Problemen bij de vaste-fase peptidesynthese: Synthese van substance P

Problemen bij de vaste-fase

peptidesynthese

Synthese van substance P

J. L. M. SYRIER

/

DELFTSE UNIVERSITAIRE PERS

n

« o

miii

_{! Illll;}

ml

HI II III!

fill i l l i

iiiiiilJi

f-Problemen bij de vaste-fase peptidesynthese

Synthese van substance P

BIBLIOTHEEK TU Delft P 1811 6387

Problemen bij de vaste-fase

peptidesynthese

Synthese van substance P

technische wetenschappen

aan de Technische Hogeschool Delft, op gezag van de rector magnificus ir. H. B. Boerema, hoogleraar in de afdeling der elektrotechniek, voor een commissie aangewezen door het college van dekanen te verdedigen op

woensdag 7 mei 1975 te 14.00 uur door

JOHANNES LEOPOLD MARIE SYRIER

scheikundig ingenieur, geboren te Maastricht

/ ^ / J (^ i (?

Dit proefschrift is goedgekeurd door de promoter P R O F . DR. H. C. B E Y E R M A N

Het onderzoek dal in dil proefschrift wordl beschreven is uitgcvoerd onder duspicicn van de Slichting Scheikundig Onderzoek in Nederland' (SON) en met financicle steun van de Ncderlandsc Organisatie voor Zuiver-Welenschappelijk Onderzoek (ZWO)

Tekenwerk J M Diiksman

Aan mijn ouders Aan Hanneke en Arjan

Inhoud

Ajkortingen 1 Inleiding en doelslellinii 2

1 De vaste-fase synthese 4 1 1 Inleiding 4 1 2 Enige recente ontwikkelingen in de vaste-fase peptidesynthese 5

1 3 Methionine in de peptidesynthese 10

2 Substance P 12 2 1 Natuurlijk substance P 12

2 2 Synthetisch substance P 15 3 De \asie-fase synthese \an de gehele sequentie (1-11), uilgaande van

methioninesuljoxide 19 3 1 Inleiding 19

3 ] 1 Methioninesulfoxide 19 3 1 2 De vaste-fase synthese 20

3 2 Resultaten 20 3 2 1 De synthese van Boc-methionincsulfoxide 20

3 2 2 De vastc-fasc synthese 21 3 3 Discussie en conclusie 24 3 4 Experimenteel gedeelte 26 4 De xasle-fase synthese \un het jragmeiu 5-11, uitgaande \an

onbeschennd methionine, en koppeling van de fragmenten 1-4 en 5-11 34

4 1 Inleiding 34 4 2 Resultaten 35

4 2 1 Poging tot de vaste-fase synthese van de gchele sequentie

(1-11), de synthese van het fragment 5-11 35 4 2 2 De vaste-fase synthese van het fragment 1-4 37 4 2 3 De koppeling van de fragmenten 1-4 en 5-11 39 4 2 4 De ontscherming met vioeibaar waterstoffluonde 40

4 2 5 Racemisatie van het methionine 40

4 3 Discussie en conclusies 41

4 4 Experimenteel gedeelte 42

5 De \asle-fase synthese \an hel fragment 1-9 en koppeling aan het

fragment 10-11 54 5 1 Inleiding 54 5 2 Resultaten 56

5 2 1 De vaste-fase synthese van het fragment 1 -9 56 5 2 2 De svnthese van het fragment 10-11 60 5 2 3 De koppeling van de fragmenten 1-9 en 10-11 60

5 2 4 De ontscherming met vlocibaar waterstoffluoride 61 5 2 5 De synthese van substance P aan het

benzhydrylammopoly-meer 61 5 2 6 De karaktensermg van de eindproducten 64

5 3 Discussie en conclusies 66 5 3 1 De vaste-fase synthese van het fragment 1-9 66

5 3 2 De synthese van het fragment 10-11 68 5 3 3 De koppeling van de fragmenten 1-9 en 10-11 69

5 3 4 De reactie met vlocibaar waterstoffluoride 69

5 3 5 Het benzhydrylaminopolymeer 69 5 3 6 De eindproducten 70 5 3 7 De strategic 71 5 4 Experimenteel gedeelte 72 Sameinatting 85 Summary 88 Ijteratuur 91 X

Afkortingen

In de gebruikte afkortingen zijn zoveel mogelijk de aanbevelingen van de lUPAC-IUB-commissie voor biochemische nomenclatuur gevolgd (J. Biol. Chem. 247 (1972) 977). De genoemde aminozuren, behalve glycine, bezitten de L-configuratie, tenzij anders is aan-gegeven. Adoc Boo Bpoc DCCI DCHA DMF Et HOAc HOBt Np Pmz P y r REMA Tcp TEA Tfa Tos Z 1-adamantyloxycarbonyl tert-butyloxycarbonyl 2-(p-bifenylyl)-isopropyloxycarbonyl N, N'-dicyclohexylcarbodiimide dicyclohexylamine N, N-dimethylformamide ethyl azijnzuur 1-hydroxybenzotriazool 4-nitrofenyl 4-methoxybenzyloxycarbonyl pyridine

repetitive excess mixed anhydride 2 , 4 , 5-trichloorfenyl trifluorazijnzuur trifluoracetyl 4-tolueensulfonyl benzyloxycarbonyl 1

Inleiding en doelstelling

De vaste-fase methode van Merrifield is in het algemeen geschikt voor de synthese van zuivere peptiden met een maximale keten-lengte van circa vijftien aminozuren. Deze werkwijze onderscheidt zich van andere, doordat de produkten snel en veelal met een hoge opbrengst kunnen worden bereid. Bovendien kan de synthese ge-mechaniseerd worden uitgcvoerd.

Bij de vaste-fase synthese van peptiden met C-terminaal methio-nine ontstaan er echter problemen; met n a m e , alkylering van de thioetherbinding van methionine tijdens de verestering van Ncf-be-schermd methionine met de vaste d r a g e r , een gechloormethyleerd copolymeer van styreen en 1,4-divinylbenzeen. Alkylering kan ook optreden tijdens acidolyse van beschermende groepen. Methionine is bovendien gevoelig voor oxidatie.

Tachykininen en bombesine-achtigen zijn in de natuur voorkomen-de peptivoorkomen-den met C-terminaal methionineamivoorkomen-de en met een keten-lengte van tien tot veertien aminozuren. Van zeven van deze pepti-den is de aminozuursequentie opgehelderd; waarschijnlijk wordt dit aantal in de toekomst g r o t e r . Deze peptiden zijn vrijwel alle-maal in de huid van amfibieBn gevonden. Vermoedelijk komt sub-stance P , een van de tachykininen, echter voor in veel dierklassen en ook in de m e n s . Er bestaan aanwijzingen, dat dit peptide een n e u r o t r a n s m i t t e r i s .

Het doel van mijn onderzoek was na te gaan, aan de hand van de synthese van een modelpeptide, op welke wijzen de vaste-fase methode kan worden toegepast voor de synthese van peptiden met C-terminaal methionineamide, zoals tachykininen en bombesine-ach-tigen.

Substance P werd als modelpeptide gekozen. Het werd in 1931 ont-dekt, m a a r pas in 1970 in zuivere vorm gel'soleerd. De amino-zuursequentie werd in 1971 opgehelderd. Bij de aanvang van mijn onderzoek was, volgens een voorlopige mededeling, het peptide gesynthetiseerd volgens de vaste-fase methode om bevestiging van de gevonden structuur te verkrijgen. Een fysische en chemische k a r a k t e r i s e r i n g van het produkt werd echter nauwelijks gegeven. De keuze van su'"'=tance P als modelpeptide was ook zinvol, om-2

dat natuurlijke bronnen niet geschikt zijn voor de winning van een voldoende hoeveelheid zuiver m a t e r i a a l . Dit m a t e r i a a l is noodza-kelijk voor de bestudering van de fysiologie en de farmacologie van substance P . Een synthetisch p r e p a r a a t geeft de mogelijkheid de eigenschappen van substance P b e t e r te leren kennen, zodat vergelijking van preparaten op andere dan alleen biologische g r o n -den mogelijk wordt.

1. De vaste-fase synthese

1.1 INLEIDING

Er bestond de opvatting, dat de werkwijze, die leidt tot de o r g a -nisch chemische synthese van proteihen, aminozuursequenties van m e e r dan honderd aminozuren, zeer eenvoudig, efficient en snel zou moeten zijn (1, 2). Met dit uitgangspunt ontwikkelde M e r r i -field vanaf 1959 de vaste-fase methode (1-6). In 1964 en 1965 syn-thetiseerde hij met deze methode het nonapeptide bradykinine (1, 4, 5, 7, 8) en het octapeptide [S-isoleucine] angiotensine II (1, 4). In 1971 werd de synthese van een p r e p a r a a t m e t een aanzienlijke runderribonuclease-A-aktiviteit voltooid (9). Runderribonuclease-A bevat 124 aminozuren (10).

Tegenover de successen van Merrifield en zijn m e d e w e r k e r s en de synthesen van een groot aantal kleine peptiden ook door ande-ren* (2, 11) staan de mislukte synthesen van lysozyme uit kippeSi-wit (18), varkensfosfolipase-A (19), bacterieel ferredoxine (20, 21)**, menselijk calcitonine (22) en v a r k e n s s e c r e t i n e (23) m e t r e s p . 129, 123, 55, 33 en 27 aminozuren (10). Sedert enige jaren zijn er verhandelingen verschenen, waarin de vaste-fase methode zeer kritisch met andere methoden werd vergeleken (11, 24-27). De huidige mening i s , dat peptiden met een ketenlengte tot twaalf a vijftien aminozuren in veel gevallen te bereiden zijn, m a a r dat de synthese van proteihen in min of m e e r zuivere vorm in de na-bije toekomst zeker niet mogelijk i s .

De problematiek van de vaste-fase synthese is a l s volgt s a m e n te vatten. In elke stap i s een z e e r hoge opbrengst v e r e i s t .

