WSZ EC HŚWI AT

WSZ EC HŚWI AT

■***]} PISMO PRZYRODNICZE

Tom 94 Nr 5 Maj 1993

Gen m ęskości

M odliszki i n ieto p erze Biotechnologiczna ow ca

Wydano z pomocą finansową Komitetu Badań Naukowych

Treść zeszytu 5 (2353)

H. K r z a n o w s k a , Jak poszukiwano genu determ inującego pleć męską człow ieka... 109 M. J. K a t k o w s k a, Hodgkin i Huxley — droga do s ł a w y ... 112 P. I n d y k i e w i c z , G enialnyśm ieciarz( ? ) ... 1 1 7 H . S ż a r s k i , Jeszcze raz o pokrewieństwach kręgowców lą d o w y c h ... 121 T. T w a r d o w s k i , „Bankowe” depozyty m ikro o rg an izm ó w ... 122 K. S i u c i ń s k i, Indukcja transformacji nowotworowych kom órek in vitro przez promieniowanie

jo n iz u ją c e ... ! 2 3 E. K o ś m i e k i , Kompozycje roślinne. Próba estetyki o g r o d u ... 1 2 5 Drobiazgi

Wystąpienie tarcznika Aspidiotus destnictor Signoret na okazach draceny (W. Karnkowski) . 127 Modliszki wiedzą, że dzwonią, ale nie wiedzą, w którym kościele (J. L a t i n i ) ... 128 N apęd cyklu komórkowego (Z. P o la ń s k i) ... 1 2 9 Wszechświat przed 100 laty (oprać. J G V ) ... 1 3 0 R o z m a ito śc i... 132 Recenzje

Encyklopedia M ćm o Larousse: Wszechświat i Ziemia. Fauna i Flora (W. Mizerski) ... 133 U . E. Z i m m e r, A. H a n d e l : Guide de la faunę et de la florę de nos rćgions (B. Prędota) 133 Komunikaty

Zaprzyjaźnione czasopisma: K o sm o s... 1 3 4

* * *

O k ł a d k a : MŁODA SOWA USZATA A sio otiis. Fot. D. Karp

(sekretarz). Członkowie: Stefan W. AIexandrowicz, W incenty Kilarski, Adam Kotarba, Halina Krzanowska, Barbara Płytycz, Adam Zając, Kazimierz Zarzycki

Kom itet redakcyjny: Jerzy V etulani (redaktor naczelny), Halina Krzanowska (z-ca redaktora naczelnego), Stefan W . A lexandrow icz, Barbara Płytycz, A dam Zając, Wanda Lohman (sekretarz redakcji)

A dres Redakcji: R edakcja C zasopism a Wszechświat, 31-118 Kraków, ul. Podwale 1, tel. (12) 22-29-24

PR ZEP ISY D L A A U T O R Ó W

1. W stę p

W szechśw iat je s t p ism em u p o w szechniającym w ied zę p izyrodniczą, przeznaczonym dla w szystkich interesujących się postępem n auk p izy ro d n iczy ch , a

zw łaszcza m ło d zieży licealnej i akadem ickiej. i

W szech św ia t zam ieszcza op raco w an ia pop u larn o n au k o w e ze w szystkich dziedzin nauk przyrodniczych, ciekaw e obserw acje przyrodnicze o raz fotografie i zap rasza d o w sp ó łp racy w szy stk ich ch ętn y ch . W szechśw iat nie je s t je d n a k czasopism em zam ieszczającym oryginalne dośw iad czaln e prace naukow e.

N ad sy łan e d o W szech św ia ta m ateriały s ą recen zo w an e p rzez redaktorów i specjalistów z odpow iednich dziedzin. O ich p iz y ję ciu do d ru k u decyduje o s ta te c z n e K o m itet R ed ak cy jn y , po u w zg lęd n ien iu m erytorycznych i popularyzatorskich w artości pracy. R ed ak cja zastrzega so b ie praw o w prow adzania sk ró tó w i m odyfikacji sty listy czn y ch . P o czątk u jący m au to ro m R edakcja będzie niosła pom oc w opracow aniu m ateriałów lu b w y jaśn iała pow o d y od rzu ce­

nia pracy.

2 . T y p y p ra c

W szechśw iat d rukuje m ateriały w p ostaci artykułów , drobiazgów i ich cykli, rozm aitości, fotografii na ok ład k ach i w ew n ątiz num eru o ra z listów do R edakcji. W szechśw iat zam ieszcza ró w n ież recenzje z książek przyrodniczych oraz krótkie w iadom ości z życia śro d o w isk p iz y ro d n iczy ch w Polsce.

A rtyla iiy po w in n y stan o w ić oryg in aln e opracow ania na p rzystępnym poziom ie naukow ym , napisane żyw o i interesująco ró w n ież dla laika. N ie m ogą o g raniczać się do w ied zy po d ręczn ik o w ej. P o żądane je s t ilustrow anie artykułu fotografiam i, rycinam i kreskow ym i lub sch em atam i. O dradza się sto so w a­

nie tabel, z w łaszcza je ż e li m o g ą być p rzedstaw ione ja k o w ykres. W arty k u łach i innych rodzajach m ateriałów nie um ieszcza się w tekście odnośników d o p iśm ien n ictw a, n aw et w form ie: (A utor, rok), z w y jątk iem odnośników d o prac publikow anych w e w cześniejszych num erach W szechśw iata (w form ie: "p a trz W szech św ia t rok, tom , stro n a"). O b ow iązuje n ato m iast podanie źródła ptzedrukow yw anej lub p izerysow anej tabeli bądź ilustracji o raz — w p rzypadku op raco w an ia opierająceg o się na p o jedynczym artykule W innym czasopiśm ie — odnośnika dotyczącego całeg o źródła. P iz y p rzygotow y­

w an iu a rty k u łó w ro czn ico w y ch n ależy p am iętać, że nie m o g ą się o ne, ze w zg lęd u na cykl w ydaw niczy, ukazać w cześniej n iż 4 m iesiące p o ich zło żen iu do R ed ak cji.

A rty k u ły (ty lk o one), s ą op atizo n e o p raco w an ą p raez R edakcję - n o tk ą biograficzną. A utoizy artykułów pow inni p odać do k ład n y adres, ty tu ł naukow y, stan o w isk o i nazw ę zak ład u pracy, o raz inform acje, k tó re chcieliby zam ies'ćić w notce. Ze w zględu na sk ro m n ą o b jęto ść czasopism a artykułu nie p ow inien b y ć dłu ższy n iż 9 stron.

D ro b ia zg i s ą k rótkim i a rty k u łam i, liczącym i 1— 3 stro n m aszynopisu. R ów nież i tu ilustracje s ą m ile w idziane. W szechśw iat zach ęca d o publikow ania w tej fo rm ie w ła sn y c h o b serw acji.

C yk l stan o w i kilka D ro b ia zg ó w p isan y c h na je d e n tem at i ukazujących się w kolejnych num erach W szechśw iata. C h ętn y ch do opracow ania cyklu p ro sim y o w cześn iejsze poro zu m ien ie się z R edakcją.

R o zm a ito ści s ą krótkim notatkam i o m aw iający m i najciekaw sze prace ukazujące się w m iędzynarodow ych czaso p ism ach p rzy ro d n iczy ch o najw yższym standardzie. N ie m ogą o ne być tłu m aczen iam i, ale p ow inny być oryginalnym i opracow aniam i. Ich objętość w ynosi 0.3 d o 1 stro n y m aszynopisu.

O b o w iązu je p o d an ie źró d ła (sk ró t tytułu czaso p ism a, rok, tom : strona).

R e c e n zje z k siążek m u szą być interesu jące d la czy teln ik a: ich celem je st dostarczanie now ych w iadom ości p izyrodniczych, a nie inform acji o książce.

N ależy pam iętać, że ze w zg lęd u na cy k l redakcyjny i listę czekających w kolejce, recenzja ukaże się zapew ne w tedy, kiedy om aw iana książka ju ż d aw no z n ik n ie z rynku. O b ję to ść recenzji nie pow inna p rzein aczać 2 stro n m aszynopisu.

