Hormonal replacement therapy in posmenopausal women and neutrophils selected functions - TNF-α preactivation

(1)

P

PRRZZEEGGLL¥¥DD MMEENNOOPPAAUUZZAALLNNYY 55//22000044 63

H

Ho orrm mo on na alln na a tteerra ap piia a zza assttêêp pcczza a u

u k ko ob biieett p po o m meen no op pa au uzziiee a

a w wyyb brra an nee ffu un nk kccjjee n neeu uttrro offiillii –– p prreea ak kttyyw wa accjja a T TN NF F-- αα

H

Hoorrm moonnaall rreeppllaacceem meenntt tthheerraappyy iinn ppoossm meennooppaauussaall w woom meenn aanndd nneeuuttrroopphhiillss sseelleecctteedd ffuunnccttiioonnss – – T TN NF F--αα pprreeaaccttiivvaattiioonn

T

Toommaasszz SStteettkkiieewwiicczz¹¹,, IIrreenneeuusszz PPoo³³aaææ¹¹,, GGrrzzeeggoorrzz SSttaacchhoowwiiaakk¹¹,, SS³³aawwoommiirr JJêêddrrzzeejjcczzyykk¹¹,, H

Haannnnaa RRoommaannoowwiicczz--MMaakkoowwsskkaa²²,, GGrrzzeeggoorrzz SSuurrkkoonntt²²,, TToommaasszz PPeerrttyyññsskkii¹¹

Neutrofile wykazuj¹ zdolnoœæ do chemotaksji, adherencji, fagocytozy i destrukcji sfagocytowanych mikroorganizmów przy pomocy mechanizmów tlenowych i pozatlenowych oraz do degranulacji i uwalniania ziarnistoœci wewn¹trzkomórkowych i produktów metabolizmu tlenowego komórki. Mog¹ tak¿e produkowaæ cytokiny zapalne. S¹ jednym z najwa¿niejszych Ÿróde³ reaktywnych form tlenu w organizmie. W pracy badano wp³yw z³o¿onej ci¹g³ej hormonalnej terapii zastêpczej u kobiet po menopauzie na preaktywacjê (priming) TNF-αneutrofili krwi obwodowej. Stwierdzono zmniejszenie zjawiska primingu ju¿ po 3 mies. stosowania tej terapii.

S³owa kluczowe: neutrofile, TNF-α, priming, HTZ

(Przegl¹d Menopauzalny 2004; 5: 63–66)

W Wssttêêp p

Neutrofile w organizmie ludzkim pe³ni¹ niezwy- kle istotn¹ rolê we wczesnej odpowiedzi, skierowanej przeciwko organizmom patogennym ze œrodowiska zewnêtrznego, zjawiaj¹c siê jako pierwsze komórki w miejscu tocz¹cego siê procesu zapalnego [1]. Ce- chuje je krótki czas ¿ycia, du¿a aktywnoœæ biologicz- na i du¿a zdolnoœæ do migracji. Codziennie ok. 100 mln neutrofili opuszcza kr¹¿enie, ulegaj¹c apoptozie, a na ich miejsce trafiaj¹ nowe komórki [1].

Neutrofile wykazuj¹ zdolnoœæ do chemotaksji, adherencji, fagocytozy i destrukcji sfagocytowanych mi- kroorganizmów przy pomocy mechanizmów tlenowych i pozatlenowych oraz do degranulacji i uwalniania ziarnistoœci wewn¹trzkomórkowych i produktów metabolizmu tlenowego komórki. Mog¹ tak¿e produ- kowaæ cytokiny zapalne [1]. S¹ jednym z najwa¿niejszych Ÿróde³ reaktywnych form tlenu w organizmie [1].

Funkcje neutrofili, takie jak migracja, fagocytoza, de- granulacja, wytwarzanie reaktywnych form tlenu podle- gaj¹ regulacji pod wp³ywem ró¿nych mediatorów [1].