Onvolle* In dit laboratorium werden volgens de v a s t e f a s e methode b e -reid: oxytocine, [ 8 - l y s i n e ] vasopressine en enige derivaten van deze peptiden (12, 15), menselijk calcitonine (13), thyrotropine releasinghormoon (14, 15), lutetoiserend hormoon r e l e a s i n g -hormoon (16) en fragmenten van menselijk groei-hormoon (17). ** Ofschoon Bayer et al. concludeerden, dat bun synthese w a s ge-slaagd, bestaat er volgens Merrifield twijfel aan de zuiverheid van het produkt. Ongeveer 2% ferredoxineactiviteit kon worden waargenomen (2).

dige omzettingen leiden na een aantal cyclussen tot i m m e n s e schei-dingsproblemen en een lage opbrengst (28, 29). Om zeer hoge koppelingsopbrengsten te bereiken wordt het reactant in overmaat g e -bruikt. De toepassing van sterk geactiveerde aminozuurderivaten en van zeer grote overmaten leidt in het algemeen niet tot een ho-g e r e koppelinho-gsopbrenho-gst, terwijl het ho-gevaar van r a c e m i s a t i e en andere nevenreacties toeneemt (30-32).

Een goede hechting van de peptideketens aan het polymeer moet voorkomen, dat tijdens de synthese peptiden worden afgesplitst

(9, 18, 33-36). Een te s t e r k e peptide-pol}rmeerbinding leidt tot moeilijkheden, wanneer aan het einde van de synthese het peptide van het polymeer moet worden afgesplitst (23).

Evenzo moeten de zijketens van de trifunctionele aminozuren zodanig worden b e s c h e r m d , dat er tijdens de synthese geen d e p r o -tectie van de zijketens kan optreden, hetgeen tot ketenvertakking kan leiden (37-40).

Het polymeer moet goed zwellen in oplosmiddelen, die geschikt zijn voor peptidesynthese. Dit is noodzakelijk voor een goed t r a n s -port van de reactanten. Ook i s e r het probleem van de solvatering van het polymeer en de peptideketens. In de delen van het polymeer, die niet gesolvateerd zijn, zitten peptideketens verborgen, die niet toegankelijk zijn voor reagentia (26, 41). Peptideketens, die niet gesolvateerd zijn, kunnen een zodanige conformatie hebben aange-nomen, dat r e a c t i e s s t e r i s c h gehinderd zijn (26, 42).

De analysemethoden, die inzicht moeten geven in het verloop van de synthese, schieten te kort wat snelheid, nauwkeurigheid en gevoeligheid betreft (43).

Ondanks deze uitgebreide problematiek i s er een groot aantal pep-tiden met circa tien aminozuurresten met succes gesynthetiseerd (2, 11). E r wordt gezocht n a a r verbeteringen van de methode, z o -dat ook g r o t e r e peptiden en protelhen binnen het bereik van de vaste-fase synthese komen. Deze verbeteringen vt'orden niet alleen gezocht in de tactiek van de synthese (bv. keuze van beschermende groepen, koppelingsreagentia), m a a r ook in de s t r a t e g i c (geheel sequentiele synthese aan het polymeer, of de vaste-fase synthese van fragmenten, gevolgd door fragmentkoppelingen in oplossing of aan de vaste-fase) (44). Waarschijnlijk zal het niet mogelijk zijn een procedure te ontwikkelen volgens welke elke gewenste sequentie gesynthetiseerd kan worden. Voor elk peptide of protelYie afzonder-lijk zal de m e e s t geschikte bereidingswijze gezocht moeten worden.

1.2 ENIGE RECENTE ONTWIKKELINGEN IN DE VASTE-FASE PEPTIDESYNTHESE

Hieronder volgt de behandeling van een aantal ontwikkelingen, die gebruikt werden bij het werk, dat in dit proefschrift is beschreven

Het polymeer, dat Merrifield voorstelde, is gechloormethyleerd copolymeer van 98% styreen en 2% 1,4-divinylbenzeen ('Merrifield-polymeer, 2% vertakt') (45). Later werd gechloormethyleerd polystyreen met 1% divinylbenzeen opnieuw onderzocht (1) en van-af 1969 in toenemende mate gebruikt (33). Van dit polymeer is de mechanische stabiliteit minder en de oplosbaarheid g r o t e r , zodat op m e e r v e r l i e s aan m a t e r i a a l gerekend moet worden. Het zwel-vermogen i s echter aanzienlijk b e t e r , zodat de r e a c t i e s sneller en b e t e r verlopen.

-CH —CH2-CH — CH2---CH — C H ,

H C - N H ;

6

Fig. 1.1 Het benzhydrylaminopolymeer

Het benzhydrylaminopoly styreen, vertakt met 1% divinylbenzeen, (fig. 1.1) werd ingevoerd door Pietta en Marshall (46). Het i s g e -schikt voor de synthese van peptiden met C-terminaal amide. De amidebinding tussen het peptide en het polymeer is stabieler dan de benzylesterbinding, die met het Merrifield-polymeer wordt v e r k r e g e n . Een nadeel van het benzhydrylaminopolymeer is e c h t e r , dat het niet universeel bruikbaar i s .

In het algemeen worden voor de koppelingen in de vaste-fase synthese 3 tot 4 equivalenten Boc-aminozuur en N, N'-dicycio-hexylcarbodiimide (DCCI) gebruikt met twee uur als koppelings-tijd (11). In enige gevallen werden b e t e r e resultaten verkregen door de koppelingsstap te herhalen (16, 47, 48) of door een lange-r e koppelingstijd te kiezen (49, 50). Tussen twee koppelingsstap-pen wordt het polymeer een aantal malen afwisselend met methyleen-chloride en ethanol gewassen, waardoor het polymeer een aan-tal malen zwelt en weer k r i m p t . Dit heeft een goede invloed op de koppelingsopbrengst. Misschien zijn hier twee factoren van invloed: 1. door het krimpen en weer zwellen verandert de structuur van het polymeer zodanig, dat e r aminogroepen bereikbaar worden, die voorheen niet bereikbaar waren door plaatselijk slechte solva-tering van het polymeer (13, 41);

2. in het polymeer g e k r i s t a l l i s e e r d e ureumderivaten worden zeer efficient weggewassen. PoriSn, die door ureumkristallen zijn afgesloten gaan weer open, waardoor nog niet geacyleerde a m i -nogroepen bereikbaar worden voor koppelingsreagentia (51). Herhaling van de koppeling in een ander oplosmiddel kan een goede invloed hebben op de koppelingsopbrengst, indien de peptideketens 6

beter g e s o l v a t e e r d worden (41, 42).

De werkwijze m e t DCCI i s ook zodanig gemodificeerd, dat het gevormde Oacyllactim in een ander aanvallend deeltje wordt o m -gezet:

1. door het Boc-aminozuur t e activeren met 0, 5 equivalent DCCI (ten opzichte van het Boc-aminozuur) ontstaat het s y m m e t r i s c h e anhydride (fig. 1.2) (51-53);

2. het m e t DCCI geactiveerde Boc-aminozuur wordt met 1hydroxybenzotriazool in situ omgezet in een actieve e s t e r (54, 55). D e -ze actieve e s t e r heeft een -zeer hoge aminolysesnelheid door complexvorming met de aminocomponent (fig. 1.3) (56). Deze werkwijze kan r a c e m i s a t i e onderdrukken (15, 54, 55, 57). N -hydroxysuccinimide heeft dezelfde eigenschappen, m a a r dit r e a g e n s kan de vorming van 6-alaninepeptiden veroorzaken (58, 59). R-COOH DCCI 0 NH II I R-COOH R - C - O - C *• II N R-C R-c.,

Q

Fig. 1.2 De r e a c t i e van een Boc-aminozuur (R-COOH) met een ondermaat DCCI tot het s y m m e t r i s c h e anhydride

Q

a>

s Q

Q

7-H

''-'^

Fig. 1. 3 Vorming van een actieve e s t e r met behulp van 1-hydroxy-benzotriazool (HOBt); aminolyse van een 1-benzotriazolylester (KOnig en Geiger (54-56))

Deze activeringsmethoden bieden de volgende voordelen:

1. desactivering door omlegging naar het N-acylureumderivaat wordt vermeden;

2. dicyclohexylureum kan worden afgefiltreerd indien de a c t i v e -ring wordt uitgcvoerd buiten het reactievat waarin zich het po-lymeer bevindt;

3. dehydratering van Boc-glutamine en Boc-asparagine tot de ni-trillen wordt voorkomen (52, 55)*.

Na de koppelingsreactie kan het polymeer behandeld worden met een r e a g e n s , dat het restant aminogroepen permanent blokkeert. Voorbeelden van een dergelijk reagens zijn: azijnzuuranhydride, acetylimidazool en 3-sulfopropionzuuranhydride (11). Ofschoon de a c y l e r i n g s r e a c t i e met een dergelijk reagens aanzienlijk m i n -der s t e r i s c h gehin-derd is dan de koppelingsreactie, is het toch de vraag of alle, tijdens de koppelingsreactie niet bereikte, a m i n o -groepen nu wel bereikt zullen worden (41, 48).

In een vroeg stadium werden 1 N zoutzuur in ijsazijn (7) en 4 N zoutzuur in dioxaan (60) getotroduceerd als afsplitsingsreagentia voor de B o c g r o e p . Karlsson et al. toonden aan, dat 50% t r i f l u o r -azijnzuur in methyleenchloride (33) beter voldoet (35). In dit reagens zwelt het polymeer b e t e r dan in zoutzuur/ijsazijn. Tegenwoordig wordt ook 20% trifluorazijnzuur in methyleenchloride g e -bruikt, omdat in dit reagens zijketenbeschermingen (bv. Lys(Z)) en de benzylesterbinding tussen het peptide en het polymeer stabie-l e r zijn (9, 36). Om verdunning van het afspstabie-litsingsreagens met in het polymeer aanwezig oplosmiddel te voorkomen, wordt het polymeer voor de eigenlijke deprotectiestap gewassen met het af-splitsingsreagens (9, 13, 41).

Peptiden, gesynthetiseerd aan het Merrifield-polymeer, kunnen als C - t e r m i n a a l amide van het polymeer gesplitst worden door om-zetting van de benzylesterbinding met vloeibare ammoniak (12, 61) of met ammoniak, opgelost in dimethylformamide (62), ethanol

(61, 63) of methanol (12, 64). Goede resultaten worden verkregen met een bij 0° verzadigde oplossing van ammoniak in methanol. De r e a c t i e verloopt in dit milieu gedeeltelijk via de methylester

(fig. 1.4) (65, 66). Door het polymeer te behandelen met een t e r -t i a i r e b a s e in me-thanol on-ts-taa-t alleen de me-thyles-ter, omda-t de ammonolysen van de methylester en het peptide-polymeer geblok-keerd worden.

