OVER D E SYNTHESE V A N
VASOACTIVE INTESTINAL
PEPTIDE
1 i- ¡ í !;: III ¡ i i: i 1 l l 1 i! ' i ! Ii i i 1 iiiiü lí l! II 1 "O BIBLIOTHEEK TU Delft P 1632 3229 C 471642
OVER DE SYNTHESE V A N
VASOACTIVE INTESTINAL
PEPTIDE
PROEFSCHRIFT
TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE TECHNISCHE WETENSCHAPPEN AAN DE TECHNISCHE HOGESCHOOL DELFT,
OP GEZAG VAN DE RECTOR MAGNIFICUS PROF. IR. B.P.Th. VELTMAN, VOOR EEN COMMISSIE AANGEWEZEN DOOR HET COLLEGE VAN DEKANEN TE VERDEDIGEN OP DONDERDAG 6 NOVEMBER 1980 TE 14.00 UUR
DOOR
A L E X A N D E R WILHELMUS BUIJEN V A N W E E L D E R E N
scheikundig ingenieur
geboren te Delft -A(o2>2. ^P^°\
Dit proefschrift is goedgekeurd door de promotor PROF. DR. H.C. B E Y E R M A N
Een ieder is zo knap als hij zich voelt, als u begrijp wat ik bedoelt.
Aan m i j n o u d e r s
H e t i n d i t p r o e f s c h r i f t b e s c h r e v e n o n d e r z o e k i s u i t g e v o e r d o n d e r auspiciën v a n de S t i c h t i n g " S c h e i k u n d i g O n d e r z o e k i n N e d e r l a n d " (SON) met financiële s t e u n v a n de N e d e r l a n d s e O r g a n i s a t i e v o o r Z u i v e r - W e t e n s c h a p p e l i j k O n d e r w i j s (ZWO).
Inhoud
AFKORTINGEN I N L E I D I N G EN DOELSTELLING 1 1. ALGEMENE I N L E I D I N G 3 1.1 V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P e p t i d e ( V I P ) , i s o l e r i n g , s t r u c t u u r - 3 o p h e l d e r i n g , a k t i v i t e i t en v o o r k o m e n 1.2 B e k e n d e s y n t h e s e n v a n V I P , f r a g m e n t e n en a n a l o g a 8 L i t e r a t u u r 122. OVER DE SYNTHESE VAN V I P 16 2.1 A l g e m e e n g e d e e l t e , s t r a t e g i e , k e u z e v a n de f r a g m e n t e n , 16 s y n t h e s e p l a n 2.2 S y n t h e t i s c h e m e t h o d e n 19 2.2.1 REMA m e t h o d e 19 2.2.2 C a r b o d i i m i d e s 21 2.2.3 A k t i e v e - e s t e r s 22 2.2.4 A z i d e m e t h o d e 22 2.3 Hoge d r u k v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i e (HPLC) 23 L i t e r a t u u r 24
3. SYNTHESE VAN DE FRAGMENTEN 3.1 F r a g m e n t 18-28 3.2 F r a g m e n t 14-17 3.3 F r a g m e n t 7-13 3.4 F r a g m e n t 1-6 3.5 E x p e r i m e n t e e l g e d e e l t e 3.5.1 A l g e m e n e g e g e v e n s 3.5.2 A l g e m e n e w e r k w i j z e n 3.5.3 G e s y n t h e t i s e e r d e s e q u e n t i e s L i t e r a t u u r 27 27 30 32 36 38 38 40 42 47
4. KOPPELING VAN DE FRAGMENTEN 49 4.1 I n l e i d i n g 49 4.2 De k o p p e l i n g v a n 14-17 aan 18-28 49 4.3 De k o p p e l i n g v a n 7-13 aan 14-28 51 4.4 De k o p p e l i n g v a n 1-6 aan 7-28 51 4.5 De k o p p e l i n g v a n 1-6 aan 7-13 52 4.6 De k o p p e l i n g v a n 1-13 a a n 14-28 52 4.7 E x p e r i m e n t e e l g e d e e l t e 54 4.7.1 A l g e m e n e g e g e v e n s en w e r k w i j z e n 54 4.7.2 F r a g m e n t k o p p e l i n g e n 55 L i t e r a t u u r 59
5. SYNTHESE VAN VASECTRINE I I I 60 5.1 I n l e i d i n g , s y n t h e s e 60 5.2 Z u i v e r i n g en k a r a k t e r i s e r i n g 62 5.3 B i o l o g i s c h en i m m u n o c h e m i s c h o n d e r z o e k 63 5.4 E x p e r i m e n t e e l g e d e e l t e 64 5.4.1 A l g e m e n e g e g e v e n s 64 5.4.2 K o p p e l i n g v a n V I P 1-13 aan s e c r e t i n e 14-27 64 L i t e r a t u u r 66 6. D I S C U S S I E EN CONCLUSIES 67 SAMENVATTING 72 SUMMARY 74
Afkortingen
In de g e b r u i k t e a f k o r t i n g e n z i j n z o v e e l m o g e l i j k d e a a n b e v e l i n g e n v a n d e IUPAC-IUB C o m m i s s i e v o o r B i o c h e m i s c h e N o m e n c l a t u u r g e v o l g d ( B i o c h e m i s t r y ( 1 9 7 2 ) 1 7 2 6 ) . De g e b r u i k t e a m i n o z u r e n h e b b e n d e L - c o n f i g u r a t i e . Boe : t e r t - b u t y l o x y c a r b o n y l t B u : t e r t - b u t y l BZ : o r t h o - b r o o m b e n z y l o x y c a r b o n y l B z l : b e n z y l CD : c i r c u l a i r d i c h r o i s m e CMCI : N - c y c l o h e x y l - N ' - B - ( N - m e t h y l m o r f o l i n o ) e t h y l - c a r b o d i i m i d e . p - t o l u e e n s u l f o n a a t CMCU : N - c y c l o h e x y l - N ' - B - ( N - m e t h y l m o r f o l i n o ) e t h y l - u r e u m . p - t o l u e e n s u l f o n a a t CZ : o r t h o - c h l o o r b e n z y l o x y c a r b o n y l DCCI : N , N ' - d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e DCHA : d i c y c l o h e x y l a m i n e DCU : N , N ' - d i c y c l o h e x y l u r e u m Ddz : a , a - d i m e t h y l - 3 , 5 - d i m e t h o x y b e n z y l o x y c a r b o n y l DLC : d u n n e l a a g c h r o m a t o g r a f i e DMF : N , N - d i m e t h y l f o r m a m i d e HMPT : h e x a m e t h y l f o s f o r z u u r t r i a m i d e HOAc : a z i j n z u u r HOBt : 1 - h y d r o x y b e n z o t r i a z o o l HOSu : N - h y d r o x y s u c c i n i m i d e HPLC : h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y Mbh : 4 , 4 ' - d i m e t h o x y b e n z h y d r y l Me : m e t h y l NB : 4 - n i t r o b e n z y l NMM : N - m e t h y l m o r f o l i n e NMR : n u c l e a i r m a g n e t i s c h e r e s o n a n t i e Np : 4 - n i t r o f e n y l ( i P r ) - E t N : d i i s o p r o p y l e t h y l a m i n e REMA : r e p e t i t i v e e x c e s s m i x e d a n h y d r i d e TEA : t r i e t h y l a m i n e TFA : t r i f l u o r a z i j n z u u r Tos : 4 - t o l u e e n s u l f o n y l Z : b e n z y l o x y c a r b o n y lInleiding en doelstelling
H e t g a s t r o i n t e s t i n a l e - en n e u r o p e p t i d e V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P e p t i d e ( V I P ) i s na z i j n o n t d e k k i n g i n 1 9 7 0 , i s o l e r i n g en s t r u c t u u r o p h e l d e r i n g h e t o n d e r w e r p g e w e e s t van s y n t h e t i s c h o n d e r z o e k . N i e t a l l e e n w i l d e men de v o o r g e s t e l d e s e -q u e n t i e ( z i e f i g . 1.2) b e w i j z e n , d o c h men was ook s t e r k g e i n t e r e s s e e r d i n b i o l o g i s c h v o l l e d i g a k t i e f s y n t h e t i s c h V I P d a t i n t e g e n s t e l l i n g t o t h e t n a t u u r -l i j k e m a t e r i a a -l n i e t v e r o n t r e i n i g d zou z i j n met nauw v e r w a n t e en m o g e -l i j k ook a k t i e v e p e p t i d e n .
I n 1973 i s B o d a n s z k y e r g r o t e n d e e l s i n g e s l a a g d een 2 8 - p e p t i d e met de v o o r v a r k e n s V I P v o o r g e s t e l d e s e q u e n t i e t e s y n t h e t i s e r e n . Het n i e t g e z u i v e r d e p r o -d u k t b e z a t een b i o l o g i s c h e a k t i v i t e i t -d i e t e v e r g e l i j k e n was met -d i e van h e t n a t u u r l i j k e p e p t i d e . Na z u i v e r i n g was de a k t i v i t e i t e c h t e r t e r u g g e l o p e n . VIP en v o o r a l de p r o b l e m e n d i e z i c h b i j de s y n t h e s e e r v a n v o o r d o e n z i j n s i n d s -d i e n o n -d e r w e r p e n van s t u -d i e g e b l e v e n v o o r -de g r o e p v a n B o -d a n s z k y .
Aan h e t Max P l a n c k I n s t i t u u t t e München i s d o o r de g r o e p v a n Wünsch r e e d s j a r e n aan de s y n t h e s e van V I P g e w e r k t ; r e s u l t a t e n z i j n t o t nu t o e n i e t b e k e n d . De omvang v a n de p r o b l e m e n b i j de s y n t h e s e z i j n k l a a r b l i j k e l i j k g r o t e r dan men b i j e e r s t e b e s c h o u w i n g z o u v e r w a c h t e n .
H e t g a s t r o i n t e s t i n a l e hormoon s e c r e t i n e ( 2 7 - p e p t i d e ) d a t samen met V I P , g l u c a g o n en G a s t r i c I n h i b i t o r y P e p t i d e ( G I P ) e e n g r o e p nauw v e r w a n t e p e p t i d e n v o r m t ( z i e f i g . 1.2) w e r d i n D e l f t v o l l e d i g met b e h u l p v a n de r e p e t i t i e v e o v e r m a a t gemengd a n h y d r i d e m e t h o d e g e s y n t h e t i s e e r d . Het s u c c e s van d e z e m e t h o d e van p e p t i d e s y n t h e s e i n o p l o s s i n g was a a n l e i d i n g de m e t h o d e t e b e p r o e -v e n op een p e p t i d e -van d e z e l f d e o r d e -v a n g r o o t t e d o c h met p r o b l e m a t i s c h e r a m i n o z u r e n . H e t V I P l e e k d a a r t o e een g e s c h i k t m o d e l .