1

1KKlliinniikkaa GGiinneekkoollooggiiii ii CChhoorróóbb MMeennooppaauuzzyy IInnssttyyttuuttuu CCeennttrruumm ZZddrroowwiiaa MMaattkkii PPoollkkii ww ££ooddzzii;;

k

kiieerroowwnniikk KKlliinniikkii:: pprrooff.. ddrr hhaabb.. mmeedd.. TToommaasszz PPeerrttyyññsskkii

2

2PPrraaccoowwnniiaa BBiioollooggiiii MMoolleekkuullaarrnneejj,, ZZaakk³³aadd PPaattoommoorrffoollooggiiii KKlliinniicczznneejj IInnssttyyttuuttuu CCeennttrruumm ZZddrroowwiiaa MMaattkkii PPoollkkii,, w

w ££ooddzzii,, kkiieerroowwnniikk:: pprrooff.. ddrr hhaabb.. mmeedd.. AAnnddrrzzeejj KKuulliigg

3

3II KKlliinniikkaa GGiinneekkoollooggiiii ii OOnnkkoollooggiiii GGiinneekkoollooggiicczznneejj,, II KKaatteeddrraa GGiinneekkoollooggiiii ii PPoo³³oo¿¿nniiccttwwaa UUnniiwweerrssyytteettuu M

Meeddyycczznneeggoo ww ££ooddzzii,, SSzzppiittaall iimm.. MM.. MMaadduurroowwiicczzaa;; kkiieerroowwnniikk KKlliinniikkii:: pprrooff.. ddrr hhaabb.. mmeedd.. JJaacceekk SSuuzziinn

(2)

P

Jednym z takich mediatorów jest TNF-α. TNF-α – czynnik martwicy guzów (ang. tumor necrosis factor) jest bia³kiem o masie 17 000 daltonów, w sk³ad którego wchodzi 157 aminokwasów. Nazwa tej cytokiny wywo- dzi siê z badañ, prowadzonych przez Carswella [2], któ- ry wykry³ jej obecnoœæ w osoczu zwierz¹t po podaniu en- dotoksyny. Uwa¿ano pocz¹tkowo, ¿e jest to czynnik wywo³uj¹cy martwicê nowotworów, wytwarzany przez ko- mórki jednoj¹drzaste pod wp³ywem mediatorów zapale- nia lub mitogenów [3]. Z dalszych osi¹gniêæ badawczych dotycz¹cych TNF-α nale¿y wspomnieæ o ustaleniu se- kwencji aminokwasów wchodz¹cych w jego sk³ad oraz zmapowaniu jego genu w 6. parze chromosomów [4].

TNF-αpe³ni w organizmie ludzkim rolê mediatora wielu procesów zarówno fizjologicznych, jak i patolo- gicznych. Cytokina ta spe³nia bardzo wa¿n¹ rolê w reak- cjach procesu zapalnego. Jest jednym z najsilniejszych modyfikatorów funkcji neutrofili [1, 5]. Ma zdolnoœæ in- dukcji aktywnoœci cytostatycznej i cytotoksycznej neutrofili w stosunku do komórek nowotworowych [6].

Stwierdzono, ¿e pod bezpoœrednim wp³ywem TNF-α dochodzi do zwiêkszonej ekspresji receptorów integry- nowych neutrofila, nasilenia fagocytozy oraz do nie- wielkiego wzmocnienia wybuchu oddechowego [7].

Termin priming zosta³ wprowadzony w 1984 r. przez Guthrie i wsp. [8] do okreœlenia zjawiska wzrostu gene- racji wolnych rodników przez stymulowane neutrofile po uprzedniej ich preinkubacji z lipolisacharydami. Ten sam termin zosta³ zastosowany w odniesieniu do wzmo-

¿onej odpowiedzi neutrofili na stymulatory, obserwowa- nej po preaktywacji czynnikiem pochodz¹cym z akty- wowanych komórek jednoj¹drzastych [9]. Czynnik ten zosta³ wyizolowany i zidentyfikowany jako TNF-α[3].

PóŸniejsze badania potwierdzi³y zdolnoœæ TNF-α do preaktywacji neutrofili, tzw. primingu. W wyniku preaktywacji neutrofili przy u¿yciu tej cytokiny, w odró¿nie- niu od dzia³ania bezpoœredniego, dochodzi³o do wzmo-

¿onej ich odpowiedzi na nastêpny bodziec.

