Medycyna Wet. 2006, 62 (9) 1073
Praca oryginalna Original paper
Jednym z podstawowych elementów wiatowego Programu Zachowania Zasobów Genetycznych Zwie-rz¹t Gospodarskich FAO jest zinwentaryzowanie wia-towych zasobów genetycznych, które umo¿liwi moni-torowanie i identyfikowanie ras zagro¿onych wyginiê-ciem oraz opracowanie programów ich zachowania. Zasoby genetyczne zwierz¹t gospodarskich utrzymywa-nych w Polsce s¹ znaczne, ka¿dy z gatunków reprezen-towany jest przez kilkakilkanacie ras, odmian i linii, wród których wystêpuje szereg cennych ras rodzimych (lokalnych), odznaczaj¹cych siê specyficznymi cecha-mi u¿ytkowycecha-mi i unikatowym genotypem. W maju 2000 r. Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi zaakcepto-wa³ do realizacji 32 programy hodowlane obejmuj¹ce 75 ras, odmian i rodów gospodarskich. W populacji owiec programem ochrony zasobów genetycznych ob-jêto 13 ras i odmian: wrzosówkê, winiarkê, owcê ol-kusk¹, wielkopolsk¹, pomorsk¹, kamienieck¹, corrie-dale, leine oraz polsk¹ owcê górsk¹ odmiany barwnej, polsk¹ owcê nizinn¹ odmiany ¿elazneñskiej, polsk¹ owcê nizinn¹ odmiany uhruskiej, merynosa odmiany barwnej i merynosa booroola.
Kryzys, jaki dotkn¹³ w latach dziewiêædziesi¹tych polskie owczarstwo, doprowadzi³ do znacznego spad-ku pog³owia owiec, nastêpstwem czego mog³o byæ ogra-niczenie zmiennoci genetycznej niektórych ras owiec hodowanych w kraju. Uwa¿a siê zatem za celowe pod-jêcie dzia³añ na rzecz odbudowy i doskonalenia war-toci hodowlanej krajowego pog³owia owiec, a szcze-gólnie tej grupy zwierz¹t, które mog¹ stanowiæ
rezer-wê genetyczn¹ dla takich cech, jak: zdrowotnoæ, p³od-noæ i plenp³od-noæ. Dzia³ania te powinny obj¹æ równie¿ kompleksow¹ analizê ich struktury genetycznej przy wykorzystaniu mo¿liwie najwiêkszej liczby markerów genetycznych, co pozwoli na zachowanie bioró¿norod-noci badanych owiec w stadach zachowawczych. Do-tychczas analiza struktury genetycznej owcy rasy wrzo-sówka przeprowadzona by³a na podstawie grup krwi i polimorficznych bia³ek, nie wykonano natomiast ta-kiej analizy na podstawie markerów mikrosatelitarnych DNA (6). Celem badañ by³o podjêcie próby scharakte-ryzowania owcy rasy wrzosówka na podstawie analizy polimorfizmu 14 sekwencji mikrosatelitarnych DNA zalecanych przez FAO do oceny bioró¿norodnoci owiec.
Materia³ i metody
Badania przeprowadzono na 73 owcach rasy wrzosówka pochodz¹cych z terenów po³udniowej Polski. Próbki krwi od tych zwierz¹t przekazywane by³y w latach 2001-2002 do Dzia-³u Immuno- i Cytogenetyki Zwierz¹t w celu wykonania ba-dañ kontroli rodowodów.
Do analizy polimorfizmu DNA wybrano 14 loci (BM757, BM827, BM6526, BM8125, OarAE129, OarCP20, OarCP34, OarFCB20, OarFCB48, OarFCB128, OarFCB304, OarHH35, OarHH47, OarHH64) wchodz¹cych w sk³ad zestawu zaleca-nego przez FAO do oceny bioró¿norodnoci owiec.
