Porównanie efektywności różnych metod izolacji genomowego DNA ze śladów biologicznych

(1)

Wstęp i cel

Rozwój nauk kryminalistycznych spowodowa³ zwrócenie wiêkszej uwagi na pozostawione na miej-scu zdarzenia œlady biologiczne, które mo¿na poddaæ badaniom genetycznym. W ci¹gu ostatnich lat analiza DNA wyizolowanego z biologicznego materia³u dowo-dowego sta³a siê jednym z najsilniejszych narzêdzi kryminalistyki. Obecnie badania genomowego DNA s¹ metod¹ identyfikacji cz³owieka charakteryzuj¹c¹ siê najwy¿sz¹ si³¹ dyskryminacji. Ma ona zastosowanie zarówno w identyfikacji osobniczej, jak i w ustalaniu pokrewieñstwa. Materia³em do badañ genetycznych mog¹ byæ: krew, nasienie, œlina, mocz, a tak¿e w³osy, koœci, paznokcie, zêby i fragmenty tkanek miêkkich [5]. W praktyce równie czêsto mamy do czynienia zarówno z próbkami dobrej jakoœci, jak i z materia³em bardzo zdegradowanym i starym. Zdarza siê równie¿, ¿e œlady biologiczne pozostawione na miejscu zdarze-nia zawieraj¹ niewielk¹ iloœæ materia³u genetycznego. Uzyskanie pe³nego profilu genetycznego z zabezpie-czonych œladów mo¿e stanowiæ dla eksperta krymina-listyki du¿e wyzwanie. Jednym z kluczowych etapów badania DNA jest jego odzyskanie z pod³o¿a, na któ-rym zosta³o ujawnione, a nastêpnie oczyszczenie z substancji hamuj¹cych reakcjê amplifikacji (inhibito-ry reakcji PCR). Mo¿liwoœæ oznaczenia profilu gene-tycznego z zabezpieczonych œladów biologicznych jest uzale¿niona od jakoœci i iloœci DNA, które uzysku-je siê w procesie ekstrakcji. Zastosowanie odpowied-niej metody izolacji materia³u genetycznego ma za-sadniczy wp³yw na koñcowe wyniki badañ [3, 4, 8]. W praktyce laboratoryjnej korzysta siê z wielu metod izolacji kwasów nukleinowych. W Wydziale Biologii Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego Ko-mendy G³ównej Policji do ekstrakcji DNA z zabezpie-czonych œladów stosuje siê obecnie metodê organicz-n¹ w uk³adzie fenol : chloroform : alkohol izoamylowy. Technologia badañ genetycznych w kryminalistyce stale siê rozwija, wiêc pojawiaj¹ siê na rynku gotowe zestawy przeznaczone do izolacji DNA z ró¿nego ro-dzaju próbek, w tym ze œladów zawieraj¹cych znikom¹ iloœæ materia³u genetycznego. Nowo wprowadzane

metody charakteryzuj¹ siê coraz mniejsz¹ toksyczno-œci¹ stosowanych odczynników, dziêki czemu s¹ bar-dziej bezpieczne dla u¿ytkowników.

W Wydziale Biologii CLK KGP przeprowadzono te-sty skutecznoœci czterech nowych zestawów przezna-czonych do izolacji DNA ze œladów biologicznych. Do badañ wytypowano zestawy rekomendowane przez producentów i innych u¿ytkowników – dwa wykorzystu-j¹ce technologiê separacji magnetycznej oraz dwa ko-lumienkowe, wykorzystuj¹ce technologiê separacji na membranie silikonowej. Uzyskane wyniki porówna-no z wynikami otrzymanymi dla próbek wyizolowanych metod¹ organiczn¹ w uk³adzie fenol : chloroform : alko-hol izoamylowy. Testy pozwoli³y oceniæ ich w³aœciwoœci i przydatnoœæ do badañ prowadzonych w policyjnych laboratoriach kryminalistycznych. Dodatkowym efek-tem testów jest mo¿liwoœæ doboru optymalnych metod badañ materia³u genetycznego zapewniaj¹cych naj-wy¿sz¹ skutecznoœæ przy minimalizacji ponoszonych kosztów.

Testowana w doœwiadczeniu technologia separacji magnetycznej opiera siê na powinowactwie cz¹ste-czek DNA do specjalnie zaprojektowanego ligandu zwi¹zanego z kulk¹ paramagnetyczn¹. Ligandem mo-¿e byæ cz¹steczka pochodzenia naturalnego lub syn-tetycznego, wykazuj¹ca powinowactwo do izolowanej biomoleku³y. W praktyce najczêœciej stosowane s¹ monodyspersyjne kulki paramagnetyczne o jednako-wej œrednicy otoczone cienkimi warstwami polimeru. Polimer stanowi specyficzn¹ powierzchniê do przy³¹-czenia bioreaktywnego ligandu, w tym przypadku skierowanego wobec kwasów nukleinowych. Proce-dura izolacji rozpoczyna siê od lizy komórek. Nastêp-nie do roztworu dodaje siê zawiesinê zawieraj¹c¹ kul-ki paramagnetyczne. Ligandy znajduj¹ce siê na po-wierzchni kulek wi¹¿¹ cz¹steczki DNA. Kulki parama-gnetyczne ze zwi¹zanym materia³em osadzaj¹ siê na œcianie probówki od strony magnesu. Supernatant usuwa siê za pomoc¹ pipety. DNA przytwierdzone do kulek przemywa siê kilkakrotnie, a nastêpnie odzy-skuje w postaci eluatu [1, 2, 6]. Schemat procedury przedstawiono na rycinie 1.