K ro n ika d ru k u je k rótkie (d o 1.5 stro n y ) notatki o ciek aw szy ch sym pozjach, konferencjach itd. N ie je s t to kronika tow arzyska i d lateg o p rosim y nie robić w y liczan k i au to ró w i referatów , p o m ijać tytuły naukow e i n ie ro zw o d zić się nad cerem oniam i otw arcia, a raczej p o w iad o m ić czytelnika, co ciek aw eg o w y sz ło z om aw ian ej im prezy.

L is ty d o R e d a k c ji m o g ą być ró żn eg o typu. T u dru k u jem y m. in. uw agi dotyczące artykułów i innych m ateriałów dru k o w an y ch w e W szechśw iecie.

O b jętość listu nie pow inna p iz ek raczać 1.5 stro n y m aszynopisu. R edakcja zastizeg a sobie praw o selekcji listów i ich edytow ania.

F o to g ra fie pizezn aczo n e do ew entualnej publikacji na ok ład ce lub w ew nątrz num eru m ogą być czarno-białe lub kolorow e. K ażde zd jęcie pow inno być p o dpisane na o d w ro cie. P o d p is p o w in ien zaw ierać n azw isko i adres autora i proponow any tytuł zdjęcia. N ależy p o d ać d atę i m iejsce w ykonania zdjęcia. P iz y fo to g rafiach z w ie iz ą t i roślin należy p o d ać nazw ę gatu n k o w ą p o lsk ą i łacińską. Za praw idłow e o znaczenie od p o w ied zialn y je s t fo to g rafu ­ ją c y .

3. F o rm a n a d sy ła n y c h m a te ria łó w

R edakcja pizy jm u je d o d ru k u tylko staran n ie w y k o n an e, łatw o czytelne m aszynopisy, przygotow ane zgodnie z P o lsk ą N o rm ą (3 0 linijek na stronę, ok. 6 0 u d e iz e ń na linijkę, stro n y n um erow ane na g órnym m arginesie, lew y m argines conajm niej 3 cm , ak ap ity w cięte na 3 spacje), napisane pizez czam ą, św ież ą taśm ę. B a n lz o ch ętnie w id z im y prace przygotow ane na kom puteize. W ydruki kom puterow e po w in n y być w yso k iej ja k o śc i (N L Q lub H Q ) i pisane na św ieżej taśm ie.

T ab ele n ależy pisać nie w tekście, ale k a żd ą na osobnej kartce. N a osobnej kartce należy też napisać spis rycin w raz z ich objaśnieniam i. R yciny m ożna p iz y sy ła ć albo ja k o fotografie, alb o ja k o rysunki kreskow e w tuszu, na kalce technicznej. Pow inny być po n u m ero w an e i p o dpisane z tyłu lub na m arginesie ołów kiem .

Fo to g rafie ilustrujące a rty k u ł m u szą b yć popraw ne technicznie. Pizy jm u jem y zarów no zdjęcia czarno-białe, ja k i kolorow e (p o zy ty w y i negatyw y).

M ateriały p ow inny być przysyłane z je d n ą kopią. K o p ie m aszynopisów i rycin, ale nie oryginały, m o g ą być kserogram am i. K opie rycin s ą m ile w idziane, ale n ie o b ow iązkow e.

Z aakceptow ana praca po recenzji i n an iesieniu u w ag redakcyjnych zostanie zw rócona d o autora celem p izygotow ania w ersji ostatecznej. Przesłanie o statecznej w e rsji na d y sk ietce znaczn ie p izy sp ieszy u k azanie się p racy drukiem .

P race n ależy n ad sy łać na adres R ed ak cji (P o d w ale 1, 3 1 -118 K raków ). R ed ak cja w zasadzie nie zw raca nie zam ó w io n y ch m ateriałów .

4. H o n o ra ria

O p u b lik o w an e prace s ą honorow ane z g o d n ie z ak tualnym i staw kam i W ydaw nictw a. P onadto au to r otizy m u je bezpłatnie je d e n e g ze m p la iz W szechśw ia­

ta z w y d ru k o w an y m m ateriałem .

W ydaw nictw o Platan, 32-060 Liszki, Kryspinów 189.

PISMO POLSKIEGO TOWARZYSTWA PRZYRODNIKÓW IM. KOPERNIKA WYDAWANE PRZY WSPÓŁUDZIALE POLSKIEJ AKADEMII UMIEJĘTNOŚCI

TOM 94 ROK 112

MAJ 1993 ZESZYT 5

(2353)

HALINA KRZANOWSKA (Kraków)

JAK POSZUKIWANO GENU DETERMINUJĄCEGO PŁEĆ MĘSKĄ CZŁOWIEKA*

U wszystkich gatunków rozdzielnopłciowych w prawidłowych warunkach każdy osobnik zostaje zróżnicowany jako samica lub samiec, jakkolwiek mechanizmy prowadzące do osiągnięcia tego stanu m ogą być różne. Jak jednak wykazują obecne badania, genetyczną kontrolę determinacji płci można sprowadzić do ogól­

nego schem atu i przedstawić w trzech etapach (ryc. 1). Pierwszy etap stanowi sygnał wywoławczy, który działa jak „przełącznik”

nastawiający rozwój organizmu według typu żeńskiego lub m ę­

skiego. Sygnałem tym m oże być czynnik środowiskowy (np. u żółwi jest nim tem peratura otoczenia) lub genetyczny, jak obec­

ność pewnych chromosom ów (genów) albo wzajemne stosunki między nimi, np. u muszki owocowej Drosopliila melanogaster decydujący jest stosunek liczby chromosomów X do liczby auto- somów (czyli wszystkich chromosom ów z wyłączeniem chrom o­

somów płci), u ssaków zaś taki sygnał stanowi obecność chro­

m osom u Y. E ta p drugi to uruchom ienie kaskady genów regula­

torowych, z których każdy pobudza lub ham uje aktywność nas­

tępnego z serii. I dopiero ostatni z nich urucham ia etap trzeci, oddziałując na geny odpowiedzialne już bezpośrednio za zróżni­

cowanie się narządów i struktur płciowych.

Badania nad determinacją płci i różnicowaniem się cech płcio­

wych dotyczą wielu ważnych problem ów biologicznych o ogól­

nym znaczeniu, ja k precyzyjna kontrola ekspresji genów, auto­

regulacja, m ierzenie wartości progowych, interakcje i koordyna­

cje komórkowe. Dopiero od niedawna zaczynamy poznawać m o­

lekularne mechanizmy leżące u podstaw tych procesów. U m u­

szki owocowej, jednego z najlepiej zbadanych obiektów genety­

cznych, opisano różne m utanty o fenotypie wskazującym na za­

burzenia determ inacji płci, co umożliwiło poznanie kluczowych genów regulatorowych, z których wiele ju ż sklonowano, a nawet posłużono się nimi do uzyskania osobników transgenicznych.

Samice D. melanogaster mają dwa chromosomy X, samce zaś jeden chromosom X i jeden Y. Determ inacja płci nie zależy jednak od obecności chrom osom u Y, lecz od stosunku liczby

I n nr

SYGNAŁ KASKADA GENÓW r ó ż n i c o w a n ie

WYWOŁAWCZY —►

REGULATOROWYCH CECH PŁCIOWYCH

^rodowiskowu C np. tern pena tum)

Chromosomowy lub jenowy

►Rt—♦Ruf

,D« • ,D ł - 't > , -

‘‘Dif -

‘■Ds'

O dczyt wygłoszony na posiedzeniu wydziałów Przyrodniczego, M edycznego i M atem atyczno-F izycznego PAU w dniu 23 marca 1993 r.

Ryc. 1. Trzy etapy genetycznej kon tro li determ inacji płci (wg M cL aren 1988, zm ienione)

chromosomów X do liczby zespołów autosomów, czyli stosunku X/A, który u samicy wynosi 1:1 a u samca 1:2 (ryc. 2.).