M i j n d o e l was d o o r m i d d e l van een s y n t h e s e v a n V I P de h i e r b i j o p t r e d e n d e p r o b l e m e n t e l o c a l i s e r e n , t e b e s t u d e r e n en w a a r m o g e l i j k op t e l o s s e n . De r e p e t i -t i e v e o v e r m a a -t gemengd a n h y d r i d e m e -t h o d e zou h i e r b i j c e n -t r a a l s -t a a n , d i -t -t e r n a d e r e b e s t u d e r i n g van z i j n t o e p a s b a a r h e i d . In d i e g e v a l l e n w a a r d i t v o o r de s y n t h e s e n o d i g m o c h t b l i j k e n zou e c h t e r van d e z e m e t h o d e w o r d e n a f g e w e k e n .
De r e e d s genoemde v e r w a n t s c h a p t u s s e n V I P en s e c r e t i n e i s n i e t a l l e e n t e r u g t e v o e r e n t o t de g r o t e g e l i j k e n i s van hun p r i m a i r e s t r u c t u u r , d o c h de b e i d e p e p t i d e n b e z i t t e n n a a s t m a r k a n t e v e r s c h i l l e n ook v e e l o v e r e e n k o m s t e n i n hun f a r m a c o l o g i s c h e e i g e n s c h a p p e n . Door D. Voskamp w e r d e n t e r b e s t u d e r i n g v a n de s t r u c -t u u r - w e r k i n g s r e l a -t i e s e e n a a n -t a l a n a l o g a v a n s e c r e -t i n e g e s y n -t h e -t i s e e r d . D a a r o n d e r w a r e n twee a n a l o g a w a a r b i j i n h e t N - t e r m i n a l e d e e l a m i n o z u r e n w e r d e n v e r v a n g e n d o o r a m i n o z u r e n d i e z i c h op i d e n t i e k e p l a a t s i n V I P b e v o n d e n . Aan d e z e z o g e n a a m d e v a s e c t r i n e s w e r d d o o r m i j één 2 7 - p e p t i d e t o e g e v o e g d ; h e t N-t e r m i n a l e 1 3 - p e p N-t i d e v a n V I P w e r d g e k o p p e l d a a n h e N-t C - N-t e r m i n a l e 1 4 - p e p N-t i d e v a n s e c r e t i n e . D i t v a s e c t r i n e I I I w o r d t b e s c h r e v e n i n h o o f d s t u k 5.
1. Algemene inleiding
1.1 VASOACTIVE INTESTINAL PEPTIDE
In 1902 o n t d e k t e n B a y l i s s en S t a r l i n g ( 1 ) i n h e t s l i j m v l i e s v a n de t w a a l f -v i n g e r i g e darm h e t g a s t r o i n t e s t i n a l e hormoon s e c r e t i n e . Z i j m a a k t e n d a a r b i j ook m e l d i n g v a n de v o n d s t v a n een s t o f d i e een b l o e d d r u k v e r l a g e n d e f f e c t had en u i t m e e r d e r e w e e f s e l s kon w o r d e n g e i s o l e e r d . H e t d u u r d e e c h t e r t o t 1970 v o o r d a t P i p e r en S a i d ( 2 ) h e r o n t d e k t e n d a t z i c h i n e x t r a c t e n van de d a r m e n en l o n g e n van h e t v a r k e n e e n p e p t i d e b e v o n d d a t de p e r i f e r e b l o e d s t r o o m v e r h o o g d e en e e n a l g e h e l e b l o e d d r u k v e r l a g i n g v e r o o r z a a k t e . N i e t v e e l l a t e r i s o l e e r d e n S a i d en M u t t ( 3 - 5 ) e e n p o l y p e p t i d e d a t een b r e e d s p e c t r u m aan b i o l o g i s c h e a k t i v i t e i t e n b e z a t . H e t g e i s o l e e r d e V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P e p t i d e b l e e k , mede d o o r z i j n z u i v e r i n g s p r o c e d u r e , nauw v e r w a n t met h e t hormoon s e c r e t i n e .
T i j d e n s de i s o l e r i n g van s e c r e t i n e ( 6 ) w e r d e n de i n m e t h a n o l o p l o s b a r e p e p t i d e n i n een w a t e r i g e o p l o s s i n g d o o r v e r z a d i g i n g met n a t r i u m c h l o r i d e g e p r e c i p i -t e e r d . D i -t p r o d u k -t d a -t ook h e -t s e c r e -t i n e b e v a -t -t e was h e -t u i -t g a n g s m a -t e r i a a l v o o r de i s o l e r i n g v a n V I P . I n t a b e l 1.1 i s s c h e m a t i s c h w e e r g e g e v e n hoe d e z e i s o l e r i n g v e r d e r v e r l i e p . T a b e l 1.1 I s o l e r i n g van V I P
1. C h r o m a t o g r a f i e van h e t u i t g a n g s p r o d u k t o v e r C M - c e l l u l o s e , e l u t i e met een f o s f a a t b u f f e r pH 8 g a f de ruwe s e c r e t i n e f r a k t i e , e l u t i e met 0,2 M z o u t z u u r g a f de ruwe V I P f r a k t i e .
2. A d s o r p t i e aan a l g i e n z u u r , e l u t i e met 0,2 M HC1 en u i t w i s s e l i n g van c h l o r i d e t e g e n a c e t a a t . 3. C h r o m a t o g r a f i e o v e r S e p h a d e x G-25, e l u t i e met 0,2 M a z i j n z u u r . 4. C h r o m a t o g r a f i e o v e r C M - c e l l u l o s e , e l u t i e met 0,1 M a m m o n i u m b i c a r b o n a a t . 5. C o u n t e r c u r r e n t d i s t r i b u t i e i n h e t s y s t e e m n b u t a n o l 0,1 M a m m o n i u m b i c a r -b o n a a t , g e v o l g d d o o r a d s o r p t i e aan a l g i e n z u u r , e l u t i e met 0,2 M z o u t z u u r en u i t w i s s e l i n g van c h l o r i d e t e g e n a c e t a a t . 6. C h r o m a t o g r a f i e o v e r S e p h a d e x G-25, e l u t i e met 0,2 M a z i j n z u u r . 3
De i s o l e r i n g s p r o c e d u r e w e r d l a t e r i e t s v e r b e t e r d ( 7 ) . Men kan nu u i t de darmen van 1000 v a r k e n s 1 mg g e z u i v e r d V I P v e r k r i j g e n , h e t g e e n c i r c a 10% i s v a n de h o e v e e l h e i d s e c r e t i n e w e l k e u i t e e n z e l f d e h o e v e e l h e i d v a r k e n s d a r m v e r k r e g e n w o r d t . De a m i n o z u u r s a m e n s t e l l i n g w e r d v a s t g e s t e l d ( 8 ) en n i e t v e e l l a t e r v o l g d e de a m i n o z u u r v o l g o r d e ( 9 ) . B i j d e z e b e p a l i n g v a n de s e q u e n t i e ( p r i m a i r e s t r u c t u u r ) w e r d v o o r n a m e l i j k g e b r u i k g e m a a k t v a n e n z y m a t i s c h e b e h a n d e l i n g e n w a a r b i j h e t 2 8 - p e p t i d e i n v e l e k l e i n e b r o k s t u k k e n w e r d g e s p l i t s t . T e r i d e n t i f i c a t i e v a n sommige d i p e p t i d e n was h e t n o d i g d e z e t e v e r g e l i j k e n met s y n t h e t i s c h e p r o d u k t e n . Dat de s t r u c t u u r o p h e l d e r i n g g e e n e e n v o u d i g e z a a k was mag b l i j k e n u i t f i g . 1.1.
De g e v o n d e n p r i m a i r e s t r u c t u u r v a n V I P i s i n f i g . 1.2 n o g m a a l s w e e r g e g e v e n n a a s t a n d e r e p e p t i d e n waarmee h e t s t e r k e g e l i j k e n i s v e r t o o n t . Z o a l s r e e d s genoemd b e z i t V I P een b r e e d s p e c t r u m v a n b i o l o g i s c h e a k t i v i t e i t e n w a a r v a n de b e l a n g r i j k s t e n h i e r w o r d e n o p g e s o m d . 1. H e t v e r o o r z a a k t v a a t v e r w i j d i n g en d a a r m e e e e n b l o e d d r u k v e r l a g i n g i n v r i j w e l h e t g e h e l e v a t e n s t e l s e l ( 1 0 , 1 1 ) . E v e n a l s g l u c a g o n h e e f t h e t een p o s i -t i e f i n o -t r o p i c e f f e c -t op de h a r -t s p i e r ( 1 2 , 1 3 ) . 2. H e t h e e f t een r e l a x e r e n d e f f e c t op de l o n g e n en h e t b e v o r d e r t de a d e m h a l i n g ( 1 0 ) . 3. E v e n a l s g l u c a g o n s t i m u l e e r t h e t de l i p o l y s e en de g l y c o g e n o l y s e en h e t b e v o r -d e r t -de s e c r e t i e v a n g l u c a g o n en i n s u l i n e ( 1 0 , 1 4 , 1 5 ) . 4. H e t s t i m u l e e r t c y c l i s c h - A M P p r o d u k t i e i n v e l e o r g a n e n ( 1 6 - 1 8 ) . 5. H e t o n d e r d r u k t z u u r en p e p s i n e s e c r e t i e i n de maag en h e t r e l a x e e r t de maag-s p i e r ( 1 9 , 2 0 ) . 6. H e t s t i m u l e e r t e v e n a l s s e c r e t i n e w a t e r en e l e c t r o l y t s e c r e t i e d o o r de p a n c r e a s e c h t e r i s de mate v a n d e z e s e c r e t i e s t e r k a f h a n k e l i j k van de o n d e r -z o c h t e d i e r s o o r t ( 2 1 , 2 2 , 7 ) .
7. H e t i s e e n s t e r k e s t i m u l a n t van de dunne darm s e c r e t i e en h e t b e v o r d e r t de m o t i l i t e i t ( 2 3 - 2 5 ) .
8. H e t v e r h o o g t de g a l s t r o o m en r e l a x e e r t de g a l b l a a s ( 2 6 - 2 8 ) .
9. H e t w o r d t i n r e l a t i e f hoge c o n c e n t r a t i e s a a n g e t o o n d i n h e t p l a s m a en i n t u m o r e n van patiënten met h e t W a t e r y D i a r r h e a S y n d r o m e ( 2 9 - 3 1 ) .
10. H e t w o r d t s n e l g e i n a k t i v e e r d en d i t g e b e u r t n i e t a l l e e n i n de l e v e r ( 3 2 - 3 4 ) .
De genoemde a k t i v i t e i t e n z i j n w a a r g e n o m e n na t o e d i e n i n g v a n r e l a t i e f hoge d o s e s V I P . De f y s i o l o g i s c h e r o l v a n V I P i s nog n i e t b e k e n d a l r i c h t h e t o n d e r z o e k e r -n a a r z i c h v o o r a l op de ge-noemde b i o l o g i s c h e a k t i v i t e i t e -n .
