Przebieg redukcji kwasu dehydroaskrobinowego siarkowodorem gazowym w zależności od wielkości pH I czasu

Z. B02YK, S KRAUZE

ROCZNIKI PZH 1960, t. XI, nr 2

PRZEBIEG REDUKCJI KWASU DEHYDROASKORBINOWEGO SIARKOWODOREM GAZOWYM W

ZALEŻNOŚCI

OD

WIELKOŚCI

pH I CZASU

Zakład Badania środków Spożywczych AM w Warszawie Kierownik: prof. dr S. Krauze

1. UWAGI WSTĘPNE

Zgodnie

z

ustalonymi

poglądami

na

działanie

witaminy C

w

orga- nizmie

człowieka,

kwasy askorbinowy

i

dehydroaskorbinowy

odgrywają równorzędną rolę biologiczną

(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8),

stąd też

przy usta- laniu

wartości

witaminowej

środków spożywczych

równoczesne ozna- czanie tych

związków

jest jednakowo

ważne.

Wielu autorów oznacza

zawartość

witaminy C w

środkach spożyw­

czych bez

uwzględnienia

aktywnego pod

względem

biologicznym pierw- szego produktu utlenienia kwasu askorbinowego; inni natomiast

zalecają

stosowanie metod

określających całkowitą zawartość

witaminy C (1, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14), tzn. sumy kwasów askorbinowego

i

dehydroaskor- binowego *.

Tak

pojęte

oznaczanie witaminy C ma szczególnie

duże

znaczenie dla

badań

biochemicznych

żywych

tkanek

roślinnych

oraz przy ustalaniu

wartości

witaminowej tych

środków spożywczych,

które przeznacza

się

do

bezpośredniego spożycia,

bez uprzedniego poddawania ich

wstępnej

obróbce kulinarnej, a w

szczególności działaniu podwyższonej

tempe- ratury. Odnosi

się

to przede wszystkim do owoców i niektórych warzyw.

Większ-ość

znanych i

najczęściej

stosowanych metod oznaczania kwasu dehydroaskorbinowego opiera

się

na stosunkowo

łatwej

jego

zdolności

redukowania

się

siarkowodorem do kwasu askorbinowego, który jest

następnie

oznaczany w sumie z kwasem askorbinowym pierwotnym, to jest

występującym

w tkance

roślinnej.

Wykonuje

się

dwa oznaczenia -

jedno przed i

drugie po redukcji. Z

różnicy

wyników oblicza

się

zawar-

tość

kwasu dehydroaskorbinowego. Ten sposób

pośredniego

oznaczania kwasu dehydroaskorbinowego zaproponowali

Emmerie i van Eekelen

(9, 10, 11, 12).

Został

on ogólnie

przyjęty

i do dzisiaj

uważany

jest za najbardziej pewny przy oznaczaniu kwasu dehydroaskoribinowego.

Według Roe i in. (15) redukcja siarkowodorem jest klasycznym postę­

powaniem przy oznaczaniu obok siebie kwasów askorbinowego i dehy- droaskorbinowego. Von

Fellenberg (16), Krauze i Kotomska (1) oraz

wielu innych

bad;łczy przyjęło

przy oznaczaniu witaminy C

zasadę

me- tody

Emmerie i van Eekelena. Roe i in. (15) zastosowali ją

w metodzie

• - biorąc pod uwagę aspekt żywieniowy autorzy zaproponowali (30. 37) przy-

jęcie jedynie dla kwasu askorbinowego synonimu witamina C, nie obejmując nim kwasu dehydroaskorbinowego.

144 ^{Z. Bożyk,} S. Krauze

Nr 2

oznaczania obok siebie kwasów: askorbinowego, dehydroaskorbinowego i gulonowego. Kwas dehydroaskorbinowy

oznaczają

w postaci osazonu z

2,4-dwunitrofenylohydrazyną, zaś

kwas askor binowy z

różnicy

wyni- ków uzyskanych przed i po utlenieniu

wyciągu.

Nawet w tej metodzie nie

można było wyeliminować

redukcji siarkowodorem, albowiem na innej drodze nie

było możliwe odróżnienie

od kwasu dehydroaskorbino- wego kwasu 2,3-dwuketo-1-gulonowego, który tworzy identyczny osa- zon z

2,4-dwunitrofenylohydrazyną.

Gil lam {17) oraz Scharrer i Werner (18)

stosując metodę

polarograficz-

ną

do oznaczania sumy kwasów askorbinowego i dehydroaskorbinowego redukowali

wyciągi

siarkowodorem w temperaturze pokojowej

.

Wendland (19, 20) wprowadza do redukcji kwasu dehydroaskorbino- wego tioacetamid na miejsce

trującego

H2S (0,4-0,5 g na jedno ozna- czenie)

.

Pijanowski (14)

odwrócił postępowanie przyjęte

przez Emmerie i van Eekelena (9). Redukuje on najpierw badany

wyciąg

siarkowodorem, który powstaje w nim po dodaniu mianowanego roztworu siarczku sodu,

usuwając

go

następnie ilościowo

z

wyciągu

przez

strącenie

HgS za po-

mocą również

mianowanego HgCb.

Zasadę

metody Emmerie i van Eekelena

przyjęli

Stewart i Sharp (21)

.

Eliminują

oni

wpływ

reduktonów na wynik oznaczenia kwasu askorbi- nowego

prowadząc biologiczną redukcję

kwasu dehydroaskorbinowego

. za ^pomocą

wybranych kultur bakterii Escherichia coli lub Staphyloco-

cus albus. Kwas askorbinowy pierwotny

utleniają

uprzednio askorbina-

zą otrzymaną

z ogórków. Askorbinaza utlenia zarówno kwas askorbi- nowy, jak i inne

związki redukujące,

natomiast wymienione kultury bakterii

mają redukować

wybiórczo jedynie kwas dehydroaskorbinowy.

Metoda

znalazła

uznanie wielu badaczy (22, 23, 24, 25, 26), jednak jest

również

krytykowana (27). Stwierdzono bowiem,

że

askorbinaza utlenia

cysteinę,

glutation, redukton, kwas reduktynowy i melanoidyny, ale nie utlenia praktycznie: kwasu galusowego, hydrochinonu, pirogalolu

,

pirokatecholu, p-fenylenodwuaminy, gwajakolu, tiosiarczanu sodu, cy- styny i benzydyny, co

podważałoby podkreślaną

przez cytowanych autorów

wybiórczość

metody enzymatycznomikrobiologicznej.