U samic D. melanogaster, jeszcze w okresie zarodkowym, mieszczące się w obu chromosom ach X geny regulatorowe pro­

dukują białka, które rozpoznają sekwencje zasad D N A w pro ­ m otorze nadrzędnego genu regulatorowego Sxl, dzięki czemu działają jako czynniki transkrypcyjne urucham iające jego aktyw­

ność. Gen Sxl koduje białko łączące się z prekursorem m R N A i umożliwiające w ciągu dalszego rozwoju funkcjonalną obróbkę (splicing) zarówno własnego produktu (Sxl) , jak i następnego w kaskadzie genu tra. Ten z kolei oddziałuje na produkt genu dsx w taki sposób, że powstaje białko tego genu typu żeńskiego (ryc. 2).

U samców natom iast, obecność jednego tylko chrom osom u X nie wystarcza do wprowadzenia w stan aktywności genu Sxl, wskutek czego produkt zarówno Sxl jak i tra jest niefunkcjonal­

ny, a transkrypt genu dsx podlega alternatywnej obróbce pro­

wadząc do powstania białka typu męskiego. Okazało się więc, że w wyniku tej regulacji produkty tych samych genów m ogą być różne u samic niż u samców.

Jak na tle tych zaawansowanych badań przedstawiają się na­

sze wiadomości o determinacji płci u człowieka? O d dawna wia­

domo, że osobniki żeńskie (podobnie jak u muszki owocowej) mają dwa jednakow e chrom osom y płci (X X ) i produkują ko-

X X A A ( X /A = M )

J

Y X A A

(x/A = 1:Z)

funkcjonalne

produKł^ tira obróbka x r a

białko d»x

4 q p q i . e ^ s k f f c ^ o

biettko olsx tj^pu. męskiegones

Ryc. 2. K askada głównych genów regulatorow ych biorących udział w d eterm in a­

cji płci u D. melanogaster. Sxl i tra funkcjonują tylko u samic, co decyduje o produkcji białka dsx typu żeńskiego, n ato m iast u sam ców alternatyw na obróbka transkiyptu dsx prow adzi d o w ytworzenia białka typu m ęskiego (wg H odgkina 1990, zm ienione)

mórki jajowe z chrom osom em X , natom iast samce (X Y ) pro ­ dukują połowę plemników z chrom osom em X , połowę z chro­

mosom em Y; od tego, jaki plemnik zapłodni kom órkę jajową, zależy płeć potom ka. Przez długi czas przypuszczano, że podob­

nie ja k u muszki owocowej, determ inacja płci zależy od stosun­

ku liczby chrom osom ów X do autosom ów . D opiero w 1959 r.

zostały opracowane m etody analizy chrom osom ów, co um oż­

liwiło badanie osobników nietypowych, z zaburzeniam i chrom o­

somów płci. Stwierdzono wówczas, że osobnicy X X Y (zespół chorobowy Klinefeltera) są płci męskiej, zaś X O (zespół Turne­

ra) płci żeńskiej. O ba te zespoły prowadzą do niepłodności, gdyż

— jak się później okazało — obecność drugiego chrom osom u X u mężczyzn pow oduje zam ieranie sperm atogoniów zaraz po urodzeniu osobnika, natom iast u kobiet brak drugiego chrom o­

somu X przyczynia się do zam ierania oocytów. W każdym razie stało się jasne, że w chrom osom ie Y m usi się mieścić jakiś czyn­

nik (gen), który odgrywa kluczową rolę w determ inacji płci m ę­

skiej. Czynnik ten został nazwany TD F (ang. Testis Determining Factor). TSki sam typ dziedziczenia stwierdzono także u innych ssaków, w tym u myszy, m ałp i zwierząt domowych.

Poszukiwania genu determ inującego płeć m ęską ssaków przy­

pom inają rozwiązywanie fascynującej zagadki kryminalnej: ko­

lejno stawiane hipotezy musiały być odrzucane w świetle coraz to nowych odkrywanych faktów, aż wreszcie rok 1990 przyniósł, jak się wydaje, rozstrzygnięcie tego problem u, do czego przy­

czyniły się przede wszystkim badania dotyczące człowieka i my­

szy laboratoryjnej.

Najpierw, od 1975 r. panowała powszechnie bardzo atrakcyj­

na — jak się początkowo wydawało — hipoteza, iż gen TDF jest u ssaków r*'vnozńaczny z genem kodującym antygen zgodności tkankowej f l-Y , który powoduje odrzucanie przeszczepu tka­

nek samca przez samicę, nawet w obrębie jednego szczepu wsob­

nego, a więc przy całkowitej zgodności wszystkich innych genów.

O definitywnym odrzuceniu tej hipotezy zadecydowało dopiero w 1984 r. zidentyfikowanie zmutowanych osobników u myszy, które były wprawdzie samcami, ale nie produkowały antygenu H -Y . Stało się więc oczywiste, że gen kodujący H -Y jest od ­ rębnym genem od TDY, jakkolwiek są one blisko siebie poło­

żone w chromosom ie Y.

Trzeba było zaczynać poszukiwania od początku. Punktem wyjścia były nienormalności chromosom owe, powodujące wy­

kształcenie płci żeńskiej u osobników z niekompletnym chrom o­

som em Y, lub płci męskiej mimo braku tego chrom osom u na preparatach cytologicznych. Nienormalności te, jak się później okazało, powstają najczęściej wskutek nietypowego przebiegu Crossing over między chromosomami X i Y podczas mejozy.

Chromosom y X i Y koniugują ze sobą terminalnie, tzn. na bar­

dzo niewielkim końcowym odcinku (ryc. 3), w którym są hom o­

logiczne. Odcinek ten określany bywa jako region pseudoau- tosomowy, gdyż zlokalizowane w nim sekwencje D N A posia­

dają swe odpowiedniki zarówno w chrom osom ie X , jak i Y, toteż dziedziczą się jak geny autosom owe, a nie jak geny sprzę­

żone z płcią.

U człowieka gen TD F mieści się w krótkim ramieniu chro­

mosom u Y, w pobliżu regionu pseudoautosom owego, o czym przekonano się analizując płeć osobników z ubytkami fragm en­

tów tego chrom osom u. Jest to lokalizacja bardzo niefortunna, gdyż przy zdarzającym się czasem „głębokim” Crossing over, wy­

kraczającym poza region homologii, gen ten może zostać prze­

niesiony na chrom osom X (ryc. 3). Jeżeli plemnik z takim chro­

mosom em zapłodni jajo z normalnym chrom osom em X, to po­

wstanie osobnik o kariotypie XX , ale posiadający gen TD F i wobec tego płci męskiej (oczywiście, niepłodny ze względu na obecność dwu chromosomów X). N atom iast po zapłodnieniu jaja plemnikiem z chromosomem Y pozbawionym czynnika TDF, powstanie osobnik o kariotypie X Y , ale płci żeńskiej (również niepłodny ze względu na brak drugiego chrom osom u X).

Analizując nienormalności spowodowane „głębokim” Cros­

sing over, a także różnymi delecjami lub translokacjami, starano się określić minimalny region chrom osom u Y, który musi być obecny u mężczyzn o kariotypie X X , ale którego nie może po ­ siadać osobnik płci żeńskiej o kariotypie X X , W tym czasie dys­

ponowano ju ż wieloma sondami D N A specyficznymi dla chro­

m osom u Y, była też znana lokalizacja odpowiadających im re­

gionów na m apie tego chrom osom u. Stosując 135 sond D N A wyznaczających różne regiony chromosomu Y, oraz m etodę kro­

czenia wzdłuż chromosom u (chromosomu walking) określono, iż gen TDF musi się u człowieka mieścić w krótkim ramieniu chrom osom u Y, w obrębie sekwencji D N A o długości 280 000 nukleotydów, przyległej do regionu pseudoautosom owego (ryc.