VIP
c y a n o g e e n b r o m i d e s p l i t s i n g
LeUj L y S j Phe^ T h r , T y r j V a l j ) Met
K a l l i k r e i n e I I I IV L y s - G l n - M e t T r y p s i n e V I L e u - A r g C h y m o t r y p s i n e L y s2 S e r ^ T y r V a l j ) C h y m o t r y p s i n e _ X I I A l a - V a l - L y s - L y s - T y r . X I I I T h e r m o l y s i n e L e u - A s i v ^ S e r ^ I l e - L e u XIV AsnNH V I I V I I I T h r - A s p - A s n - T y r IX T h r - A r g T h e r m o l y s i n e XI V a l - P h e D i p e p t i d y l a m i n o p e p t i d a s e A s p - A l a H i s S e r A s p A l a V a l P h e T h r A s p A s n T y r T h r A r g L e u A r g L y s O l n M e t A l a V a l L y s -- L y s -- T y r -- L e u -- A s n -- S e r -- I Í e -- L e u -- A s n N H F i g . 1.1 S t r u c t u u r o p h e l d e r i n g v a n V I P . 5
H H H
1 His — 1 His 1 His
Ser Ser S e r A s p A s p A s p A l a A l a Gly Val V a l Thr P h e — Phe Phe Thr Thr Thr A s p A s p S e r A s n A s n Glu T y r Tyr L e u Ser Thr S e r Arg A r g A r g P h e Leu Leu A r g Arg A r g L y s L y s A s p G i n G i n S e r Met Met A l a A l a A l a Arg Val V a l Leu Lys Lys G i n Lys L y s A r g Tyr Tyr L e u Leu — L e u Leu A s n A s n Gin S e r Ser G l y V a l H e Leu Leu Leu 27 V a l 2 8 T h r 28 A s n NH2 N H2 NH2
VIP VIP Secretin
(kip) (varken, rund)
H H — 1 His 1 Tyr Ser A l a Gin Glu Gly Gly Thr Thr Phe P h e Thr l i e S e r Ser A s p A s p Tyr Tyr S e r Ser Lys l i e Tyr A l a Leu Met — A s p A s p — S e r L y s A r g l i e 1 31 Lys — A r g A r g Gly A l a G i n L y s — G i n G i n L y s A s p A s p S e r Phe P h e A s p V a l V a l T r p — G i n A s n Lys Trp T r p His — Leu — L e u A s n Met L e u l i e A s n A l a Thr 29 Thr G i n «3 G i n OH 30 G i n OH
e Glucagon GIP
F i g . 1.2 De s e q u e n t i e s van k i p p e e n v a r k e n s c . q . r u n d e r V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P e p t i d e ( V I P ) , S e c r e t i n e , G l u c a g o n e n G a s t r i c I n h i b i t o r y P e p t i d e ( G I P ) .De o n t w i k k e l i n g v a n r a d i o i m m u n o a s s a y v o o r V I P ( 3 5 - 3 9 ) b l e e k v a n g r o o t b e l a n g v o o r h e t l o k a l i s e r e n v a n V I P c o n c e n t r a t i e s i n mens e n d i e r . Een b e w i j s h i e r v o o r i s de v o n d s t v a n S a i d e n P e a r s e v a n r e l a t i e f hoge c o n c e n t r a t i e s V I P i n h e r s e n -en z e n u w w e e f s e l ( 4 0 , 4 1 ) .
In t a b e l 1.2 z i j n p e r v i n d p l a a t s de h o e v e e l h e d e n V I P a a n g e g e v e n i n h e t v a r k e n , de hond e n de mens w a a r b i j o v e r i g e n s de g e l i j k h e i d i n s t r u c t u u r nog n i e t i s b e w e z e n . T a b e l 1.2 H o e v e e l h e d e n V I P i n d i v e r s e o r g a n e n O r g a a n V a r k e n Hond Mens g r o t e h e r s e n e n v o o r h o o f d s k w a b a c h t e r h o o f d s k w a b h y p o t h a l a m u s m e d u l l a s y m p a t i s c h e zenuw v a g u s t w a a l f v i n g e r i g e darm n u c h t e r e darm k r o n k e l darm d i k k e darm l e v e r p a n c r e a s g a l b l a a s l o n g e n s k e l e t s p i e r e n p l a s m a ( n g / 1 ) 36 20 196 66 52 66 65 6 0,6 13 14 11 0,1 50 1,8 0,6 125 99 50 53 7 350 203 280 450 0,2 109 95 g e m i d d e l d e w a a r d e a a n g e g e v e n i n n g / g n a t g e w i c h t d e t e c t i e g r e n s t u s s e n 10 e n 20 n g / g U i t de t a b e l b l i j k t d a t de b e l a n g r i j k h e i d q u a h o e v e e l h e i d v a n v o o r k o m e n v a n V I P i n h e r s e n - e n z e n u w w e e f s e l z e k e r z o g r o o t i s a l s i n h e t g a s t r o i n t e s t i n a l e s y s t e e m . 7
H e t a a n t o n e n van v e r h o o g d e c o n c e n t r a t i e s V I P i n de z e n u w u i t e i n d e n i s een o n d e r s t e u n i n g v a n de v e r o n d e r s t e l l i n g d a t V I P e e n n e u r o t r a n s m i t t e r r o l v e r v u l t ( 4 2 ) . H e t v o o r k o m e n van V I P i n z o w e l h e t z e n u w w e e f s e l a l s h e t g a s t r o i n t e s t i n a l e s y s t e e m kan z i j n v e r k l a r i n g v i n d e n i n h e t f e i t d a t b e i d e o r g a n e n d e z e l f d e e m b r y o -n a l e o o r s p r o -n g h e b b e -n ( 4 3 ) . In 1974 i s o l e e r d e N i l s s o n h e t k i p p e V I P ( 4 4 ) en n i e t v e e l l a t e r s l a a g d e z i j e r i n de s t r u c t u u r e r v a n op t e h e l d e r e n ( 4 5 ) . D i t k i p p e V I P v e r t o o n t op v i e r p l a a t -s e n i n de -s e q u e n t i e v e r -s c h i l l e n met h e t v a r k e n -s V I P en w e l op de p l a a t -s e n 1 1 , 1 3 , 26 en 28 ( z i e f i g . 1 . 2 ) . T o t d u s v e r z i j n e r s l e c h t s e e n a a n t a l k l e i n e v e r -s c h i l l e n i n b i o l o g i -s c h e a k t i v i t e i t t u -s -s e n v a r k e n -s en k i p p e V I P g e v o n d e n . Zo i -s k i p p e V I P een r e l a t i e f s t e r k e r e r e l a x a n t van c a v i a t r a c h e a dan van r a t t e g l a d d e m a a g s p i e r e n . H e t b l o e d d r u k v e r l a g e n d e e f f e c t van k i p p e V I P , g e m e t e n i n h o n d e n , i s m i n d e r s p r e k e n d en k o r t e r van d u u r dan d i t van v a r k e n s V I P ( 4 4 ) .
De i s o l e r i n g en s t r u c t u u r o p h e l d e r i n g van r u n d e r V I P w e r d g e p u b l i c e e r d i n 1979 ( 4 6 ) . N a a s t de ook b i j v a r k e n s V I P g e b r u i k t e c h r o m a t o g r a f i s c h e m e t h o d e n w e r d a l s l a a t s t e s t a p v o o r de z u i v e r i n g de hoge d r u k v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i e t o e g e p a s t . B i j de s t r u c t u u r o p h e l d e r i n g b l e e k d a t r u n d e r V I P i d e n t i e k was aan v a r k e n s V I P . H e t i s dus v o o r t a a n n i e t meer v o l d o e n d e o v e r V I P t e s p r e k e n z o n d e r d a a r b i j de o o r s p r o n g t e v e r m e l d e n . I n d i t p r o e f s c h r i f t w o r d t e c h t e r met V I P s t e e d s h e t v a r k e n s c . q . r u n d e r V I P b e d o e l d t e n z i j h i e r b i j a n d e r s w o r d t v e r m e l d .
1.2 SYNTHETISCH V I P , FRAGMENTEN EN ANÁLOGA
Van de v o o r v a r k e n s V I P v o o r g e s t e l d e s e q u e n t i e z i j n t o t nu t o e s l e c h t s t w e e s y n t h e s e n b e k e n d . B o d a n s z k y ( 4 7 - 5 1 ) s y n t h e t i s e e r d e h e t d o o r m i d d e l v a n een f r a g m e n t s y n t h e s e w a a r b i j de f r a g m e n t e n s t a p s g e w i j s w e r d e n opgebouwd o n d e r g e b r u i k m a k i n g van v o o r n a m e l i j k a k t i v e r i n g met p - n i t r o f e n y l e s t e r s . I n f i g . 1.3 i s d e z e s y n t h e s e s c h e m a t i s c h w e e r g e g e v e n . Het s y n t h e t i s c h e V I P w e r d op z i j n b i o l o g i s c h e a k t i v i t e i t v e r g e l e k e n met h e t na t u u r l i j k e p e p t i d e ( 5 1 5 3 ) . V o o r de e i n d z u i v e r i n g b e z a t h e t 8 0 1 0 0 % v a n de b l o e d -d r u k v e r l a g e n -d e a k t i v i t e i t . 1 0 0 % van -de m a a g r e l a x a t i e a k t i v i t e i t en 2 0 0 - 2 5 0 % v a n de l u c h t w e g r e l a x a t i e a k t i v i t e i t . Na z u i v e r i n g v i a een k o r t e c o u n t e r c u r r e n t v e r d e l i n g was de a k t i v i t e i t a f g e n o m e n . In v e r b a n d met d e z e a k t i v i t e i t s a f n a m e en een a a n t a l s y n t h e t i s c h e p r o b l e m e n k o n d i g d e B o d a n s z k y aan met een n i e u w e s y n t h e s e met a n d e r e b e s c h e r m e n d e g r o e p e n t e z i j n b e g o n n e n . G e p u b l i c e e r d w e r d t o t d u s v e r s l e c h t s de s y n t h e s e v a n