Magdalena Dębska, Jacek Drabik

Porównanie efektywności

różnych metod izolacji genomowego

DNA ze śladów biologicznych

(2)

Metoda kolumienkowa bazuje na specjalnie zbudo-wanej membranie silikonowej, z któr¹ ³¹czy siê DNA. Procedura izolacji obejmuje cztery etapy: lizê komórek, zwi¹zanie DNA ze z³o¿em krzemionkowym, przemywa-nie oraz elucjê DNA z membrany (ryc. 2). Próbki pod-dawane s¹ lizie w obecnoœci proteinazy K i odpowied-niego buforu lizuj¹cego. Adsorpcjê DNA do matrycy

si-likonowej umo¿liwia obecnoœæ soli chaotropowej o wy-sokim stê¿eniu. Nastêpnie za pomoc¹ roztworów p³u-cz¹cych DNA przemywane jest z inhibitorów reakcji PCR, bia³ek i innych zanieczyszczeñ. Uwolnienie DNA z silikonowej membrany nastêpuje dziêki dzia³aniu bu-foru o niskiej zawartoœci soli, który powoduje zmianê warunków wi¹zania [7, 9].

Celem przeprowadzonych badañ by³o porównanie efektywnoœci ró¿nych metod izolacji kwasów nukleino-wych.

Zestawy przeznaczone do izolacji DNA zosta³y po-równane pod wzglêdem nastêpuj¹cych kryteriów:

• Wydajnoœæ metody (porównanie uzyskanych stê-¿eñ DNA).

• Jakoœæ uzyskanego DNA (porównanie uzyskanych profili genetycznych).

• Stopieñ trudnoœci wykonania procesu izolacji. • Czas potrzebny do przeprowadzenia procedury

izolacji.

• Czynniki ryzyka wyst¹pienia kontaminacji.

• Zu¿ycie materia³ów i dodatkowych odczynników niezbêdnych do przeprowadzenia procedury. • Koszt zestawu.

Materiał i metody

Schemat doświadczenia

Badania wykonywano w okresie od wrzeœnia 2008 do marca 2009 roku na 280 próbkach krwi pobranych od oœmiu osób i umieszczonych w probówkach z hepa-ryn¹ jako œrodkiem antykoagulacyjnym. Materia³ do ba-dañ stanowi³a krew naniesiona na odpowiednie pod³o-¿e (ja³owe p³ótno, materia³ jeansowy) o wymiarach oko³o 5 x 5 mm. Do sprawdzenia zale¿noœci iloœci uzy-skanego DNA od iloœci materia³u wyjœciowego na ja³o-we p³ótno nanoszono kolejno 1 μl, 2,5 μl oraz 5 μl krwi. W celu zbadania efektywnoœci usuwania inhibitora re-akcji PCR z ekstraktu, na materia³ jeansowy zawieraj¹-cy barwnik indygo nanoszono 1 μl krwi. Dodatkowo izo-lowano materia³ zdegradowany stanowi¹cy 1 μl krwi

Ryc. 1. Procedura izolacji DNA metod¹ separacji magnetycznej

Fig. 1. Procedure of DNA isolation using separation based on magnetic beads Ÿród³o (ryc. 1–11): autorzy

Ryc. 2. Procedura izolacji DNA metod¹ separacji na membranie silikonowej Fig. 2. Procedure of DNA isolation using separation based on silica membrane

(3)

na ja³owym p³ótnie poddany dzia³aniu temperatury 150oC przez 30 minut. Temperaturê i czas degradacji ustalono wczeœniej doœwiadczalnie. Wszystkie próby od momentu przygotowania do czasu przeprowadze-nia procesu izolacji przechowywano przez okres 4 mie-siêcy w wyja³owionych, suchych, otwartych probów-kach w temperaturze pokojowej.

Plan doœwiadczenia zak³ada³ wykonanie izolacji DNA w oœmiu powtórzeniach dla nastêpuj¹cych przy-padków:

• 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. • 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. • 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno.

• Degradacja – 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ót-no degradowanej 30 minut w temperaturze 150oC. • Inhibicja – 1 μl krwi naniesionej na materia³

jean-sowy zawieraj¹cy barwnik indygo.

• Kontrola pozytywna – 1 μl krwi naniesionej na ja³o-we p³ótno.

• Kontrola negatywna – ja³owe p³ótno bez naniesio-nej krwi.

Wszystkie próbki przygotowane w opisany sposób poddano procesom izolacji piêcioma metodami:

Metody oparte na separacji magnetycznej: • NucleoMag 96 Trace

• DNA IQ™ System

Metody wykorzystuj¹ce silikonow¹ membranê: • NucleoSpin®Tissue XS

• QIAamp®DNA Micro Metoda organiczna:

• Metoda organiczna w uk³adzie fenol : chloroform : alkohol izoamylowy (25 : 24 : 1).