* Volgens Hemmasi en Bayer (52) kurmen NQ,-beschermd glutamine en asparagine gekoppeld worden als de symmetrische anhydriden (gevormd met 0,5 equivalent DCCI). Zij controleerden dit alleen met Boc-glutamine, terwijl de dehydratering juist in s t e r k e r e mate optreedt bij asparagine dan bij glutamine. Hagenmaier en Frank konden na toepassing van deze methode bij een koppeling van Boc-glutamine 1,7% dehydratering aantonen (51).

6-0

R-C-O-® -H CH3OH -I- NH3 =::rR-C-0-(P);^R-C-0-(g) = O-CHj O-CH3 H-N-H NH3 route 1

f

Fig. 1.4 Ammonolyse van een peptide-polymeer in een ammoniak/ methanolmengsel

Van de methoden, waardoor het verloop van de synthese gevolgd kan worden, worden hier slechts drie genoemd (43).

1. de aminozuuranalyse van m o n s t e r s peptidepolymeer na h y d r o -lyse met behulp van zuur;

2. de bepaling van het aantal aminogroepen volgens Dorman (67). Hierbij worden de aminogroepen omgezet in het hydrochloride met pyridiniumchloride. Na uitwassen van de overmaat van het reagens wordt het zoutzuur van het polymeer gewassen met een triethylamineoplossing. In de filtraten van deze en een aantal volgende wassingen wordt het chloride bepaald door t i t r a t i e met zilvernitraat. Bij het toepassen van deze methode moet men crop bedacht zijn, dat aminogroepen, die door slechte solvatering in het polymeer verscholen zijn, niet mede bepaald w o r -den (41). Bij gebruik van het Merrifield-polymeer wordt een bianco waarde gemeten (16, 4 1 , 68);

3. de k l e u r r e a c t i e met ninhydrine volgens Kaiser (69). Met deze test kan het verloop van de koppeling kwalitatief bepaald w o r -den. Hiertoe wordt een monster uit het polymeer, nadat het degelijk i s gewassen (68, 70), met het reagens gedurende vijf minuten op 100° verhit. De kleur wordt violet, tenzij het niet geacyleerde aminozuur proline of asparaginezuur-g-benzyl-e s t asparaginezuur-g-benzyl-e r i s . In diasparaginezuur-g-benzyl-e gasparaginezuur-g-benzyl-evallasparaginezuur-g-benzyl-en ontstaat asparaginezuur-g-benzyl-e r asparaginezuur-g-benzyl-easparaginezuur-g-benzyl-en bruinasparaginezuur-g-benzyl-e klasparaginezuur-g-benzyl-eur. Door t e r m i s c h e afsplitsing van Boc-groepen ontstaat e r een bianco kl curing.

1.3 METHIONINE IN DE PEPTIDESYNTHESE

Een apart probleem m de peptidesynthese wordt gevormd door methionine. Het kan geoxideerd worden tot het sulfoxide en het kan gealkyleerd worden tot een sulfomumzout.

De oxidatie vmdt plaats door zuurstof uit de lucht. N o r r i s et al. (34) hebben aangetoond, dat dit met gebeurde m hun v a s t e f a s e -synthesemachine. Deze machine is uitgerust met een schudreactor. Worden de p o l y m e e r k o r r e l s echter in beweging gehouden door mid-del van een constante stikstofstroom door de suspensie been, dan blijkt, dat gedeeltelijke oxidatie toch moeihjk te voorkomen i s . Het gevormde sulfoxide kan na afloop van de synthese met thiolen worden g e r e d u c e e r d .

De alkyleringsreactie t r e e d t op, wanneer Boc-methionine volgens de methode van Merrifield (7) wordt v e r e s t e r d met een g e -chloormethyleerd polymeer (71). Een gedeelte van de Boc-methio-nine wordt dan met als e s t e r m e t het polymeer verbonden (fig

1.5a), m a a r via het zwavelatoom (fig 1 5b). Deze nevenreactie

CHj

CH2 S - C H 3 C H 2 - S - C H 2 - ( ^ ^ > - C H CH2 CH2 CH2

Boc-NH-CH-C 0-CH2-f V c H Boc - NH-CH-C-OH

II \ = / II

(a) (b)

Fig. 1.5 Boc-methionine, verbonden met het Merrifield-polymeer, (a) als benzylester en (b) via het zwavelatoom, als derivaat van homocysteine

IS m het verleden op de volgende manieren vermeden

1. door N-beschermd methionine met behulp van carbonyldiimida-zool of DCCI te \ e r e s t e r e n met een ander polymeer (hydroxy-methylpolystyreen, vertakt met divinylbenzeen (72), fenol-trioxaancopolymeer (73) en poly ethyl eengly col (74)),

2 door Boc-methiomne te koppelen aan benzhydrylaminopolysty-r e e n , vebenzhydrylaminopolysty-rtakt met divinylbenzeen, met behulp van DCCI (75-77),

3. door Boc-methiomnesulfoxide volgens de methode van Merrifield te v e r e s t e r e n met een Merrifieldpolymeer, gevolgd door r e -ductie met natriumjodide en acetyl chloride (34).

Tijdens de afsplitsing van Boc-groepen en Z-groepen met behulp van zuur kan methionine gealkyleerd worden door r e s p . t e r t b u t y l -10

kationen en benzylkationen. Volgens McKay en Albertson is m e -thionine niet gevoelig voor tert-butylering (78), m a a r uit werk van Sieber et al. (79, 80) en Hirschmann et al. (81, 82) blijkt, dat d e ze r e a c t i e wel kan optreden. Bij de ontleding van het t e r t b u t y l -sulfoniumzout van een methioninepeptide ontstond voornamelijk weer het methioninepeptide (80). Het i s echter niet bekend hoe spe-cifiek deze r e a c t i e in andere sequenties is en wat de invloed van het milieu i s , waarin de ontleding plaats vindt. Benzylering van de thioetherbinding leidde in een aantal gevallen tot de vorming van S-benzylhomocysteine (83-88).

Omdat de alkyleringsreactie tijdens elke cyclus na de invoering van methionine kan optreden en e r tijdens een vaste-fase synthese geen zuivering van tussenprodukten plaats vindt, verdient het aan-beveling methionine te b e s c h e r m e n tegen deze nevenreactie. De vorming van sulfoniumzouten kan vermeden worden door een afvanger voor kationen aan het reactiemengsel toe te voegen. D a a r -toe geschikte verbindingen zijn ethyl methyl sulfide (87-89), methio-nine (81, 90), diethylfosfiet (87, 88) en anisool (91, 92). Sulfonium-zoutvorming kan ook voorkomen worden door methionine als sulf-oxide te b e s c h e r m e n (93).

2. Substance P

2 . 1 NATUURLIJK SUBSTANCE P

Substance P (94-96) werd in 1931 ontdekt door Von Euler en Gaddum in extracten van hersenen en d a r m e n van paarden (97). Oorspronkelijk werd de t e r m ' P r e p a r a t i o n P ' (P van powder) g e -bruikt, m a a r in 1934 werd door Gaddum en Schild de naam

sub-stance P ingevoerd (98).

Substance P-activiteit is bij zoogdieren, v i s s e n , amfibieSn en ook bij de mens in de wanden van het spijsverteringskanaal en in het centrale zenuwstelsel aangetoond. Er werden pogingen gedaan sub-stance P te isoleren uit de darmen en h e r s e n e n van varkens, paar-den, geiten en runderen. Dit bleek een moeilijke opgave te zijn, doordat substance P slechts in zeer geringe hoeveelheden voor-komt in de weefsels en doordat het moeilijk w a s van extracten de substance P-activiteit specifiek te bepalen (96).

Ondanks deze problemen werd de farmacologie van substance P al sedert de ontdekking onderzocht. De volgende eigenschappen wer-den gevonwer-den (96):

1. substance P veroorzaakt contractie van glad spierweefsel in d a r m p r e p a r a t e n van alle tot nu toe onderzochte zoogdieren en koudbloedige dieren. Bij het konijn en de bond zijn deze werkin-gen ook in vivo gevonden;

2. het stimuleert de menselijke tuba in v i t r o ;

3. zowel in vivo als in vitro veroorzaakt het een verwijding van de bloedvaten, en in vivo bovendien een d a a r m e e gepaard gaande verlaging van de bloeddruk;

4. het veroorzaakt vernauwing van de bronchien;

5. het stimuleert de speekselklieren van r a t t e n , marmotten, ham-s t e r ham-s , kippen en honden, m a a r niet van konijnen en katten; 6. het verhoogt de capillaire permeabiliteit van haarvaten van m a r

-motten en konijnen;

7. het veroorzaakt pijn na intracutane injectie.

Over de functie van substance P in het o r g a n i s m e is niet veel b e -kend. Er bestaan vermoedens, dat het een n e u r o t r a n s m i t t e r is (96).

Substance P-activiteit wordt op de volgende manieren gemeten: 12

1. uit de daling van de bloeddruk na intraveneuze injectie in proef-dieren (96);

2. uit de contractie van glad spierweefsel in een proefopstelling (96);

3. uit dc speekselproduktie in ratten na intraveneuze injectie (99). De activiteit wordt uitgedrukt in VonEulereenheden, die g e r e l a -teerd zijn aan de drempeldosis die nodig i s voor de contractie van glad spierweefsel in vitro (96). In 20 h 50 mg weefsel van de dunne darm van paarden komt 1 Von Euler-eenheid voor (94, 95). De sialagogische eenheid, ingevoerd door Chang en Leeman, bedraagt ongeveer 200 Von-Euler-eenheden (100). Sinds kort bestaat er een radioimmunologische bepaling (101).

P a s in 1970, bijna 40 j a a r na de ontdekking, isoleerden Chang en Leeman substance P in nagenoeg zuivere vorm uit runderhypotha-lami (100). De werkwijze i s in tabel 2.1 weergegeven.