4). W 1987 r. został tam zidentyfikowany gen kodujący białko o charakterze czynnika transkrypcyjnego o 13 „palcach cynkowych”, mających zdolność wiązania się ze specyficznymi sekwencjami D N A Nazwano go Z F Y (ang. Z inc Finger o f the Y chromoso- m e) i wydawało się, że jest to wreszcie poszukiwany gen TDF.

G en Z F Y został znaleziony w chrom osom ie Y u wszystkich badanych ssaków, okazało się, że ma on także wysoce homologi­

czne odpowiedniki w chrom osom ie X . Jednak ju ż w roku 1989 hipoteza o roli Z F Y jako genu determ inującego płeć u czło­

wieka została obalona, gdy wykazano brak tego genu u trzech mężczyzn o kariotypie X X . Zidentyfikowano u nich natom iast w chrom osom ie X fragm ent o długości 60 000 nukleotydów, po­

chodzący z odcinka chrom osom u Y bezpośrednio przyległego do regionu pseudoautosom owego (ryc. 4b). Tam więc należało poszukiwać właściwego genu TDF. W rok później, po znalezie­

niu następnych m arkerów DNA, region poszukiwań został za­

wężony do 35 000 nukleotydów (ryc. 4c). I wreszcie w odcinku tym, oprócz wielu powtarzalnych sekwencji DNA, bardzo blisko regionu pseudoautosom owego znaleziono sekwencję (ryc. 4d), która jak dotąd spełnia wszystkie założenia teoretyczne, aby być długo poszukiwanym genem TDY.

Jest to sekwencja nazwana S R Y (ang. Sex-detennining Re­

gion o f the Y chrom osom e), obejmująca odcinek, który koduje białko zawierające bardzo konserwatywny fragment (domenę) złożony z 80 aminokwasów. Jest on homologiczny do domeny białka Mc biorącego udział w wyznaczaniu typu koniugacyjnego u drożdży Schisosaccharomyces pom be (!), a mającej zdolność wiązania się ze specyficzną sekwencją DNA. Na tej podstawie można sądzić, iż gen S R Y jest genem regulatorowym, którego produkt kontroluje aktywność innych genów biorących udział w determinacji płci. Opisano ju ż przypadek kobiety o kariotypie

x y

i t

x x

TDF

y

TDF

Ryc. 3a. Schem at koniugacji chrom osom ów X -Y u człowieka; region pseudoau- tosomowy, w któiym zachodzi Crossing o\cr (x) zaznaczono linią przerywaną, puste kółko oznacza centrom er, ciem ne kółka geny TDF; b. w wyniku praw i­

dłowego Crossing over pow stają plem niki z chrom osom em X oraz plem niki z chrom osom em Y i genem TDF; c. w wyniku nietypowego „głębokiego” Crossing over gen T D F zostaje przeniesiony z jednej chrom atydy Y na jed n ą chrom atydę X i pow stają 4 typy plem ników, z których dwa są nieprawidłowe: jed en z nich zaw iera chrom osom X z genem TDF, drugi chrom osom Y pozbawiony tego genu (częściowo wg M cL aren 1988)

XY, u której właśnie w obrębie genu S R Y zidentyfikowano de- lecję 4 zasad, co prawdopodobnie stało się przyczyną utraty fun­

kcji genu wskutek przesunięcia fazy odczytu (czyli zmiany zna­

czenia kolejnych kodonów). U ojca tej kobiety gen S R Y był nie- zmutowany.

I 280 0 0 0 p i 1

a

\_cr

«000p:

Y i

|* / o

*^—35000 p* -i

C = = = 3

!T

PY 5 1 3

I >| f-

I I I I I d * T

J -H0 P1 k

m t

SRY —

‘3 ’

Ryc. 4. Lokalizow anie genu determ inującego płeć u człowieka: a — schem at chrom osom u Y, Y p — ram ię krótkie, Yq — długie, kreskowany region pseu- doautosom owy; b — m apa fragm entu 280 0000 p ar zasad (pz) z genam i Z F Y i SRY; c — mapa odcinka 35 000 pz (czarno zaznaczone sondy użyte d o badań; w obrębie sondy pY 53.3 mieści się gen SR Y ); d - diagram sondy pY 53.3: w obrębie genu S R Y czarno zam alowany fragm ent 240 pz kodujący 80-am inokw a- sową dom enę o charakterze czynnika transkrypcyjnego (a i b na podstaw ie M ac- L aren 1988, zm ienione; c i d wg S in clair i in. 1990, uproszczone)

Gen 57?Y jest konserwatywny ewolucyjnie, występuje w chro­

mosomie Y u wszystkich zbadanych dotąd ssaków. U myszy, analizując przy pomocy hybrydyzacji in situ kom plem entarne do sekwencji S R Y cząsteczki m RNA, wykazano, iż ekspresja tego genu następuje w komórkach zawiązka gonady w 11,5 dniu ży­

cia płodowego myszy, czyli w okresie bezpośrednio poprzedzają­

cym różnicowanie się płciowe gonady. A więc zarówno czas, jak i miejsce ekspresji wskazują na rolę S R Y w determinacji płci męskiej.

Wreszcie rok 1991 przyniósł bezpośrednie potwierdzenie toż­

samości determinującego płeć genu T D Y i genu SRY: po w pro­

wadzeniu do przedjądrza zapłodnionych jaj myszy odcinka D N A o długości 14 000 par zasad z genem S R Y uzyskano szereg zwie­

rząt transgenicznych, a wśród nich trzy sam ce o kariotypie XX.

Wprawdzie nie wszystkie osobniki X X posiadające kopie S R Y były samcami, ale fakt uzyskania osobników pozytywnych wyda­

je się dowodem wystarczającym, aby uznać ten gen za determ i­

nujący płeć męską.

Oczywiście, złudne byłyby spekulacje, że tą m etodą można dowolnie „produkować” norm alne samce. Wiemy przecież, że osobniki męskie X X są bezpłodne z powodu obecności dodat­

kowego chromosom u X. Otrzymane transgeniczne sam ce X X były także sterylne. Doświadczenie to nie miało więc znaczenia praktycznego, natom iast było doniosłe z punktu widzenia p o ­ znawczego jako dowód na rolę genu S R Y w wyznaczaniu płci męskiej.

Jednak identyfikacje genu TDF to dopiero początek badań nad determinacją płci ssaków. W iadomo bowiem, że gen ten musi współdziałać z szeregiem innych, tworząc prawdopodobnie

„kaskadę regulatorową” ja k u muszki owocowej. Wskazują na to przypadki, w których mim o obecności norm alnego chrom o­

somu Y, płeć męska nie zostaje wykształcona. U ssaków pozna­

no dotąd zaledwie kilka z tych genów, które m ogą być zlokalizo­

wane zarówno w chromosom ie X, jak w autosom ach.

U lemingów Myopus scliisticolor występują dwa rodzaje chro­

mosomów X: normalny oraz krótszy, z ubytkiem fragm entu krót­

kiego ramienia oznaczony X*. Samcami są tylko osobniki XY,

natom iast zarówno XX, XX *, jak X *Y są samicami. Wynika z tego, że w normalnym chrom osom ie X musi występować gen, który — w obecności chrom osom u Y — jest też niezbędny dla wykształcenia płci samca.

N atom iast u myszy wykryto przynajmniej dwa geny autoso- mowe, których obecność jest konieczna dla zróżnicowania się gonady męskiej. Okazało się bowiem, iż po skrzyżowaniu sam ­ ców myszy posiadających chrom osom Y z podgatunku M us musculus domesticus (Y do) z samicami szczepu laboratoryjnego C57BL/6J (M. rru musculus) rodzą się osobniki X Y będące sa­

micami lub hermafrodytami; te ostatnie m ają jajnik oraz ovote- stis czyli narząd składający się z zarówno z tkanek typowych dla jądra, jak i tkanek jajnikowych. Analiza różnych krzyżówek wy­

kazała, że w jednym z autosom ów znajduje się gen, którego allel występujący w szczepie C57BL/6J nie w spółpracuje prawidłowo z chrom osom em Ydo. W innych krzyżówkach zidentyfikowano jeszcze dwa geny o podobnym działaniu.