Roe i in

.

(15) zbadali wiele

związków redukujących,

w tym SnC12 i Na2S, ale

żaden

ze sprawdzonych przez nich nie

okazał się

tak dobry, jak siarkowodór gazowy.

Giinther {28

,

29)

ustalił, że pył

cynkowy stosowany w

środowisku kwaśnym

nie nadaje

się

do redukcji kwasu dehydroaskorbinowego, co

stwierdził

na

wyciągach

naturalnych.

Bożyk

(30)

wykazał, że

w warunkach metody polarografi.cznej nie

można wprowadzać

silnych kwasów mineralnych (np. HCl lub H2 SO4) do roztworu,

ponieważ powodują

one powstawanie substancji powierzch- niowo-aktywnych

wykazujących

ujemny

wpływ

na

postać

fali kwasu askorbinowego.

Giinther (28, 29)

zaproponował redukcję elektrolityczną. Jednakże późniejsze

prace Wendlanda (33), Knoblocha (13) i

Bożyka

(30) zaprze-

czyły możliwości

zastosowania katody platynowej,

ponieważ

kwas de-

hydroaskorbinowy nie redukuje

się

na niej w warunkach zapropono-

wanych przez Giinthera.

Nr 2 Redukcja kwasu dehydroaskorbinowego

145

Zastosowanie w badaniach polarograficznych podsiarczynu sodowego (ditionitu, hydrosulfitu) do redukcji kwasu dehydroaskorbinowego jest

niemożliwe, ponieważ

w procesie redukcji

wywiązuje się

siarka koloidal- na, która ma niekorzystny

wpływ

na

postać

fali kwasu askorbinowego.

Ponadto zachodzi

konieczność

usuwania S02 z roztworu, co nie stanowi

okoliczności ułatwiającej

w porównaniu do metody redukcji kwasu dehydroaskorbinowego siarkowodorem gazowym

(30).

Bożyk (30) analizując możliwość

zastosowania innych

związków

do redukcji kwasu dehydroaskorbinowego

wysunął

przypusz- czenie,

że

hy- droksylamina i hydrazyna nie

nadają się

do tego celu. Mroziewicz (34)

wykazała doświadczalnie, że

siarczan hydroksylaminy nie redukuje kwasu dehydroaskorbinowego w szerokim zakresie

wielkości

pH od

2,2

do 7.

Również

bororowodorek sodu, jeden z

najnowocześniejszych środków redukujących

nie nadaje

się

do redukcji kwasu dehydroaskorbinowego, co

wykazały szczegółowe

badania

Bożyka (30) .

. Jak wynika z

przeglądu

przytoczonych prac nie

udało się

dotychczas, mimo licznych prób przeprowadzonych przez wielu badaczy,

zastąpić

siarkowodoru dogodniejszym w pracy i lepszym

środkiem redukują­

cym. Autorzy,

zalecający

jego stosowanie nie

mają

jednakowych po-

glądów

w zakresie ustalania optymalnych warunków redukcji. Zazna- cza

się

to w

szczególności

przy wyborze

wielkości

pH roztworów redu- kowanych oraz najkorzystniejszego czasu prowadzenia redukcji.

Zagadnienie doboru najodpowiedniejszej

wielkości

pH roztworów re- dukowanych jest doceniane bez

wyjątku

przez wszystkich autorów,

stosujących

siarkowodór do redukcji kwasu dehydroaskorbinowego.

I tak np. von Fellenberg (16) stosuje

zobojętnianie

roztworu przed

redukcją

za

pomocą

CaCOa.

Według

Sabalitschki (35) roztwór

należy

przed

redukcją doprowadzić

do

wielkości

pH od 4 do 5,

ponieważ

w

środowisku

bardziej

kwaśnym

redukcja kwasu dehydroaskorbinowego ma

przebiegać

nie

ilościowo.

Franke (31)

omawiając redukcję

siarkowodorem zwraca

uwagę, że wielkość

pH roztworu nie

może być większa

od 5,

ponieważ

w takich warunkach kwas dehydroaskorbinowy

łatwo

utlenia

się

do kwasu gulonowego.

Glick

(32)

zaleca

kwaśne wyciągi

przygotowane za

pomocą

kwasu metafosforowego

zobojętniać

octanem sodu lub

węglanem

sodu (w sub- stancji) do

wielkości

pH od

2

do 3. Dopiero tak przygotowane

wyciągi

wysyca siarkowodorem gazowym.

Roe i in. (15) redukowali kwas dehydroaskorbinowy w szerokim za- kresie

wielkości

pH od 0,4 do 7,0

.

Ustalili,

że

optymalne warunki re- dukcji uzyskuje

się

w zakresie

wielkości

pH od 1,2 do 4,7.

Stwierdzają

oni,

że większość

badaczy przyjmuje pH 3,5 jako najbardziej optymal-

ną wielkość

pH redukcji.

Według

tych autorów, w roztworach o wiel-

kościach

pH mniejszych od 1,2

szybkość

redukcji bardzo szybko zwal- nia

się.

Przypuszcza

się, że

jest to spowodowane zmniejszeniem

stężenia

siarkowodoru oraz

przekształcaniem się

kwasu dehydroaskorbinowego do kwasu gulonowego w warunkach

dużego stężenia

jonów wodorowych.

Pijanowski (14) natomiast podaje,

że

redukcja

może być

przeprowa- dzana w szerokim zakresie

wielkości

pH od 2 do 6, a w pewnych przy-

Roczniki PZH - 5

146

^{Z. Bożyk,} S. Krauze

Nr 2

padkach - nawet od 1 do 7, przy czym najkorzystniej ma

przebiegać

w roztworach o

wielkościach

pH od 2 do 4.

Z

przytoczonych

poglądów wynikają

dwa

rozbieżne

stanowiska. Jedni

skłaniają się

do twierdzenia,

że

redukcja nie przebiega

ilościowo

w sil- nie

kwaśnym środowisku

o

wielkościach rzędu

pH 1,2-2,

zalecając

sto- sowanie

wyższych wielkości

pH redukowanych roztworów, natomiast inni

utrzymują, że

redukcja w takich warunkach

również

przebiega

ilościowo. ·

Poza

rozbieżnością poglądów

na

wielkość

pH roztworów redukowa- nych, nie ma

również zgodności co

do czasu prowadzenia redukcji.