Na bazie wyizolowanego genomowego DNA amplifikacjê sekwencji z wybranych loci wykonano metod¹ ³añcuchowej reakcji polimerazowej (PCR) przy u¿yciu fluorescencyjnie znakowanych starterów. Sekwencje starterowe do powiele-nia fragmentów DNA z analizowanych loci pozyskano z
in-Genetyczna charakterystyka owcy rasy wrzosówka
na podstawie 14 markerów mikrosatelitarnych DNA
ANNA RADKO, TADEUSZ RYCHLIK, EWA S£OTA
Dzia³ Immuno- i Cytogenetyki Zwierz¹t Instytutu Zootechniki, ul. Krakowska 1, 32-085 Balice Radko A., Rychlik T., S³ota E.
Genetic characterization of the wrzosówka sheep breed on the basis of 14 microsatellite DNA markers
Summary
The genetic characterization of the wrzosówka sheep breed was performed on the basis of microsatellite DNA markers. 73 sheep were typed with a set of 14 microsatellites (BM757, BM827, BM6526, BM8125, OarAE129, OarCP20, OarCP34, OarFCB20, OarFCB48, OarFCB128, OarFCB304, OarHH35, OarHH47, OarHH64) recommended by the FAO for biodiversity studies. The analyzed microsatellite markers were characterized by a high polymorphism in the studied material. Except for locus OarAE129, which shows the lowest variation (H=0.485 and PIC=0.368), the calculated H and PIC values exceeded 0.5. The highest poly-morphism was characteristic of locus OarAE128 and OarHH47 (H=0.837, PIC=0.817 and H=0.827, PIC=0.807). The high polymorphism of selected DNA microsatellite sequences (with H and PIC values averaging 0.711 and 0.670 respectively) and the probability of excluding the wrong parent based on all analyzed markers (99.96%) are clear evidence that they are useful for parentage control of wrzosówka sheep.
Medycyna Wet. 2006, 62 (9) 1074
ternetowej bazy danych http://www.projects.roslin.ac.uk/ sheepmap. Uzyskane produkty PCR poddawano rozdzia³owi elektroforetycznemu w 4% ¿elu poliakryloamidowym w la-serowym sekwenatorze ABI PRISM 377. Wyniki rozdzia³u elektroforetycznego analizowano przy pomocy programu komputerowego GeneScan 2.1., natomiast wielkoci ziden-tyfikowanych alleli okrelono w programie Genotyper 2.0.
Na podstawie czêstoci wystêpowania poszczególnych alleli sekwencji mikrosatelitarnych wyliczono stopieñ hete-rozygotycznoci H (7), indeks stopnia polimorfizmu PIC (3) oraz prawdopodobieñstwo wykluczenia ojcostwa z uwzglêdnieniem mo¿liwoci przebadania obydwu osobni-ków rodzicielskich PE (5) dla ka¿dego locus. Obliczono równie¿ ³¹czne prawdopodobieñstwo wykluczenia ojcostwa PEC na podstawie wszystkich 14 badanych loci.
Wyniki i omówienie
Owca rasy wrzosówka jest jedn¹ z najstarszych ras rodzimych, któr¹ charakteryzuje ³atwa adaptacja do zró¿nicowanych warunków klimatyczno-rodowisko-wych, ma³e wymagania w zakresie ¿ywienia i warun-ków chowu, du¿a ¿ywotnoæ i odpornoæ na choroby, wczesne dojrzewanie p³ciowe, asezonowoæ oraz wy-równany poziom owulacji i plennoci. Ponadto, rasê tê cechuje doskona³a jakoæ skór oraz wyj¹tkowo specy-ficzny smak miêsa. Wrzosówka zaliczana by³a niegdy do grupy owiec o znacznym udziale w pog³owiu kra-jowym, jednak w okresie powojennym zaniechano hodowli tej rasy, co spowodowa³o, ¿e trafi³a ona do hodowli zachowawczej.