W zale¿noœci od zastosowanej metody i zaleceñ producenta koñcowa objêtoœæ, w jakiej zawieszano izo-lowane DNA, wynosi³a:

• NucleoMag 96 Trace: 50 μl

• DNA IQ™ System: 25 μl

• NucleoSpin®Tissue XS: 20 μl

• QIAamp®DNA Micro: 20 μl

• Metoda organiczna: 20 μl

Oznaczenie uzyskanego stê¿enia DNA w izolacie wykonano metod¹ „Real Time PCR” z wykorzystaniem aparatu ABI PRISM 7500 Sequence Detection System i oprogramowania 7500 System Detection Software v. 1.2.3 z zastosowaniem zestawu odczynników Quan-tifiler™ Human DNA Quantification Kit. Otrzymane eks-trakty DNA amplifikowano przy u¿yciu zestawu

odczyn-ników AmpFlSTR® SGM Plus™ i aparatu GeneAmp

PCR System 9700. Produkty reakcji PCR poddawano elektroforezie w sekwenatorze ABI PRISM®3130 XL.

Do analizy wyników u¿ywano oprogramowania Gene-Mapper®ID v. 3.2.1 firmy Applied Biosystems.

Wszystkie badania przeprowadzono w obecnoœci kontroli dodatniej (DNA o znanym genotypie) i kontroli ujemnej (próba odczynnikowa), otrzymuj¹c prawid³owe dla nich wyniki.

Procedury badawcze

Procedura izolacji wykorzystuj¹ca wi¹zanie DNA przez paramagnetyczne kulki (separacja magnetycz-na) – NucleoMag 96 Trace:

1. Do probówki o pojemnoœci 1,5 ml z badanym ma-teria³em dodaæ 25 μl roztworu proteinazy K i 200 μl buforu FLB, a nastêpnie zworteksowaæ przez oko³o 15 sekund i krótko zwirowaæ.

2. Inkubowaæ próbkê przez 1 godzinê w temperatu-rze 56oC.

3. Z probówki przenieœæ 225 μl lizatu do do³ka na plastikowej p³ytce Square-well Block (ryc. 3).

4. Do lizatu dodaæ 14 μl zawiesiny paramagnetycz-nych kulek oraz 360 μl buforu MB2. Ca³oœæ wy-mieszaæ przez 5 minut na wytrz¹sarce.

5. P³ytkê umieœciæ na separatorze magnetycznym NucleoMag SEP (ryc. 4, 5) i pozostawiæ na 2 mi-nuty w celu oddzielenia paramagnetycznych

ku-Ryc. 3. P³ytka Square-well Block (NucleoMag 96 Trace) Fig. 3. Square-well Block plate (NucleoMag 96 Trace)

Ryc. 4. Separator magnetyczny (NucleoMag 96 Trace) Fig. 4. Magnetic separator (NucleoMag 96 Trace)

(4)

lek od roztworu. Supernatant odci¹gn¹æ za pomo-c¹ pipety.

6. Zdj¹æ p³ytkê z separatora. Dodaæ 600 μl buforu MB3, a nastêpnie mieszaæ przez 5 minut na wy-trz¹sarce.

7. Ponownie umieœciæ p³ytkê na separatorze. Pozo-stawiæ na 2 minuty w celu oddzielenia parama-gnetycznych kulek od roztworu. Supernatant od-ci¹gn¹æ za pomoc¹ pipety.

8. Zdj¹æ p³ytkê z separatora. Dodaæ 600 μl buforu MB4, a nastêpnie mieszaæ przez 5 minut na wy-trz¹sarce.

9. Ponownie umieœciæ p³ytkê na separatorze. Pozo-stawiæ na 2 minuty w celu oddzielenia parama-gnetycznych kulek od roztworu. Supernatant od-ci¹gn¹æ za pomoc¹ pipety.

10. Pozostawiaj¹c p³ytkê na separatorze dodaæ 900 μl buforu MB5 i inkubowaæ przez 60 sekund, a na-stêpnie odci¹gn¹æ za pomoc¹ pipety supernatant. 11. Zdj¹æ p³ytkê z separatora. Dodaæ 50 μl buforu MB5 podgrzanego do temperatury 56oC. Mieszaæ przez 10 minut na wytrz¹sarce.

12. Umieœciæ p³ytkê na separatorze. Pozostawiæ na 2 minuty w celu oddzielenia paramagnetycznych kulek od roztworu. Uzyskany roztwór DNA odci¹-gn¹æ do probówki o pojemnoœci 1,5 ml za pomo-c¹ pipety.

Procedura izolacji wykorzystuj¹ca wi¹zanie DNA przez paramagnetyczne kulki (separacja magnetycz-na) – DNA IQ™ System:

1. Do probówki o pojemnoœci 1,5 ml zawieraj¹cej badany materia³ dodaæ 150 μl buforu lizuj¹cego. 2. Inkubowaæ przez 30 minut w temperaturze 70oC. 3. Lizat wraz z pod³o¿em przenieœæ na filtr DNA IQ™ Spin Basket umieszczony w probówce o po-jemnoœci 1,5 ml.

4. Wirowaæ przez 2 minuty przy maksymalnych ob-rotach. Usun¹æ DNA IQ™ Spin Basket.

5. Do probówki dodaæ 7 μl homogennej zawiesiny kulek paramagnetycznych. Inkubowaæ próbkê przez 5 minut w temperaturze pokojowej, wortek-suj¹c co minutê.

6. Probówkê umieœciæ w statywie magnetycznym, a nastêpnie ostro¿nie usun¹æ z probówki super-natant (ryc. 6).

7. Dodaæ 100 μl buforu lizuj¹cego. Wyj¹æ probówkê ze statywu magnetycznego i zworteksowaæ. 8. Ponownie umieœciæ probówkê w statywie

magne-tycznym i usun¹æ ca³y bufor lizuj¹cy.