Oprócz tych genów zaangażowanych bezpośrednio w deter­

minację płci, równie ważną rolę odgrywają geny jeszcze „niższe­

go rzędu”, kierujące różnicowaniem się narządów rozrodczych i d ru g o - oraz trzeciorzędowych cech płciowych. W iadomo, że o prawidłowym wykształceniu tych cech u ssaków decyduje kieru­

nek różnicowania się gonady. Powstaje ona we wczesnym okre­

sie zarodkowym z zawiązka utw orzonego przez komórki som a­

tyczne, do którego wmigrowują komórki prapłciowe i tylko te ostatnie dadzą początek wszystkim kom órkom rozrodczym: ja ­ jom lub plemnikom. Początkowo gonada jest jednakow a u obu płci, a jej dalsze zróżnicowanie zależy od kierunku rozwoju linii kom órek somatycznych typu podporowego. Jeżeli zawierają one chromosom Y, to przekształcają się w komórki Sertoliego indu­

kując rozwój em brionalnego zawiązka gonady w jądro: komórki prapłciowe różnicują się wtedy w sperm atogonia, zaś komórki

sterydogenne w komórki Leydiga produkujące horm on płciowy męski, testosteron, odpowiedzialny za zapoczątkowanie szeregu dalszych procesów związanych ze sperm atogenezą i wykształce­

niem cech męskich osobnika.

Natom iast w braku chrom osom u Y gonada różnicuje się ja ­ ko jajnik, co prowadzi do wykształcenia płci żeńskiej. W tym przypadku komórki prapłciowe stają się oocytami, które ju ż w okresie zarodkowym wchodzą w profazę mejotyczną, a otacza­

jące je komórki podporowe przekształcają się w komórki pęche­

rzykowe (folikularne); komórki sterydogenne zaś biorą udział w tworzeniu torebki pęcherzyków jajnikowych i produkują ho r­

mony płciowe żeńskie.

Jak z tego wynika, zasadniczą rolę w prawidłowym wykształ­

ceniu cech płciowych odgrywa układ hormonalny. Jego funkcjo­

nowanie zaś m oże być upośledzone genetycznie. N a przykład zarówno u ludzi, jak u myszy, osobniki X Y będące nosicielami sprzężonej z chrom osom em X mutacji T fm (ang. testicular fe- m inization), tzw. zespołu feminizujących jąder, mają fenotyp żeń­

ski, mimo posiadania jąder. M utacja ta powoduje bowiem pro­

dukcję defektywnego receptora dla testosteronu, wskutek czego

— mim o iż horm on ten jest syntetyzowany w normalnych iloś­

ciach — nie m oże on pełnić funkcji; w rezultacie komórki roz­

rodcze obum ierają, a męskie cechy płciowe zależne od testoste­

ronu nie mogą się rozwinąć. Wykształcenie prawidłowej płci wy­

maga więc precyzyjnie regulowanej aktywności szeregu genów, z których zaledwie kilka udało się zidentyfikować. M utacja któ­

regokolwiek z nich może prowadzić do zaburzeń lub nawet „od­

wrócenia” płci.

Wpłynęło 6 I V 1993

Halina Krzanowska jest profesorem i kierownikiem Zakładu Gene­

tyki i Ewoldcjonizmu w Instytucie Zoologii UJ.

M ARIA JOLANTA KATKOWSKA (Toruń)

HODGKIN I HU XLEY - DROGA DO SŁAWY

Odkrycia, które przyczyniły się do uzyskania w 1991 r. Nagrody Nobla przez E. N ehera i B. Sakm anna (patrz Wszechświat 1992, 93:59), sięgają korzeniami do osiągnięć badawczych uzyskanych przez innych laureatów tej Nagrody — Hodgkina i Huxleya.

W 1963 roku N agroda Nobla w dziedzinie medycyny i fizjo­

logii przypadła w udziale dwóm angielskim uczonym, A. L. Hodg- kinowi i A. F. Huxleyowi, a także fizjologowi australijskiemu Johnowi Carew Ecclesowi. Hodgkin i Huxley N agrodę tę otrzy­

mali za badania dotyczące przewodnictwa nerwowego i ruchów jonów w czasie pobudzenia błony nerwowej, przy okazji których wysunęli koncepcję kanałów jonowych. Tytuł wykładu Hodgkina wygłoszonego z okazji przyznania N agrody N obla brzm iał w pol­

skim tłum aczeniu — „Podstawy jonow e przewodnictwa nerw o­

wego”, a Huxleya — „Ilościowa analiza pobudzenia i przewod­

nictwa w nerw ie”.

Obydwaj uczeni przez wiele lat związani byli z Uniwersyte­

tem w Cam bridge i Royal Society. R enom a obu tych instytucji nie wymaga chyba kom entarza. Z nazwiskami Hodgkina i IIux- leya związane są pionierskie badania zjawisk bioelektrycznych za pom ocą mikroelektrodowej techniki wewnątrzkomórkowej. Są oni także twórcami, opartej na wcześniejszych badaniach B ern­

steina, teorii jonowej genezy potencjałów bioelektrycznych. Obaj w ogrom nej m ierze przyczynili się do poznania istoty pobudze­

nia i przewodzenia impulsów nerwowych.

Rozwinięta w końcu X IX wieku teoria dotycząca układu ner­

wowego stwierdzała, że zasadniczą funkcją kom órek nerwowych jest przenoszenie informacji pod postacią zm ian pola elektrycz­

nego w poprzek błony. Hodgkin najpierw zainteresował się w latach trzydziestych mechaniką impulsów nerwowych, a więk­

szość swych badań z Huxleyem poświęcił ilościowej i jakościowej charakterystyce potencjałów elektrycznych, co zaowocowało w efekcie wysunięciem przez obu uczonych koncepcji kanałów jo ­ nowych w ich klasycznej analizie prądów przepływających przez błony neuronów. Kolejne lata przyniosły wiele dowodów na to, że kanały jonow e rzeczywiście funkcjonują w błonach kom órko­

wych. Badanie pojedynczych kanałów jonowych oraz pom iar i rejestracja jednostkowych prądów płynących przez pojedyncze kanały błony komórkowej stały się możliwe jednak dopiero w latach siedemdziesiątych po opracowaniu przez N ehera i Sak­

m anna techniki stabilizacji potencjału skrawka błony {patch clamp). W dziedzinie badania błon pobudliwych teoria często wyprzedzała technologię i musiała czekać na nowe rozwiązania techniczne, aby uzyskać potwierdzenie lub zaprzeczenie.

Elektrofizjologia jest nauką mającą dwa podstawowe cele:

ścisłe obserwacje elektryczności wytwarzanej przez żywe tkanki w toku normalnej ich czynności oraz badanie, co się dzieje, kie­

dy prąd elektryczny przepływa przez żywe tkanki i wzbudza ich reakcje. Mianem pierwszego elektrofizjologa można określić Wło-

A lan Lloyd H odgkin u ro d ził się 15 lutego 1914 roku w hrabstwie Ox- fordshire, w miejscowości Banbury. Uczęszczał do szkoły G resham a w H olt, a następnie uzyskał dyplom w Trinity C ollege w Cam bridge w 1936 roku. W latach 1937/38 pracow ał przez rok w Instytucie R ockefellera w Nowym Yor­

ku i w L aboratorium B iologii M orza w W oods H o le w M assachusetts, prze­

bywając tam na zaproszenie H erb erta G assera. Tam rozpoczął swoje badania na kałam arnicy. Po pow rocie d o C am bridge rozpoczął w spółpracę z A. F.

Huxleyem , ale została ona przerw ana przez II wojnę światową, podczas któ­

rej H odgkin najpierw zajmował się pewnymi aspektam i medycyny lotniczej w Royal A irc ra ft Establishm ent w Farnborough, a następnie badaniam i nad echolokacją pow ietrzną w M alvern na zlecenie M inisterstwa Lotnictw a. Po w ojnie powróci! d o C am bridge, gdzie od roku 1945 był wykładowcą i zas­

tępcą D yrektora ds. B adań Naukowych w Z akładzie Fizjologii aż d o roku 1952, kiedy został profesorem (F o u lerto n R esearch Professor, Royal Society).