H- |21-28~-NH : H-Lys(Z)-Tyr—Leu—Asn-Ser—Ile—Leu—Asn—NH Boc-2 1 - Boc-2 8 1 8 - 2 0 1 4 - 17 7- 13 ! " 6
1
1) -OH 2 3'W
Boc-Ala-Val-Lys(Z)-OH 2 3 2) I 1 - 6 |-NnH : Boc-His-Ser-Asp—Ala-Val-Phe-N H 2) 2 3 2 3 1) De z i j t e k e n s v a n T y r e n S e r w e r d e n b e s c h e r m d m e t d e B z l - g r o e p n a k o p p e l i n g w e r d d e z e d i r e k t v i a h y d r o g e n o l y s e v e r w i j d e r d . 2) 7-13 e n 1-6 w e r d e n p a r t i e e l o n t s c h e r m d v o o r d a t de m e t h y l e s t e r w e r d o m g e z e t i n h e t h y d r a z i d e . Boe- 1 8 - 2 0 -OH + H- 2 1 - 2 8 -NH B o e - J 1 4 - 1 7 -N2H3 + H Boe- |7-13|-N H3 + H- 1 4 - 2 8 DCC/HOBt TFA |l8-28)-NH azide TFA -NH„ Boc-|l-6|-N2H3 + H- 7 - 2 8 azide TFA NH, H- 1 - 2 8 azide TFA NH, A m i n o z u u r a n a l y s e n a z u r e h y d r o l y s e : Asp 4,7 ( 5 ) T h r 1,8 ( 2 ) S e r 2,0 ( 2 ) G l u 1,0 ( 1 ) A l a 2,0 ( 2 ) V a l 1,8 ( 2 ) M e t 0,9 ( 1 ) I l e 1,0 ( 1 ) L e u 2,9 ( 3 ) T y r 2,0 ( 2 ) Phe 1,0 ( 1 ) L y s 2,9 ( 3 ) H i s 1,0 ( 1 ) A r g 2,2 ( 2 ) . F i g . 1.3 S y n t h e s e v a n V I P d o o r B o d a n s z k y . 9[ N l e ] - 1 4 - 2 8 V I P ( 5 4 ) en de s y n t h e s e v a n h e t N - t e r m i n a l e d e e l 1-10 ( 5 5 ) . B e i d e w e r d e n opgebouwd met b e h u l p v a n de a k t i e v e - e s t e r k o p p e l i n g s t e c h n i e k . G e b r u i k t w e r d e n v r i j w e l d e z e l f d e b e s c h e r m e n d e g r o e p e n a l s b i j de e e r s t e s y n t h e s e v a n V I P . De s y n t h e t i s c h e f r a g m e n t e n h a d d e n s l e c h t s w e i n i g a k t i v i t e i t e n i n h e t a l g e m e e n g e l d t d a t n a a r m a t e de k e t e n g r o t e r w o r d t de a k t i v i t e i t t o e n e e m t . I n t a b e l 1.3 z i j n de a k t i v i t e i t s g e g e v e n s v a n V I P , z i j n f r a g m e n t e n en a n a l o g a w e e r g e g e v e n . T a b e l 1.3 A k t i v i t e i t s g e g e v e n s v a n v a r k e n s en k i p p e V I P , f r a g m e n t e n en a n a l o g a P e p t i d e B l o e d d r u k v e r l a g i n g ' ' ' ' 2) L u c h t w e g r e l a x a t i e ' Maag r e l a x a t i e3' n a t . V I P 100 100 100 1-28 8 0 - 1 0 0 2 0 0 - 2 5 0 100 18-28 0,05 0,05-0,1 0,05 15-28 0,1 0,2 0,1 14-28 1-2 1 1-2 7-28 2-10 5-10 10-15 1-10 0,2 0,02 0,02 1-6 0,2 0,01 0,04 [ N l e1 7] - 1 4 - 2 8 - 1 1-2 n a t . k i p p e V I P 100 105 95 1-28
-
+ 100 + 90 18-28-
0,4-1 0,4-1 [ N l e1 7] - 1 4 - 2 8 - 1-2 1-1,5 [ L e u1 7] - 1 4 - 2 8 - 1-2 1-1,5 1) g e m e t e n i n g e a n e s t h e s e e r d e h o n d e n . 2) g e m e t e n a a n g e i s o l e e r d e s p i e r e n v a n de c a v i a t r a c h e a . 3) g e m e t e n a a n g e i s o l e e r d e s p i e r e n v a n de r a t t e maag. U i t de t a b e l b l i j k t d a t z o w e l b i j h e t N- a l s h e t C - t e r m i n a l e d e e l a k t i v i t e i t w e r d g e v o n d e n en d i t f e i t , d a t d u s t w e e e l k a a r n i e t o v e r l a p p e n d e s e q u e n t i e s V I P a k t i -v i t e i t b e z i t t e n , m a a k t h e t b e s t a a n -v a n t w e e o n a f h a n k e l i j k e "commando s e q u e n t i e s " a a n n e m e l i j k ( 5 5 , 5 6 ) . T i j d e n s h e t s c h r i j v e n v a n d i t p r o e f s c h r i f t v e r s c h e e n e e n p u b l i k a t i e v a n D.H. Coy en J . G a r d n e r ( 5 7 ) w a a r i n de v a s t e f a s e s y n t h e s e v a n v a r k e n s V I P w e r d g e r a p p o r -t e e r d . H i e r o n d e r v o l g -t e e n k o r -t e b e s c h r i j v i n g v a n d e z e s y n -t h e s e . A l s v a s t e - f a s e d i e n d e e e n b e n z h y d r y l a m i n e h a r s met lï " c r o s s - 1 i n k i n g " . Dea m i n o z u r e n w e r d e n g e k o p p e l d met b e h u l p v a n d i i s o p r o p y l c a r b o d i i m i d e o n d e r g e b r u i k m a k i n g v a n e e n a p p a r a a t v o o r g e m e c h a n i s e e r d e p e p t i d e s y n t h e s e . De a m i n o z u r e n w e r -den a l l e a l s B o c - d e r i v a a t i n g e z e t , t e r w i j l de z i j k e t e n s a l s v o l g t w e r d e n b e s c h e r m d : H i s en A r g , t o s y l ; S e r , T h r en A s p , b e n z y l ; L y s , 2 - c h l o o r b e n z y l o x y c a r b o n y l ; T y r , 2 - b r o o m b e n z y l o x y c a r b o n y l ; a l l e m a a l b e s c h e r m e n d e g r o e p e n d i e i n d i t p r o e f s c h r i f t z i j n b e h a n d e l d . B o c - A s n en B o c - G l n w e r d e n , v a n w e g e de e v e n e e n s i n d i t p r o e f s c h r i f t b e s c h r e v e n n e v e n r e a k t i e s , g e k o p p e l d v i a de d i i s o p r o p y l c a r b o d i i m i d e m e t h o d e i n a a n -w e z i g h e i d v a n 1 - h y d r o x y b e n z o t r i a z o o l . De B o c - g r o e p -w e r d s t e e d s a f g e s p l i t s t met TFA i n d i c h l o o r m e t h a a n . 21 15 P r o b l e m e n b i j h e t z o v o l l e d i g m o g e l i j k k o p p e l e n t r a d e n op b i j T y r , L y s en 14 A r g . H e r h a l i n g v a n de k o p p e l i n g , nu v i a de s y m m e t r i s c h e a n h y d r i d e n , was h i e r n o o d z a k e l i j k . H e t p e p t i d e w e r d v a n de h a r s a f g e s p l i t s t met b e h u l p v a n v l o e i b a r e w a t e r s t o f f l u o r i d e en h i e r d o o r g e l i j k t i j d i g o n t s c h e r m d . V I P b l e e k goed b e s t a n d t e g e n d e z e b e h a n -d e l i n g . H e t p r o -d u k t w e r -d a c h t e r e e n v o l g e n s g e z u i v e r -d met b e h u l p v a n e e n C M - c e l l u l o s e k o l o m en d o o r m i d d e l v a n v e r d e l i n g s c h r o m a t o g r a f i e o v e r S e p h a d e x . De z u i v e r i n g w e r d g e v o l g d met HPLC w a a r b i j e e n L i C h r o s o r p RP 18 k o l o m w e r d g e b r u i k t e n h e t s y s t e e m A c e t o n i t r i l / w a t e r , 3 0 : 7 0 , w a a r a a n t o e g e v o e g d 0 , 1 % E t g N - 0 , 0 1 M N H4. a c e t a a t (pH 4 ) . H e t g e z u i v e r d e p e p t i d e w e r d met b e h u l p v a n c y a n o g e e n b r o m i d e g e s p l i t s t b i j de m e t h i o n y l p e p t i d e b a n d . De t w e e b r o k s t u k k e n k o n d e n e v e n e e n s met HPLC w o r d e n g e s c h e i d e n en v e r v o l g e n s g e a n a l y s e e r d . De a m i n o z u u r a n a l y s e v a n h e t g e s y n t h e t h i s e e r -de V I P na z o w e l z u r e a l s e n z y m a t i s c h e h y d r o l y s e was goed t e noemen.
De b i o l o g i s c h e a k t i v i t e i t w e r d o n d e r z o c h t b i j h o n d e n op de e i g e n s c h a p de z u u r -s e c r e t i e i n de maag t e v e r m i n d e r e n n a d a t d e z e d o o r p e n t a g a -s t r i n e wa-s g e -s t i m u l e e r d . Een met n a t u u r l i j k V I P t e v e r g e l i j k e n d o s i s - r e s p o n s i e c u r v e was h e t r e s u l t a a t .
Met b e h u l p v a n HPLC a n a l y s e w e r d g e v o n d e n d a t V I P a l s d r o o g g e v r o r e n p o e d e r , i n vacuüm en b i j k a m e r t e m p e r a t u u r b e w a a r d e e n b i j p r o d u k t v o r m d e . D i t b i j p r o d u k t b e -z a t d e -z e l f d e a m i n o -z u u r s a m e n s t e l l i n g a l s h e t V I P . Of d i t p r o d u k t ook e e n a n d e r e b i o l o g i s c h e a k t i v i t e i t b e z i t w e r d n i e t v e r m e l d .