W przedstawionych badaniach dokonano próby oce-ny struktury genetycznej owcy rasy wrzosówka na pod-stawie analizy markerów mikrosatelitarnych DNA. Markery te ze wzglêdu na du¿¹ czêstoæ wystêpowania w genomie (dotychczas u owiec zidentyfikowano po-nad 1800 sekwencji mikrosatelitarnych, wysoki stopieñ polimorfizmu oraz stosunkowo ³atw¹ i szybk¹ identy-fikacjê, przy u¿yciu reakcji PCR i analizy produktu amplifikacji w sekwenatorach DNA) sta³y siê najlicz-niejsz¹ klas¹ markerów genetycznych, które znalaz³y szerokie zastosowanie do analizy zmiennoci genetycz-nej miêdzy ró¿nymi rasami owiec (1, 2, 4, 8-10). W koordynowanym przez FAO Programie MoDAD Analiza Ró¿norodnoci Biologicznej Zwierz¹t Gospo-darskich wybrano 27 sekwencji mikrosatelitarnych, któ-re zaleca siê do badania zmiennoci genetycznej owiec. Na podstawie czêstoci wystêpowania alleli warunku-j¹cych poszczególne markery mikrosatelitarne mo¿na obliczyæ, miêdzy innymi, takie wskaniki, jak stopieñ polimorfizmu i stopieñ heterozygotycznoci. Wskani-ki te umo¿liwiaj¹ z kolei oszacowanie zmiennoci ge-netycznej ró¿nych ras owiec. Ocena zmiennoci gene-tycznej i stopnia heterozygotycznoci mo¿e byæ pomoc-na przy wyborze zwierz¹t do hodowli dla zachowania ich biologicznej ró¿norodnoci oraz przy ustalaniu opty-malnego wariantu krzy¿owania w celu uzyskania mak-symalnego efektu heterozji. Badania polimorfizmu, jak najwiêkszej liczby markerów genetycznych pozwalaj¹ tak¿e na ledzenie i monitorowanie zmian, jakie
zacho-dz¹ w strukturze genetycznej okrelonych populacji owiec pod wp³ywem prowadzonej pracy hodowlanej.
W badanej populacji owiec w obrêbie badanych 14 markerów mikrosatelitarnych, wchodz¹cych w sk³ad
i c o L Allel Czêstoæ Loci Allel Czêstoæ 7 5 7 M B 6 7 1 0,123 8 4 B C F r a O 8 4 1 0,110 8 7 1 0,39 150 0,555 0 8 1 0,192 152 0,062 2 8 1 0,253 154 0,041 4 8 1 0,041 156 0,096 7 2 8 M B 6 1 2 0,164 158 0,137 8 1 2 0,596 8 2 1 B C F r a O 199 0,075 2 2 2 0,185 109 0,075 4 2 2 0,055 111 0,247 6 2 5 6 M B 2 6 1 0,411 113 0,212 4 6 1 0,116 121 0,041 6 6 1 0,082 123 0,075 8 6 1 0,233 125 0,158 0 7 1 0,158 127 0,116 5 2 1 8 M B 2 1 1 0,075 4 0 3 B C F r a O 2 6 1 0,021 6 1 1 0,445 164 0,267 8 1 1 0,055 166 0,240 0 2 1 0,342 172 0,212 2 2 1 0,082 180 0,110 9 2 1 E A r a O 144 0,418 188 0,151 6 4 1 0,582 5 3 H H r a O 9 1 1 0,212 0 2 P C r a O 1 7 0,253 121 0,089 3 7 0,178 123 0,466 5 7 0,082 125 0,041 7 7 0,253 127 0,110 3 8 0,103 131 0,021 7 8 0,041 133 0,062 9 8 0,089 7 4 H H r a O 9 2 1 0,048 4 3 P C r a O 4 1 1 0,192 131 0,137 6 1 1 0,363 139 0,247 8 1 1 0,137 141 0,178 2 2 1 0,103 143 0,178 4 2 1 0,205 145 0,144 0 2 B C F r a O 9 8 0,055 153 0,068 3 9 0,096 4 6 H H r a O 4 2 1 0,055 5 9 0,171 128 0,253 7 9 0,322 132 0,096 9 9 0,041 134 0,596 1 0 1 0,151 5 0 1 0,164
Tab. 1. Czêstoæ wystêpowania zidentyfikowanych alleli w badanych 14 mikrosatelitarnych loci DNA
Medycyna Wet. 2006, 62 (9) 1075