9. Dodaæ 100 μl roztworu p³ucz¹cego. Wyj¹æ pro-bówkê ze statywu magnetycznego i zwortekso-waæ.

10. Ponownie umieœciæ probówkê w statywie magne-tycznym i usun¹æ ca³y roztwór p³ucz¹cy.

11. P³ukanie powtórzyæ jeszcze dwa razy. Upewniæ siê, ¿e ca³y roztwór zosta³ usuniêty po ostatnim p³ukaniu.

12. Osad suszyæ przez 5 minut w temperaturze poko-jowej przy otwartych probówkach.

13. Dodaæ 25 μl buforu elucyjnego i zworteksowaæ. 14. Inkubowaæ przez 5 minut w temperaturze 65oC. 15. Wyj¹æ z cieplarki, zworteksowaæ, a nastêpnie

wstawiæ do statywu magnetycznego (osad musi byæ gor¹cy). Uzyskany roztwór DNA przenieœæ do czystej probówki o pojemnoœci 1,5 ml.

Procedura izolacji wykorzystuj¹ca wi¹zanie DNA przez silikonow¹ membranê – NucleoSpin®Tissue XS:

1. Do probówki z badanym materia³em o pojemno-œci 1,5 ml dodaæ 160 μl buforu T1, a nastêpnie zworteksowaæ 2 x 5 sekund.

Ryc. 5. P³ytka Square-well Block umieszczona na separatorze magnetycz-nym (NucleoMag 96 Trace)

Fig. 5. Square-well Block plate placed on the magnetic separator (NucleoMag 96 Trace)

Ryc. 6. Usuwanie supernatantu po oddzieleniu siê kulek magnetycznych od roztworu (DNA IQ™ System)

Fig. 6. Discarding of supernatant after magnetic beads separation (DNA IQ™ System)

(5)

2. Inkubowaæ próbkê przez 10 minut w temperatu-rze 94oC. Po zakoñczonej inkubacji pozostawiæ próbki, aby ostyg³y.

3. Dodaæ 16 μl roztworu proteinazy K, zwortekso-waæ, a nastêpnie krótko zwirowaæ.

4. Inkubowaæ próbkê przez 1 godzinê w temperatu-rze 56oC.

5. Przenieœæ lizat wraz z pod³o¿em na filtr Nucleo-Spin®Filter umieszczony w probówce o pojemno-œci 1,5 ml. Zwirowaæ przez 1 minutê przy 11 000 obr./min. Filtr z pod³o¿em odrzuciæ.

6. Dodaæ 160 μl buforu B3, a nastêpnie zwortekso-waæ 2 x 5 sekund.

7. Inkubowaæ przez 5 minut w temperaturze 70oC. 8. Zworteksowaæ próbkê po wyjêciu z cieplarki i

po-zostawiæ do ostygniêcia.

9. Dodaæ 160 μl etanolu, zworteksowaæ 2 x 5 se-kund, a nastêpnie krótko zwirowaæ.

10. Przenieœæ lizat na kolumienkê z membran¹ siliko-now¹, umieszczon¹ w probówce o pojemnoœci 2 ml i zwirowaæ przez 1 minutê przy 11 000 obr./min (je¿eli ca³a p³ynna zawartoœæ nie przes¹czy siê przez membranê, powtórzyæ wirowanie). Odrzuciæ probówkê wraz z supernatantem, a kolumienkê przenieœæ do nowej probówki o pojemnoœci 2 ml. 11. Dodaæ na membranê 50 μl buforu B5, a nastêpnie

zwirowaæ przez 1 minutê przy 11 000 obr./min. 12. Ponownie dodaæ 50 μl buforu B5 i zwirowaæ

przez 2 minuty przy 11 000 obr./min.

13. Umieœciæ kolumienkê w nowej probówce o pojem-noœci 1,5 ml, a nastêpnie dodaæ 20 μl buforu BE dok³adnie na sam œrodek membrany silikonowej. Zwirowaæ przez 1 minutê przy 11 000 obr./min. 14. Inkubowaæ otwart¹ probówkê przez 8 minut

w temperaturze 90oC w celu odparowania pozo-sta³oœci etanolu.

Procedura izolacji wykorzystuj¹ca wi¹zanie DNA przez silikonow¹ membranê – QIAamp®DNA Micro:

1. Do probówki o pojemnoœci 1,5 ml z badanym ma-teria³em dodaæ 300 μl buforu ATL i 20 μl roztworu proteinazy K. Zworteksowaæ pulsacyjnie przez 10 sekund.

2. Inkubowaæ próbkê przez 1 godzinê w temperatu-rze 56oC. Po wyjêciu z cieplarki krótko zwirowaæ. 3. Dodaæ 300 μl buforu AL, a nastêpnie

zwortekso-waæ pulsacyjnie przez 10 sekund.

4. Inkubowaæ przez 10 minut w temperaturze 70oC. Zwirowaæ przez 1 minutê przy 14 000 obr./min. Jeœli materia³ biologiczny znajduje siê na pod³o¿u ch³onnym (np. tkaninie), nale¿y przenieœæ lizat wraz z pod³o¿em na kolumnê QIAshredder Spin (ryc. 7, 8) i zwirowaæ 2 minuty przy 14 000 obr./min.

5. Ostro¿nie przenieœæ supernatant na kolumnê QIA-amp® MinElute umieszczon¹ w probówce o po-jemnoœci 2 ml, bez zwil¿ania obwódki (ryc. 9).