Emmerie i van Eekelen (9), a za nimi Fellenberg (16) oraz Krauze i Kotomska (1) prowadzą redukcję

w temperaturze pokojowej w

ciągu

kilkunastu godzin.

Scharrer i Werner (18) zalecają redukować wyciąg

w tych warunkach temperatury w

ciągu

16 godzin, natomiast

Franke

(31)

podkreślając, że

redukcja kwasu dehydroaskorbinowego w tempera- turze pokojowej przebiega powoli,

uważa

za konieczne prowadzenie redukcji w

wyciągu

18 godzin.

Glick (32) zaleca wysycanie wyciągu*

w

ciągu

15 minut, a

następnie

pozostawienie go w

ciemności

w czasie 2 godz.

Zgodnie z danymi

Engelhardta i Bukina, cytujemy za Sznajdmanem

(36), a ostatnio

Bogdańskiego

(23), na

przejście

czynnego biologicznie kwasu dehydroaskorbinowego w form~

nieczynną

(kwas 2,3-dwuketo- l-gulonowy) ma

wpływ

przede wszystkim

wielkość

temperatury i pH roztworu. Niska temperatura i silnie

kwaśny

odczyn

środowiska

za-

pobiegają przekształcaniu

kwasu dehydroaskorbinowego w

formę

nie-

aktywną

pod

względem

biologicznym.

Powyższe

czynniki

mają więc

identyczny

wpływ

na

stabilność

kwa~

sów askorbinowego i dehydroaskorbinowego.

Konieczność

wykonania

badań

w

przyjętym

przez nas zakresie

wynikła stąd, że

metodyka do-

świadczeń przyjęta

przez wielu badaczy

różniła się,

a

więc należało

przy-

puszczać, że

wyniki

badań

uzyskane przez nich

mogą

nie

być

porówny- walne. W

związku

z tym,

że

prace wielu autorów

zm:erzające

do

zastą­

pienia siarkowodoru wygodniejszym

związkiem redukującym

nie

dały,

jak dotychczas, zamierzonych rezultatów,

a

siarkowodór jest w dalszym

ciągu dominującym środkiem redukującym

przy oznaczaniu kwasu de- hydroaskorbinowego,

postanowiliśmy ustalić

optymalne warunki redukcji za

pomocą

tego

związku.

Opracowanie optymalnych warunków redukcji kwasu dehydroaskorbinowego za

pomocą

siarkowodoru gazowego jest

ważne

i z tego powodu,

ponieważ

ze

względu

na

niedoskonałość

obecnie stosowanych metod oznaczania witaminy C, trudno jest

rozstrzygnąć,

czy kwas dehydroaskorbinowy

występuje

w warzywach i owocach.

Krauze i Bożyk

(30, 37) na podstawie

badań

polarograficznych

wysunęli hipotezę, że

kwas dehydroaskorbinowy nie

występuje

w warzywach i owocach, jednak autorzy

podkreślają konieczność

potwierdzenia ich wniosków przez innych badaczy i za

pom:::>cą

innych metod.

Ustalenie optymalnych warunków redukcji kwasu dehydroaskorbino- weg:::>

może więc mieć duże

znaczen:e teoretyczne,

ponieważ

powinno

się przyczynić

do ostatecznego

wyjaśnienia,

czy kwas dehydroaskorbi- nowy

występuje

w warzywach i owocach.

• - Q wielkości pH doprowadzonej do 2-3.

Nr 2 Redukcja kwasu dehydroaskorbinowego 2. CZĘśC DOŚWIADCZALNA

2.1.

Aparat ur a pomiar o w o - kontr o 1 n a warunki analizy

147

ogólne

Oznaczenia polarograficzne wykonano na polarografie Radiometr typ

PO 3 k, w naczyńku

Kalouseka z

elektrodą siarczanową.

Pomiary

wielkości

pH wykonano na pH-metrze RFT typ 158 z nisko-

oporową elektrodą

Schotta.

Stosowaliśmy elektrodę kroplową o następującej

charakterystyce:

m = 2,7 mg sek.-

^1;

t = 3,05 sek.;

wielkość

t oznaczono w roztworze podstawowym (5 ml buforu octanowego o pH 4, 7 + ⁵

ml 50/o-owego

roztworu kwasu metafosforowego) przy 8 zwoju drutu

bębna

potencjo-

metrycznego i h = 40 cm. ·

Krzywe kwasu askorbinowego rejestrowano w

środowisku

beztleno- wym. Tlen

usuwaliśmy

z roztworów za

pomocą

azotu z butli. Oczyszcza-

liśmy

go

przepuszczając prżez płuczki

z alkalicznym roztworem piroga- lolu i roztworem nadmanganianu potasowego.

Kroplową elektrodę rtęciową polaryzowaliśmy

katodowo-anodowo.

stosując czułość

1 : 5.

Bufor octanowy o pH 4,7

przygotowaliśmy

przez zmieszanie 500 ml 2M roztworu octanu sodowego i 500 ml 2M roztworu kwasu octowego.

2.2. Us t a

1

e n i e s z y b ko

ś

c i r e d u kc j i kw a s u d e h y d r o- a s k o r b

i

n o w e g o w z a 1 e

ż

n o

ś

c i o d w

i

e 1 k o

ś

c

i

pH

i

czasu

Badania

szybkości

redukcji kwasu dehydroaskorbinowego w

zależnoś­

ci

od

wielkości

pH i czasu

przeprowadził Bożyk

(30)

ograniczając

je do

wielkości

pH 1,9; 4,65; 6,15.

Mroziewicz (34) wykonała

badania

uzupeł­

niające,

które przedstawiamy

łącznie poniżej.

Roztwory kwasu dehydroaskorbinowego przygotowywano w 5

⁶

/o-owym HPOa.

Żądane wielkości

pH roztworów redukowanych uzyskiwano za

pomocą

dodawania odpowiednich

ilości

buforów octanowego i fosfora- nowego. Redukcje przeprowadzano w roztworach o

wielkościach

pH 1,8; 3,1; 5,0; 6,1

i

6,7.

Każdy

roztwór redukowano kolejno w

ciągu

5; 7½; 10; 15; 20 i 30 minut. Jedynie roztwór o

wielkościach

pH 1,8

i

3,1 redukowano w

ciągu

10, 15, 20, 30 i 60 min.

Siarkowodór usuwano z roztworów za

pomocą

silnego strumienia dwu- tlenku

węgla

z butli, w

ciągu

15 minut.