Tabel 2.1 Isolering en zuivering van substance P uit 20 kg runder-hypothalami (Chang en Leeman (100))

B e w e r k l n g

E x t r a c t i e met z o u t z u u r / aceton en ontvettlng

Gelfiltratie over Sephadex G-25 Herhaling g e l f i l t r a t i e C h r o m a t o g r a f i e o v e r sulfoethyl sephadex C h r o m a t o g r a f i e o v e r c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e O p b r e n g s t U " B ; 100.000 2.000 1.000 5 1 H o o g s p a n n i n g s p a p i c r e l e c t r o f o r e s e 0, 150 Activiteit (sialagogische e e n h e d e n / m g ) 0 , 3 12 20 1.300 5.000 13.000 (Von E u l c r -e -e n h -e d -e n / m g ) 60 2.400 4 . 0 0 0 260.000 1 . 0 0 0 . 0 0 0 2 . 6 0 0 . 0 0 0

De p r i m a i r e structuur (aminozuursequentie) van het gel'soleerde peptide werd in 1971 opgehelderd in samenwerking met Niall (102), De gevonden sequentie is vermeld in figuur 2 . 1 . De structuuropheldering verliep als volgt. De aminozuursamenstelling na h y d r o -lyse met behulp van zuur en na enzymatische hydro-lyse was bekend. Hieruit bleek, dat al het glutaminezuur aanwezig is als glutamine. Edman-degradatie leverde de sequentie A r g - P r o - L y s - P r o op. Door afbraak met chymotrypsine gevolgd door Edman-degradatie werd de sequentie Phe-Gly-Leu gevonden. Afbraak met chymo-trypsine gevolgd door afbraak met carboxypeptidase-A leverde de sequentie Gln-Phe op. Door deamidering en afbraak met cai'boxy-peptidase-A werden methionine, leucine, glycine en fenylalanine vrij-gemaakt. Het nog r e s t e r e n d e glutamine werd op de enig mogelijke plaats 5 (fig. 2.1) gezet. Samen met T r e g e a r en Potts werd een peptide van deze sequentie gesynthetiseerd t e r bevestiging van de

HN N H ;

V

1 0

-n

"•9

-9

1 1 1.//

Fig. 2 . 1 P r i m a i r e structuur van substance P ; de polyamideketen van het peptide i s voorgesteld door een dikke lijn

structuur (75).

Recent slaagden Studer et al. erin een onzuiver preparaat uit paardendarm (103) te zuiveren (104). De werkwijze is in tabel 2.2 samengevat. De sequentieopheldering van substance P van paarden door Studer et al. (104) was analoog aan de opheldering van de structuur van substance P uit runderen. Dezelfde sequentie (fig. 2.1) werd gevonden. Het is opmerkelijk, dat met chymotrypsine in substance P van runderen de Phe-Phe-binding en in substance P van paarden voornamelijk de Phe-Gly-binding werd gehydroly-s e e r d .

Tabel 2.2 Zuivering van een substance P - e x t r a c t uit paardendarm (Vogler et al. (103) en Studer et al. (104))

Bewerking Opbrengst

(mg) Tegenstroomverdeling

Gelfiltratie over Sephadex G-25 Herhaling gelfiltratie Chromatografie over carboxymethyl sephadex Hoogspanningspapierelectroforese 500 70 7,6 0,228 Activiteit (Von-Euler-eenheden/mg) 10.000 68.700 2.270.000 Lang voordat de p r i m a i r e structuur van substance P bekend was, bestond er het sterke vermoeden (105, 106), dat de sequentie sterk zou lijken op de sequentie van eledol'sine (107, 108) en physalae-mine (109), afkomstig uit r e s p . de speekselklieren van een soort inktvis en de huid van een soort kikker. Deze peptiden zijn nauwe-lijks van elkaar te onderscheiden met behulp van biologische ijkin-gen (96). Zij vertonen kruistachyfylaxie. Het antiserum teijkin-gen sub-stance P , bereid door Pov/ell et a l . , vertoont echter geen activi-14

teit tegen eledol'sine en physalaemine (101). Tot deze groep van peptiden, die door E r s p a m e r tachykininen zijn genoemd (110, 111), behoren ook phyllomedusine (112) en uperolelhe (113), afkomstig uit de huid van k i k k e r s . Van uperolel"ne is de structuur nog onbe-kend. Andere op substance P lijkende peptiden zijn de bombesine-achtige peptiden (110, 111); bombesine (114, 115), alytesine (114, 115) en ranatensine (116), alle afkomstig uit de huid van v e r s c h i l lende soorten k i k k e r s . Figuur 2. 2 geeft een overzicht van de s e -quenties. Waarschijnlijk zullen m e e r tachykininen en bombesine-achtigen gevonden worden en zullen de aminozuursequenties van deze peptiden opgehelderd worden.

De grote overeenkomst in de sequenties bevindt zich in het C t e r -minale deel. Uit experimenten met analoga van eledol'sine, physalaemine en substance P is vastgesteld, dat de C - t e r m i n a l e hexapeptiden voldoende zijn voor aanzienlijke activiteit (111, 117). De aanwezigheid van histidine in het Cterminale deel van de s e quenties van de bombesineachtige peptiden uit zich in andere f a r -macologische eigenschappen van deze peptiden (110, 111).

Bij de bestudering van de farmacologie t r a d als het grote p r o -bleem naar voren, dat substance P niet in voldoende mate in zui-v e r e zui-vorm zui-verkregen kon worden. De m e e s t e p r e p a r a t e n , Vzui-v'aar- Vv'aarm e e de experiVv'aarmenten werden gedaan, hadden activiteiten van Vv'aarm i n -d e r -dan 50.000 V o n - E u l e r - e e n h e -d e n / m g . Deze p r e p a r a t e n bevatten dus voor m e e r dan 98% verontreinigingen, die al of niet s t o o r -den in de experimenten. De farmacologie van substance P zal aan de hand van zuiver m a t e r i a a l opnieuw onderzocht moeten worden. Dit m a t e r i a a l moet van synthetische oorsprong zijn, omdat het dier niet geschikt is als bron voor de winning van zuiver substance P .

2.2 SYNTHETISCH SUBSTANCE P

Toen in 1971 werd begonnen met het werk, dat in dit proefschrift i s beschreven, hadden alleen T r e g e a r et al. een synthese van sub-stance P genoemd in een korte mededeling (75). Het doel van deze synthese was de gevonden sequentie te bevestigen, Zij syntheti-seerden het peptide aan benzhydrylaminopoly styreen, vertakt met 1% divinylbenzeen (46). De Boc-aminozuren werden gekoppeld met DCCI, behalve Boc-Gln, dat als p-nitrofenylester werd gekoppeld. De Boc-groepen werden afgesplitst met zoutzuur in dioxaan, na koppeling van Boc-glutamine v.'erd echter trifluorazijnzuur gebruikt. De zijketens van lysine en arginine werden met r e s p . de Z - en de nitrogroep b e s c h e r m d . Het peptide werd als het amide van het polymeer gesplitst en tegelijkertijd ontschermd door r e a c t i e met vioeibaar waterstoffluoride in aanwezigheid van anisool. Het ruwe produkt werd gezuiverd door gelfiltratie achtereenvolgens over

Tachykininen S u b s t a n c e P E l e d o i s i n e P h y s a l a e m i n e P h y l l o m e d u s i n e besjne-achtlgen: Bombesine A l y t e s i n e R a n a t e n s i n e -< G l u < G l u <:Glu < G l u < G l u <:Glu -A r g -— -— Gin Gly -Pro Pro A l a Lys Ser Asp Asn Arg Arg -Leu Leu -Gly Gly V o l P r o G i n Lys Asp Pro Pro Asn Thr P r o Asn Asn Gin Gin Gin Gin A l a Lys Arg Trp Trp Trp Phe Phe Phe Phe Ala Ala A l a Phe He Tyr He Vol Vol Vol Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly -His H I S His Leu Leu Leu Leu Leu Leu P h e Met Met Met Met Met Met Met NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 N H j

Bio-Gel en Sephadex G-15. Het p r e p a r a a t had in vier biologische bepalingen en in een radioimmunologische bepaling (101) dezelfde activiteit als het natuurlijke produkt. Zowel de aminozuuranalyse als de gebrekkige chemische k a r a k t e r i s e r i n g doen twijfel rijzen aan de homogeniteit van het produkt.

In 1973 gaven Yajima en Kitagawa een beknopte beschrijving van hun synthese in oplossing (118). Figuur 2.3 geeft deze synthese

schematisch w e e r . Het produkt werd gezuiverd door c h r o m a t o g r a -fie over carboxymethylcellulose en het werd g e k a r a k t e r i s e e r d door element analyses, aminozuuranalyse, een optische rotatie en dunne-laagchromatografie. Het p r e p a r a a t vertoonde dezelfde of hogere biologische activiteit dan het synthetische produkt van T r e g e a r . Vermoedelijk hebben Yajima en Kitagawa moeilijkheden gehad bij de laatste fragmentkoppeling (hoofdstuk 4), De auteurs v e r z u i m den opbrengsten te vermelden. De aminozuuranalyse doet v e r m o e -den, dat het eindprodukt niet homogeen i s (169).

1 Arg 2 Pro NO; 3 Lys NO; Pmz-•OH H-4 5 Pro Gin b 6 Gin 7 Phe 9 Gly 10 Leu •OH 0 •OH •OH Pmz-•OH H-•ONp H^ Pm2-4-ONp H-Pmz Pmz-j-ONp H' Pmz Pmz' Pmz' -OH H-11 Met •NH, •NH; •NH, a / b c

DCCI/HOBt koppeling , ontscherming met trifluorazijnzuur , ontscherming met trifluorazijnzuur in aanwezigheid von anisool . ontscherming met HP m aanwezigheid van anisool

Fig. 2. 3 Synthese van substance P (Yajima en Kitagawa (118)) In 1974 noemden Bergmann et al. hun sequentisle synthese in oplossing (117). Zij gingen uit van het C-terminale tetrapeptide. BocGln en BocArg(N02) werden als gemengde anhydriden g e koppeld. De andere Bocaminozuren werden gekoppeld als t r i -chloorfenylesters, 3-lysine en 2-proline als Bpoc-Lys (Boc)-OTcp en B p o c - P r o - O T c p . Aminobeschermende groepen werden afge-splitst met zoutzuur en de nitrogroep met waterstoffluoride. Het p r e p a r a a t was biologisch actief. Een uitvoerige beschrijving van de synthese is aangekondigd.