Opisano zwiêkszenie wybuchu tlenowego po inkuba- cji neutrofili z TNF-αi fMLP [7]. Inne badania potwier- dza³y, ¿e TNF-αsam nie aktywowa³ wytwarzania reaktywnych form tlenu i nie nasila³ agregacji i degranulacji, ale preinkubacja neutrofili z TNF-αnasila³a znacznie od- powiedŸ komórek na stymulatory (np. fMLP). Stwierdzo- no, ¿e efekt preaktywacji zale¿a³ od stê¿enia TNF-α, czasu preinkubacji i temperatury otoczenia [10]. Wiles [11]

opisa³ znaczne zwiêkszenie poziomu wybuchu tlenowego indukowanego fMLP, C5a, opsonizowanym zymosanem po preinkubacji neutrofili z TNF-α. Neutrofile preinkubo- wane z TNF-α, w porównaniu do GM-CSF, G-CSF i IL- 8 wykazywa³y najwiêkszy poziom wybuchu oddechowego po stymulacji fMLP. Jednoczeœnie preaktywacja przez TNF-α najbardziej zwiêksza³a intensywnoœæ wi¹zania fMLP ze swoistym receptorem na neutrofilu [12].

TNF-α³¹czy siê na powierzchni komórki z recep- torami TNF-R (p55, CD120a i p75, CD120b). Bada-

nia Zemana i wsp. [1] dostarczaj¹ wielu informacji o roli wy¿ej wymienionych receptorów. Mechanizm transdukcji sygna³u na tej drodze receptorowej jest s³abo poznany. Przypuszczalnie dochodzi do wzrostu aktywnoœci oksydazy NAD (P) H oraz poprzez j¹dro- we czynniki transkrypcyjne NF-KB do zmiany trans- krypcji genów szeregu biologicznie wa¿nych media- torów wtórnych, m.in. IL-1, 6, 8 oraz czynników:

PAF, NGF, TGF-β, LTB4, GM-CSF, G-CSF. Docho- dzi tak¿e do wzrostu ekspresji receptorów powierzch- niowych, takich jak integryny CD11/CD14 [13, 14].

C

Ceell p prra accyy

Ocena wp³ywu z³o¿onej ci¹g³ej hormonalnej terapii zastêpczej u kobiet po menopauzie na preaktywacjê (priming) TNF-αneutrofili krwi obwodowej.

M

Meetto od dyyk ka a

Badan¹ grupê stanowi³o 46 kobiet w okresie pomenopauzalnym, bêd¹cych pacjentkami Poradni Kliniki Ginekologii i Chorób Menopauzy ICZMP w £odzi.

Œredni wiek w badanej grupie wynosi³ 54,0±5,1 lat, œredni wiek wyst¹pienia menopauzy 49,1±3,5 lat, a œredni czas od wyst¹pienia menopauzy 5,0±4,1 lat.

Kryteriami wykluczaj¹cymi by³y istnienie przeciw- wskazañ do hormonalnej terapii zastêpczej, ostre lub przewlek³e choroby zapalne, cukrzyca, stosowanie leków o w³aœciwoœciach antyoksydacyjnych i HTZ w okresie ostatnich 6 mies.

Na wykonywanie badañ uzyskano zgodê Komisji Etyki Badañ Naukowych przy Akademii Medycznej w £odzi.

Pacjentki zakwalifikowano do hormonalnej terapii zastêpczej. Zastosowano HTZ doustn¹ zawieraj¹c¹ 17beta-estradiol i octan norethisteronu.

Efekt antyoksydacyjny HTZ okreœlano, porównu- j¹c generacjê reaktywnych form tlenu przez neutrofile krwi obwodowej pacjentek, ocenian¹ na podstawie pomiaru chemiluminescencji (CL) w czasie tzw. wybuchu tlenowego tych komórek przed rozpoczêciem hormonalnej terapii zastêpczej oraz po 3 i po 6 mies. stosowania tej terapii. Do wywo³ania wybuchu tlenowego neutrofili zastosowano nastêpuj¹ce stymulatory: formylo-metionylo-leucylofenyloalaninê (fMLP), octan mirystynianu forbolu (PMA) i zymosan firmy Sigma- -Aldrich. Jako wzmacniacza chemiluminescencji bez- poœredniej u¿yto luminolu (Sigma-Aldrich). Do preaktywacji (primingu) neutrofili u¿ywano rekombinowa- nego ludzkiego TNF-α(5x10⁷U/mg) (Sigma-Aldrich).

P³yn PBS (fizjologiczny roztwór NaCl zbuforowany fosforanami) pochodzi³ z firmy Biomed.