Stężenia

kwasu askorbinowego w badanych roztworach ustalano me-

todą

dodawan

ia roztworu wzorcowego.

W celu uzyskania porównywalnych wyników,

wielkości

odzysków kwasu askorbinowego obliczano w O/o w stosunku do

ilości

uzyskanego kwasu askorbinowego przy pH 6,7,

którą przyjęliśmy

za 100°/o. Otrzy- mane wyniki

badań zestawiliśmy

na ryc

. 1.

2.3. B a d a n i a s t a b i 1 n o

^ś

c i kw a s

ó

w a s kor b i n o w e go

i dehydroaskorbinowego w roztworach wodnych

Ze

^względu

na sprzeczne dane

dotyczące stabilności

kwasów askorbi-

nowego i dehydroaskorbinowego w roztworach,

postanowiliśmy

zagad-

nienie

wyjaśnić.

Kwasy askorbinowy

i

dehydroaskorbinowy przeche>-

.1."J:U

{00

odzysk

kwasu.

askoTb~

nowego

SO

20

w

~o

L.. ouzyK, :::, . .i<...rauze

20

30

pH

6.7

pH 6.i pH

5.0

pH 3,8

pH 3,i.

pH t,I

czas redukcji.

60m10.

Ryc. l. Przebieg redukcji kwasu dehydroaskorbinowego w roztworach wodnych w zależności od wielkości pH

i czasu.

Nr 2

wywano w roztworach buforów w

ciągu ¹

12, 1, 2 i 6 godzin. Po

upływie określonego

czasu oznaczano kwas dehydroaskorbinowy

metodą

Pija- nowskiego (14). Wyniki

oznaczeń obliczono

w

⁰

/o w stosunku do ml

ilości

barwnika

zużytego

do miareczkowania roztworu odniesienia

(O

min.).

Kwas askorbinowy oznaczano miareczkowaniem

bezpośrednim

bez wykonywania uprzedniej redukcji. Wyniki

oznaczeń obliczono

w O/o w stosunku do liczby ml barwnika

użytego

do miareczkowania

roztwo-

rów odniesienia kwasów askorbinowego i dehydroaskorbinowego

(O

min.).

Uzyskane wyniki przedstawiono na

ryc.

2.

3. OMÓWIENIE WYNIKÓW

Z

przedstawionych

na

ryc.

1 krzywych

obrazujących

w poszczegól- nych roztworach

o określonych wielkościach

pH

przebieg

redukcji kwasu dehydroaskorbinowego,

można wyciągnąć wniosek, że szybkość

redukcji kwasu dehydroaskorbinowego, redukowanego siarkowodorem gazowym,

zależy od wielkości

pH roztworu. Im

wielkość

pH

wyższa,

tym

szybkość

redukcji

większa.

Jest ona

określona

kierunkami stycznych odcinków krzywych ryc. 2 wyznaczonych

pomiędzy

punktem zerowym

układu

osi

współrzędnych

oraz np. punktami uzyskanymi po 5 min. re- dukcji. Przy

wielkości

pH 6,7

redukcję można uznać

za

zakończoną już

po 10-15 min.

Obniżenie wielkości

pH redukowanych roztworów odbija

się

niekorzystnie na

wielkości

odzysków kwasu askorbinowego. To jest

Nr 2

^Redukcja kwasu dehydroaskorbinowego

100·~~:t:::::::::::-r---.t.

^{pH 2.t}

k11as aslcor-

o:,~

SO

30

20

iO

....

'

.... --O_

'e._

' 'a.

' ^....

- - k1,1a.s askorbi.now~

- -- kwas deh~droa..skorbi.now~

2 3

pYi,6 pH4,8 pHt,O

- _{- -e}

_{pH S.O}

- "0 pHł,u

6 gad-?.

Ryc. 2. Rozkład kwasów askorbinowego i dehydroasko1-- binowego w roztworach wodnych w zależności od wiel-

kości pH i czasu.

14!:l

między innymi

powód, dla którego mamy

zastrzeżenia

do metody Róe

i

in. (15), którzy

redukują

kwas dehydroaskorbinowy przy niskich wiel-

kościach

pH.

Z przedstawionych wyników

badań można wyciągnąć

wniosek,

że

re-

dukcję

za

pomocą

siarkowodoru gazowego

należy wykonywpć

w roztwo- rach, których

wielkość

pH

została

doprowadzona do 6, 7.

Należy ją

pro-

wadzić

w

ciągu

15 min. Wniosek ten wydaje

się obowiązywać

nie tylko w metodzie polarograficznej, ale

również

w metodach miareczkowych

.

Na podstawie przeprowadzonych przez nas

badań

opisanych w niniej- szej pracy, jak

również

w pracach poprzednich (30, 37) dochodzimy do wniosku,

że również

w metodach miareczkowych, w których

stosuje się

2,6-dwuchlorofenoloindofenol,

należy stosować

przy redukcji gazowym siarkowodorem podane

wyżej

warunki pH i czasu.

W świetle

omówionych wniosków wydaje

się, że

wyniki

badań Roe

i in. (15)

mają

zastosowanie

wyłącznie

do metody oznaczania kwasu de- liydroaskorbinowego za

pomocą

2,4-dwunitrofenylohydrazyny.

Wyciąg­

nięty

przez tych autorów wniosek,

że duże stężenie

jonów wodorowych

(<

pH 1,2) przyspiesza

przekształcenie

kwasu dehydroaskorbinowego

w

kwas 2,3-dwuketo-1-gulonowy, powinien

być zawężony

i prawdopo- dobnie odnosi

się

do

szybkości sprzęgania

2,4-dwunitrofenylohydrazyny zarówno z jednym, jak

i

z drugim

związkiem,

a

być może przekształca-

,

nia

się

kwasów dehydroaskorbinowego w

środowisku,

które badali autorzy.

Można przyjąć, że

2,4-dwunitrofenylohydrazyna

spełnia rolę

katalizatora

przyspieszającego

utlenianie kwasu dehydroaskorbinowego,

jeżeli przyjąć hipotezę Penneya i Zilvy (38), potwierdzoną

przez Roe i in. (15),

że

2,4-dwunitrofenylohydrazyna

łączy się

tylko z kwasem 2,3-dwuketo-1-gulonowym, natomiast nie

łączy się

z kwasem dehydro-

askorbinowym.