De s y n t h e s e v a n k i p p e V I P w e r d r e c e n t g e m e l d d o o r z o w e l B o d a n s z k y ( 5 8 ) a l s Y a j i m a ( 5 9 ) . Van de s y n t h e s e v a n B o d a n s z k y was de s e q u e n t i e 1 8 - 2 8 , met de d a a r u i t opgebouwde s e q u e n t i e s [ N l e1 7] - 1 4 - 2 8 en [ L e u1 7] - 1 4 - 2 8 , r e e d s e e r d e r b e s c h r e v e n ( 5 0 ) . H e t g e h e l e 2 8 - p e p t i d e w e r d s t a p s g e w i j s g e s y n t h e t i s e e r d o n d e r g e b r u i k m a k i n g v a n de a k t i e v e - e s t e r m e t h o d e . De z i j k e t e n b e s c h e r m e n d e g r o e p e n w e r d e n a f g e s p l i t s t met b e h u l p v a n w a t e r s t o f b r o m i d e i n t r i f 1 u o r a z i j n z u u r en h e t p r o d u k t w e r d g e z u i v e r d v i a e e n c o u n t e r - c u r r e n t d i s t r i b u t i e en g e l p e r m e a t i e c h r o m a t o g r a f i e . H e t a l d u s v e r k r e g e n k i p p e V I P b e z a t v r i j w e l d e z e l f d e b i o l o g i s c h e a k t i v i t e i t a l s h e t n a t u u r -1 i j k e m a t e r i a a l . 11
Y a j i m a ( 5 9 ) s y n t h e t i s e e r d e h e t p e p t i d e u i t g a a n d e van z e s f r a g m e n t e n d i e a c h t e r e e n v o l g e n s b e g i n n e n d met h e t C t e r m i n a l e d e e l v i a de a z i d e m e t h o d e w e r d e n g e k o p -p e l d . V o o r de o-pbouw d e r f r a g m e n t e n w e r d e n de a k t i e v e - e s t e r en de DCCI/HOBt m e t h o d e g e b r u i k t . M e t h i o n i n e w e r d a l s s u l f o x i d e b e s c h e r m d , t e r w i j l v o o r t s noemens-w a a r d i s de b e s c h e r m i n g van A r g met de m e s i t y l e e n - 2 - s u l f o n y l ( M t s ) g r o e p . P r o b l e m e n b i j de s y n t h e s e d e d e n z i c h v o o r na de k o p p e l i n g v a n - A s p ( B z l ) a a n A s n en A l a . De m o g e l i j k e v o r m i n g h i e r b i j v a n s u c c i n i m i d e d e r i v a t e n w o r d t l a t e r i n d i t p r o e f s c h r i f t b e s p r o k e n ( 3 . 3 ) . H e t p e p t i d e w e r d o n t s c h e r m d met b e h u l p v a n v l o e i b a r e w a t e r s t o f f l u o r i d e n a d a t e e r s t h e t M e t ( O ) was g e r e d u c e e r d met t h i o f e n o l . H e t p r o -d u k t w e r -d g e z u i v e r -d met b e h u l p v a n g e l p e r m e a t i e c h r o m a t o g r a f i e en c h r o m a t o g r a f i e o v e r C M - c e l l u l o s e . Na v o o r t g e z e t t e z u i v e r i n g v i a i s o e l e c t r i s c h e f o c u s s e r i n g w e r d een o n g e v e e r g e l i j k e v a a t v e r w i j d e n d e w e r k i n g i n h o n d e n g e v o n d e n a l s v o o r h e t n a -t u u r l i j k e k i p p e V I P . Y a n a i h a r a en een g r o e p m e d e w e r k e r s s y n t h e t i s e e r d e n V I P v o l g e n s de m e t h o d e z o a l s b e s c h r e v e n d o o r B o d a n s z k y ( 6 1 ) . U i t de a m i n o z u u r a n a l y s e v a n h e t g e z u i v e r d e p r o -d u k t kan men z i e n -d a t h e t l a a t s t e f r a g m e n t 1-6 v o o r + 1 5 % t e w e i n i g i n h e t p e p t i -d e v o o r komt (Phe en H i s 0,85 t e n o p z i c h t e v a n g e m i d d e l d 1,0 p e r a m i n o z u u r ) . H e t p e p t i d e en z i j n f r a g m e n t e n w e r d e n o n d e r w o r p e n a a n een b i o l o g i s c h e t e s t e c h t e r w e r d e n de p r o d u k t e n n i e t v e r g e l e k e n met n a t u u r l i j k V I P o f f r a g m e n t e n v a n V I P . E v e n e e n s d o o r een J a p a n s e g r o e p ( 6 2 ) w e r d h e t N t e r m i n a l e 6 p e p t i d e g e s y n t h e t i s e e r d . H e t d o e l van hun s y n t h e s e was de t o e p a s b a a r h e i d v a n h e t d i f e n y l f o s f o r -a z i d -a -a t (DPPA) i n de p e p t i d e c h e m i e n -a d e r t e o n d e r z o e k e n . De z i j k e t e n s v-an S e r en A s p w e r d e n b e s c h e r m d met de t b u t y l g r o e p en n o e m e n s w a a r d i s v o o r t s de a f -s p l i t -s i n g v a n de C - t e r m i n a l e m e t h y l e -s t e r met o c - c h r o m o t r y p -s i n e . LITERATUUR 1. w.M. B a y l i s s en E.H. S t a r l i n g , J . P h y s i o l . 28 ( 1 9 0 2 ) 325 2. P . J . P i p e r , S . I . S a i d en J.R. V a n e , N a t u r e 225 ( 1 9 7 0 ) 1144 3. S . I . S a i d en V. M u t t , S c i e n c e 169 ( 1 9 7 0 ) 1217 4. S . I . S a i d en V. M u t t , E u r . J . B i o c h e m . 28 ( 1 9 7 2 ) 199 5. S . I . S a i d en V. M u t t , N a t u r e 225 ( 1 9 7 0 ) 863 6. V. M u t t , A r k i v f u r Kemi 15 ( 1 9 5 9 ) 69 7. S. S u z u k i , K. A r a k i en S. T a c h i b a n a , P e p t i d e C h e m i s t r y 1 9 7 6 , T. N a k a j i m a ( e d . ) P r o t e i n R e s e a r c h F o u n d a t i o n , O s a k a ( 1 9 7 7 ) 151
8. S . I . S a i d en V. M u t t , P r o g . P e p t . R e s . I I , S. L a n d e ( e d . ) G o r d o n and B r e a c h , New Y o r k ( 1 9 7 2 ) 285 9. V. M u t t en S . I . S a i d , E u r . J . B i o c h e m . 42 ( 1 9 7 4 ) 581 10. S . I . S a i d e n G.M. M a k h l o u f , E n d o c r i n o l o g y o f t h e G u t W.Y. Chey en F.P. B r o o k s ( e d . ) C h a r l e s S l a c k I n c . T h o r o f a r e ( 1 9 7 4 ) 83 11. S. D o m s c h k e , W. D o m s c h k e , S.R. B l o o m , P. M i t z n e g g , S. M i t c h e l l , G. L u x , U. S t r u n z en L. D e m l i n g , G u t Hormones S.R. B l o o m ( e d . ) ( 1 9 7 8 ) 475 12. J . K a c h e l h o f f e r , M.R. E l o y , A. P o u s s e , D. H o h m a t t e r en J . F . G r e n i e r , Pflügers A r c h . 352 ( 1 9 7 4 ) 37 13. S . I . S a i d , L.P. B o s h e r , J.A. Späth en H.A. K o n t o r , C l i n . R e s . 20 ( 1 9 7 2 ) 29 14. M. S c h e b a l i n , S . I . S a i d en G.M. M a k h l o u f , Amer. J . P h y s i o l . 232 ( 1 9 7 7 ) E197 15. K. A k i o , K. T o s h i o , K. H i r o s h i en K. K i n o r i , M e t a b . C l i n . E x p . 26 ( 1 9 7 7 ) 781 16. J . P . C h r i s t o p h e , M. S v o b o d a , M . D e s c h o d t - L a n c k m a n en P. R o b b e r e c h t , P r o c . FEBS Meet. 1 9 7 7 , 45 ( 1 9 7 8 ) 259 17. B. Simon en H. K a t h e r , G a s t r o e n t e r o l o g y 74 ( 1 9 7 8 ) 722 18. S.R. B l o o m , L.C. I v e r s e n en M. Q u i k , B r . J . P h a r m a c o l . 62 ( 1 9 7 8 ) 4 3 5 P 19. B.A. S c h o r r , S . I . S a i d en G.M. M a k h l o u f , C l i n . R e s . 22 ( 1 9 7 4 ) 23A 20. S . J . K o n t u r e k , A. D e m b i n s k i , P. T h o r en R. " K r o l , Pflügers A r c h . 361. ( 1 9 7 6 ) 175 2 1 . S . J . K o n t u r e k , P. T h o r , A. D e m b i n s k i en R. K r o l , G a s t r o e n t e r o l o g y 68 ( 1 9 7 5 ) 1527 22. S . J . K o n t u r e k , A. P u c h e r en T. R a d e c k i , J . P h y s i o l . ( L o n d o n ) 255 ( 1 9 7 6 ) 497 2 3 . G.O. B a r b e z a t en M.I. G r o s s m a n , S c i e n c e ( 1 9 7 1 ) 422 24. I.M. C o u p a r , C l i n . E x p . P h a r m a c o l . P h y s i o l . 3 ( 1 9 7 6 ) 615 25. C . J . S c h w a r t z , D.V. K i m b e r g , H.E. S h e e r i n , M. F i e l d en S . I . S a i d , J . C l i n . I n v . 54 ( 1 9 7 4 ) 536 26. L. T h u l i n en M. H e l l g r e n , A c t a C h i r . S c a n d . 142 ( 1 9 7 6 ) 235 2 7 . J . P . Ryan en S. R y a v e , Amer. J . P h y s i o l . 234 ( 1 9 7 8 ) E44
28. R. J a n s s e n , G. S t e e n en J . S v a n v i k , G a s t r o e n t e r o l o g y 75_ ( 1 9 7 8 ) 47 2 9 . S.R. B l o o m , J.M. P o l a k en A.G.E. P e a r s e , L a n c e t ( 1 9 7 3 ) 14
3 0 . S . I . S a i d en G.R. F a l o o n a , New Eng. J . Med. 293 ( 1 9 7 5 ) 155
3 1 . I.M. M o d l i n , S.R. B l o o m en S . J . M i t c h e l l , G a s t r o e n t e r o l o g y 75 ( 1 9 7 8 ) 1051 32. S. K i t a m u r a , T. Y o s h i d a en S . I . S a i d , P r o c . S o c . E x p . B i o l . Med. 148 ( 1 9 7 5 ) 25 3 3 . U . I . S t r u n z , J.H. W a l s h , S.R. B l o o m , M.R. Thompson en M.I. G r o s s m a n , G a s t r o e n t e r o l o g y 73 ( 1 9 7 7 ) 768 34. A.M. E b e i d , J . E n c o u r r o u , P.B. S o e t e r s , P. M u r r a y en J . E . F i s c h e r , Ann. S u r g . 188 ( 1 9 7 8 ) 28 13
3 5 . A.M. E b e i d , P. M u r r a y , H. H i r s c h , R . I . C . Wesdorp e n J . E . F i s c h e r , J . S u r g . R e s . 20 ( 1 9 7 6 ) 355 36. J . F a h r e n k r u g e n O.B. S c h a f f a l i t z k y de M u c k a d e l l , J . L a b . C l i n . Chem. 89 ( 1 9 7 7 ) 1379 37. J . B e s s o n , C. D u p o n t , M. L a b u r t h e , D. B a t a i l l e en G. R o s s e l i n , A n n . E n d o c r i n o l . 38 ( 1 9 7 7 ) 145 3 8 . P.G. B u r h o l , I . L y g r e n en H.L. Waldum, S c a n d . J . G a s t r o e n t e r o l o g y U ( 1 9 7 8 ) 807 3 9 . T.M. C h a n g , F.L. R o t h j r . , H.H. T a i e n w.Y. C h e y , A n a l . B i o c h e m . 97 ( 1 9 7 9 ) 286 4 0 . S . I . S a i d en R.N. R o s e n b e r g , S c i e n c e 192 ( 1 9 7 6 ) 902 4 1 . A.G.E. P e a r s e , N a t u r e 262 ( 1 9 7 6 ) 92 4 2 . A. G i a c h e t t i , S . I . S a i d , R.C. R e y n o l s en F.C. Königes P r o c . N a t l . A c a d . S e i . ( U S A ) 74 ( 1 9 7 7 ) 3424 4 3 . S.H. S n y d e r , S c i e n t i f i c A m e r i c a n , m a a r t 1977 44 44. A. N i l s s o n , FEBS L e t t . 47 ( 1 9 7 4 ) 284 4 5 . A. N i l s s o n , FEBS L e t t . 60 ( 1 9 7 5 ) 322 46. M. C a r l q u i s t , V. M u t t en H. Görnvall, FEBS L e t t . 108 ( 1 9 7 9 ) 457 4 7 . M. B o d a n s z k y , Y.S. K l a u s n e r en V. M u t t , B i o o r g . Chem. 2 ( 1 9 7 2 ) 30 48. Y.S. K l a u s n e r , V. M u t t en M. B o d a n s z k y , B i o o r g . Chem. 2 ( 1 9 7 2 ) 87 4 9 . Y.S. K l a u s n e r , C.Y. L i n , V. M u t t en M. B o d a n s z k y , B i o o r g . Chem. 2