Pomiaru chemiluminescencji dokonywano przy u¿y- ciu aparatu LUMINOMETR 1251 (Pharmacia LKB).

(3)

P

PRRZZEEGGLL¥¥DD MMEENNOOPPAAUUZZAALLNNYY 55//22000044 65 Tab. I. Preaktywacja (priming) neutrofili TNF-ααpodczas stosowania HTZ

Parametry Okres stosowania HTZ Rezultaty

statystyczne analizy

wariancji*p

stosunek pól BS (n= 6) œrednia ±SD 1,31±0,45 1,14±0,32 1,1±0,2 <0,0005

=po preaktywacji/ minimum÷maksimum 0,85÷1,96 0,67÷1,74 0,8÷1,53

bez preaktywacji

FMLP (n=46) œrednia ±SD 1,94±0,47 1,35±0,29 1,38±0,27 <0,0005 minimum÷maksimum 1,29÷3,47 0,72÷2,13 1,02÷2,41

PMA (n=46) œrednia ±SD 1,94±0,52 1,34±0,20 1,36±0,35 <0,0005 minimum÷maksimum 1,31÷4,24 0,93÷1,89 0,97÷3,07

Z (n=46) œrednia ±SD 1,79±0,40 1,29±0,28 1,30±0,28 <0,0005 minimum÷maksimum 1,21÷3,02 0,22÷2,03 1,03÷2,69

stosunek pików BS (n 46) œrednia ±SD 1,29±0,51 0,73±0,40 1,14±0,38 <0,0005

=po preaktywacji/ minimum÷maksimum 0,76÷1,95 0,16÷1,8 0,76÷1,64

bez preaktywacji

fMLP (n=46) œrednia ±SD 1,96±0,54 1,36±0,42 1,53±0,91 <0,0005 minimum÷maksimum 1,11÷3,59 0,75÷2,88 0,67÷7,12

PMA (n=46) œrednia ±SD 1,87±0,78 1,29±0,31 1,43±0,48 <0,0005 minimum÷maksimum 0,84÷5,10 0,64÷2,30 0,73÷2,97

Z (n=46) œrednia ±SD 1,70±0,43 1,18±0,32 1,30±0,36 <0,0005 minimum÷maksimum 1,05÷2,80 0,21÷1,91 0,62÷2,04

BS – bez stymulacji fMLP – stymulacja formylo-metionylo-leucylofenyloalanin¹

PMA – stymulacja octanem mirystynianu forbolu Z – stymulacja zymosanem

*jednoczynnikowa analiza wariancji dla zmiennych zale¿nych

Badania przeprowadzano w sta³ej temperaturze 37^oC±0,1. Luminometr w ci¹gu 30 min dokonywa³ 15 pomiarów. Ka¿d¹ seriê pomiarów wykonywano na 4 próbkach krwi, powtarzaj¹c j¹ 2-krotnie. Na podstawie wyników pomiarów obliczano parametry chemiluminescencji: a) pole powierzchni pod krzyw¹ emisji w funkcji czasu, liczon¹ w ci¹gu 30 min, wyra¿aj¹ce ca³kowit¹ iloœæ energii wyemitowan¹ przez komórki w czasie pomiaru), b) maksimum krzywej emisji. Oceniano chemilu- minescencjê spontaniczn¹ (BS) i stymulowan¹ fMLP, PMA i zymosanem neutrofili. Próbki, w których oceniano wybuch tlenowy neutrofili spoczynkowych zawiera-

³y: 20 µl krwi pe³nej, 20 µl luminolu, 20 µl PBS (BS), lub 20 µl fMLP (2x10^-6M/ml), lub 20 µl PMA (2x10^-8M/ml) lub 30 (l zymosanu (10 mg/ml), PBS do ³¹cznej objêtoœci 1 000 µl. Próbki, w których oceniano wybuch tlenowy neutrofili preaktywowanych by³y inkubowane przez 30 min z TNF-α(10 ng/ml) przed dodaniem stymulatorów.

Do oceny istotnoœci zmian wartoœci parametrów chemiluminescencji w czasie stosowania HTZ zastosowano metody analizy wariancji dla zmiennych zale¿nych.