Chcąc wyjaśnić

uzyskane przez nas wyniki, które

są

sprzeczne z ba-

daniami Roe i in. można przyjąć hipotezę, że

uzyskane przez tych

150

^{7.:. Bożyk, S. Krauze}

Nr 2

autorów wyniki

świadczą

o

szybkości łączenia się

kwasu dehydroaskor- binowego z

2,4-dwunitrofenylohydrazyną

w

określonych

warunkach pH

1

a nie jego

przekształcenia

do kwasu 2,3-dwuketo-1-gulonowego. Dla- tego

też

wydaje

się, że

wnioski wymienionych autorów nie

zostały

do- statecznie udowodnione.

Ponieważ

zasada metody Roe i in. oznaczania obok siebie kwasów askorbinowego, dehydroaskorbinowego i gulonowego opiera

się

na re- dukcji siarkowodorem gazowym, wyniki naszych

badań upoważniają

do

zgłoszenia zastrzeżeń dokładnego

oznaczenia obok siebie kwasów askorbinowego i dehydroaskorbinowego za jej

pomocą.

Nasz

pogląd

traktujemy jako

wstępny.

Do jego potwierdzenia i

pełnego

zakwestio- nowania metody Roe i in.

należałoby wykonać

badania specjalne. Jest

interesujące, że również Szoke

* kwestionuje

metodę

Roe i in., która

została uznana przez większość autorów, szczególnie amerykańskich, za

najbardziej

specyficzną wśród

metod

oznaczania witaminy C. Autorka

wykazała, że

w metodzie Roe i in. nie eliminuje

się wpływu

substancji

przeszkadzających,

które jak wynika z

dostępnego

streszczenia pracy,

podwyższają

wyniki o 10 do 200/o.

Na

podstawie uzyskanych przez nas wyników, przedstawionych w ni-

niejszej pracy, powtórnie potwierdzamy uprzednio sprecyzowany przez nas

pogląd

(30, 37),

że

jedynie za

pomocą

metody polarograficznej

moż­

na

oznaczać dokładnie

obok siebie kwasy askorbinowy i dehydroaskor- binowy.

W

przeciwieństwie

do wyników eksperymentalnych wielu badaczy dochodzimy do wniosku na podstawie przeprowadzonych przez nas ba-

dań, że

redukcja kwasu dehydroaskorbinowego w roztworach o wiel-

kościach

pH

rzędu

2,0 przebiega bardzo powoli i nie

ilościowo.

Ten wniosek nasuwa przypuszczenie,

że

warunki redukcji kwasu dehydroaskorbinowego w metodzie Pijanowskiego (14) powinny

być

dodatkowo sprawdzone. Zaproponowane przez tego autora warunki bu-

dzą zastrzeżenia

w

świetle

wykonanych przez nas

badań.

Wyniki

badań

uzyskane przez wszystkich autorów w tych warun- kach pH powinny

być

zakwestionowane.

Niezrozumiały

dla nas i

rozbieżny

stan

poglądów

wielu autorów na

wielkość

pH roztworów redukowanych

powstał

prawdopodobnie

stąd, że

poszczególni badacze przenosili wyniki

badań

nad uzyskaniem opty- malnych warunków redukcji kwasu dehydroaskorbinowego, otrzymane

jedną metodą

do warunków metod opartych na innych zasadach lub innych analizowanych

układach.

I tak np.

Scharrer i Werner (18) zalecają pr,owadzić

w badaniach po- larograficznych

redukcję

w

ciągu

16 godzin. Nie sprawdzili oni

tą

me-

todą

wyników uzyskanych na drodze miareczkowej przez innych bada- czy. Jak

się okazało

w wyniku przeprowadzonych przez nas

badań

(30, 37)

przedłużanie

czasu redukcji powoduje wzrost

ilości

wielosiarczków w roztworze, które

wywierają

ujemny

wpływ

na

postać

fali polar, ogra- ficznej kwasu askorbinowego. Fakt

zwiększania się

w -czasie redukcji

właściwości

redukcyjnych roztworów kwasu dehydroaskorbinowego wy- sycanych siarkowodorem gazowym w stosunku do 2,6-dwuchlorofeno-

* Autorzy znają niestety tylko krótkie stresżczenie pracy, która została wygło­

szona na zjeździe żywieniowców w Budapeszcie (1959 r.). Praca prawdopodobnie nie była pub1ikowana (39).

Nr 2

Redukcja kwasu dehydroaskorbinowego

151

1oiil.dofenolu, a nie stwierdzenia tego wzrostu przy badaniu

tychże

roz- tworów

metodą polarograficzną świadczy

z jednej strony o specyficz-

. ności

tej ostatniej m

etody, z drugiej zaś

ujawnia po raz pierwszy w pi-

śmiennictwie światowym

prawdziwe przyczyny wzrostu

właściwości

redukcyjnych roztworów wysycanych siarkowodorem w stosunku do 2,6-dwuchlorofenoloindofenolu.

Knobloch (13) omawiając

ujemne strony redukcji siarkowodorem ga- zowym zwraca

szczególną uwagę

na fakt,

że

w produktach naturalnych pod

wpływem

siarkowodoru otrzymuje

się

zbyt wysokie wyniki.

Według

tego autora powodów zjawiska, mimo licznych

usiłowań,

nie

udało się

ostatecznie

wyjaśnić. Sądzimy, że przyjęta

na podstawie

badań

polaro- graficznych (30, 37) przez nas hipoteza,

że

w metodach miareczkowych

powstające

pod

wpływem

siarkowodoru wielosiarczki

podwyższają

wy- niki, znajdzie potwierdzenie innych autorów.

Dla

pełności

obrazu

poniżej

podajemy

poglądy

niektórych autorów na stwierdz.one wady metod miareczkowych, w których stosowano siarko- wodór gaz, owy.

·wykazali oni, że

zastosowanie siarkowodoru w meto- dach miareczkowych oznaczania witaminy C

może prowadzić

do

błę­

dów. Wyniki uzyskiwane za

pomocą

tych metod

budzą zastrzeżenia.

Przede wszystkim

podważa się

ich

specyficzność.

[ tak np

. Glick (32) ogólnikowo stwierdza, że pod wpływem

siarko- wodoru

ulegają

redukcji nie tylko kwas dehydroaskorbinowy, ale rów-

nież

inne

związki.