( 1 9 7 3 ) 345 5 0 . Y.S. K l a u s n e r en M. B o d a n s z k y , B i o o r g . Chem. 2 ( 1 9 7 3 ) 354 5 1 . M. B o d a n s z k y , Y.S. K l a u s n e r , C.Y. L i n , V. M u t t e n S . I . S a i d , J . Amer. Chem. S o c . 96 ( 1 9 7 4 ) 4 9 7 3 52. M. B o d a n s z k y , Y.S. K l a u s n e r en S . I . S a i d , P r o c . N a t . A c a d . S e i . ( U S A ) 70 ( 1 9 7 3 ) 382 5 3 . G.M. M a k h l o u f , W.M. Y a u , A.M. Z f a s s , S . I . S a i d en M. B o d a n s z k y , S c a n d . J . G a s t o e n t e r o l . 13 ( 1 9 7 8 ) 759 54. M. B o d a n s z k y , C.Y. L i n en S . I . S a i d , B i o o r g . Chem. 3 ( 1 9 7 4 ) 320 5 5 . M. B o d a n s z k y , J . B . H e n e s , A.E. Y i o t a k i s en S . I . S a i d , J . Med. Chem. 20 ( 1 9 7 7 ) 1461 56. M. B o d a n s z k y , H o r m o n a l R e c e p t o r s i n D i g e s t i v e T r a c t P h y s i o l o g y S. B o n f i l s , P. F r o m a g e o t e n G. R o s s e l i n ( e d s . ) N o r t h H o l l a n d P u b l . Comp. A m s t e r d a m 1977 17 57. D.H. Coy en J . G a r d n e r , I n t . J . P e p t . P r o t . R e s . 15 ( 1 9 8 0 ) 73 58. M. B o d a n s z k y , A. B o d a n s z k y en S . I . S a i d , F e d e r . P r o c . 37 ( 1 9 7 8 ) A b s t . 3071 p.1829
5 9 . H. Y a j i m a , M. T a k e y a m a , K. Koyama, T. T o b e , K. I n o u e , T. Kawano en H. A d a c h i , Chem. Pharm. B u l l . 27 ( 1 9 7 9 ) 3 1 9 9 6 0 . M. B o d a n s z k y , C.Y. L i n en A. Y i o t a k i s , B i o o r g . Chem. 5 ( 1 9 7 6 ) 339 6 1 . N. Y a n a i h a r a , M. S a k a g a m i , H. S a t o , K. Yamamoto, T. H a s h i m o t o , C. Y a n a i h a r a , Z. I t o , K. Y a m a g u c h i en K. A b e , G a s t r o e n t e r o l o g y 7_2_ ( 1 9 7 7 ) 803
2. Over de synthese van vasoactive intestinal
peptide
2.1 ALGEMEEN GEDEELTE H e t s l a g e n v a n de s y n t h e s e v a n een p e p t i d e i s v a a k s t e r k a f h a n k e l i j k v a n de gek o z e n s t r a t e g i e . I n h e t g e v a l v a n de s y n t h e s e v a n V I P w e r d de gek e u z e v a n de s t r a -t e g i e b e m o e i l i j k -t d o o r e e n a a n -t a l o n b e k e n d e f a c -t o r e n . Zo w e r d e n b i j de s y n -t h e s e z o a l s u i t g e v o e r d d o o r B o d a n s z k y e e n a a n t a l p r o b l e m e n g e s i g n a l e e r d d o c h w e r d ook d u i d e l i j k d a t e r nog e e n o n b e k e n d a a n t a l n i e t w a r e n g e l o c a l i s e e r d . Een g r o t e h i n d e r n i s b i j de s y n t h e s e was de b i j z o n d e r s l e c h t e o p l o s b a a r h e i d v a n met name h e t C - t e r m i n a l e d e e l . O n d e r k e n n i n g h i e r v a n h i e l d i n d a t b i j een s y n t h e s e i n o p l o s s i n g v o l g e n s de gemengd a n h y d r i d e m e t h o d e , z o a l s opgenomen i n m i j n d o e l -s t e l l i n g , h e t b e -s t e g e k o z e n kon w o r d e n v o o r e e n f r a g m e n t -s y n t h e -s e . De k e u z e v a n de f r a g m e n t e n was b e m o e i l i j k t omdat b e s e f t w e r d d a t w a n n e e r z o ' n k e u z e was b e -p a a l d h i j n i e t o-p k o r t e t e r m i j n kon w o r d e n v e r a n d e r d . N i e t o n d e r z o c h t w e r d de i n d e z e s i t u a t i e m o g e l i j k b r u i k b a r e v a s t e - f a s e m e t h o d e . A l h o e w e l e r w e i n i g b e k e n d i s v a n h e t w e r k v a n Wünsch ( 1 ) mag i n a n a l o g i e met z i j n a n d e r e s y n t h e s e n w o r d e n aangenomen d a t h i j u i t g i n g v a n de s y n t h e s e v a n een g r o o t a a n t a l k l e i n e p e p t i d e n d i e v e r v o l g e n s aan e l k a a r g e k o p p e l d d i e n d e n t e w o r -d e n . Deze zogenaam-de p y r a m i -d e s t r a t e g i e w e r -d o n -d e r a n -d e r e t o e g e p a s t -d o o r Y a j i m a b i j de s y n t h e s e v a n G a s t r i c I n h i b i t o r y P e p t i d e ( G I P ) ( 2 ) . H e t u i t b l i j v e n v a n r e s u l t a t e n was o n d e r m e e r a a n l e i d i n g b i j de s y n t h e s e van V I P de k e u z e v a n de f r a g -m e n t e n z o a l s g e d a a n d o o r B o d a n s z k y i n g e d a c h t e n t e h o u d e n . De k e u z e van g r o t e r e f r a g m e n t e n w e r d b o v e n d i e n d o o r H i r t ( 2 1 ) met s u c c e s t o e g e p a s t b i j z i j n s y n t h e s e van c a l c i t o n i n e . H i j m a a k t e h i e r b i j v o o r n a m e l i j k g e b r u i k v a n de r e p e t i t i e v e o v e r m a a t gemengd a n h y d r i d e " r e p e t i t i v e e x c e s s m i x e d a n h y d r i d e " (REMA) m e t h o d e . H e t g e b r u i k van a k t i e v e - e s t e r s en h e t w e r k e n h i e r m e e i n s u s p e n s i e n o o p t e B o d a n s z k y h e t f r a g m e n t 18-28 u i t t w e e d e l e n op t e bouwen. B i j de REMA m e t h o d e kan met een o n g e v e e r t i e n maal k l e i n e r e c o n c e n t r a t i e w o r d e n g e w e r k t dan b i j h e t g e b r u i k v a n a k t i e v e - e s t e r s z o n d e r d a t d a a r b i j de r e a k t i e t i j d e n t e g r o o t w o r d e n . Om d i e r e d e n l e e k h e t i n t e r e s s a n t t e t r a c h t e n h e t C - t e r m i n a l e d e e l v a n V I P met b e h u l p v a n d e z e m e t h o d e t e s y n t h e t i s e r e n . G e l e t op de s e q u e n t i e m o e s t h e t moge-l i j k z i j n o n g e v e e r de h e moge-l f t van h e t p e p t i d e a moge-l d u s s t a p s g e w i j s t e v e r k r i j g e n .A a n g e z i e n d e REMA m e t h o d e g e b r u i k m a a k t v a n e e n f l i n k e o v e r m a a t a c y l e r e n d a g e n s ( c a . 1,4 e q . ) l e e k h e t n u t t i g u i t t e g a a n v a n e e n s y n t h e s e o n d e r v o l l e d i g e b e s c h e r m i n g v a n de f u n c t i o n e l e z i j k e t e n s v a n d e t e g e b r u i k e n a m i n o z u r e n . V o l l e -d i g e b e s c h e r m i n g b i j -d e p e p t i -d e s y n t h e s e w o r -d t o n -d e r a n -d e r e a a n g e h a n g e n -d o o r S a k a k i b a r a . Een r e c e n t a r t i k e l v a n z i j n hand ( 3 ) b e s c h r i j f t u i t v o e r i g de m o t i e -v e n -v o o r d e z e t a k t i e k . M e t h i o n i n e s t a a t a l g e m e e n b e k e n d a l s v e r o o r z a k e r v a n p r o b l e m e n b i j de p e p t i d e s y n t h e s e . De b e k e n d s t e e n v r i j w e l n i e t t e v e r m i j d e n n e v e n r e a k t i e i s d e o x i d a t i e t o t h e t m e t h i o n i n e - s u l f o x i d e . Vanwege de s n e l l e v e r g i f t i g i n g v a n d e k a t a l y s a t o r i s o n t s c h e r m i n g v i a k a t a l y t i s c h e h y d r o g e n o l y s e v a n z w a v e l h o u d e n d e p e p t i d e n v r i j -w e l ( 4 , 5 ) n i e t m o g e l i j k . G e b r u i k v a n s t e r k e z u r e n b i j m e t h i o n i n e k a n a a n l e i d i n g g e v e n t o t a l k y l e r i n g ( 6 ) e n b r e u k v a n de m e t h i o n y l - p e p t i d e band ( 7 ) . Met h e t o o g op d e z e p r o b l e m e n b i j m e t h i o n i n e i s d i t a m i n o z u u r i n e e n a a n t a l g e v a l l e n v e r v a n g e n d o o r h e t homomorfe n o r l e u c i n e d a t d e z e p r o b l e m e n n i e t k e n t . De b i o l o g i s c h e a k t i e v e p e p t i d e n d i e op d e z e w i j z e w e r d e n " v e r a n d e r d " : s u b s t a n c e P, m o t i l i n e e n e e n f r a g m e n t v a n s t a p h y l o c o c c a l n u c l e a s e ( 8 - 1 0 ) , b l e k e n a l l e hun v o l l e d i g e b i o l o g i s c h e a k t i v i t e i t t e b e h o u d e n . H e t l e e k d a a r o m i n t e r e s -s a n t om o o k h e t [ N l e ^7] - a n a l o g o n v a n V I P t e s y n t h e t i s e r e n . T e r u g k e r e n d e n a a r de f r a g m e n t k e u z e z o u d i t b e t e k e n e n d a t a l s C t e r m i n a a l f r a g ment 1 8 2 8 m o e s t w o r d e n g e k o z e n . D a a r n a z o u met de k o p p e l i n g v a n e e n k l e i n f r a g -ment e e n v o u d i g z o w e l h e t M e t - a l s h e t N l e - p e p t i d e kunnen w o r d e n v e r k r e g e n . De k e u z e v a n h e t f r a g m e n t 14-17 l a g v o o r de hand a a n g e z i e n w e r d v e r w a c h t d a t d i t p e p t i d e z o n d e r v e e l m o e i t e e n z u i v e r z o u k u n n e n w o r d e n g e s y n t h e t i s e e r d . De k o p p e -l i n g v a n d i t k -l e i n e p e p t i d e a a n 1 8 - 2 8 -l e e k o o k goed m o g e -l i j k e n b o v e n d i e n z o u e e n t e v o l g e n f r a g m e n t k o p p e l i n g m o e t e n w o r d e n u i t g e v o e r d m e t e e n p e p t i d e m e t C t e r -m i n a a l L e u w a a r b i j h e t g e v a a r v o o r r a c e -m i s a t i e g e r i n g i s .