6. Zwirowaæ przez 1 minutê przy 8000 obr./min. Pro-bówkê z przes¹czem odrzuciæ, a kolumnê QIA-amp® MinElute umieœciæ w nowej probówce o po-jemnoœci 2 ml.

Ryc. 7. Przenoszenie pod³o¿a na kolumnê QIAshredder Spin (QIAamp® DNA Micro)

Fig. 7. Transferring the solid sample material to the QIAshredder Spin co-lumn (QIAamp® DNA Micro)

Ryc. 8. Pod³o¿e na kolumnie QIAshredder Spin po zwirowaniu (QIAamp® DNA Micro)

Fig. 8. The solid sample material on the QIAshredder Spin column after centrifugation (QIAamp® DNA Micro)

Ryc. 9. Kolumna QIAamp® MinElute (QIAamp® DNA Micro) Fig. 9. QIAamp® MinElute column (QIAamp® DNA Micro)

(6)

7. Na kolumnê dodaæ 500 μl buforu AW1, zwirowaæ przez 1 minutê przy 8000 obr./min. Probówkê z przes¹czem odrzuciæ, a kolumnê QIAamp® MinElute umieœciæ w nowej probówce o pojem-noœci 2 ml.

8. Na kolumnê dodaæ 500 μl buforu AW2, zwirowaæ przez 1 minutê przy 8000 obr./min. Probówkê z przes¹czem odrzuciæ, a kolumnê QIAamp® Min-Elute umieœciæ w nowej probówce o pojemnoœci 2 ml.

9. Zwirowaæ przez 3 minuty przy 14 000 obr./min, probówkê z przes¹czem odrzuciæ, a kolumnê QIAamp® MinElute umieœciæ w nowej probówce o pojemnoœci 1,5 ml.

10. Dodaæ 20 μl buforu AE na œrodkow¹ czêœæ mem-brany.

11. Inkubowaæ przez 5 minut w temperaturze pokojo-wej, a nastêpnie zwirowaæ przez 1 minutê przy 14 000 obr./min.

Procedura izolacji DNA metod¹ organiczn¹

w uk³adzie chloroform : fenol : alkohol izoamylowy (25 : 24 : 1)

1. Do probówki o pojemnoœci 1,5 ml z badan¹ prób-k¹ dodaæ kolejno:

– 300 μl 2% roztworu SDS w buforze ekstrakcyj-nym,

– 12 μl 1 M roztworu DTT w buforze ekstrakcyj-nym,

– 15 μl 20 mg/ml roztworu proteinazy K.

2. Inkubowaæ próbkê w temperaturze 56oC przez noc.

3. Roz¿arzon¹ w p³omieniu palnika ig³¹ przek³uæ wieczko i dno zawieraj¹cej materia³ probówki. Probówkê umieœciæ w nowej opisanej probówce o pojemnoœci 1,5 ml, a nastêpnie zwirowaæ przez 5 minut przy 9000 obr./min. Odrzuciæ górn¹ probówkê z pod³o¿em.

4. Do przes¹czu dodaæ 300 μl mieszaniny fenol : chloroform : alkohol izoamylowy (25 : 24 : 1) roz-puszczonej w 10 mM roztworze Tris pH 8 z 1 mM EDTA i zworteksowaæ do uzyskania mlecznej za-wiesiny.

5. Próbkê odwirowaæ przez 5 minut przy 13 500 obr./min.

6. Górn¹ fazê ekstraktu (wodn¹) przenieœæ na filtr zestawiony z opisan¹ probówk¹ mikrokoncentra-tora Microcon®YM-100, na który wczeœniej wpi-petowano 100 μl wody (ryc. 10, 11). Zwirowaæ przez 10 minut przy 5500 obr./min.

7. Mikrokoncentrator wyj¹æ ostro¿nie z probówki, usun¹æ z niej przefiltrowany p³yn i ponownie ze-stawiæ mikrokoncentrator z probówk¹.

8. Na filtr mikrokoncentratora wpipetowaæ 200 μl wody.

9. Odwirowaæ przez 10 minut przy 5500 obr./min. 10. Na filtr mikrokoncentratora wpipetowaæ 20 μl

wo-dy, a nastêpnie zestawiæ go w pozycji odwróconej z now¹ opisan¹ probówk¹ o pojemnoœci 1,5 ml. 11. Zwirowaæ przez 5 minut przy 2500 obr./min.

Opracowanie wyników

Wyniki uzyskane z oznaczenia iloœciowego opraco-wano z u¿yciem analizy wariancji testem Tukeya za po-moc¹ wersji demo oprogramowania GraphPad Prism v. 5 przeznaczonego do obliczeñ biostatystycznych (zgodnie z obwi¹zuj¹c¹ licencj¹ producenta).

Omówienie wyników badań

Testowane w doœwiadczeniu zestawy przeznaczone do izolacji DNA analizowano w nastêpuj¹cych aspek-tach:

• Wydajnoœæ metody (uzyskane stê¿enie DNA). • Jakoœæ uzyskanego DNA (obraz profilu

genetycz-nego).

• Ryzyko wyst¹pienia kontaminacji.

Ryc. 10. Przenoszenie fazy wodnej ekstraktu (metoda organiczna): a – faza wodna z widoczn¹ zawartoœci¹ barwnika indygo, b – faza wodna bez zawartoœci barwnika indygo.