W Wyyn niik kii

Stosunek pól pod krzywymi CL i stosunek pików CL neutrofili preaktywowanych, bêd¹ce miar¹ preaktywacji (primingu) równie¿ uleg³y zmniejszeniu po 3 mies. stosowania HTZ w sposób statystycznie istotny dla wszystkich stymulatorów (p<0,0005).

Priming neutrofili niestymulowanych i stymulowa- nych fMLP, PMA i zymosanem, oceniany na podstawie stosunku ca³kowitych energii CL neutrofili preaktywowanych i spoczynkowych, zmniejszy³ siê œrednio po 3.

stosowania HTZ odpowiednio o 13, 30,4, 30,9 i 27,9%, a po 6 mies. œrednio o 16, 28,9, 29,9 i 27,4% (p<0,0005).

D

Dyyssk ku ussjja a

Analizuj¹c parametry chemiluminescencji zarówno neutrofili spoczynkowych, jak i preaktywowanych mo¿liwa sta³a siê ocena wp³ywu HTZ na priming neutrofili TNF-α. Wykazano, ¿e ju¿ 3-miesiêczne stosowanie hormonoterapii zastêpczej powoduje zmniejszenie zjawiska primingu neutrofili. Stwierdzona zale¿- noœæ nie znajduje odniesieñ w piœmiennictwie.

W dostêpnej literaturze mo¿na znaleŸæ jedynie prace poœwiêcone badaniu poziomów TNF-αu kobiet po menopauzie, jak i wp³ywowi hormonalnej terapii za- stêpczej na te poziomy.

Brooks-Asplund i wsp. stwierdzili 2-krotny wzrost stê¿eñ TNF-αpo zastosowaniu zarówno terapii estroge- nowej, jak i estrogenowo-gestagenowej [15].

Podobnie w badaniach Porter i wsp. w grupie 27 kobiet pomenopauzalnych, stosuj¹cych HRT estrogenowo-gestagenow¹, poziomy TNF-αby³y wy¿sze ni¿

w grupie kobiet niestosuj¹cych tej terapii [16].

Zupe³nie przeciwstawne wyniki uzyskali Bernard-Po- enaru i wsp., którzy w swoich badaniach odnotowali statystycznie istotny spadek wydzielania TNF-αprzez ko- mórki krwi obwodowej po 6 mies. stosowania HTZ [17].

(4)

P

Zmniejszenie produkcji wybranych cytokin pod wp³ywem 17β-estradiolu, w tym równie¿ TNF-α, uzyskano tak¿e w badaniach in vitro prowadzonych na ho- dowlach monocytów [18].

Wspomniane wy¿ej prace dostarczaj¹ sprzecz- nych wyników odnoœnie wytwarzania TNF-α u kobiet w okresie pomenopauzalnym stosuj¹cych HRT w porównaniu do kobiet bez tej terapii. O wiele bar- dziej wartoœciowe wydaj¹ siê byæ badania maj¹ce na celu ocenê skutków dzia³ania tej cytokiny na wybra- ne komórki.

Zmniejszony priming neutrofili TNF-αpo zastosowaniu hormonalnej terapii zastêpczej jest z jednej strony zjawiskiem korzystnym, poniewa¿ zmniejsza gene- racjê reaktywnych form tlenu przez te komórki, które to zwi¹zki wykazuj¹ dobrze znane cytotoksyczne, mu- tagenne i rakotwórcze w³aœciwoœci w starzej¹cym siê organizmie.

Z drugiej strony, zmniejszenie primingu neutrofili mo¿e powodowaæ upoœledzenie reakcji odpornoœcio- wych organizmu, a tak¿e zahamowanie apoptozy nie- prawid³owych, zmutowanych komórek.

Summary

Objective: To evaluate effects of selected HRT in postmenopausal women on priming of neutrophils by TNF-α, measured in peripheral blood using the method of chemiluminescency.

Material and methods: Study group consists of 46 postmenopausal women diagnosed and treated in Outpatient Clinic and Clinical Department of Gynaecology and Menopausal Diseases in our Institute. Oxydative burst of neutrophils was evaluated in 20 µl peripheral blood sample before, after 3 and 6 months of this therapy. Oxydative burst was observed after neutrophils acivation with stimulators: fMLP, PMA and zymosan with or without previous preactivation with 10 ng TNF-α. Chemiluminescency associated with oxydation burst was measured with Luminometr 1251, BioOrbit, Turku, Finland in stable temperature during 30 minutes (15 readings).