W roku 1970 H o d g k in przyjął obowiązki profesora biofizyki (Jo h n H um - phrey P lu m m er Professor) U niw ersytetu w C am bridge (do 1981 r.) i w kolej­

nym roku (1971) objął stanow isko R ektora U niw ersytetu w Leicester, które piastował d o czasu przejścia na em eiyturę w roku 1984. H odgkin je st człon­

kiem R oyal Society (w 1958 r. odznaczony M edalem Królewskim tego Towa­

rzystwa) i w o kresie 1970-75 był jeg o Prezesem. Jest o n też członkiem szere­

gu innych towarzystw o raz członkiem rzeczywistym i honorowym w ielu A k a­

dem ii N auk na całym świecie, a ponadto doktorem honoris causa w ielu uczel­

ni. N aukow o zajm ow ał się głów nie fizjologią przewodnictwa nerwowego i b adaniem elektrycznych odpow iedzi pręcików i czopków siatkówki. H o d g ­ kin je st żonaty o d 1944 r. O żen ił się z córką Peytona R ousa, M arion. M a trzy córki i jed n eg o syna.

V J

cha Ludwika Galvaniego, który w końcu X V III wieku wraz ze swoją żoną Łucją przeprowadził na żabie rewolucyjne doświad­

czenia z piorunochronem i baterią dowodzące, że prąd elektry­

czny wprawia mięśnie i nerwy w stan ożywionej aktywności ściśle przypominającej ich norm alne funkcjonowanie. Kolejnym kro­

kiem milowym na drodze elektrofizjologii było ogniwo Volty (około r. 1800), elektrom etr włosowaty czy bardziej czuły gal- w anom etr strunowy, opracowany przez Einthovena w 1902 r., i wreszcie, wprowadzony do biologii przez Gassera, Erlangera i Bishopa, oscyloskop katodowy, który pojawił się we wczesnych latach dwudziestych oraz zbudowany przez Gassera i Forbesa z Uniwersytetu Harvarda w tym samym mniej więcej czasie wzma­

cniacz. O d czasu odkryć Galvaniego biolodzy zastanawiali się czy jego „elektryczność zwierzęca” była czymś jedynym w swoim rodzaju, czy też można by ją objaśnić dobrze znanymi procesa­

mi fizykochemicznymi. Ju ż od połowy X IX wieku uważano, w związku z badaniam i nad osmozą, że w błonie istnieją pory i odtąd krok za krokiem zbliżano się do koncepcji kanałów jono­

wych. W oparciu o pośrednie obserwacje ju ż w drugiej połowie X IX wieku przeczuwano fakt, że wnętrze komórki jest elektry­

cznie ujem ne w stosunku do środowiska i że w czasie pobu­

dzenia następuje odwrócenie polaryzacji komórki. Przeczucie to ugruntowało się w pierwszej dekadzie naszego wieku. Overton (1902 r.) przeprowadził staranne doświadczenia dotyczące zna­

czenia wewnątrzkomórkowych jonów N a + dla aktywacji mięśnia i, przewidując pewną wymianę pomiędzy jonami K + włókna mięś­

niowego a jonam i N a + środowiska pozakomórkowego, przepo­

wiedział teorię jonową pobudzenia błony, która obecnie akcep­

towana jest przez wszystkich elektrofizjologów. Jednakże cał­

kowita prawidłowość tego stwierdzenia, prawie zapomnianego przez wiele lat, pozostawała nieudowodniona przez prawie 50 następnych lat. Również w pierwszej dekadzie X X wieku Julius Bernstein, eksperymentalny neurofizjolog, stworzył obszerną te ­ orię zmian przepuszczalności błony podczas pobudzenia mięśni i nerwów. Opierając się w dużej mierze na elektrochemicznych teoriach N ernsta (1889 r.), Bernstein próbował po raz pierwszy

A ndrew F ielding IIuxley, wnuk wybitnego X IX -w iecznego naukowca Thom asa IIuxleya, urodził się 22 listopada 1917 roku w Londynie. D roga jego kształcenia w iodła przez szkoły U niversity C ollege i W estm inster do Trinity C ollege (od 1935 r.) w Cam bridge, gdzie najpierw specjalizow ał się w naukach fizycznych. Studia ukończył w roku 1938, a tytuł magistra uzyskał w 1941 r. Ju ż w 1939 roku spotkał się z H odgkinem i zainteresow ał fizjologią.

Jego rozpoczęte b adania zostały przerw ane przez II w ojnę światową, w czasie której był on zaangażowany w b adania operacyjne na rzecz Dowództwa O b ­ rony Przeciwlotniczej (1940-42), a następnie dla A dm iralicji (d o 1945). Po swoim powrocie d o Cam bridge H uxley kontynuow ał z H odgkinem badania, które przyniosły później im obu N agrodę Nobla (1963). Huxley był najpierw dem onstratorem (tzn. asystentem przy profesorze; 1946-50) na U niw ersyte­

cie w C am bridge, a następnie został tam zastępcą D yrektora ds. B adań N a­

ukowych (1946-60), pełniąc jednocześnie w Trinity C ollege funkcję D yre­

ktora B adań (1951—59), przy czym przez rok był tam lektorem biofizyki doświadczalnej. W 1955 roku został wybrany członkiem Royal Society, a w roku 1980 objął po A leksandrze Toddzie urząd Prezesa tego Towarzystwa.

W międzyczasie przeniósł się d o U niversity C ollege w Londynie (1960), gdzie w 1969 roku otrzymał stanow isko profesora (Jo d rell Professor o f Phy- siology) i kierow nika Zakładu Fizjologii. J e s t o n członkiem rzeczywistym i honorowym w ielu A kadem ii N auk na całym świecie o raz szeregu towarzystw, ponadto doktorem honoris causa w ielu uczelni. W swoich badaniach zaj­

mował się analizą przewodnictwa nerwowego, w ram ach tego także badaniem skokowego przewodnictwa w obwodowych w łóknach nerwowych z osłonką mielinową, badał też strukturę m ięśni i zajmował się teo rią skurczu. P onadto w łasnoręcznie skonstruował nowego typu m ikroskop interferencyjny i udos­

konalił ultram ikrotom . H uxley je st żonaty od 1947 roku i ma pięć c ó rek oraz jednego syna.

stworzyć fizyczne podstawy aktywności żywych kom órek pobud­

liwych. Zasugerował on, że — przy założeniu asymetrycznego rozłożenia jonów po obu stronach błony — potencjał spoczyn­

kowy jest wynikiem selektywnej przepuszczalności błony nerwo­

wej dla jonów K +. O n również uważał, że potencjał czynnoś­

ciowy jest skutkiem załam ania się tej selektywności (przy ogól­

nym wzroście przepuszczalności błony dla wszystkich rodzajów obecnych jonów, a głównie N a +, K + i Cl-) tak, że transm em - branowy potencjał spada do zera, przy czym wyjściowa prze­

puszczalność dla K + zostaje przywrócona po przejściu impulsu.

Jego prace były w pewnym sensie kontynuow ane przez H odgki­

na i Huxleya, którzy przez wiele lat badali elektrochemiczne zachowania błon nerwowych. D opiero jednak w latach czter­

dziestych i pięćdziesiątych wprowadzono metody, które pozwo­

liły na ścisłe pomiary asymetrycznego rozłożenia jonów N a +, K + i C l' po obu stronach błony oraz potencjałów i prądów błono­

wych, potwierdzając jednocześnie jonow ą teorię transm em bra- nowych potencjałów, oraz doprowadziły do ujętej m atem atycz­

nie teorii tych zjawisk.

