Przygotowanie próbek Skórki cytrusów
Do badania należy przygotować fragment skórki o powierzchni 3 – 6 cm².
Za pomocą noża oddzielić albedo od flawedo.
Flawedo pokroić w paski o szerokości < 2 mm a następnie paski pokroić w drobną kostkę.
Nasiona i suchy materiał roślinny
Około 1 g próbki rozetrzeć w moździerzu.
Ekstrakcja
Próbkę przenieść do strzykawki, w strzykawce umieścić tłok i ścisnąć próbkę tak, aby wycisnąć z niej sok.
Na szalkę Petriego lub do małej zlewki wlać 2 –3 cm³ octanu etylu.
Pobrać rozpuszczalnik z szalki do strzykawki.
Ekstrakcję prowadzić wytrząsając zawartość strzykawki z rozpuszczalnikiem przez ok. 1 minutę lub przez kilkukrotne przetłaczanie rozpuszczalnika / ekstraktu między szalką a strzykawką.
Ekstrakt przenieść na szalkę Petriego i pobrać za pomocą drugiej strzykawki przez filtr strzykawkowy.
Usunąć filtr ze strzykawki.
Jeżeli w ekstrakcie znajduje się woda widoczna w postaci kropel (nastąpiła separacja faz), to należy ją usunąć (odwrócić strzykawkę tłokiem w górę, postukać, tak aby krople wody opadły na dół i
wycisnąć).
Przefiltrowany ekstrakt przenieść do fiolki i w razie konieczności uzupełnić rozpuszczalnikiem (octanem etylu).
Filtr strzykawkowy oczyścić z cząstek stałych przepuszczając przez niego pozostały w strzykawce ekstrakt. W trakcie płukania filtra w przeciwnym kierunku należy naciskać na tłok strzykawki przyciskając jednocześnie filtr do stożka strzykawki.
Strzykawkę po odfiltrowanym ekstrakcie i filtr wypłukać czystym rozpuszczalnikiem.
Analiza
Fiolki z próbkami umieszcza się w automatycznym dozowniku.
Na kolumnę chromatograficzną dozuje się1 µl próbki.
Widma analitu rejestruje się w zakresie 35 – 550 m/z.
Na podstawie chromatogramu substancji wzorcowej – wosku polietylenowego – określa się czasy retencji normalnych alkanów. Wzorzec stanowi mieszanina węglowodorów o znaczącym udziale
normalnych alkanów i α-olefin. Ponadto we wzorcu występują węglowodory o rozgałęzionych łańcuchach. Za pomocą MS należy zidentyfikować piki pochodzące od n-alkanów. Do wzorca został wprowadzony dodatkowo n-nonan (największy pik) w celu ułatwienia identyfikacji.
Z chromatogramów badanych próbek należy wybrać ok. 10 najistotniejszych pików. Czasy retencji zamieścić w tabeli i zapisać widma do pliku.
Dla wszystkich wybranych pików wyznaczyć wartość indeksu retencji Kovátsa ze wzoru:
𝑅𝐼 = 100 × 𝑛 +𝑡𝑟 𝑥 − 𝑡𝑟 𝑛 𝑡𝑟 𝑁 − 𝑡𝑟 𝑛 gdzie:
RI – indeks retencji Kovátsa, tr – czas retencji [min],
n – liczba atomów węgla w węglowodorze o czasie retencji mniejszym od czasu retencji analitu, N – liczba atomów węgla w węglowodorze o czasie retencji większym od czasu retencji analitu, tr(x) – czas retencji analitu,
tr(n), tr(N) – czasy retencji odpowiednich węglowodorów.
Na podstawie zarejestrowanych widm dokonuje się półautomatycznej identyfikacji związków korzystając z dostępnych baz, wspomagając się indeksami retencji (jeśli są dostępne).
Na podstawie całkowitego prądu jonowego (TIC) określa się przybliżoną względną zawartość poszczególnych związków.
Sprawozdanie
Sprawozdanie powinno zawierać:
Krótki(!) wstęp – co było celem i co wykonano (opis sposobu sporządzenia próbek, nie całą procedurę jak wyżej).
Warunki analizy (aparat, kolumna chromatograficzna, program temperaturowy, temperatura dozownika, energia jonizacji).
Tabelę z czasami retencji n-alkanów i odpowiedni chromatogram.
Chromatogramy poszczególnych próbek.
Uzyskane wyniki w postaci tabeli zawierającej zidentyfikowane związki, ich czas retencji i obliczone indeksy retencji Kovátsa oraz porównanie ich z wartościami tablicowymi. Ewentualnie dodatkowe informacje (np. klasyfikację, charakterystyczne jony, ilość).
Podsumowanie i wnioski.
Poniżej przykład danych, które należy zamieścić w sprawozdaniu.
Wzorzec:
Rysunek 1: Chromatogram mieszaniny wzorcowej Tabela 1: Czas retencji n-alkanów w mieszaninie wzorcowej
n tr [min]
7 4,56 8 6,77 9 8,11 10 9,55 (…) (…)
Próbka 1 – Wyciąg ze skrzydła ropuchy:
Rysunek 2: Wyciąg ze skrzydła ropuchy - chromatogram TIC i SIM (jony 136 + 204)
Związek tr [min] RI RI z baz danych Uwagi
Flogiston 12,120 1190 1187 [tak było napisane na jakimś dziwnym garnku]
1188 [lit., kolumna DB-5]
1191 [inna baza, kolumna RX-1]
Cytronelal 13,821 1233 1238 [lit.] Nadaje wywarowi
przyjemny cytrynowy aromat
(…) (…) (…) (…) (…)
Próbka 2 – Niebieskie migdały:
Rysunek 3: Niebieskie migdały - chromatogram TIC i SIM (jony 136 + 204)
Związek tr [min] RI RI z baz danych Uwagi
n-nonanon 11,344 1111 1111 [lit.]
1123 [inna baza, kolumna DB-Wax]
Kwas moronowy 26,368 1445 1451 [lit.]
(…) (…) (…) (…) (…)
Próbka 3 – Aromat parówkowy:
Rysunek 4: Aromat parówkowy - chromatogram TIC i SIM (jony 136 + 204)
Związek tr [min] RI RI z baz danych Uwagi
Pirydyna 8,307 968 969 [informacja producenta,
propozycja podania]
Ułatwia dyspergowanie aromatu, zabija karaluchy
Związek X 14,510 1210 brak danych Budowa chemiczna objęta tajemnicą producenta, związek
prawdopodobnie zakazany przez konwencję genewską z 12 sierpnia 1949, Protokół Dodatkowy I Octan geranylu 14,944 1225 1227 [lit.] Wydobywa z parówki subtelne nuty
różanego papieru toaletowego
(…) (…) (…) (…) (…)
Widma wybranych związków:
Rysunek 5: Widmo masowe – Pirydyna, RI: 968, występuje w: aromacie parówkowym, (…)
Rysunek 6: D-limonen, RI: 1010, występuje w: pomarańczy, mandarynce
Do tego jeszcze kilka widm. Część związków będzie się powtarzać w poszczególnych próbkach, więc widmo wystarczy zamieścić tylko raz. Dobrze byłoby, gdyby znalazły się tu widma związków
charakterystycznych dla danej próbki (z taką informacją), np. piperyna w pieprzu, bergapten w niektórych cytrusach, kumaryny, aldehydy itp.