Bayer en IVIutter publiceerden in 1974 uitvoerig over een synthese van substance P (74) volgens hun 'vloeibare-fase methode' (119-121). Boc-methionine werd met behulp van DCCI v e r e s t e r d met polyethyleenglycol. Van de aminozuren werden de Boc-verbindin-gen gebruikt, behalve van arginine en lysine, die als Z-Arg(Tos) en Boc-Lys(Z) werden gekoppeld. De derivaten v/erden gekoppeld als de symmetrische anhydriden, die in situ werden bereid met DCCI. De Boc-groepen werden afgesplitst met trifluorazijnzuur. Het undecapeptide werd van het polymeer afgesplitst door ammono-lyse en ontschermd door r e a c t i e met waterstoffluoride in aanwe-zigheid van anisool. Na zuivering door middel van d r a g e r v r i j e hoogspanningselectroforese werd het produkt g e k a r a k t e r i s e e r d met behulp van elementanalyses en aminozuuranalyse. Het had dezelf-de biologische activiteit als het natuurlijke m a t e r i a a l . Het is te b e t r e u r e n , dat in deze uitvoerige publikatie geen gegevens over dunnelaagchromatografie, electroforese en de optische rotatie zijn v e r m e l d . Er i s geen onderzoek v e r r i c h t naar de optische zuiver-heid van het eindprodukt.

Ook F i s h e r et al. (77) beschreven in 1974 een vaste-fase syn-t h e s e . Deze verschilde slechsyn-ts mesyn-t de door T r e g e a r esyn-t al. (75) vermelde synthese in de guanidine beschermende groep en in het afsplitsingsreagens voor de Bocgroep (resp. T o s g r o e p en t r i -fluorazijnzuur/methyleenchloride). Het produkt werd gezuiverd door gelfiltratie over Bio-Gel en door partitiechromatografie. Het werd g e k a r a k t e r i s e e r d door middel van aminozuuranalyse, een optische rotatie en dunnelaagchromatografie. In d r i e biologische bepalingen vertoonde het activiteit. Helaas is het peptidegehalte van het p r e p a r a a t niet vermeld en hebben de auteurs de optische rotatie gemeten in een oplosmiddel, dat verschilt met het door Yajima en Kitagawa gebruikte oplosmiddel.

Studer et al. hebben hun synthese van substance P niet in een publikatie beschreven (122).

De firma Beckman, Palo Alto, Calif. , brengt een synthetisch p r e p a r a a t in de handel. Dit i s gesynthetiseerd volgens methoden in oplossing (123).

Geen van de hierboven beschreven synthesen beantwoordt aan het volgende tweeledige doel:

1. toegang te verkrijgen tot grote hoeveelheden zuiver substance P , waardoor het onderzoelt naar de fysiologie en de farmacolo-gie van substance P wordt gestimuleerd;

2. de eigenschappen van substance P te leren kennen, zodat v e r g e -lijking van preparaten op andere dan alleen biologische gronden mogelijk wordt.

3. De vaste-fase synthese van de gehele

sequentie (1-11), uitgaande van

methioninesulfoxide

3.1 INLEIDING

3 . 1 . 1 Methioninesulfoxide

In paragraaf 1. 3 i s uiteengezet, dat het wenselijk i s tijdens een vaste-fase synthese methionine te beschermen tegen alkylering en oxidatie. N o r r i s et al. hebben laten zien, dat Boc-methioninesulf-oxide kan worden v e r e s t e r d met een gechloormethyleerd polymeer, zonder dat daarbij alkylering optreedt (34). Het leek een goede tactiek Boc-methioninesulfoxide met het Merrifield-polymeer te v e r e s t e r e n en de reductie van het sulfoxide niet direct na de v e r -estering (Norris et a l . ) te laten plaatsvinden, m a a r pas in het l a a t s t e stadium van de synthese, dus na afsplitsing van het poly-m e e r en de b e s c h e r poly-m e n d e groepen. Deze werkwijze bood de vol-gende aspecten:

1. het gebruik van het Merrifield-polymeer i s mogelijk;

2. tijdens de gehele synthese i s er geen kans op de vorming van nevenprodukten door oxidatie of alkylering, behoudens in een geval, dat h i e r n a genoemd wordt.

De afsplitsing van de Z - g r o e p van een peptide met methioninesulfoxide met behulp van waterstofbromide in ijsazijn veroorzaakt r e -ductie van het sulfoxide en daardoor de vorming van S-benzylhomo-cystelhe (93). Dit treedt niet op in geconcentreerd zoutzuur bij k a m e r t e m p e r a t u u r (93, 124) en in vioeibaar waterstoffluoride (124).

Het heeft geen zin om van L-methioninesulfoxide een van de dia-s t e r e o i dia-s o m e r e n in zuivere vorm te gebruiken, omdat er bij de vaste-fase synthese geen tussenprodukten worden gezuiverd. In een synthese in oplossing kan de aanwezigheid van een d i a s t e r e o -isomerenmcngsel hinderlijk zijn, met name bij zuiveringen door middel van k r i s t a l l i s a t i e . Chirale sulfoxiden r a c e m i s e r e n in aan-wezigheid van s t e r k e zuren (93, 124, 125).

Boc-methioninesulfoxide werd op de volgende manieren bereid: 1. door oxidatie van methionine tot het sulfoxide met

waterstof-peroxide, gevolgd door omzetting naar Boc-methioninesulfoxide volgens de methode van Schnabel (126);

2. door oxidatie van Boc-methionine met waterstofperoxide (127). Het i s van belang, dat de oxidatie plaats vindt m e t een geringe overmaat waterstofperoxide om de vorming van het sulfoxide

ledig te doen verlopen en toch de vorming van het sulfon zoveel mogelijk te vermijden (93).

3 . 1 . 2 De vaste-fase synthese

Boc-methioninesulfoxide werd v e r e s t e r d volgens de methode van Merrifield (7) met een gechloormethyleerd copolymeer van 98% styreen en 2% divinylbenzeen.

De Boc-groep werd gekozen als de N - b e s c h e r m e n d e g r o e p . Als afsplitsingsreagens voor de Boc-groep werd gekozen voor 1 N zoutzuur in ijsazijn in verband met de bepaling van het aantal ami-nogroepen in het polymeer t e r controle van de deprotectiestap. Het aantal aminogroepen werd bepaald door potentiometrische chlo-r i d e t i t chlo-r a t i e s in de filtchlo-raten van de neutchlo-ralisatiestap (10% tchlo-riethyl- triethyl-amine in dimethylformamide) en de daarop volgende wassingen met dimethylformamide. De deprotectie werd herhaald, als de gevonden waarde te laag was. In de deprotectiestappen na de koppelingen van Boc-glutamine werd 50% trifluorazijnzuur in methyleenchloride gebruikt om de vorming van pyroglutamylpeptiden te voorkomen (128, 129). Om de chloridebepalingen te kunnen uitvoeren werden trifluoracetaalionen uitgewisseld tegen chlorideionen met 0, 3 N pyridiniumchloride in methyleenchloride (68).

Lysine werd gelhtroduceerd als Boc-Lys(Tfa) en arginine als BocArg(Boc). De Tfagroep i s volledig stabiel in z o u t z u u r / i j s a -zijn en trifluora-zijnzuur/methyleenchloride.

Als koppelingsreagens werd DCCI gebruikt, soms in combinatie met 1-hydroxybenzotriazool. Voor de koppeling van Boc-glutamine werd de actieve-estermethode gekozen met 1, 2 , 4 - t r i a z o o l als bifunc-tionele katalysator (12). Het verloop van de koppelingen werd ge-controleerd door middel van de ninhydrinetest volgens K a i s e r et al. (69). Bij een positieve uitslag werd de koppelingsreactie herhaald.

Het peptide zou met ammoniak in methanol van het polymeer ge-splitst kunnen worden. Tijdens deze r e a c t i e ge-splitst de Ng-Tfa-groep grotendeels af. Na r e a c t i e met 1 M piperidine (130) en be-handeling met trifluorazijnzuur zou de reductie met thioglycolzuur

(93) ktmnen plaatsvinden.

3.2 RESULTATEN

3 . 2 . 1 De synthese van Boc-methioninesulfoxide

De oxidatie van methionine of Boc-methionine tot de overeenkom-stige sulfoxiden verliep kwantitatief met 20% overmaat waterstof-peroxide in azijnzuur. Sulfonvorming t r a d echter in geringe mate op, met name tijdens de opwerking. Dit kon worden v e r m e d e n door tijdens de opwerking e e r s t de overmaat waterstofperoxide door middel van v e r s bereid platinazwart te ontleden (127). Bij dit on-20

derzoek bleek platina op kool veel beter te voldoen.

De synthese van Boc-methioninesulfoxide uit methioninesulfoxide volgens Schnabel (126) was moeilijk. De opbrengst was laag, ondanks het gebruik van een g r o t e r e overmaat Bocazide dan g e b r u i kelijk. Waarschijnlijk is s t e r i s c h e hindering door de zijketen h i e r -van de oorzaak. De opwerking door extractie werd z e e r bemoeilijkt door de wateroplosbaarheid van Boc-methioninesulfoxide. Zowel met ethylacetaat/watermengsels (34) als met butanol/azijnzuur/ watermengsels (131) werden onbevredigende resultaten bereikt. Misschien had het gebruik van een kationenwisselaar tot b e t e r e r e -sultaten geleid.

Veel bevredigender dan de synthese via methioninesulfoxide v e r -liep de bereiding door oxidatie van Boc-methionine, dat e e r s t uit het dicyclohexylammoniumzout was vrijgemaakt.

De produkten vertoonden verschillen in optische r o t a t i e . Dat was het gevolg van verschillen in de verhoudingen van de d i a s t e r e o -i s o m e r e n -in de gel'soleerde produkten. Deze versch-illen werden ook met N M R - s p e c t r o m e t r i e waargenomen. Het signaal van de protonen in de methylsulfinylgroep was opgesplitst in een doublet.

Door vergelijking van de produkten met Boc-methioninesulfon met behulp van N M R - s p e c t r o m e t r i e en dunnelaagchromatografie werd vastgesteld, dat de produkten geen sulfon bevatten.

3 . 2 . 2 De vaste-fase synthese

Het aminozuurgehalte van het polymeer werd bepaald uit het zwavelgehalte en het sulfoxidegehalte (34) van het polymeer. De g e -vonden waarden waren r e s p . 0, 63 en 0, 60 m m o l / g .