Sądzę, że dla nas, przyzwyczajonych do korzystania z drogiej skomplikowanej aparatury i często nie wyobrażających sobie w ogóle możliwości pracy i uzyskania wartościowych wyników bez niej, interesujące byłoby prześledzenie trudnej, a jednocześnie niewiarygodnie prostej drogi, która doprowadziła Hodgkina i Huxleya do odkryć, które otworzyły im drogę do grona laure­

atów Nagrody Nobla. Pełen szczerości, skromności i uwypukla­

jący bardziej zasługi innych niż własne wykład A. L. H odgkina wygłoszony na Zjeździe Tbwarzystwa Fizjologicznego w Cam brid­

ge w lipcu 1976 r., a więc w wiele lat po otrzym aniu Nagrody Nobla, o której zresztą w ogóle w swoim wykładzie nie wspomi­

na, mógłby być wzorem dla każdego z nas. Wykład ten był też dla autorki wielką pom ocą przy pisaniu tego < rtykułu, bo dzięki niemu możliwe stało się pokazanie tak wielkich u c z o n /c h ;a k Hodgkin i Huxley także jako ludzi, z całym balastem ich^proble- mów i wątpliwości.

Prześledzenie serii prac dotyczących przewodnictwa nerwo­

wego, napisanych przez Hodgkina i jego współpracowników w latach 1937-52 i później, może wywoływać wrażenie ścisłego ukierunkowania i planowania badań, co wcale nie pokrywa się z faktycznym przebiegiem wypadków. Często istotny był w tych badaniach elem ent przypadku, a nie starannego planowania i logiki. Najczęściej przemilcza się tę część, w której przypadek czy szczęście odegrały istotną rolę w tym, co następnie wydaje się raczej logicznym ciągiem zdarzeń.

H odgkin z całą skromnością przypisuje znaczny udział w je ­ go badaniach, przynajmniej tych pierwszych, przypadkowi, pro ­ wadzącemu w efekcie do logicznego rozwoju badań. Rozpoczął on pierwsze swoje badania jeszcze na studiach w 1934 r. Dzięki lekturze prac tak wybitnych uczonych, ja k m. in. A. V. Hill (che­

miczne przewodnictwo w nerwie; N agroda N obla — 1922), W.

J. V. O sterhout czy L. R. Blinks, który to stwierdził w zrost prze­

wodności błony w czasie potencjału czynnościowego u glonu Nitella (1930), Hodgkin skoncentrował swoje zainteresowania na błonach. Używając bardzo prostej aparatury, m. in. kimogra- fu, i preparatu nerwowo-mięśniowego żaby, w którym nerw był zablokowany wskutek miejscowego zam rożenia, zajął się bada­

niem przewodzenia nerwowego, starając się uzyskać dowód ist­

nienia transmisji nerwowej, co w pierwszej fazie badań mu się nie udało. W międzyczasie przeczytał wszystkie prace J. Erlan- gera i H . S. Gassera (laureatów N agrody N obla w 1944 r.), G.

H. Bishopa, H. T Graham a, R. Lorente de N ó oraz F. O. Schmit- ta i stwierdził, że ci wiodący badacze aksonu są bardzo sceptycz­

nie nastawieni do teorii błonowej w ogóle, a teorii prądu lokal­

nego w szczególności. H odgkin doszedł do wniosku, że warto byłoby zobaczyć czy przejściowy wzrost pobudliwości poza zlo­

kalizowanym blokiem jest efektem elektrycznym i zdecydował się podjąć taki projekt badawczy.

W tamtym okresie większość aparatury trzeba było zbudo­

wać samemu, wykorzystując własne umiejętności i inwencję. Brzmi to może deprymująco, ale takim nie było dla ówczesnych uczo­

nych. W dzisiejszych czasach naukowcy m ają skłonność do po­

padania we frustracje i zarzucania pracy, jeśli wiedzą, że ich aparatura jest znacznie gorsza niż innych. Rzeczywiście, uważa się za nieco nienaukowe wykonywanie doświadczeń za pomocą czegokolwiek innego oprócz najlepszej aparatury. Dla Hodgkina jednak, jedyne co liczyło się, to mieć ap aratu rę wystarczającą, aby zrobić coś nowego. Jest on może skrajnym przypadkiem w tym względzie, ale ogólne nastawienie do aparatury było z pew­

nością wtedy bardzo odm ienne od prezentowanego dzisiaj. Wy­

bitny fizyk J. A. Ratcliffe mówi, że w latach dwudziestych i trzy­

dziestych za doskonałą aparaturę czy doświadczenie uważano takie, które można było zbudować lub wykonać tanio. Twierdzi on, ilustrując to przykładami, że najlepszym badaniem jest to, które zostało wykonane w najprostszy sposób. Hodgkin uważał się za szczęściarza, bo odziedziczył po M atthewsie oscyloskop i inne oprzyrządowanie elektryczne, a wzmacniacz skonstruował sam wykorzystując jako obudowę kilka puszek po ciastkach. Z a ­ jęło mu to, przy braku wielu dzisiejszych udogodnień, sporo czasu, ale dumny był z efektu. Jesienią 1935 r. mógł ju ż rejes­

trować potencjały elektrotoniczne rozprzestrzeniające się przez zablokowany obszar nerwu. Nadal też udoskonalał swoją apara­

turę z lepszym lub gorszym skutkiem. W połowie 1936 r. H odg­

kin ukończył swoje główne doświadczenia i opisał ich wyniki w pracy dyplomowej dla Trinity College. Po otrzymaniu stypen­

dium spędził kilka miesięcy na powtarzaniu i udoskonalaniu do­

świadczeń, co zaowocowało 2 publikacjami w renomowanym czasopiśmie Journal o f Physiology (1937). Wnioski były w za­

sadzie prawidłowe, wyjąwszy ten dotyczący nerwu z osłonką mie- linową, gdzie, jak wiadomo, prąd jest ograniczony tylko do prze­

wężenia.

Przypadek i szczęście odegrały równie ważną rolę w kolejnej fazie badań Hodgkina. Zainteresow ał się on teorią kablową i właściwie równolegle z R ushtonem doprowadziło go to do idei odpowiedzi podprogowej. Zaniechał jednak przemyślanych sta­

rań, aby sprawdzić te idee i zamiast tego, zgodnie z sugestią profesora Adriana (Nagroda Nobla — 1932), zajął się nerwem kraba. Mial wiele szczęścia, bo bez pomocy odpowiedniego mi­

kroskopu udało mu się wyizolować pojedynczy akson o średnicy 30 /im; dopiero później pożyczył taki mikroskop. W krótce też stwierdził, że bodziec podprogowy wywołuje coś jakby mały sto­

pniowany potencjał czynnościowy, którego wielkość szybko roś­

nie, gdy bodziec osiąga wartość progową. Było to dokładnie to, co było niezbędne, aby wyjaśnić wyniki badań B ernarda Katza (N agroda N obla - 1970) i Hodgkinowi było ogrom nie miło, że uzyskał dowód na istnienie czegoś tak niezwykłego na owe cza­

sy, jak stopniowana odpowiedź pojedynczego włókna nerwowe­

go. Technika, którą dysponował nie była jednak wystarczająca do dalszych badań, ale pom oc znalazła się w zasięgu ręki, gdyż H erb ert G asser (ówczesny dyrektor Instytutu Rockefellera w Nowym Yorku) zaproponował mu odbycie rocznego stażu w jego grupie badawczej. Hodgkin miał tam dostęp do lepszej aparatury i możliwość współpracy z dobrymi elektronikami i wy­

bitnymi uczonymi, jak chociażby L orente de Nó, G rundfest czy H ursch. Instytut Rockefellera był w tym czasie ju ż bardzo wy­

bitnym laboratorium i dla Hodgkina bardzo wartościowym do­

świadczeniem była praca w dużym, dobrze zorganizowanym la­

boratorium , co pomogło mu przekształcić się, jak stwierdza, z am atora w profesjonalnego naukowca. Wielu ludzi tam pra­

