remming van de reactie bij modelstoffen met een factor 2,5 als de waterstof op de 2'-plaats wordt vervangen door deuterium. Verder blijkt uit polarografische metingen dat de halfwaardepotentiaal van het product dat naast lumichroom en lumiflavine ontstaat niet overeenkomt met die van hqt dihydroriboflavine.

Het mechanisme dat in grote lijnen op dit ogenblik het meest aannemelijk lijkt, i s dat van MOORE c s . ^ ^ (zie hiervoor volgende pagi-na).Dit reactieschema kan de meeste verschijnselen verklaren. De vorming van lumiflavine komt echter in het schema niet voor, maar deze zou volgens M O O R E C S . ^ ^ verklaard kunnen worden door aan te nemen dat de inwendige hydrogenering ook kan plaats vinden aan het 3'-C-atoom. O S T E R ^ ^ neemt aan dat lumiflavine in een donkerreactie ontstaat uit " d e u t e r o f l a v i n e " . Lumichroom daarentegen zou onder invloed van licht uit " d e u t e r o f l a v i n e " ontstaan. De vorming van het 6,7-dimethyl-9-formylmethylisoalloxazine, welke door S M I T H en

OH I H j C C — R ' H I I ^ ^ ^ ^ N A ^ - ^ "

' "3^-4:^,

M E T Z L E R ^ * i s waargenomen na oxydatie van de gebleekte oplossing met luchtzuurstof, doet echter weer aan een andere reactie denken. Tenslotte heeft men zich de vraag gesteld of de triplet van ribo-flavine bij deze fotoreductie een rol speelt, O S T E R neemt aan dat het proces via de triplet van riboflavine moet lopen omdat sporen kaliumjodide (ongeveer 10"^M) de kwantenopbrengst duidelijk ver-lagen, Deze lage concentratie kaliumjodide heeft daarentegen geen enkel effect op de fluorescentie van riboflavine. Daarvoor zou onge-veer 0,1 M kaliumjodide nodig zijn. Berekeningen lieten zien dat de levensduur van deze triplettoestand ongeveer 10""^ sec, moest be-dragen.

Een andere aanwijzing voor de deelname van de triplet aan de reactie is volgens O S T E R C . S . de afhankelijkheid van de buffercon-centratie bij de proeven van HALWER^^. De buffer beïnvloedt de fluorescentie namelijk niet.

RADDA en CALVIN^^ concludeerden uit het feit dat paramagne-t i s c h e ionen de foparamagne-toreducparamagne-tie van FMN door NADH2 remden, daparamagne-t de triplettoestand de chemische reactieve aangeslagen toestand moest zijn. Zij berekenden dat de levensduur ervan ongeveer 10" -10"^ s e c . bedroeg.

Recente onderzoekingen van H O L M S T R Ö M ^ ^ ' ^ ^ met behulp van flitsfotolyse geven veel bewijsmateriaal voor het ontstaan van een semichinonradicaal via de triplettoestand. Een semichinonradicaal bij de fotoreductie van riboflavine in tegenwoordigheid van NADH is ook met behulp van electronenspinresonantie gevonden^^.

3. De betekenis van riboflavine bij fotodynamische reacties

Onder fotodynamische reactie verstond men aanvankelijk het lethale of remmende effect teweeggebracht in een levend systeem als gevolg van de gecombineerde werking van licht, zuurstof en een f o t o s e n s i b i l i s a t o r ' ° ° ' ' ° ' . Meestal komt dit neer op de fotoöxydatie van een vitaal bestanddeel van het systeem, waarbij de sensibilisator een stof i s , welke het licht absorbeert en de geabsorbeerde energie doorgeeft aan het substraat dat vervolgens wordt geoxydeerd. Soms breidt men de definitie uit tot soortgelijke reacties in biologische materialen of zelfs tot modelstoffen voor deze m a t e r i a l e n ' ^ . Daar verder de neiging b e s t a a t om r e a c t i e s , welke geen zuurstof vereisen erbij te b e t r e k k e n ' " ^ , i s het de vraag of het zin heeft onderscheid te maken tussen fotodynamische reactie en fotosensibilisatie. Onder fotosensibilisatie wordt verstaan, het gevoelig maken van een stof voor licht door middel van een lichtacceptor (sensibilisator). In dit

proefschrift zal genoemd onderscheid dan ook niet worden gemaakt. Het eerste voorbeeld van een fotodynamische reactie i s in 1900 door R A A B ontdekt. Hij zag dat infusoriën in verdunde oplossingen van acridinekleurstoffen door licht werden gedood. De benaming is afkomstig van T A P P E I N E R ' ° ' * in wiens laboratorium R A A B werkte en die veel onderzoek op dit gebied heeft gedaan. Later zijn de meest uiteenlopende systemen onderzocht: meercellige organismen (waar-onder de mens), cellen van allerlei soort, enzymen, mitochondria, virussen, fagen, nucleinezuren, eiwitten, aminozuren, purines etc. Over deze bijna onafzienbare reeks van onderzoekingen op dit gebied zijn een aantal overzichten geschreven"^°""^''.