Bij de afsplitsing van de Boc-groepen met zoutzuur in ijsazijn klonterde het polymeer vaak samen. De behandeling werd dan h e r -haald.

Na afloop van de zevende cyclus werd ongeveer de helft van het polymeer uit de r e a c t o r genomen. De deprotectiestap, die hierop volgde, werd herhaald om zeker te zijn van een voUedige afsplit-sing van de Boc-groepen.

In een aantal cyclussen werd na de deprotectie een te gering aan-tal aminogroepen gevonden. Herhaling van de deprotectiestap deed in geen geval dit aantal g r o t e r worden, hetgeen erop w e e s , dat er steeds een complete afsplitsing van de Bocgroepen had p l a a t s g e -vonden. De r e s u l t a t e n van de bepalingen van het aantal aminogroe-pen zijn verwerkt tot een grafiek (fig. 3.1).

Tabel 3.1 geeft een overzicht van de koppelingsstappen in de tien cyclussen van de synthese. De koppelingen van Boc-fenyl-alanine in de vierde cyclus en Boc-Gln-ONp in de vijfde cyclus bleken moeilijkheden op te lever en. Om toch tot een goede koppeling van glutamine te kunnen komen werd niet m e e r de p n i t r o -fenylester gebruikt, m a a r werd er gekoppeld met behulp van DCCI en 1-hydroxybenzotriazool.

l a b e l 3 1 0 \ e i z i c h t van de koppelingsstappen in de svnthese xin Boc-Arg(Boc)-Pio-L\',(TI i)-- P r o i)-- G l n i)-- G l n i)-- P h e i)-- P h e i)-- G h i)-- L e u i)-- M e t (O)i)--polymeei

Cyclus Anlinozuuiderivaat/ Aantll Oplosmiddel Tijd Ninhydrine- A int il koppelingsie igcns e q u m l c n t t n test" amino

gioepen (uien) ( ) 1 Boc-Leu DCCI Boc-Lcu/DCCI Boc-Leu/DCCI 2 Boc-Glj/DCCI Boc-Glv/DCCI J Boc-Phe/DCCI Boc-Phc/DCCI Boc-Phe/DCCI 4 Boc Phe/DCCI Boc-Phe/DCCI Boc-Phc/DCCI 5 Boc-Gln-ONp/triazool Boc-Gln-ONp/ti lazool Boc-Gln-ONp/tii i/ool Boc-Gln/DCCI/IIOBt Boc-Gln/DCCI/IIOBt 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2,5 2 5 2,5 2 2 CHjClj CHsClp ClbCU CllsCb CIIsCIs CIIsCU CHsCU CHsCls C H B C U CIIsCU CIIsCU DM1 DMT DMF CHsCU/(DMF) CHsCl2/(DMl 1 2 18 1 1 in 2 17 3 16 4 G4 21 2 ! 7 15 17 p z\\ p z p p / p 7 p 0 0 6 4 ' 0 047* 6 Boc Gln/DCCl/HOBt Boc-Gln/DCCI/IIOBt CIl2CIa/(D]\IF) 80 CUsCIs/CDMF) 21 7 Boc-Pro/DCCI Boc-Pro/DCCI Boc-Pio/DCCI 8 Boc-Lys(Tfa)/DCCI Boc-Lj s(Tla)/DCCI/IIOBt 9 Boc-Pro/DCCI Boc Pro/DCCl 10 Boc-Arg(Boc)/DCCI/I10Bt Boc-Arg (Boc )/DCCI /HOBt

2 2 2 2 2 2 2 2 2 CHsCU CHjCU CIIsClj CIlsClp/(DMF) CHsCl2/(DMF) CIIsCU CHsCls CHaCU/DMi CHpUj/DMF 2 15 2 J bl n 21 40 70 0 2 0 1 0 ^ 0,^

Ten opzichte \an dc aminocomponent bcickcnd uit de bel idint> \ in Boc Met(O) pol^mcci ni de ze\ende cyclus g e c o i i i g e e i d \ooi het polymeei dat uit de reactoi werd weggenomcn Het tussen haakjes \ e i m e l d e oplosmiddel wcid gebiuikt om het Boc-iminozuui op tc lessen z p zeei positief het pol>meei en de oplossing kleuiden diep \iolet p posilief het poly-meei kleuide \iolct /w p /w ik positici hot p o h m e e r kleuide binnen 2 minuten lichlbl luw n negiticf het p o h m e e : blccf 2 minuten kleuiloos

Nict te i n t t i p r c t c r e n dooi storende biumklcui ing mmol, ongecoiiigeerd \ooi de blancowaaidc

I '•'• 1 mol 1.2 0.4 gemeten na correctie voor weggenomen polymeer (zie lekst)

Mel(O) Leu Gly Phe Phe Gin Gin Pro Lys Pro Arg

• cyclus

F i g . 3.1 Aantal aminogroepen na deprotectie, volgens chloride-t i chloride-t r a chloride-t i e s

De koppelingsopbrengst werd vanaf de vijfde cyclus niet m e e r g e controleerd door middel van de ninhydrinetest, doordat het o p t r e -den van een donkerbruine kleur tij-dens het uitvoeren van de t e s t de juiste interpretatie ervan onmogelijk maakte. De kwantitatieve bepaling volgens Dorman (67) bleek wel te voldoen.

Na de vijfde cyclus werd een monster van het peptide-polymeer behandeld met triethylamine in methanol. De gevormde peptide-methylester bevatte volgens dunnelaagchromatografie een belang-rijke hoeveelheid verontreinigingen. De aminozuuranalyse van dit produkt na hydrolyse met behulp van zuur gaf lage waarden voor leucine en methionine (resp. 0, 73 en 0,46 ten opzichte van glycine).

De gewichtstoename van het polymeer na tien cyclussen (0, 25 g) w a s te laag. De berekende gewichtstoename bedroeg 0, 97 g na c o r r e c t i e voor het gewicht van het peptide-polymeer, dat na zeven cyclussen uit het reactievat was verwijderd. De aminozuursamen-stelling van beide peptide-polymeren i s v e r m e l d in tabel 3 . 2 . Het sulfoxidegehalte van het undecapeptide-polymeer werd jodome-t r i s c h bepaald (34). Hejodome-t bedroeg slechjodome-ts 0,015 m m o l / g (circa 5% van de berekende waarde).

De zeer slechte oplosbaarheid van Boc-Arg (Boc) in voor koppe-lingen in de vaste-fase synthese geschikte oplosmiddelen kan de oorzaak zijn van het z e e r lage argininegehalte. Getracht werd het derivaat op te lessen door een oplossing van het triethylammonium-zout in water aan te zuren en vervolgens te extraheren met methyl-eenchloride. Kennelijk i s deze werkwijze mislukt.

iVIet het polymeer, dat na de zevende cyclus uit de r e a c t o r was verwijderd werd getracht de sequentie te voltooien. In plaats van

Boc-Arg(Boc) werd nu Z-Arg(AdoCg) gebruikt. Dit d e r i v a a t lost aanmerkelijk b e t e r op in organische oplosmiddelen.

Tabel 3. 2 Aminozuursamenstelling van peptide-polymeren*

iVIet + L e u Gly P h e Glu P r o L y s A r g X , ^ X3 = Met(O) I 0 , 4 9 0 , 8 1 1 , 0 0 1 , 8 8 1 , 6 6 0 , 8 4 0 , 0 9 0 , 0 6 II 0 , 4 9 0 , 8 1 1,00 1 , 8 8 1 , 6 6 1,26 0 , 5 8 0 , 0 4 0 , 0 8 0 , 0 6 III 0 , 4 7 0 , 8 0 1 , 0 0 1 , 8 5 1 , 6 5 1 , 1 8 0 , 3 7 0 , 1 4 0 , 0 9 0 , 0 6 I: B o c - P r o - G l n - G l n - P h e - P h e - G l y - L e u - M e t (O)-polymeer. II: B o c A r g ( B o c ) P r o L y s ( T f a ) P r o G l n G l n P h e P h e G l y L e u --Met(0)-polymeer. Ill: Z A r g ( A d o c 2 ) P r o L y s ( T f a ) P r o G l n G l n P h e P h e G l y L e u --Met(0)-polymeer.

' Door aminozuuranalyse na hydrolyse in geconcentreerd zout-zuur/ijsazijn (1:1) met 0 , 1 vol. -% mercaptoethanol.

^ Onbekende verbinding, die in het chromatogram van de amino-zuuranalysator een piek geeft op de plaats van t y r o s i n e . " Idem, piek direct na arginine.

Tabel 3. 3 geeft het aantal aminogroepen, dat na elke deprotectie werd gevonden, en een overzicht van de koppelingsstappen.

De aminozuursamenstelling van het polymeer na voltooiing van de d r i e cyclussen i s eveneens gegeven in tabel 3. 2. Het jodome-t r i s c h bepaalde sulfoxidegehaljodome-te van hejodome-t pepjodome-tide-polymeer v.'as minder dan 0,006 m m o l / g .

Van een monster van dit polymeer werd het peptide door metha-nolyse afgesplitst. Uit de aminozuursamenstelling na b a s i s c h e hy-drolyse (132) bleek, dat 16% van het aanwezige methionine als methioninesulfoxide aanwezig was. Volgens dunnelaagchromato-grafie was het methanolyseprodukt een complex m e n g s e l .

Vanwege deze onbevredigende resultaten werd de synthese op dit pimt afgebroken. De kans op een succesvolle beBindiging leek te gering.

3.3 DISCUSSIE EN CONCLUSIE

Gedurende de gehele synthese is het aantal vrije aminogroepen aan-24

Tabel 3. 3 Overzicht van het aantal aminogroepen na deprotectie, en van de koppelingsstappen in de synthese van Z A r g ( A d o c 2 ) P r o L y s ( T f a ) P r o G l n G l n P h e P h e G l y L e u M e t ( 0 ) p o l y -m e e r C y c l u s 8 9 10 A m i n o z u u r d e r i v a a t / k o p p e l i n g s r e a g e n s B o c - L y s ( T f a ) / D C C I B o c - Ly s (Tf a) / D C C I / H O B t B o c - P r o / D C C I B o c - P r o / D C C I Z - A r g ( A d o c s ) / D C C I Z - A r g ( A d o c s ) / D C C I / H O B t A a n t a l e q u i v a l e n t e n ^ 2 2 2 2 2 2 O p l o s m i d d e l ^ C H 2 C l 2 / ( D M F ) C H 3 C l 2 / ( D M F ) C H s C l 2 C H s C l 2 CH2CI3 CH2C12 Tijd (uren) 14 4 16 2 16 A a n t a l a m i n o -g r o e p e n ' ' ( m m o l ) 0 , 3 4 0 , 2 9 0 , 2 2 * ^ Berekend op 0, 34 m m o l .