Nu de k e u z e was g e v a l l e n op de genoemde twee f r a g m e n t e n b l e e f o v e r h e t d e e l 1-13. V o o r de hand l a g d i t f r a g m e n t met b e h u l p v a n de REMA m e t h o d e s t a p s g e w i j s t e s y n -t h e -t i s e r e n e c h -t e r b l e e k b i j e e n oriën-terende s y n -t h e s e d a -t e r p r o b l e m e n z o u d e n o n t s t a a n b i j h e t v e r k r i j g e n v a n h e t C - t e r m i n a l e v r i j e c a r b o n z u u r . Immers, z o u L e u w o r d e n b e s c h e r m d a l s m e t h y l e s t e r d a n z o u b i j de u i t e i n d e l i j k e a l k a l i s c h e h y d r o l y s e h i e r v a n p r o b l e m e n o n t s t a a n d o o r g e d e e l t e l i j k e a f s p l i t s i n g v a n d e 6-c a r b o x y l b e s 6-c h e r m e n d e g r o e p a a n d e t w e e A s p r e s t e n ( 1 1 , 1 2 ) . D a a r n a a s t w e r d l a t e r de A s p ( X ) - A s n o m l e g g i n g i n b a s i s c h m i l i e u b e s c h r e v e n ( 1 3 ) ( z i e 3 . 3 ) . H e t z o u d a n n o o d z a k e l i j k z i j n i n e e n v r o e g s t a d i u m v a n de s y n t h e s e t e v e r z e p e n e n d a a r n a v o o r t t e gaan met a k t i e v e e s t e r k o p p e l i n g e n , d e REMA m e t h o d e d a a r m e e g e h e e l v e r -l a t e n d .
Een a n d e r e t a k t i e k was de C - t e r m i n a l e c a r b o x y l g r o e p z o t e b e s c h e r m e n d a t d e z e d o o r h y d r o g e n o l y s e t e v e r w i j d e r e n z o u z i j n . De k e u z e v a n de z i j k e t e n en Notb e s c h e r m e n d e g r o e p e n w o r d t dan Notb e m o e i l i j k t . A l s N a Notb e s c h e r m i n g z o u d a n Notb i j v o o r -b e e l d e e n z e e r z u u r g e v o e l i g e g r o e p m o e t e n w o r d e n g e -b r u i k t , e c h t e r k a n -b i j e e n g r o t e r w o r d e n d p e p t i d e de a f s p l i t s i n g h i e r v a n m o e i l i j k h e d e n g a a n o p l e v e r e n ; v o o r -a l o p l o s b -a -a r h e i d s p r o b l e m e n z u l l e n d-an e e n r o l s p e l e n . De v e e l b e l o v e n d e a , a - d i m e t h y l - 3 , 5 - d i m e t h o x y b e n z y l o x y c a r b o n y l g r o e p ( D d z ) ( 1 4 ) i s z o ' n z e e r z u u r g e v o e l i g e g r o e p en komt i n h o o f d s t u k 3.4 nog t e r s p r a k e . Nu w i l i k w i j z e n op h e t r e c e n t e w e r k v a n B i r r ( 1 5 ) d i e d e z e g r o e p g e b r u i k t e v o o r de REMA s y n t h e s e v a n e e n z e s t a l a n t a m a n i d e a n a l o g a ( 1 0 p e p t i d e n ) . D i t w e r k i s e e n o n d e r -s t e u n i n g v a n m i j n g e d a c h t e n d a t z e k e r v o o r de l a a t -s t g e n o e m d e t a k t i e k de Ddz g r o e p goed t o e p a s b a a r kan z i j n . Een a a n t a l v r a g e n d i e o n t s t a a n b i j de s y n t h e s e v a n g r o t e r e eïi m i n d e r goed o p l o s b a r e p e p t i d e n m o e t e n e c h t e r nog n a d e r w o r d e n o n d e r -z o c h t . De k e n n i s o m t r e n t de t o e p a s s i n g s m o g e l i j k h e i d v a n de Ddz g r o e p was op h e t moment v a n de f r a g m e n t k e u z e a a n z i e n l i j k k l e i n e r . Ook a a n h e t g e b r u i k v a n a n d e r e z e e r z u u r g e v o e l i g e g r o e p e n b l e k e n n a d e l e n v e r b o n d e n . Een e n a n d e r o v e r z i e n d l e e k h e t v e r s t a n d i g 1-13 op t e bouwen u i t t w e e f r a g m e n t e n . D a a r t o e w e r d met h e t oog op de u i t t e v o e r e n z u i v e r i n g g e d a c h t a a n t w e e s t u k k e n met e e n v r i j w e l e v e n g r o o t m o l e c u l a i r g e w i c h t . W o r d t h e t 1 3 - p e p t i d e i n een 6- en e e n 7 - p e p t i d e g e d e e l d d a n z i j n e r t w e e moge-l i j k h e d e n en w e moge-l z a moge-l e e n f r a g m e n t k o p p e moge-l i n g m o e t e n p moge-l a a t s v i n d e n t u s s e n Phe en T h r o f t u s s e n T h r en A s p . B i j d e z e l a a t s t e m o g e l i j k h e i d z o u h e t f r a g m e n t 1-7 m o e t e n w o r d e n g e s y n t h e t i s e e r d u i t g a a n d e v a n T h r ; de e e r d e r genoemde m o e i l i j k h e d e n b i j de k e u z e v a n de b e s c h e r m e n d e g r o e p e n komen dan w e e r n a a r v o r e n , ( z i e 3.4) B o d a n s z k y k o o s v o o r de e e r s t g e n o e m d e m o g e l i j k h e i d ; de k o p p e l i n g v a n 1-6 a a n de r e s t v a n z i j n m o l e c u u l l e v e r d e k e n n e l i j k geen g r o t e p r o b l e m e n o p . G e z i e n de o n b e k e n d h e i d met de m o g e l i j k h e i d t o c h o p t r e d e n d e p r o b l e m e n b i j e e n f r a g m e n t s y n t h e -s e v a n 1-13 w e r d b e -s l o t e n de f r a g m e n t k e u z e t e b e p a l e n op 1-6 en 7-13. S a m e n v a t t e n d k a n g e z e g d w o r d e n d a t m i j n s y n t h e s e p l a n v o o r V I P b e s t o n d u i t de s y n t h e s e v a n v i e r f r a g m e n t e n , t e w e t e n 1-6, 7-13, 14-17 e n 18-28 w a a r n a d o o r r 17-i f r a g m e n t k o p p e l i n g e n h e t V I P c . q . h e t |_Nle J - V I P m o e s t o n t s t a a n . V o o r de k e u z e v a n de v o l g o r d e v a n de k o p p e l i n g e n d e r f r a g m e n t e n w i l i k v e r w i j z e n n a a r h o o f d -s t u k 4.1.
2.2 SYNTHETISCHE METHODEN V o o r de i n d i t p r o e f s c h r i f t b e s c h r e v e n s y n t h e s e w e r d g e b r u i k g e m a a k t v a n b e k e n d e k o p p e l i n g s t e c h n i e k e n . I n h o o f d z a a k w e r d g e b r u i k g e m a a k t v a n d e REMA m e t h o d e ; d a a r n a a s t w e r d e n a k t i e v e - e s t e r , DCCI/HOBt e n a z i d e k o p p e l i n g e n u i t g e v o e r d . Hoe-w e l d e z e m e t h o d e n a l s k l a s s i e k mogen Hoe-w o r d e n b e s c h o u Hoe-w d e n a l v e l e m a l e n Hoe-w e r d e n b e s c h r e v e n z a l i k h i e r o n d e r p e r m e t h o d e e e n a a n t a l k a n t t e k e n i n g e n maken d i e b i j m i j n s y n t h e s e a a n d e o r d e kwamen. 2.2.1 REMA m e t h o d e De r e p e t i t i e v e o v e r m a a t gemengd a n h y d r i d e m e t h o d e w e r d t e n d e l e i n D e l f t o n t w i k -k e l d e n d a a r o o -k met s u c c e s t o e g e p a s t ( 1 6 - 2 1 ) . Een b e l a n g r i j -k e s y n t h e s e was d i e v a n h e t hormoon s e c r e t i n e d a t v o l l e d i g m e t b e h u l p v a n d e REMA m e t h o d e w e r d o p g e -bouwd ( 2 2 ) .
In h e t p r o e f s c h r i f t v a n Van Zon ( 2 3 ) i s e e n u i t v o e r i g o v e r z i c h t opgenomen o v e r d e z e m e t h o d e . F i g . 2.1 g e e f t w e e r hoe e e n a m i n o z u u r na a k t i v e r i n g a l s gemengd a n h y d r i d e k a n r e a g e r e n m e t e e n p e p t i d e k e t e n . T e v e n s i s h i e r i n e e n b e l a n g r i j k e n e v e n r e a k t i e , d e a n o m a l e k o p p e l i n g , a a n g e g e v e n . O H R2 O O H i l l Ü „ , R - C - N - C H - C - O H + R 3 - O - C - C I 0 H R2 O II I I II R , - C - N - C H - C R , - 0 - C , R4 O 1 I II H2N - C H - C - R5 R , - C - N - C H - C - N - C H - C - R6 + R3OH + CO2 O H R4 O II I I II R 3 - O - C - N - C H - C - R 5
+
O H R, O II I I II R , - C - N - C H - C - O H F i g . 2.1 Gemengd a n h y d r i d e e n m o g e l i j k e a n o m a l e k o p p e l i n g . 19Deze a n o m a l e k o p p e l i n g w o r d t s p e c i a a l v e r m e l d a a n g e z i e n h i j b i j m i j n s y n t h e s e een a a n t a l m a l e n t e r s p r a k e komt. H e t b i j p r o d u k t d a t o p d e z e w i j z e o n t s t a a t , h e t i s o b u t y l o x y c a r b o n y l p e p t i d e , i s i n t e g e n s t e l l i n g t o t e e n t e r t . b u t y l o x y c a r b o n y l -p e -p t i d e n i e t e e n v o u d i g t e o n t s c h e r m e n . De -p e -p t i d e k e t e n b l i j f t d a n g e b l o k k e e r d , w a a r b i j b i j h e r h a a l d o p t r e d e n v a n d e z e r e a k t i e h e t p r o d u k t i s v e r o n t r e i n i g d met d i v e r s e k e t e n g e t e r m i n e e r d e s e q u e n t i e s . H e t o p t r e d e n v a n a n o m a l e k o p p e l i n g i s m e e s t a l a f h a n k e l i j k v a n d e s t e r i s c h e e i g e n s c h a p p e n v a n h e t t e k o p p e l e n a m i n o -z u u r d e r i v a a t ( 1 6 ) . De r e a k t i e i s b o v e n d i e n m o e i l i j k t e v o o r s p e l l e n e n h i j k a n soms ' o v e r w a c h t g r o t e vormen a a n n e m e n . M e t name B o d a n s z k y ( 2 4 ) s t e l t d a t om d e z e r e d e n d e REMA m e t h o d e o n g e s c h i k t i s v o o r h e t s y n t h e t i s e r e n v a n g r o t e r e p e p t i d e n . N a a r m i j n m e n i n g z a l e c h t e r d e m a t e w a a r i n a n o m a l e k o p p e l i n g o p t r e e d t s t e r k a f -h a n k e l i j k z i j n v a n d e s e q u e n t i e v a n -h e t t e s y n t -h e t i s e r e n p e p t i d e . A s p a r a g i n e s t a a t b e k e n d a l s v e r o o r z a k e r v a n b i j p r o d u k t e n b i j d e p e p t i d e s y n -t h e s e . Zo w e r d b i j k o p p e l i n g v a n d i -t a m i n o z u u r me-t b e h u l p v a n DCCI d e v o r m i n g van g c y a n o a l a n i n e g e s i g n a l e e r d ( 2 5 2 7 ) t e r w i j l b i j a k t i v e r i n g v a n A s n a l s g e -mengd a n h y d r i d e e e n g r o t e h o e v e e l h e i d v a n h e t s u c c i n i m i d e - d e r i v a a t o n t s t o n d ( 2 8 , 2 9 ) w a a r d o o r d e o p b r e n g s t e n s t e e d s l a a g w a r e n e n w e l k l e i n e r d a n 5 0 % ( z i e f i g . 2.2) x C = N H C H2 B o c - N - C H O H C ii O F i g . 2.2 N e v e n r e a k t i e v a n A s p a r a g i n e n a a k t i v e r i n g . 0,
A
H C H ? N H i i 2 ; / B o c - N - C H ƒ QI?