Siarkowodór ponadto

może się łączyć

z innymi

związ­

kami,

tworząc

pochodne, których ni, e

można następnie usunąć

z bada- nego roztworu za

pomocą obojętnego

gazu. One to

właśnie,

jak rów-

nież związki

zredukowane

reagują

z indofenolem, co powoduje

zwięk­

szanie wyników. Na tym ma

polegać mała specyficzność

metod,

·

opar- tych na zasadzie redukcji

wyciągów

siarkowodorem gazowym.

Bardziej

szczegółowe

badania

wykonał Gunther (29). Badając

do-

kładność oznaczeń udowodnił

on,

że wyciągi roślinne

traktowane octa- ' nem

rtęciowym,

a

następnie

redukowane siarkowodorem,

wykazują

pozorną, wyższą zawartość

witaminy C. Wymieniony autor

wykazał

to na czystych roztworach asparaginy, alaniny, cysteiny, kwasu glutami- nowego i glutationu (które to

związki występują

w mniejszej lub

więk­

szej

ilości

w

każdej

tkance

roślinnej),

jak

również

w ich m

ieszaninach.

Podczas redukcji

mają powstawać

w tych roztworach pod

wpływem

siarkowodoru substancje

redukujące,

które

przeszkadzają

w miareczko- waniu kwasu askorbinowego i

podwyższają

wyniki.

Na

zmienność

wyników

oznaczeń

kwasu askorbinowego ma ponadto

wpływ działanie

soli metali

ciężkich

,które

powodują

powstawanie z pektyn i kwasu galakturonowego

związków mających zdolności

redu-

kujące

(40).

Z

powyższego

wynika wniosek,

że

metodami miareczkowymi za po-

mocą

2,6-dwuchlorofenoloindofenolu

określa się

kwas dehydroaskorbino- wy w

przybliżeniu,

natomiast

metodą polarograficzną

oznacza

się

ten

składnik

witaminy C

dokładnie,

z tym samym stopniem

dokładności

co

i

kwas askorbinowy

.

Należy podkreślić, że

w metodzie polarograficznej w opisanych przez nas warunkach (30, 37) produkty redukcji kwasu dehydroaskorbinowego nie

mają

istotnego

wpływu

na

wysokość

fali kwasu askorbinowego oraz na jej

postać.

Oznacza to,

że użycie

siarkowodoru do redukcji kwasu

I

Z. Bożyk, S. Krauze

Nr 2

dehydroaskorbinowego w metodzie polarograficznego oznaczania wita- miny C jest bardziej specyficzne,

niż

w metodach miareczkowych

,

a ponadto

umożliwia dokładne

oznaczanie obok siebie kwasów askor- binowego i dehydroaskorbinowego. Na

tę cechę

metody polarograficz- nej

zwróciliśmy już uwagę

poprzednio (30, 37).

Z wykonanych przez nas

badań można

ponadto

wyciągnąć

wniosek,

że

w metodach miareczkowych opartych na zasadzie Emmerie i van Eekelena

redukcję należy prowadzić również

w

ciągu

15 min.

,

a nie jak dotychczas

postępowano, kilkanaście·

godzin.

W

świetle

opisanych w niniejszej pracy wyników

badań słuszność przyjętego

przez nas w poprzedniej pracy (41)

założenia, że metodę

Pijanowskiego

należy uważać

jako

metodę standartową

(odniesienia), wydaje

się być

udowodniona.

Badaniami

stabilności

kwasów askorbinowego i dehydroaskorbinowe- go (ryc. 2)

potwierdziliśmy

wyniki

^badań

Bukina i Engelhardta (36) oraz

Bogdańskiego

i

Bogdańskiej

(7, 23, 42).

Bogdański i Bogdańska określili stopień trwałości

kwasu dehydroaskorbinowego w

zależności

od temperatury i

wielkości

pH. Doszli oni do wniosku,

że duże stężenie

jo- nów wodorowych stabilizuje kwas dehydroaskorbinowy, natomiast

stę­

żenie małe

nie zabezpiecza przed utlenieniem tego

związku,

którego

rozkład

przebiega zgodnie z

reakcją pierwszorzędową.

Z naszych

badań

wynika,

że

w roztworze o

wielkości

pH 7 ,O zawar-

tość

kwasu dehydroaskorbinowego

zmniejszyła się

w

ciągu

30 min.

o 15n/o,

zaś

po

upływie

6 godz. - o 75n/o. Natomiast w rotzworze o wiel-

kości

pH 1,6 kwas dehydroaskorbinowy

utlenił się

w

ciągu

30 min.

w

ilości

10/o,

zaś

po

upływie

6 godzin - 15,80/o.

Wypływa stąd

wniosek,

że

nawet stosunkowo

duże stężenie

jonów wodorowych nie chroni kwasu dehydroaskorbinowego w

środowisku

wodnym przed utlenieniem.

Należy

to

mieć

na uwadze przy wykorzysty- waniu roztworów kwasu dehydroaskorbinowego jako roztworów wzor- cowych.

Z ryc. 2 wynika

również, że

kwas askorbinowy jest

związkiem

znacz- nie trwalszym od kwasu dehydroaskorbinowego. Praktycznie

można przyjąć, że

kwas askorbinowy w roztworze o

wielkości

pH 2,1 nie utle- nia

się

w

ciągu

6 godz. (tylko o 0,2°/o). Jak wynika z ryc. 2 zmniejszenie

stężenia

jonów wodorowych

ułatwia

utlenianie kwasu askorbinowego

, w

znacznie mniejszym jednak stopniu

niż

w przypadku kwasu dehydro- askorbinowego.

W

przybliżeniu można przyjąć, że

kwas dehydroaskorbinowy

rozkła­

da

się

w roztworach wodnych ok. 2,5-krotnie szybciej w porównaniu z kwasem askorbinowym.

Należy podkreślić, że

w pracy poprzedniej (30

,

37)

ustaliliśmy, że

kwas dehydroaskorbinowy redukuje

się ilościowo

po 15 min. zarówno przy pH 6,2, jak i 4,7.

Uzyskiwanie

niższego

odzysku kwasu askorbinowego w przypadku

użycia

buforu octanowego

interpretowaliśmy

(30)

obecnością

w roztwo- rze

większego stężenia

soli, które

powodują obniżanie wysokości

fali.

Nasze wnioski

były

zgodne z wynikami

badań

Scharrera i Werne- ra (18) którzy wykazali,

że wysokość

fali polarograficznej kwasu askor- binowego

zależy

od

stężenia

buforu w roztworze. W niniejszej pracy

wyeliminowaliśmy wpływ stężenia

soli na

wysokość

fali,

ponieważ stę-

, Nr 2 Redukcja kwasu dehydroaskorbinowego

153

żenie

kwasu askorbinowego w roztworze

ustalaliśmy metodą

dodawania roztworu wzorcowego.