^ Het tussen haakjes v e r m e l d e oplosmiddel werd gebruikt om het Bocaminozuur op te l e s -sen.

" Na de deprotectie.

'' Na herhaling van de d e p r o t e c t i e .

zienlijk gedaald. Deze daling heeft een nogal grillig verloop (fig. 3.1). Een gedeelte (per cyclus 1 ft 2% van de belading) is het g e -volg van de afsplitsing van peptiden door acidolyse van de peptide-polymeerbinding. Het r e s t a n t moet het gevolg zijn van permanen-te blokkering als gevolg van n e v e n r e a c t i e s . Dit wordt onderspermanen-teund door de cijfers van de inbouw van aminozuren, die na de koppeling van glycine steeds minder werd (tabel 3.2).

De aminozuursamenstelling van d i v e r s e m o n s t e r s polymeer werd verkregen door aminozuuranalyse na hydrolyse in een

meng-sel van zoutzuur, azijnzuur en mercaptoethanol. Onder deze con-dities wordt methioninesulfoxide omgezet in methionine (133). Ongeveer 90% wordt in de analyse gedetecteerd. Onder alkalische condities is methioninesulfoxide stabiel en kan dan naast methio-nine bepaald worden (132). Uit de cijfers van de

aminozuuranaly-ses blijkt, dat vrijwel al het methioninesulfoxide ontleed is tijdens de vaste-fase synthese. De ontledingsprodukten waren behalve methionine ook een aantal andere produkten, die in de aminozuur-analyses werden Vv/aargenomen, m a a r niet gel'dentificeerd (tabel 3.2). De ontleding van methioninesulfoxide moet grotendeels hebben plaats gevonden tijdens de cyclussen in het begin van de synthese.

Blijkens de gebruikte controlemethoden verliepen de deprotectie en de koppeling goed in de e e r s t e cyclus. Het is daarom m e r k -waardig, dat de inbouw van leucine volgens de aminozuur analyses zo laag i s (tabel 3. 2).

Over de lage inbouw van Boc-Arg(Boc) is in paragraaf 3. 2. 2 r e e d s geschreven. Na de herhaling van de laatste drie cyclussen bleek de inbouw van Z-Arg(Adoc2) hoger te zijn, m a a r die van lysine en proline waren geringer (tabel 3. 2). In deze drie

cyclus-sen lieten de chloridetitraties een snelle daling van het aantal aminogroepen zien.

Uit de resultaten moet worden geconcludeerd, dat deze vaste-fase synthese is mislukt. De bescherming van methionine als sulfoxide bleek ongeschikt te zijn voor de vaste-fase synthese, uitgaande van BocMet(0)polymeer. Het is in dit stadium niet vast te s t e l -len, of het mislukken van de synthese alleen het gevolg is van de problemen rond methioninesulfoxide. JVIogelijk speelt de sequentie zelf hierin ook een r o l .

3.4 EXPERIMENTEEL GEDEELTE Algemene gegevens

De smeltpunten werden gemeten met AnschUtz-thermometers. Ze zijn niet g e c o r r i g e e r d . De m o n s t e r s werden in een open g l a s c a -pillair verwarmd in een koperen blok.

De optische r o t a t i e s werden gemeten met een fotoBlectrische 26

p o l a r i m e t e r , P e r k i n - E l m e r P - 1 4 1 .

De NMRspectra werden verkregen met een Varian T 60 s p e c -t r o m e -t e r . De chemische verschuivingen zijn geme-ten -ten opzich-te van tetramethylsilaan als interne standaard.

De koolstof-, waterstof-, stikstof- en zwavelanalyses werden uitgcvoerd door de her en H . M . A. Buurmans, M.A. Hoefnagel en M. van Leeuwen van dit laboratorium*. De zuurstofanalyses w e r -den uitgcvoerd door de b e e r W . J . Buis, Organisch Chemisch In-stituut TNO te Utrecht. Alle m o n s t e r s werden e e r s t in vacuum bij 40° gedroogd tot constant gewicht.

De aminozuuranalyses werden uitgcvoerd door de beer A. van E s t r i k met een automatische aminozuuranalysator van Locarte (tafelmodel). Peptiden werden gehydrolyseerd in 6 N zoutzuur in geBvacueerde buizen bij 110° gedurende 24 uur. Peptide-polyme-ren werden gehydrolyseerd in geSvacueerde buizen in 12 N zout-zuur/ijsazijn (1:1) bij 110° gedurende 24 uur of in 12 N zoutzuur/ propionzuur (1:1) bij 130° gedurende 2 uur. Methionine- of methioninesulfoxidehoudende peptiden of peptidepolymeren w e r -den gehydrolyseerd in aanwezigheid van 0,1 vol. -% mercaptoethanol. Bij bepaling van het peptidegehalte werd norleucine als i n t e r -ne standaard gebruikt.

Dunnelaagchromatografie werd in het algemeen uitgcvoerd op silicagel (Merck F 254). Daar, waar het is aangegeven, werd cellulose (Schleicher & SchUll) gebruikt. De volgende loopmidde-len werden gebruikt:

A chloroform/methanol 4; 1 B chloroform/methanol 8: 1 C chloroform/methanol/azijnzuur 85; 10: 5 D butanol/azijnzuur/water 4: 1: 1 E butanol/ethanol/water 2: 2: 1 F isopropylalcohol/ethylacetaat/water 4: 3: 3 G isopropylalcohol/tolueen/water 4: 3: 1 H ethylacetaat/pyridine/water 20:20:11 J diisopropylether/chloroform/azijnzuur 6: 3: 1 K amylalcohol/pyridine/water 5: 3: 1 L butanol/pyridine/azijnzuur/water 30:20: 6:24 M isoamylalcohol/pyridine/water 35:35:30 N chloroform/methanol/ammoniak (17%) 2: 2: 1 P ethylacetaat/aceton/water 72:24: 4 Q ethylacetaat/pyridine/azijnzuur/water 5: 1: 1: 1 R butanol/pyridine/azijnzuur/water 16: 3: 1: 4 De vlekken werden op d i v e r s e manieren zichtbaar gemaakt: 1. belichten met ultraviolet licht (254 nm en 350 nm);

2. bespuiten met 0,015% fluorescamine in aceton en belichten met

* Laboratorium voor Organische Chemie, Technische Hogeschool Delft.

ultraviolet licht (350 nm) (134);

3. bespuiten met een ninhydrineoplossing (Merck) gevolgd door 5 min verhitten bij 100°;

4. chloreren in een chlooratmosfeer en bespuiten met het r e a g e n s volgens Reindel en Hoppe (135).

Gelfiltraties werden uitgcvoerd met kolommen van 2, 5 x 90 cm. Bij kolomchromatografie werd de absorptie van het eluaat g e m e ten bij 280 nm of 254 nm met behulp van een LKBUvicord II d e -t e c -t o r . Sephadex LH-20, Sephadex G-25 Superfine en CM-Sepha-dex C-25 waren afkomstig van de firma P h a r m a c i a Fine Chemi-c a l s ; de ionenwisselaars AG 1-X2, AG 2-X8 en Cellex CM van de firma Bio-Rad.

De peptide-synthesemachine werd in dit laboratorium ontwikkeld (13, 136). Met deze machine worden in iedere stap de volgende bewerkingen uitgcvoerd; toevoegen van een reagens of wasvloei-stof, agiteren en filtreren. De koppelingsstappen geschiedden m e t handbediening. Aan de suspensie van het polymeer in CH2Cls e n / of DMF werd een oplossing van het aminozuurderivaat en eventu-eel 1-hydroxybenzotriazool (1,5 eq ten opzichte van het amino-zuurderivaat) in weinig CH2CI2 of DMF toegevoegd. Een oplossing van DCCI (1,1 eq ten opzichte van het aminozuurderivaat) in CHsCls of DMF werd 10 min later toegevoegd. Bij een actieveesterkoppeling werd een oplossing van de actieve e s t e r en 1, 2 , 4 -triazool (1,0 eq ten opzichte van de actieve ester) in DMF aan het polymeer toegevoegd. Na het v e r s t r i j k e n van de koppelings-tijd werd gefiltreerd.

Bij de aanvang van een vaste-fase synthese werd het polymeer in CHsCls gesuspendeerd gedurende 30 tot 60 min om het te laten zwellen. Na afloop van de synthese werd het polymeer gewassen met azijnzuur, ethanol, DMF en CHsCls.

Aminozuren, aminozuurderivaten en reagentia werden v o o r n a m e -lijk betroliken van de f i r m a ' s Fluka AG, Ajinomoto Co. en P r o t e i n R e s e a r c h Foundation en na controle van de fysische constanten gebruikt; Boc-Gln-ONp werd omgekristalliseerd uit ethanol.

Z-Arg(Adocs) en Boc-Lys(Tfa) werden bereid door de heren G. Bijl en A. van E s t r i k . De fysische constanten van deze en an-d e r e literatuurpreparaten zijn gegeven in tabel 3.4.

Oplosmiddelen werden gebruikt in een pro-analyse-kwaliteit of voor het gebruik gezuiverd. Methyleenchloride en dioxaan werden gezuiverd door filtratie over basisch aluminiumoxide. Trifluor-azijnzuur werd gede still eerd.

Polystyreen, gecopolymeriseerd met 2% divinylbenzeen, werd gechloormethyleerd door de heer A. van der W i d e volgens de m e -thode van Merrifield (8). Het chloorgehalte bedroeg 1, 9 m m o l / g . 28

Tabel 3.4 Literatuurpreparaten

Verbinding Smeltpunt (°C) [ a ] * Literatuur Boc-Arg(Boc) 178-180 - 3 181-182 - 5 , 6 Schnabel (126) Z-Arg(Adoc2) 113-115 (ontl.) 18 120-122 (ontl.) 20.8 J a g e r en Geiger (137) Boc-Lys(Tfa) 102-103 - 6 103 Anfinsen et al. (130) Met(02) 242 31 30,3_Kl Iselin (93)

*De optische rotaties (in °) werden gemeten bij nagenoeg dezelfde condities als is aangegeven in de l i t e r a t u u r .