Results: After 3 months of HRT treatment priming with TNF-αdecrecreased by 13, 30.4, 30.9 i 27.9%, and after 6 months by 16, 28.9, 29.9 i 27.4% (p<0.0005).

Conclusions: Hormonal replacement therapy has influence on neutrophils priming by TNF-α. After therapy priming is decreased.

Key words: neutrophils, TNF-α, priming, HRT

P

Piiœœmmiieennnniiccttwwoo

1. Zeman K. The role for tumour necrosis factor-αin the induction of human polypolymorphonuclear neutrophil chemiluminescence. Immunol Lett 1996;

53: 45-50.

2. Carswell EA, Old LJ, Kassel RL, et al. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc Natl Acad Sci USA 1975; 72: 3666-70.

3. Aggarwal BB, Kohr WJ, Haas PE. Human tumour necrosis factor production, purification and characterisation. J Biol Chem 1985; 260: 2345-54.

4. Spies T, Morton CC, Nedospasov. Genes for the tumor necrosis factor αand βare linked to human major histocompatybility complex. Proc Natl Acad Sci USA, 1986; 83: 8699-8708.

5. Smith JA. Neutrophils, host defense, and inflammation: a double-edged sword.

J Leukocyte Biol 1994; 56: 672-91.

6. Frei B. Reactive oxygen species and antioxidant vitamins: Mechanism of action.

Mer J Med 1994; 97: Supl 3A: S5.

7. Perusia B, Kobayashi M, Rossi ME, et al. Immune interferon enhances functional properties of human granulocytes: role of Fc receptors and effect of lymphotoxin, tumor necrosis factor and granulocyte-macrophage stimulating factor. J Immunol 1987; 138: 765-74.

8. Guthrie LA, McPhail LC, Henson PM, et al. Priming of neutrophils for enhanced release of oxygen metabolites by bacterial lipopolysaccharide: evidence for increased activity of the superoxide-producing enzyme. J Exp Med 1984;

160: 1656-71.

9. Cross AS, Lowell GH, Palmblad JC, et al. Mechanism of priming of human neutrophils by a soluble lymphoblastic cell factor. J Immunol 1985; 135:

2074-9.

10. Ogle JD, Noel JG, Sramkoski RM. Adhesive effect of certain cytokines and other perturbants on human neutrophils. Inflammation 1992; 16: 603-12.

11. Wiles ME, Dykens JA, Wright CD. Human neutrophil (PMN) oxygen radical production and cytoskeleton. Life Sci 1995; 57: 1533-46.

12. Elbim C, Bailly S, Chollet-Martin E, et al. Differential priming effects of proinflammatory cytokines on human neutrophil oxidative burst in response to bacterial N-formyl peptides. Infect. Immun 1994; 62: 2195-201.

13. Buttke TM, Sandstrom PA. Oxidative stress as a mediator of apoptosis.

Immunol Today 1994; vol. 15, No 1: 7-10.

14. Tchórzewski H. Zapalenie – pocz¹tek czy koniec choroby? Alergia Astma Immunologia 1996; 1: 29-34.

15. Brooks-Asplund EM, Tupper CE, Daun JM, et al. Hormonal modulation of interleukin-6, tumor necrosis factor and associated receptor secretion in postmenopausal women. Cytokine 2002; 19 (4): 193-200.

16. Porter VR, Greendale GA, Schocken M, et al. Immune effects of hormone replacement therapy in post-menopausal women. Exp Gerontol 2001; 36 (2):

311-26.

17. Bernard-Poenaru O, Roux C, Blanque R, et al. Bone-resorbing cytokines from peripheral blood mononuclear cells after hormone replacement therapy:

a longitudinal study. Osteoporos Int 2001; 12 (9): 769-76.

18. Rogers A, Eastell R. The effect of 17beta-estradiol on production of cytokines in cultures of peripheral blood. Bone 2001; 29 (1): 30-4.

A

Addrreess ddoo kkoorreessppoonnddeennccjjii

Klinika Ginekologii i Chorób Menopauzy Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki ul. Rzgowska 281/289

93-338 £ódŸ tel. +48 42 271 15 07 e-mail: kgcm@interia.pl