Ook riboflavine blijkt dikwijls sensibilisator bij fotodynamische reacties te zijn. Zo i s het door sommige botanici genoemd als licht-acceptor bij de fototropie van planten, (zie voor uitgebreider be-schouwing pag. 31 ).

Het virus dat mazelen veroorzaakt wordt geïnactiveerd door hoge lichtintensiteit, vermoedelijk door de flavinen die het preparaat bevat. Fotoïnactivering van lysozym en ribonuclease in tegenwoordig-heid van riboflavine i s gevonden door S H U G A R " ' ^ . Deze inactivering loopt parallel met de tryptofaandestructie. B E L L I N en O S T E R ' ° ^

beschreven de fotoïnactivering van transforming principle DNA met riboflavine als s e n s i b i l i s a t o r . De purines guanine, xanthine en urine-zuur worden gemakkelijk geoxydeerd bij belichting in tegenwoordig-heid van riboflavine ^ ,

Het nucleinezuur van het tabaksmozaiekvirus vormt een complex met acridiheoranje en het wordt bij aanwezigheid van deze kleurstof door licht geïnactiveerd. Guanylzuur en transforming principle DNA worden in oplossing in aanwezigheid van lumichroom bij belichting g e o x y d e e r d ' ° 7 ' ' ° 8 .

Een zeer recent onderzoek van G H I R O N en S P I K E S " ^ ^ toont aan dat trypsine fotodynamisch wordt geïnactiveerd indien riboflavine of FMN als sensibilisator fungeert. Deze inactivering wordt toegeschre-ven aan de destructie van een of meer aminozuren in het eiwitmole-cuul en wel s p e c i a a l tryptofaan, tyrosine, methionine of histidi-n e ' ° 2 . i 0 3 .

Het mechanisme van de fotodynamische reacties is waarschijn-lijk niet altijd hetzelfde. Wat de fotodynamica bij levende cellen betreft, kan worden gezegd dat het doorgaans een oppervlaktever-schijnsel zal zijn waarbij de eiwitten aan de buitenkant worden ge-oxydeerd, Er zijn echter een aantal recente gevallen bekend waarbij acridinekleurstoffen complexen vormen met n u c l e i n e z u r e n ' " ^ . Men brengt dit in verband met het mutageen effect dat deze kleurstoffen

in het licht hebben. Meestal heeft men het probleem benaderd door onderzoek met modelstoffen op moleculair niveau, In de e e r s t e p l a a t s is gezocht naar overeenkomst in de structuur van de s e n s i b i l i s a t o r e n , maar het was niet mogelijk hierin veel lijn te v i n d e n ' ' ' ' ' . Er is wel aangenomen dat alleen stoffen, die kunnen worden gereduceerd, effectief zouden zijn^^. B L U M ' ° ' was van mening dat alle s e n s i -bilisatoren zouden fluoresceren; niet alle fluorescerende verbindingen

zijn echter actief a l s sensibilisator.

Over de primaire procesfase bij de fotodynamica b e s t a a t weinig twijfel. Het licht moet worden geabsorbeerd door de sensibilisator of door een complex van deze stof met het substraat (b.v. eiwit of nucle-inezuur). Na deze e e r s t e fase beginnen echter direct al de problemen en rijst de vraag hoe de electronische energie die het geabsorbeerde foton het sensibilisatormolecuul heeft meegegeven kan leiden tot de oxydatie van het substraat. Hierover zijn een vijftal theorieën opge-steld die als volgt kunnen worden samengevat,

I S + X ^ SX ^-i' SX* SX* + O2 - S + XO2 II S ^-^ S*(S*= ' S * of 3S*) S* + O2 -» SO* of SOg SO* + X -» S + XO2 III S '^-i' s* s* + O2 (- so*) - s + 0 ; o* + X - XO2 IV s ^^ s* S* + X - S + X* X* + O2 ^ XO2 V s 'ur s* S* + YHj ^ SHg + Y SH2 + 0 2 ^ S + H202 Hierin i s : S = sensibilisator X en YHg = substraat

SO = complex van s e n s i -bilisator met zuurstof Y en XO2 = geoxydeerd substraat SH, = gereduceerd sub-straat

Het teken * betekent dat het betrokken mo-lecuul of complex is aangeslagen.