* [oJo^ (c 1,6 in 95% azijnzuur). Met(O) volgens Iselin (93)

Een suspensie van 3, 75 g Met (25 mmol) in 75 ml azijnzuur werd bij c i r c a 15° g e r o e r d . Nadat 3,3 ml 30% HgOs-oplossing (circa 30 mmol) was toegevoegd loste alles langzaam op. Na 1 uur r e a c t i e tijd werd het mengsel ingedampt onder verminderde druk. Het r e -sidu werd in twee fracties g e k r i s t a l l i s e e r d uit aceton/water. Op-brengst: 3,66 g (95%). Homogeen, R j ; D 0,09; E 0,16, H 0,16; N 0 , 6 3 .

De twee door k r i s t a l l i s a t i e verkregen fracties hadden v e r s c h i l -lende optische rotaties: [Q']p^-6° (c 1,1 in azijnzuur) en [o-l^^ 56°

(c 0,9 in azijnzuur) (lit. 93: Met-dl-(O): [a]^'' 1 1 , 0 J H 2° (c 1,1 in azijnzuur), Met-d-(O): [Q-IQ* 1 0 2 , 7 + 2 ° (c 0, 6 in azijnzuur)). Boc-Met(O)

1. Uit Met(O) volgens de methode van Schnabel (126)

Aan een oplossing van 5, 50 g Met(O) (21 mmol) in 45 ml water w e r -den 35 ml dioxaan en 5, 8 g Boc-azide (41 mmol) toegevoegd. De pH van de oplossing werd ingesteld op 11 en constant gehouden met 4 N NaOH en een pH-staat. Na 20 uur werd nog 2, 9 g Boc-azide (20 mmol) toegevoegd. Na nog 6 uur reactietijd werd het mengsel achtereenvolgens drie maal geBxtraheerd met ethylacetaat, aan-gezuurd met citroenzuur, en zes maal geextraheerd met ethyl-acetaat. De waterlaag werd ingedampt tot klein volume en nog

eens d r i e maal geBxtrabeerd met ethylacetaat. De gecombineerde z u r e extracten werden gewassen met kleine porties water, vervol-gens gedroogd op magnesiumsulfaat en ingedampt tot klein volume. Het residu werd g e k r i s t a l l i s e e r d uit ethylacetaat/petroleumether 60-80. Opbrengst: 1,03 g (12%).

Smeltpunt: 126-128°. Homogeen, R,: C 0 , 2 1 . [al^^ +28° (c 1,8 in DMF) (lit. 131: Boc-Met-dl-(O): [0-]^^ - 9 , 8 ° (c 2,00 in DMF), Boc-Met-d-(O): [o-lp^ +41,6° (c 2,01 in DMF)). In het NMR-spec-trum gaven de methylsulfinylprotonen bij 6 2,7 ppm een piek met een schouder (oplosmiddel: CDCI3).

Bij een herhaling van de synthese werd in de opwerking het mengsel, na aanzuren met azijnzuur, geSxtraheerd met butanol, die was verzadigd met 2% azijnzuur. Het extract werd gewassen met 2% azijnzuur verzadigd met butanol. Omdat k r i s t a l l i s a t i e niet lukte, werd dicyclohexylamine toegevoegd aan een oplossing van het produkt in ethylacetaat. Het verkregen n e e r s l a g werd afgefil-t r e e r d en omgekrisafgefil-talliseerd uiafgefil-t aceafgefil-ton. Opbrengsafgefil-t 29%.

2. Door oxidatie van Boc-Met

Boc-Met werd vrijgemaakt uit 8, 6 g van het DCHA-zout (20 mmol) door een oplossing van het zout in water aan te zuren met

1 M KHSO4 en te extraheren met ethylacetaat. Het extract werd neutraal gewassen met water, vervolgens gedroogd over magne-siumsulfaat en ingedampt tot een olie.

Het residu werd opgelost in ongeveer 20 ml azijnzuur. Aan deze oplossing werd 2,7 ml 307c HsOsoplossing (ca. 24 mmol) t o e -gevoegd. Na 30 min reactietijd werd 0,2 g 5% P t / C toe-gevoegd. Het mengsel werd 1 uur l a t e r ingedampt, gesuspendeerd in ethylacetaat en afgefiltreerd. Het filtraat werd ingedampt. Het residu werd g e k r i s t a l l i s e e r d uit ethylacetaat/petroleumether 60-80. Opbrengst: 3, 8 g (72%). Smeltpunt: 119-122°. Homogeen, R,: C 0 , 2 1 ; D 0 , 5 3 ; E 0,60; H 0,66. [a]^° - 8 ° (c 1,9 in

DMF). In het NMR-spectrum was er bij 6 2, 7 ppm een doublet (oplosmiddel: CDCI3).

Boc-Met(02).DCHA

Dit derivaat werd bereid volgens de methode van Schnabel (126). Het produkt werd gel'soleerd als het DCHA-zout. Opbrengst; 18%. Smeltpunt 194-196°, met ontleding. Het NMR-spectrum (oplos-middel: CDCI3) toonde voor de methylsulfonylprotonen een signaal bij 6 2,9 ppm. [o-lo* 25° (c 0,94 in ethanol). Homogeen, R^:

C 0,30 en 0,57 (DCHA); D 0,64 en 0,70 (DCHA); E 0,70; H 0,87. Gevonden: C 56, 9 ; H 9,1 ; N 6, 2 ; S 7, 2%.

Berekend voor C22H42N20sS (462,6);

C 57,12; H 9,15; N 6,06; S 6,93%. 30

Boc-Met (O)-polymeer

Aan de suspensie van 6,2 g gechloormethyleerd polystyreen, g e -copolymeriseerd met 2% divinylbenzeen, (12 mmol chloormethyl-groepen) in 25 ml absolute ethanol werd 3, 2 g Boc-Met(O) (12 mmol) en 1, 5 ml triethylamine (11 mmol) toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 22 uur g e r o e r d en onder terugvloeiing g e -kookt. Vervolgens werd het polymeer afgefiltreerd, gewassen met steeds d r i e p o r t i e s ethanol, azijnzuur, ethanol, DMF en CHsCls en dan gedroogd. Opbrengst: 7,4 g. Zwavelgehalte: 1,98, 2,02%; hieruit volgt de belading; 0, 63 _f 0, 03 mmol Boc-Met(0)/g poly-m e e r .

De jodometrische bepaling van het sulfoxidegehalte werd uitgc-voerd volgens de door N o r r i s et al. (34) gemodificeerde methode van Allenmark (138). Aan een suspensie van ongeveer 100 mg polymeer in DMF werden 0, 3 g NaJ en 0,05 ml acetylchloride t o e -gevoegd. Na 5 min rustig r o e r e n werden enige druppels 1 N zoutzuur toegevoegd. Het jodium werd potentiometrisch g e t i t r e e r d met gesteld 0,02 N NasSgOs. In een triplobepaling werd g e

-vonden; 0,60, 0 , 6 2 , 0,59 m m o l / g .

B o c A r g ( B o c ) P r o L y s ( T f a ) P r o G l n G l n P h e P h e G l y L e u --Met(O)-polymeer

De synthese werd uitgcvoerd met behulp van de peptide-synthese-machine, uitgaande van 1,97 g Boc-Met(0)-polymeer (1,2 mmol). Het p r o g r a m m a is weergegeven in tabel 3. 5. Bij herhaling van de deprotectie werden de stappen 1 tot en met 18 herhaald.

Tabel 3. 5 P r o g r a m m a voor de verlenging van de peptideketens met een aminozuur

S t a p " 1 2 3 , 4 , 5 6, 7, 8 1 4 , 1 5 , 17 1 8 , 1 9 , 2 1 , 2 2 , 24 2 5 - 3 0 3 1 , 32 16 20 23 R e a g e n s of w a s v l o e i s t o f ( v o l u m e ; c a . 40 m l ) 1 N H C l / H O A c 1 N H C l / H O A c HOAc EtOH D M F 10% E t g N / D M F D M F CH2CI2 K o p p e l i n g A f w i s s e l e n d EtOH en CH2CI2 C H s C l s Tijd (min) 5 25 3 3 3 5 3 3 3 3

' I n het filtraat van de stappen 16 tot en met 20 werd het chloride bepaald.

Tabel 3. 6 P r o g r a m m a voor de deprotectie en de behandeling met pyridiniumchloride in de cyclussen 6 en 7

Stap Reagens of wasvloeistof Tijd (volume; ca, 40 ml) (min)

1 2 3, 4, 5 6 7, 8, 9 10 11, 12, 13 50% TFA/CHsCls 50% TFA/CHsCls CHgCls 10% EtsN/CHsClj CHsCla 0 , 3 N P y r . H C l / C H s C l s CH2CI2 5 2 5 3 5 3 1 5 3

Klonterde het polymeer samen in 1 N HCl/HOAc, dan w e r d stap 2 herhaald. In de zesde en de zevende cyclus werden de stappen 1 tot en met 8 vervangen door de stappen vermeld in tabel 3. 6. Bij herhaling van de koppeling werden de stappen 24 tot en met 32 herhaald. Tabel 3.1 geeft een overzicht van de koppelingscondities In een aantal cyclussen werd het restant aminogroepen na een kop-peling bepaald volgens de methode van Dorman (67). Hiertoe werd het p r o g r a m m a uitgebreid met de stappen, die v e r m e l d zijn in tabel 3. 7.

Tabel 3. 7 P r o g r a m m a voor het bepalen van het aantal aminogroe-pen volgens Dorman (67)

Stap' 33 34, 35, 37-42 4 3 44, 45, 47, 48, 36 4 6 49 Reagens of wasvloeistof (volume; ca. 40 ml) 0 , 3 N P y r . H C l / C H s C l s CH2CI2 DMF 10% EtgN/DMF DMF CHsCls Tijd (min) 15 3 3 5 3 3

*In het filtraat van de stappen 41 tot en met 46 werd het chloride bepaald.