Fig. 10. Transferring the non-organic phase of the extract (organic me-thod): a – non-organic phase containing indigo,

b – non-organic phase without indigo

Ryc. 11. Filtr mikrokoncentratora Microcon® YM-100 (metoda organiczna) Fig. 11. Microcon® Centrifugal Filter Units (organic method)

(7)

• Ekonomika przeprowadzenia procesu izolacji (iloœæ zu¿ytych materia³ów i dodatkowych odczyn-ników, czas niezbêdny do przeprowadzenia proce-dury, koszt zestawu) oraz stopieñ trudnoœci danej techniki.

Analiza ilościowa uzyskanego DNA

w zależności od zastosowanej metody izolacji Efektywnoœæ wybranych metod izolacji DNA porów-nano i omówiono dla nastêpuj¹cych przypadków:

– objêtoœæ krwi naniesionej na ja³owe p³ótno (1 μl; 2,5 μl; 5 μl),

– czynnik degraduj¹cy (wysoka temperatura), – wp³yw inhibitora (barwnik indygo).

Wyniki przedstawiaj¹ce stê¿enie DNA w zale¿noœci od iloœci naniesionej na ja³owe p³ótno krwi przedsta-wiono w tabelach 1–3.

Przy izolacji DNA z 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno najwy¿sz¹ œredni¹ ze stê¿enia [ng/μl] otrzyma-no, stosuj¹c metodê organiczn¹ (w uk³adzie fenol : chloroform : alkohol izoamylowy). Œrednie stê¿enie DNA otrzymane przy zastosowaniu technik separacji magnetycznej (NucleoMag 96 Trace i DNA IQ™ Sys-tem) oraz separacji przy u¿yciu membrany silikonowej

(NucleoSpin®Tissue XS) utrzymywa³o siê na podob-nym poziomie. Wynik ten zosta³ potwierdzony staty-stycznie. Najni¿sze stê¿enie DNA otrzymano przy u¿y-ciu metody QIAamp®DNA Micro.

Porównawszy stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane po izolacji z 1 μl krwi naniesionego na ja³owe p³ótno, przy zastosowaniu ró¿nych metod, stwierdzono ró¿ni-ce statystycznie istotne pomiêdzy wy¿szym stê¿eniem DNA uzyskanym przy zastosowaniu metody organicz-nej w porównaniu z:

– metod¹ QIAamp®DNA Micro (p ≤ 0,01)

– metodami: DNA IQ™ System, NucleoSpin®Tissue XS (p ≤ 0,05)

Porównuj¹c œrednie stê¿enia DNA uzyskane ró¿-nymi metodami, nale¿y mieæ na uwadze tak¿e wyniki cz¹stkowe. Daje siê bowiem zauwa¿yæ du¿¹ rozbie¿-noœæ pomiêdzy pojedynczymi wynikami, co potwier-dza du¿e odchylenie standardowe – zbli¿one do

œred-niej, a nawet j¹ przewy¿szaj¹ce w przypadku metod opartych na separacji magnetycznej. Taka sytuacja mo¿e potwierdzaæ nisk¹ powtarzalnoœæ otrzymywa-nych wyników przy zastosowaniu wymieniootrzymywa-nych me-tod. Najwiêksze rozbie¿noœci w otrzymanych stê¿e-niach zanotowano w przypadku metody Nucleo-Mag 96 Trace.

Tabela 1 Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi

naniesionej na ja³owe p³ótno

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of blood taken from the linen, depending on the extraction’s method

Ÿród³o (tabele 1–7): autorzy S.D. – odchylenie standardowe

Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie: AB przy p ≤ 0,01 [p – poziom istotnoœci]

ab przy p ≤ 0,05

(8)

W przypadku izolacji DNA z 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno, najwy¿sze œrednie stê¿enie [ng/μl] otrzymano przy zastosowaniu metody NucleoMag 96

Trace. Rozpatruj¹c wyniki cz¹stkowe przy zastosowa-niu tej metody, w próbce numer 3 otrzymano stê¿enie znacznie przewy¿szaj¹ce inne wyniki (19,54 ng/μl).

Tabela 2 Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji z materia³u stanowi¹cego 2,5 μl krwi

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 2,5 μl of blood taken from the linen, depending on the extraction’s method

Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie: AB przy p ≤ 0,01

ab przy p ≤ 0,05

[…] – wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 5 μl of blood taken from the linen, depending on the extraction’s method

AB przy p ≤ 0,01

(9)

Przy wyeliminowaniu tego wyniku do celów statystycz-nych œrednia stê¿enia DNA w metodzie NucleoMag 96 Trace by³a zbli¿ona do œredniego stê¿enia uzyskanego metod¹ organiczn¹. Wynik ten zosta³ potwierdzony statystycznie. Podobnie jak w przypadku omawianej wczeœniej izolacji z 1 μl krwi, tak¿e i w tym przypadku rozbie¿noœci uzyskanych wyników w metodzie Nucleo Mag 96 Trace by³y bardzo du¿e (od 1,33 ng/μl do 19,54 ng/μl). Odchylenie standardowe w metodzie opartej na separacji za pomoc¹ matrycy silikonowej przewy¿-sza³o œredni¹. Najni¿sze stê¿enie DNA otrzymano przy u¿yciu metody QIAamp®DNA Micro, co potwier-dza wynik uzyskany w doœwiadczeniu przy przeprowa-dzaniu izolacji z 1 μl.