zestawu zalecanego przez FAO do oceny bioró¿norod-noci owiec, ustalono 78 alleli, które wykazywa³y zró¿-nicowane rozmieszczenie w poszczególnych loci, od 2 do 8 alleli (tab. 2). W oparciu o wyliczone czêstoci wystêpowania zidentyfikowanych alleli, podanych w tab. 1, obliczono wartoci wskaników H i PIC (tab. 2). Otrzymane wyniki wykaza³y, ¿e badane mar-kery charakteryzuj¹ siê wysokim stopniem polimorfiz-mu. rednie wartoci wspó³czynnika heterozygotycz-noci i indeksu polimorfizmu dla wszystkich badanych loci osi¹gnê³y wysokie wartoci równe odpowiednio 0,711 i 0,670. Wyj¹tek stanowi³ locus OarAE129, dla którego ustalono jedynie 2 allele i otrzymano najmniej-sze wartoci badanych wskaników równe 0,485 i 0,368 odpowiednio dla H i PIC. W pozosta³ych loci oma-wiane wskaniki przyjê³y wartoci wy¿sze ni¿ 0,5. Najwy¿szym polimorfizmem odznacza³y siê loci OarFCB128 oraz OarHH47, dla których wskaniki H i PIC osi¹gnê³y wartoci równe odpowiednio 0,837 i 0,817 oraz 0,827 i 0,807. Inne badania przeprowa-dzone przez Tomasco i wsp. (9) oraz Cerita i wsp. (4) na ró¿nych populacjach owiec równie¿ wykaza³y wy-soki polimorfizm loci OarFCB128 i OarHH47 o wska-nikach H i PIC wy¿szych od wartoci 0,7.
Na podstawie czêstoci zidentyfikowanych alleli przeprowadzono tak¿e analizê przydatnoci badanych markerów do kontroli pochodzenia. Miar¹ przydat-noci poszczególnych markerów genetycznych do we-ryfikacji pochodzenia jest prawdopodobieñstwo wyklu-czenia niew³aciwego rodzicielstwa PE. Prawdopo-dobieñstwo wykluczenia oszacowane dla ka¿dego z 14 badanych loci, z uwzglêdnieniem mo¿liwoci przeba-dania obydwu osobników rodzicielskich podano w tab. 2. Najwy¿sze wartoci równe 0,677 i 0,658
otrzy-mano, odpowiednio, dla OarFCB128 i OarHH47 od-znaczaj¹cych siê najwy¿szym polimorfizmem, nato-miast najni¿sz¹ wartoæ wynosz¹c¹ 0,184 dla OarAE129 o najni¿szym polimorfizmie. PE wyliczone na podsta-wie wszystkich 14 loci ³¹cznie osi¹gnê³o wartoæ 0,9996, co oznacza, ¿e zastosowanie w kontroli pocho-dzenia ³¹cznie wszystkich badanych markerów gene-tycznych daje mo¿liwoæ wykluczenia niew³aciwego rodzica z 99,96% prawdopodobieñstwem. Podobne badania przeprowadzone na podstawie 10 loci mikro-satelitarnych, w tym 7 wykorzystanych w badaniach w³asnych, wykaza³y równie wysokie prawdopodobieñ-stwo wykluczenia na poziomie 99,9% (9).
W przeprowadzonej analizie polimorfizmu DNA owcy rasy wrzosówka, sporód 14 wybranych marke-rów mikrosatelitarnych przeznaczonych do okrelania bioró¿orodnoci owiec, stwierdzono wysoki polimor-fizm 13 sekwencji mikrosatelitarnych DNA, dla któ-rych oszacowane wartoci stopnia heterozygotycz-noci i polimofizmu by³y wy¿sze od wartoci 0,5, co wiadczy o du¿ej przydatnoci tych markerów do ana-lizy bioró¿norodnoci owiec rasy wrzosówka. Ograni-czon¹ przydatnoæ do tych badañ stwierdzono jedynie dla locus OarAE129, dla którego w badanej rasie owiec zidentyfikowano tylko 2 allele.