cujących wywarło niezatarty wpływ na jego życie (np. O sterhout

— duże komórki roślinne, Michaelis — błony). Ale kontakt,

który miał największy bezpośredni wpływ na jego życie nau­

kowe, to spotkanie z Curtisem i Cole’m z Uniwersytetu Colum­

bia. Hodgkin pragnął dowiedzieć się czy przewodnictwo błono­

we zwiększa się podczas aktywności i uzyskał nawet pewne do­

wody na potwierdzenie tej tezy. Odkrywał rzeczy wydające się dzisiaj dla nas tak oczywistymi. Hodgkin był szczęśliwy, bo Cole zaprosił go do współpracy w Woods Hole (czerwiec 1938). W międzyczasie odwiedził on w St Louis J. Erlangera (Nagroda Nobla — 1944), który zupełnie nie wierzył w podprogową ak­

tywność w aksonach z osłonką mielinową i miał wątpliwości co do teorii prądów lokalnych. O kres pobytu w Instytucie Rocke­

fellera i W oods H ole był jednak bardzo owocny. Doświadczenia potwierdziły istnienie wzrostu przewodnictwa błonowego pod­

czas potencjału czynnościowego i udowodniły zmianę szybkości przewodnictwa przy zmianie rezystancji elektrycznej na zewnątrz włókna nerwowego (w wyniku zamiany oleju na wodę morską).

Hodgkin wykonał tam w raz z Curtisem kilka dalekowzrocznych doświadczeń, próbując wprowadzić przez obcięty koniec olbrzy­

miego aksonu kałamarnicy (średnica ok. 0,7 mm) do jego wnę­

trza elektrody, po czym obaj rozjechali się z myślą, że stosunko­

wo łatwo m ożna będzie zarejestrować potencjały czynnościowe używając wewnątrzkomórkowej elektrody. I tak w następnym roku obaj wykonali takie doświadczenia z różnymi partnerami.

Wyjeżdżając z Nowego Yorku Hodgkin otrzymał zawrotną na owe czasy dla młodego naukowca sumę 300 funtów brytyj­

skich na wyposażenie laboratorium , którą wykorzystał na zbu­

dowanie aparatury podobnej do używanej przez niego w Insty­

tucie Rockefellera. Z ajęło mu to kilka miesięcy. Z e względu na zbliżającą się w ojnę w E uropie Hodgkin uznał, że najlepiej bę­

dzie wybrać do badania jakieś proste zagadnienie, które pozos­

tawiłoby czas na nienaukową działalność. W tym okresie An- drew Huxley zaczął współpracować z Hodgkinem przy wykony­

waniu niektórych doświadczeń. Mierzyli oni zewnętrzne zmiany elektryczne w aksonach Carcinus i otrzymali potencjał spoczyn­

kowy jako stałą różnicę potencjałów między obszarem nieusz­

kodzonym a zdepolaryzowanym wskutek uszkodzenia lub zasto­

sowania izotonicznego KC1. Wykazali też, że potencjał czynnoś­

ciowy jest dużo większy niż spoczynkowy. T&kie sam e wyniki Hodgkin uzyskał na aksonie homara.

Wyniki badań wykonywanych przy użyciu elektrod zewną- trzkomórkowych nie dawały bezwzględnych wartości potencjału czynnościowego i spoczynkowego wskutek efektu krótkiego spię­

cia w zewnętrznym płynie, co jednak wpływało jednakowo na każdy z potencjałów.

Hodgkin zdecydował się kontynuować dalsze doświadczenia w Plymouth, ze względu na dostępność kałamarnic, dokąd w lipcu 1939 r. przewiózł swoją aparaturę. Po kilku tygodniach dołączył tam do niego Huxley i rozpoczął nieudane pomiary lepkości aksoplazmy, które jednak nasunęły m u pomysł, jak sto­

sunkowo łatwo m ożna wprowadzić szklaną kapilarę do olbrzy­

miego aksonu kałamarnicy Loligo forbesi i zarejestrować róż­

nicę potencjałów w poprzek powierzchniowej błony. U dało się to od razu, chociaż były problem y z ocieraniem się kapilary o powierzchnię błony. Huxley usprawnił to jednak wprowadzając 2 lusterka, co pozwoliło ustawiać wypełnioną w odą m orską ka­

pilarę z wprowadzoną do niej srebrną elektrodą w centralnej części aksonu. Rycina 1 AB pokazuje tę technikę. Wynikiem wykonanych w ten sposób doświadczeń był potencjał czynnoś­

ciowy wielkości blisko 100 m V czyli około 2-krotnie większy niż potencjał spoczynkowy — ok. 50 m V (ryc. 1 C). Hodgkin i Hux- ley zaobserwowali, że w nętrze komórki jest elektroujem ne (po­

tencjał spoczynkowy), a podczas impulsu nerwowego potencjał błonowy ulega odwróceniu i aksoplazma staje się dodatnia w stosunku do otaczającego roztworu. Był to ten pierwszy raz, kiedy zmiany elektryczne w poprzek błony komórkowej zostały

zarejestrowane i wykazane zostało bezspornie istnienie, zapo­

mnianego od czasów Bernsteina, nadstrzału, a stało się to m oż­

liwe dzięki zastosowaniu wewnątrzkomórkowej elektrody.

Hodgkin i Huxley byli ogromnie podnieceni tym odkryciem i możliwościami tej techniki. Było to rzeczywiście odkrycie o epo­

kowym znaczeniu dla elektrofizjologii. Uczeni rozpoczęli testo­

wanie wpływu jonów K + na potencjał spoczynkowy i czynnoś­

ciowy, badanie wykonane później (1942 r.) bardzo perfekcyjnie przez Curtisa i Cole’a. Jednakże w tym czasie Hitler wkroczył do Polski i rozpoczęła się wojna, a obaj badacze porzucili swoją technikę na 8 lat, tzn. do 1947 r., kiedy to możliwy stał się powrót do Plymouth.

W 1939 r. Hodgkin i IIuxley opublikowali krótkie, podsum o­

wujące ich odkrycia, doniesienie w Naturę, w którym przedsta­

wili pierwszy bezpośredni wewnątrzkomórkowy pomiar poten­

cjału transmembranowego, tak spoczynkowego, jak i czynnoś­

ciowego, w żywej komórce pobudliwej. Następnie przez pier­

wszych kilka miesięcy wojny próbowali wieczorami pracować nad pełną pracą. Prace nie posunęły się jednak zbyt daleko i publi­

kacja została ukończona dopiero pod koniec wojny. Po wojnie obaj uczeni kontynuowali swoją współpracę rozpoczętą w 1939 r. W tym okresie, zainspirowani pracą dotyczącą pośredniej m e­

tody pomiaru wypływu K + w czasie aktywności, zaczęli myśleć o ruchach jonów podczas impulsu nerwowego w kategoriach iloś­

ciowych. Pod koniec 1946 roku i w początkach 1947 spędzili wiele czasu zastanawiając się nad rodzajem systemu, który mógł­

by wywoływać potencjał czynnościowy. Ich początkowa hipoteza zakładała, że jony N a + są przenoszone przez błonę za pośred-

Ryc. 1. A , B. Zdjęcia elektrod rejestrujących wewnątrz niekom pletnie oczyszczo­

nego olbrzym iego aksonu kałam arnicy, w ykonane przed i p o udo sk o n alen iu te ­ chniki ich w prow adzania, tzn., odpow iednio, zdjęcie bez 2-lusterkow ego u rzą­

dzenia — oglądany w małym lusterku obraz z boku (A ) i zdjęcie wykonane przy użyciu podwójnego lusterka - o braz bezpośrednio z m ikroskopu (B). Jed n a podziałka skali = 33 ftm ,. C — potencjał spoczynkowy i czynnościowy rejestro­

wany m iędzy w nętrzem a pow ierzchnią aksonu za pom ocą widocznej powyżej (A, B) szklanej kapilary wypełnionej w odą morską; znacznik czasu 500 Hz. Ska­

la pionow a pokazuje potencjał w ewnętrznej elektrody w m iliw oltach (zm odyfi­

kow ane wg H odgkin i Huxley, 1945)