0
N ii e H C H , \ i i 2 O B o e - N - C H s C/
ii O ¿7 O II c H C H \ B o c - N - C H / ii0
N - HD o o r m i j w e r d g e c o n s t a t e e r d d a t b i j b e s c h e r m i n g v a n de a m i d e f u n k t i e met b i j v o o r b e e l d de 4 , 4 ' d i m e t h o x y b e n z h y d r y l g r o e p (Mbh) A s n z e e r g o e d v i a z i j n gemengd a n -h y d r i d e t e k o p p e l e n was. H i e r o p w o r d t i n -h o o f d s t u k 3.1 n a d e r i n g e g a a n . F r a g m e n t k o p p e l i n g e n met b e h u l p v a n gemengd a n h y d r i d e s g e v e n i n h e t a l g e m e e n a a n l e i d i n g t o t v e e l r a c e m i s a t i e van h e t C t e r m i n a l e a m i n o z u u r v a n h e t g e a k t i -v e e r d e p e p t i d e ( 3 0 ) . 2.2.2 C a r b o d i i m i d e s S i n d s S h e e h a n en Hess ( 3 1 , 3 2 ) h e t g e b r u i k v a n N , N ' - d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e ( D C C I ) a l s k o p p e l i n g s r e a g e n s i n de p e p t i d e c h e m i e i n v o e r d e n i s d i t r e a g e n s één v a n de m e e s t g e b r u i k t e g e w o r d e n . De m o g e l i j k o p t r e d e n d e r a c e m i s a t i e w e r d u i t v o e r i g o n d e r z o c h t en d i t l e i d d e t o t h e t g e b r u i k v a n t o e v o e g i n g e n d i e de r a c e m i s a t i e o n d e r d r u k k e n en v a a k ook de r e a k t i e v e r s n e l l e n ( 3 3 3 5 ) . De m e e s t e b e k e n d -h e i d -h e e f t -h e t 1 - -h y d r o x y b e n z o t r i a z o o l ( H O B t ) g e k r e g e n en e r mag g e s t e l d w o r d e n d a t de DCCI/HOBt m e t h o d e t o t de r a c e m i s a t i e v r i j e mag w o r d e n g e r e k e n d ( 3 6 ) . De m e t h o d e w o r d t ook v e e l g e b r u i k t b i j f r a g m e n t k o p p e l i n g e n d o c h i n een a a n t a l g e -v a l l e n i s h i e r b i j r a c e m i s a t i e g e c o n s t a t e e r d ( 3 6 ) . Eén -v a n de n a d e l e n d i e a a n h e t g e b r u i k v a n DCCI v a s t z i t i s d a t h e t g e v o r m d e d i c y c l o h e x y l u r e u m (DCU) w e l i s -w a a r u i t een DMF o p l o s s i n g p r e c i p i t e e r t d o c h ook v a a k v o o r een d e e l i n o p l o s s i n g b l i j f t en l a t e r , na i s o l a t i e van h e t p e p t i d e , a l s v e r o n t r e i n i g i n g i n h e t p r o d u k t w o r d t t e r u g g e v o n d e n . DCU i s goed o p l o s b a a r i n een m e n g s e l v a n DMF en h e x a m e t h y l f o s f o r z u u r t r i a m i d e (HMPT) d a t v a a k a l s o p l o s m i d d e l v o o r s l e c h t o p l o s b a r e p e p t i -den w o r d t g e b r u i k t . I n d a t g e v a l i s h e t o n v e r m i j d e l i j k d a t b i j p r e c i p i t a t i e v a n h e t p e p t i d e met w a t e r a l h e t DCU i n h e t p r o d u k t t e r e c h t komt. De v e r w i j d e r i n g h i e r v a n kan dan v e e l p r o b l e m e n met z i c h m e e b r e n g e n .
In 1956 w e r d e n r e e d s w a t e r o p l o s b a r e d i i m i d e s geïntroduceerd ( 3 7 , 3 8 ) . B e k e n d z i j n : N c y c l o h e x y l N ' ( 3 d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d e , N e t h y l N ' ( 3 d i m e -t h y l a m i n o p r o p y l ) - c a r b o d i i m i d e , N - c y c l o h e x y l - N1 ( 4 d i e t h y l a m i n o c y c l o h e x y l ) c a r b o d i i m i d e en N c y c l o h e x y l N ' 6 ( N m e t h y l m o r f o l i n o ) e t h y l c a r b o d i i m i d e . p t o l u e e n -s u l f o n a a t ( C M C I ) met a l l e n v r i j w e l d e z e l f d e e i g e n -s c h a p p e n . O m t r e n t h e t o p t r e d e n v a n r a c e m i s a t i e b i j g e b r u i k v a n d e z e v e r b i n d i n g e n i s w e i n i g b e k e n d . Aangenomen w o r d t d a t z i j i n d i t o p z i c h t t e v e r g e l i j k e n z i j n met D C C I , h o e w e l ook een l i c h t e v e r h o g i n g v a n de r a c e m i s a t i e w e r d w a a r g e n o m e n ( 3 9 ) . Het CMCI w e r d d o o r m i j ( z i e 3.3) e e n a a n t a l m a l e n g e b r u i k t . De e e n v o u d v a n d e z e m e t h o d e , met name de o p w e r k i n g , m a a k t d a t h e t g e b r u i k v a n CMCI m e e r a a n d a c h t v e r d i e n t .
2.2.3 A k t i e v e - e s t e r s Het g e b r u i k v a n a k t i e v e - e s t e r s v a n a m i n o z u u r d e r i v a t e n i n d e p e p t i d e s y n t h e s e i s ook a l z e e r l a n g b e k e n d . Een i n t e r e s s a n t o v e r z i c h t w o r d t g e g e v e n d o o r B o d a n s z k y ( 4 0 ) . Een o p m e r k i n g w i l i k maken m e t b e t r e k k i n g t o t h e t g e b r u i k v a n a k t i e v e - e s t e r s b i j s l e c h t o p l o s b a r e p e p t i d e n . V a a k i s h i e r b i j de c o n c e n t r a t i e v a n d e p e p t i d e n z o l a a g d a t de r e a k t i e t i j d e n b i j z o n d e r l a n g g a a n w o r d e n . H e t g e v a a r v o o r n e v e n r e a k t i e s w a a r o n d e r r a c e m i s a t i e neemt d a n t o e . I n sommige g e v a l l e n k u n n e n t o e v o e -g i n -g e n z o a l s b i j v o o r b e e l d HOBt d e r e a k t i e t i j d e n w e e r a a n z i e n l i j k b e k o r t e n ( 4 1 , 4 2 ) A k t i e v e - e s t e r s w o r d e n i n h e t a l g e m e e n w e i n i g g e b r u i k t v o o r f r a g m e n t k o p p e l i n g e n ; de l a s t i g e b e r e i d i n g , t e l a n g e r e a k t i e t i j d e n e n r a c e m i s a t i e s p e l e n h i e r e e n r o l ( 4 3 , 4 4 ) . 2.2.4 A z i d e m e t h o d e Het g e b r u i k v a n a z i d e s i n de p e p t i d e c h e m i e i s één v a n de o u d s t e t e c h n i e k e n v o o r h e t k o p p e l e n v a n a m i n o z u r e n ( 4 5 ) . T e g e n w o o r d i g w o r d e n a z i d e s nog v e e l g e b r u i k t b i j h e t k o p p e l e n v a n f r a g m e n t e n omdat h i e r b i j g e e n o f z e e r w e i n i g r a c e m i s a t i e z o u o n t s t a a n . Een o v e r z i c h t o v e r de a z i d e m e t h o d e w o r d t g e g e v e n d o o r K l a u s n e r ( 4 6 ) Een t w e e t a l p r o b l e m e n d i e b i j m i j e e n r o l s p e e l d e n z a l i k h i e r n a d e r t o e l i c h t e n . V o o r d a t h e t a z i d e k a n w o r d e n b e r e i d moet e e r s t h e t h y d r a z i d e v a n h e t p e p t i d e w o r d e n g e s y n t h e t i s e e r d . Wanneer de g u a n i d i n e g r o e p v a n A r g i s b e s c h e r m d met e e n n i t r o g r o e p d a n w o r d t h i e r u i t d o o r h y d r a z i n o l y s e e e n g r o t e h o e v e e l h e i d o r n i t h i n e en e e n k l e i n e h o e v e e l h e i d a m i n o a r g i n i n e g e v o r m d ( 4 7 , 4 8 ) . Ook b i j h e t g e b r u i k v a n de t o s y l g r o e p a l s b e s c h e r m i n g z i j n d e z e b i j p r o d u k t e n g e s i g n a l e e r d ( 4 9 ) . I n d i e n men d e genoemde b e s c h e r m e n d e g r o e p e n w e n s t t e g e b r u i k e n s l u i t men e e n a z i d e k o p -p e l i n g d u s v r i j w e l u i t ( z i e 4 . 2 ) .
C u r t i u s v o n d d a t b i j a z i d e s e e n o m l e g g i n g k a n p l a a t s v i n d e n n a a r h e t i s o c y a n a a t ( 5 0 , 5 1 ) . Deze n a a r hem genoemde r e a k t i e i s r e l a t i e f l a n g z a a m d o c h k a n g e v o l g d w o r d e n d o o r e e n s n e l l e r e r e a k t i e met de v r i j e a m i n o g r o e p v a n e e n p e p t i d e . I n f i g . 2.3 i s t e z i e n hoe d a n e e n ureum d e r i v a a t ( a z a - a - h o m o - a m i n o z u u r ) v a n e e n p e p t i d e o n t s t a a t . R, O R, --NH-CH-C-N3 c» - N H - C H - N = C = 0 + N2 --NH-CH-N = C=0 + H2N - R2 F i g . 2.3 C u r t i u s - o m l e g g i n g met v o l g r e a k t i e . • * i 9, -NH-CH-NH-C-NH-R,