A zatem zasadniczy wniosek, jaki

wyciągnęliśmy

poprzednio,

że

do redukcji kwasu dehydroaskorbinowego

należy stosować

'bufor fosfora- nowy, pozostaje bez zmian.

Należy

jednak

podkreślić nieścisłość

inter- pretacji podanej poprzednio

,

4. WNIOSKI

1. Szybkość

redukcji kwasu dehydroaskorbinowego

zależy

od wiel-

kości

pH; im jest ona

wyższa,

tym

szybkość

redukcji

większa.

2.

Przy pH 6,7 uzyskuje

się największy

odzysk kwasu askorbinowe- go; redukcja jest

zakończona

po 10-15 min.

3. Autorzy

przypuszczają, że

podane we wniosku 2. warunki redukcji powinny

być

stosowane nie tylko w metodzie polarograficznej, ale

również w

metodach miareczkowych.

4. Na podstawie uzyskanych wyników

należy pośrednio

zakwesti-ono-

wać dokładność

i

specyficzność

metody Roe, Millsa, Oesterlinga i Da- mrona oznaczania obok siebie kwasów askorbinowego, dehydroaskorbi- nowego i gulonowego za

pomocą

2,4-dwunitrofenylohydrazyny.

5. W

związku

z tym,

że

przy

wielkości

pH 2,0 redukcja kwasu de- hydroaskorbinowego przebiega powoli i nie

ilościowo, należy

zakwestio-

nować

wyniki

badań

autorów

stosujących tę wielkość

pH przy redukcji kwasu dehydroaskorbinowego;

wysunięto

przypuszczenie,

że również

warunki redukcji w metodzie Pijanowskiego powinny

być

dodatkowo sprawdzone.

6. Autorzy

potwierdzają

sprecyzowany

już

poprzednio wniosek,

że

jedynie za

pomocą

metody polarograficznej

można oznaczać ściśle

obok siebie kwasy askorbinowy i dehydroaskorbinowy.

7. Kwas askorbinowy jest bardziej stabilny od kwasu dehydroaskor- binowego. W roztworze o

wielkości

pH 7,0 i temperaturze pokojowej

zawartość

kwasu dehydroaskorbinowego

zmniejszyła się

w

ciągu

30 min

.

o 160/o,

zaś

po

upływie

6 godz. - o

75''¼;

przy

wielkości

pH 1,6, po tych samych okresach przechowywania odpowiednio o 10/o i 15,8°/o. Kwas askorbinowy w roztworze o

wielkości

pH 2 nie utlenia

się

praktycznie

w ciągu

6 godz.,

zaś

przy

wielkości

pH 7,0 w

ilości

ok. 30°/o.

·

W przybliżeniu można · przyjąć, że

kwas dehydroaskorbinowy

rozkła­

da

się

w roztworach wodnych

około

2,5-krotnie szybciej w porównaniu

z

kwasem askoribinowym.

3. B o )K 11 K, C, K p a y ^{3 e}

TTPOUECC BOCCTAHOBJIEHI15l ,UEfH,UPOACKOPBHHOBOH KHCJIOTbl fA30BbIM CEPOBO,UOPOM B 3ABI1CHMOCTI1 OT pH I1 BPEMEHH

Asmpbl YJlOCTOBepllJI-H, 'łTO ^{BOCCTa1lOBJ1em1e} ;.iern11.poacKop61-tHOBOH KllCJJOTbl M,1leT ÓblCTpee B •pa-CTIBOpax o pH 6,7.

Y)Ke ITOCJJe 15 MllHYT ,n,ertt,1lpoacKop6HHOBaH KllCJJOTa 6bl,la KO.Tlll'tJeCTBeHHO BOCC"M'HO·

&netta,

154 ^{Z. Bożyk, S. Krauze}

Nr 2

6b!JIO cópall.(eHO 'BHH\13·HHe Ha HCCOrJJaCHbie pe3yJibTaTbl aBTOpOB C 3ilKJl!OlJCHlHIM-11 rqJc,11,11o>KeHHbtMH Roe, Mills'om, Oesterling'om H Damron'om, K0Top1,1e pemt-1JIH 'ITO

Il npo,10.TI)K{'f!Elll 15 MHHYT B'XCT,HIOB.10HHE' rrpoÓCl',lCT KO.U!lJeCTDCHHO npa pH OT 1,2 --

.UO 4,7.

0.n;HOB,PCMCHHO aBTOpbl ::ITOIO rpy/l.a co~rneBalOTCH, OC-IIODhl'Bil5lCb Ba TTOJIY4CJnlb!X pe3yJ1bTaTaX, O BOJMO)KHOCTH T04:H0f0 onpe,QCJICH!15l HaXO/l.'l!l.\HXCST COBME'CT'IIO acKopGH

lf(l'nOii ,H 11,enr_r1poac>mp6HHOBOft Kl-!CJIOT MeTO/l.OM Roe H /l.PYrHX.

KocBCHHO Cll.(C pa3 AOl(333HO, lfTO T0,1bKO lf!OJJaporpacjJH4CCJm~1 M<'TO/\OM MO)K!IO onpc·

11,eJIHTb cyMMY aCKOpÓ!-!:H030H. Il /lCf!IJl.!J03CKOpÓHHOBOii KHCJIOT B CUC)KHX OBOLl.l3X Il cj>pyK-

T;J.'( ·11 ¹1'1'0 3TOT Meron: cne1unj>ll'TeH ^H TI03Bo,n5ieT T04HO onpen:e,TTHTb COBMPCTHO OCKOpÓ<i-

HO!lYIO tt /l.Cf,i!)l!pca•CKOp6HH<YBYIO KHCJIOTbl.

KpoMe Toro ICOHCTaTH'JJOB3HO, 4TO .nern,llpO,ICKOpÓHHOlla5l K:ICJIOTa paJ.1iaraerc11 2,5-KpaT t•o CKOpt't' lłe)K('jf)-1 i1CKnpóH.HOB351 KJ-ICJIOT2.