Wyliczone wysokie prawdopodobieñstwo, z jakim mo¿na wykluczyæ niew³aciwego rodzica na podstawie analizowanych markerów wskazuje, ¿e mog¹ one byæ wykorzystane w kontroli rodowodów owiec rasy wrzo-sówka. Ewentualne wprowadzenie w przysz³oci w Pol-sce polimorfizmu mikrosatelitarnego do kontroli pocho-dzenia owiec nale¿a³oby jednak poprzedziæ szerszymi badaniami, obejmuj¹cymi wszystkie markery zalecane przez FAO do analizy polimorfizmu DNA, na ró¿nych rasach owiec. Badania takie mia³yby na celu wyzna-czenie odpowiedniego zestawu wysokopolimorficz-nych loci, gwarantuj¹cych wysokie prawdopodobieñ-stwo wskazania b³êdów w rodowodach.
Pimiennictwo
1.Achmann R., Brem G.: Parentage control in austrian domestic mountain sheep (Ovis aries) using DNA microsatellite analysis. Anim. Genet. 1998, 29, 12-13. 2.Arranz J., Bayon Y., San Primitivo F.: Genetic relationships among Spanish
sheep using microsatellites. Anim. Gen. 1998, 29, 435-440.
3.Botstein D., White R. L., Skolnicki M., Davis R. W.: Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorhisms. Am. J. Hum. Genet. 1980, 32, 314-331.
4.Cerit H., Altinel A., Elmaz O., Avanus K.: Polymorphism evaluation of various genomic loi in the kivircik sheep breed of Turkey. Turk J. Vet. Anim. Sci. 2004, 28, 415-425.
5.Jamieson A.: The genetics of transferrin in cattle. Heredity 1965, 20, 419-441. 6.Janik A., Rychlik T., Duniec M.: Struktura genetyczna krajowych ras owiec pod wzglêdem grup krwi i polimorficznych wariantów bia³ek. Rocz. Nauk. Zoot. 1996, 23, 43-57.
7.Nei M., Roychoudhury A. K.: Sampling variances of heterozygosity and genetic distance. Genet. 1974, 76, 379-390.
8.Radko A., Rychlik T.: Polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych DNA u owiec rasy Berrichone du Cher. Rocz. Nauk. Zoot. 2003, 17, 105-108.
9.Tomasco I., Wlasiuk G., Lessa E. P.: Evaluation of polymorphism in ten micro-satellite loci in Uruguayan sheep. Genetics Mol. Biol. 2002, 25, 37-41. 10.Zamorano M. J., Ruiter J., Townsend S., Cruickshank R., Bruford M., Byrne K.,
Rodero A., Vega-Pla y J. L.: Polimorfismos de DNA en Las Razas Ovinas Merino Y Churra Lebrijana. Arch. Zootec. 1998, 47, 267-272.
Adres autora: dr in¿. Anna Radko, ul. Bitschana 2/5, 31-416 Kraków; e-mail: arys@izoo.krakow.pl
Tab. 2. Zakres d³ugoci w parach zasad (pz), liczba alleli, he-terozygotycznoæ (H), indeks stopnia polimorfizmu (PIC) oraz prawdopodobieñstwo wykluczenia (PE) dla badanych loci
i c o L d³ugZaokrceis(pz) Laicllzebila H PIC PE 7 5 7 M B 176-184 5 0,730 0,686 0,494 7 2 8 M B 216-224 4 0,581 0,533 0,342 6 2 5 6 M B 162-170 5 0,732 0,692 0,505 5 2 1 8 M B 112-122 5 0,669 0,613 0,417 9 2 1 E A r a O 144-146 2 0,485 0,368 0,184 0 2 P C r a O 171-89 7 0,813 0,788 0,632 4 3 P C r a O 114-124 5 0,760 0,724 0,541 0 2 B C F r a O 189-105 7 0,803 0,777 0,619 8 4 B C F r a O 148-158 6 0,647 0,617 0,439 8 2 1 B C F r a O 199-127 8 0,837 0,817 0,677 4 0 3 B C F r a O 162-188 6 0,791 0,759 0,586 5 3 H H r a O 119-133 7 0,712 0,679 0,500 7 4 H H r a O 129-153 7 0,827 0,807 0,658 4 6 H H r a O 124-134 4 0,568 0,513 0,329