Porównuj¹c stê¿enie DNA [ng/μll] uzyskane po izo-lacji z 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno, przy za-stosowaniu ró¿nych metod, stwierdzono ró¿nice staty-stycznie istotne pomiêdzy wiêkszym stê¿eniem DNA, przy zastosowaniu metody NucleoMag 96 Trace, w po-równaniu z:

– metod¹ DNA IQ™ System (p ≤ 0,05) – metod¹ QIAamp®DNA Micro (p ≤ 0,01)

Zanotowano tak¿e wy¿sze stê¿enie DNA otrzymane metod¹ organiczn¹ w porównaniu z metod¹ QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,05). Wyniki œrednich stê¿eñ DNA przy zastosowaniu pozosta³ych metod nie ró¿ni³y siê od siebie statystycznie.

Przy izolacji DNA z 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno najwy¿sze œrednie stê¿enie [ng/μl] zanotowano

przy zastosowaniu metody NucleoMag 96 Trace. Dru-g¹ pod wzglêdem wydajnoœci metod¹ by³a metoda or-ganiczna. Najni¿sze stê¿enie DNA uzyskano, stosuj¹c metodê QIAamp® DNA Micro (podobny wynik zanoto-wano w przypadku izolacji z 1 μl i 2,5 μl krwi).

Porównuj¹c stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane po izola-cji z 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno, przy zasto-sowaniu ró¿nych metod, stwierdzono ró¿nice staty-stycznie istotne pomiêdzy wiêkszym stê¿eniem DNA przy zastosowaniu metody Nucleomag 96 Trace w po-równaniu z metodami: DNA IQ™ System, Nucleo-Spin®Tissue XS oraz QIAamp®DNA Micro (p ≤ 0,01). Potwierdzono tak¿e statystycznie wy¿sze œrednie stê-¿enie DNA [ng/μl] uzyskane metod¹ organiczn¹ w po-równaniu z nastêpuj¹cymi metodami:

– DNA IQ™ System i NucleoSpin®Tissue XS

(p ≤ 0,01)

– QIAamp®DNA Micro (p ≤ 0,001)

W tabeli 4 przedstawiono stê¿enie DNA otrzymane ró¿nymi metodami izolacji w przypadku dzia³ania czyn-nika degraduj¹cego, jakim by³a wysoka temperatura.

W przypadku izolowania DNA z materia³u zdegrado-wanego najwy¿sze œrednie stê¿enie DNA [ng/μl] uda³o siê uzyskaæ stosuj¹c metodê organiczn¹. Podobnie wysokie stê¿enie otrzymano, izoluj¹c materia³ metod¹ NucleoSpin®Tissue XS. Porównuj¹c stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane po izolacji z 1 μl zdegradowanej krwi na p³ótnie, przy zastosowaniu ró¿nych metod,

stwier-Tabela 4 Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji z materia³u zdegradowanego, stanowi¹cego

1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of degraded blood taken from the linen, depending on the extraction’s method

AB przy p ≤ 0,01 ab przy p ≤ 0,05

(10)

dzono ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy ni¿szym

stê¿eniem DNA po zastosowaniu metody QIAamp®

DNA Micro w porównaniu z metodami: – organiczn¹ (p ≤ 0,001)

– NucleoSpin®Tissue XS (p ≤ 0,01) – DNA IQ™ System (p ≤ 0,05).

W tabeli 5 przedstawiono stê¿enie DNA otrzymane ró¿nymi metodami izolacji w przypadku obecnoœci inhi-bitora reakcji PCR w pod³o¿u.

Izoluj¹c DNA z 1 μl krwi naniesionej na jeans zawie-raj¹cy inhibitor reakcji PCR (barwnik indygo), najwy¿-sze œrednie stê¿enie DNA [ng/μl] otrzymano, stosuj¹c

naniesionej na jeans z barwnikiem indygo (pod³o¿e z inhibitorem reakcji PCR)

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of blood taken from the jeans (PCR inhibitor), depending on the extraction’s method

AB przy p ≤ 0,01

[…] – wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa

Tabela 6 Stê¿enie DNA [ng/μl] stanowi¹cego próbê kontroln¹ uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji

z 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from the control – 1 μl of blood taken from the linen, depending on the extraction’s method

Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie: AB przy p ≤ 0,01; ab przy p ≤ 0,05

(11)

metodê NucleoSpin®Tissue XS. W przypadku metody QIAamp® DNA Micro nie stwierdzono wystêpowania inhibitora reakcji PCR w koñcowym izolacie, jednak DNA nie uda³o siê wyizolowaæ. Ekstrakcja DNA meto-d¹ organiczn¹ w uk³adzie fenol : chloroform : alkohol izoamylowy skutkowa³a obecnoœci¹ inhibitora reakcji PCR w koñcowym izolacie. Odchylenie standardowe w metodzie opartej na separacji magnetycznej DNA IQ™ System przewy¿sza³o œrednie stê¿enie.

Przy izolacji DNA z pod³o¿a zawieraj¹cego inhibitor reakcji PCR stwierdzono wy¿sze stê¿enie DNA przy zastosowaniu metody NucleoSpin®Tissue XS w porównaniu z:

– QIAamp®DNA Micro (p ≤ 0,001) – DNA IQ™ System (p ≤ 0,01)

Wszystkie badania przeprowadzono w obecnoœci kontroli pozytywnej – próbki o znanym genotypie, sta-nowi¹cej 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. Wyni-ki przedstawiono w tabeli 6.