Z. B oż y k, S. K r a u ze

THE COURSE OF REDUCTION OF DEHYDRO-ASCORBIC ACID BY MEANS OF GASEOUS

ms

DEPENDING UPON pH RANGE AND TIME

Summary

The authors established that reduction of dehydro-ascorbic acid takes place the quickest in solutions of pH 6.7. After 15 minutes dehydro-ascorbic acid is quantitatively reduced, Attention is called to the disagreement of the results obtained with conclusions of the investigations presented by Roe, Mills, Oesterling and Damron who have ascertained that during 15 minutes reduction takes place quantitatively with pH from 1.2 to 4.7. At the same time ethe authors on the basis of the results obtained doubt the possibility of accurate estimation of ascor- bic acid and dehydro-ascorbic acid alongside by means of Roe method and others.

It was proved once again directly that only polarographic method of estimation of the sum of ascorbic and dehydro-ascorbic acids in fresh vegetables and rruits is specific and makes possible accurate estimation of ascorbic acid and

·dehydro-ascorbic acid together.

Moreover it was found that dehydro-ascorbic acid decomposes about 2,5 times fJUh::ker than ascorbic acid.

PIŚMIENNICTWO

1. Krauze S.. Kotomska Z.: Medycyna doświadczalna i mikrobiologia, 1, 513, 1949. - 2. Marchlewski L., Skarżyński B.: Chemia fizjologiczna, t. Il, Gebethner i Wolff, Kraków 1959. - 3. Mills M. B., Damron C. M,, Roe J, H.: Ana!. Chem., 21, 707, 1949. - 4. Penney J. H., Zilva S. S.: Biochem. J. 37, 403, 1943. - 5. Roe J. H., Barnum G. L.: J. Nutrition, 11, 359, 1936. - 6. Witaminy, praca zbiorowa pod re- dakcją A. Dmochowskiego, W. Polaczkowej i B, Skarżyńskiego, Lódź 1949.

7. Bogdański K, A.: Roczniki Technologii i Chemii Żywności, 1, 55, 1957.

8. Szczygieł A.: Podstawy fizjologii żywienia, PZWL, Warszawa 1956. - 9. Emme- 1'le A., van Eekelen M.: Biochem. J., 28, 1153, 1934, - 10. Emmerie A., van

Eekelen M,: Biochem. J., 30, 25, 1936.

· 11. Emmerie A., van Eekelen M.: Zeitschrift Vitaminforschung, 6, 150, 1937, 12. Emmerie A., van Eekelen M,: Zeitschrift. Vitaminforschung, 7, 254, 1938.

Nr 2 ^{RL•dukcja kwasu de}hydroaskorbinowego

155

1:l. Knobloch H.: Die Pharmazie, 3, 70, 1948. - 14. Pijanowski E.: Bull. Acad„

Polon. Sci., Cl Il 1. 73, 1953; Przemysł Rolny i Spożywczy, 8, 410, 1954. - 15. Roe J. H., Mills M. B., Oesterling M. J., Damron C. M.: J. Biol. Chem., 174, 201, 1948. - 16. von Fellenberg T.: Mitt., 32, 135, 1941. - 17. Gillam W. S.: Ind.

Eng. Chem., A. E. 17, 217, 1945. - 18. Scharrer K., Werner W.: Z. Pflanzener- niihrung, Dungung, Bodenkunde 77, 97, 1957. - 19. Wendland G.: Pharmazie„ 2, 261, 1947. - 20. Wendland G.: Arch. Pharmazie, 286/58, 158, 1953.

21. Stewart A. P., Sharp P. F.: Ind. Eng. Chem., 17, 373, 1945. - 22. Bogdań­

ski K. A.. Bogdańska H. W.: Zeszyty Naukowe Politechniki Gdańskiej, Chemia, I, 5:ł, 1954. 2:t Bogdański K. A.: Roczniki Technologii i Chemii żywności

1, 55, 1958. - 24. Bogdańska H., Desperak B., Szczyglowa M.: Roczniki PZH, 4, 32, 1953. - 25. Bogdańska H., Desperak-Secomska B., Szczyglowa M.: Roczniki PZH,

5, :ł27, 1954. - 26. Bogdański K. A.: Roczniki PZH, 8, 1, 1957. - 27. Gstirner F.:

Chemisch - physikalische Vitaminbestimumngsmethoden, Enke-Verlag, Stuttgart 1951. - 28. Giinther E.: Biochem. Zeitschr., 314, 276, 1943. - 29. Giinther E.: Vita- mine u. Hormone, 5. 55, 1944. - 30. Bożyk Z.: Studia nad polarograficznym ozna- czeniem witaminy C w świeżych· warzywach i owocach - praca kandydacka, wy- konana w Akademii Medycznej w Warszawie 1958.

31. Paech K., Tracey M. V.: Moderne Methoden der Pflanzenanalyse Springer- Verlag, Berlin-Gottingen-Heidelberg 1956. - 32. Glick D.: Methods of Biochemical Analysis, Interscience Publishers New York, London 1957. - 33. Wendland W.:

Pharmazie, 2, 261. 1947. - :H. Mroziewicz Z.: Badania nad redukcją kwasu de- hydroaskorbinowego w metodzie polarograficznego oznaczania witaminy C w wa- rzywach i owocach - praca magisterska wykonana w Zakładzie Badania środków Spoż. AM w Warszawie 1959. - 35. Sabalitschka T.: Vitamine u. Hormone, 4, 376, 194;3. - 36. Schnajdman L. O.: Produkcja witamin z surowców roślinnych i zwie-

rzęcych, PWT, Warszawa 1954. - 37. Krauze S., Bożyk Z.: Mitt., 50, 228, 1959. - :33_ Penney J. H., Zilva S. S.: Biochem. J., 37, 403, 1943. - 39. Szoke K.: Mody- fikation der Vitamin-C- Bestimmungsmethode nach Roe und ihre papierchromato- garaphische Kontrolle - referat wygłoszony na Kongresie Żywieniowców w Bu- dapeszcie 1959. - 40. Sabalitschka T., Kleffner U.: Pharm. Zentralhalle, 87, 259, 1948.

41. Krauze S., Bożyk Z., Ociepka W.: Badania metody Pijanowskiego. I. Porów- nanie niektórych metod miareczkowych oznaczania sumy kwasów askorbinowego i dehydroaskorbinowego w wybranych surowcach roślinnych - zakwalifikowane do druku w Rocznikach Technologii i Chemii żywności. - 42. Bogdański K. A., Bogdaiiska H.: Roczniki Nauk Rolniczych, seria A, 3, 367, 1957.