W próbie kontrolnej najwy¿sze stê¿enia DNA [ng/μl], potwierdzone statystycznie, zanotowano w przypad-kach izolacji metodami NucleoMag 96 Trace oraz orga-niczn¹. Najni¿sze stê¿enie DNA uzyskano metod¹

QIAamp® DNA Micro. Porównuj¹c stê¿enie DNA

[ng/μl] uzyskane po izolacji z próby kontrolnej, przy za-stosowaniu ró¿nych metod, stwierdzono ró¿nice staty-stycznie istotne pomiêdzy wy¿szym stê¿eniem DNA uzyskanym metod¹ NucleoMag 96 Trace w porówna-niu z:

– metod¹ QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,01)

– metodami: DNA IQ™ System, NucleoSpin®Tissue XS (p ≤ 0,05)

Ponadto zanotowano statystycznie wy¿sze stê¿enie DNA przy zastosowaniu metody organicznej w porów-naniu z metod¹ QIAamp®DNA Micro (p ≤ 0,05). Analiza jakościowa uzyskanego DNA

w zależności od zastosowanej metody izolacji Po izolacji DNA z materia³u wyjœciowego, jaki stano-wi³y próbki krwi o objêtoœci: 1 μl, 2,5 μl oraz 5 μl stwier-dzono, ¿e tylko przy zastosowaniu metody Nucleo Spin®Tissue XS oraz metody organicznej uda³o siê uzyskaæ pe³ne profile w przypadku wszystkich analizo-wanych próbek. Izoluj¹c metod¹ DNA IQ™ System z 1 μl krwi, uzyskano dwa profile czêœciowe (wypadniêciu uleg³y allele z uk³adu D18S51) oraz 6 pe³nych profili. Najmniejsz¹ liczbê pe³nych profili uzyskano przy zasto-sowaniu metod: NucleoMag 96 Trace (3FP) i QIAamp® DNA Micro (4FP). W obu tych metodach uzyskano tak-¿e profile czêœciowe: w metodzie NucleoMag 96 Trace wypadniêciu uleg³y allele z uk³adów D16S539, D2S1338, D21S11, D18S51 i FGA w jednej próbce oraz TH01 w drugiej. W przypadku metody QIAamp® DNA Micro wypad³y uk³ady: D18S51 w jednej próbce oraz D3S1358, vWA, D16S539, D2S1338, D21S11, D18S51, D19, TH01 i FGA w kolejnych. Przy zastoso-waniu metod: NucleoMag 96 Trace, DNA IQ™ System oraz QIAamp®DNA Micro wraz ze wzrostem iloœci ma-teria³u wyjœciowego uzyskiwano wiêcej pe³nych profili genetycznych.

Tabela 7 Analiza uzyskanych profili genetycznych w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji

Analysis of the genetic profiles depending on the the extraction’s method

Zastosowane w tabeli oznaczenia: FP – pe³ny profil (ang. full profile) PP – czêœciowy profil (ang. partial profile) NEG – brak profilu

(12)

W przypadku analizy materia³u zdegradowanego stwierdzono, ¿e przy zastosowaniu metod: DNA IQ™ System, NucleoSpin®Tissue XS oraz organicznej uzy-skano profile, w których wypadniêciu uleg³y tylko allele w loci o wysokiej masie cz¹steczkowej. Dla DNA IQ™ System by³y to uk³ady: D2S1338 i D18S51 (w jednym przypadku tak¿e D16S539 i FGA), dla Nucleo-Spin®Tissue XS: D2S1338, D18S51 (w dwóch przy-padkach dodatkowo D16S539 i D21S11, a tak¿e w jed-nym przypadku FGA), dla metody organicznej: D16S539, D2S1338, D18S51 (w jednym przypadku tak¿e D21S11 i FGA). Stosuj¹c metody izolacji z zasto-sowaniem systemów NucleoMag 96 Trace i QIAamp® DNA Micro, uda³o siê uzyskaæ tylko profile czêœciowe, w których wypadniêciu uleg³y allele z wiêkszoœci loci. W przypadku metody QIAamp®DNA Micro nie uzyska-no profili genetycznych dla piêciu na osiem badanych próbek.

Analiza profili DNA z materia³u izolowanego z pod-³o¿a zawieraj¹cego inhibitor reakcji PCR wskaza³a, ¿e jedynie stosuj¹c metodê opart¹ na separacji za pomo-c¹ paramagnetycznych kulek – DNA IQ™ System – uda³o siê uzyskaæ wszystkie profile genetyczne (czte-ry pe³ne profile i czte(czte-ry czêœciowe). W pozosta³ych sto-sowanych metodach wielokrotnie obserwowano brak sygna³u: dla QIAamp® DNA Micro nie uda³o siê uzy-skaæ profili genetycznych we wszystkich oœmiu przy-padkach, dla NucleoMag 96 Trace w siedmiu, oraz dla NucleoSpin®Tissue XS w szeœciu.

Próba kontrolna potwierdzi³a wyniki uzyskane z izo-lacji przeprowadzonej z 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno w przypadku metod: DNA IQ™ System, Nucleo Spin®Tissue XS oraz metody organicznej. Natomiast dla metody NucleoMag 96 Trace otrzymano w przypad-ku próby kontrolnej znacznie lepszy wynik – osiem pe³-nych profili. Podobnie w przypadku systemu QIAamp® DNA Micro otrzymano wiêcej pe³nych profili.

W ¿adnym z analizowanych przypadków nie stwier-dzono profilu mieszanego, co œwiadczy o braku wyst¹-pienia kontaminacji.

Ekonomika procesów izolacji DNA

oraz ocena stopnia trudności ich stosowania Podsumowanie ekonomiki wykonania izolacji DNA poszczególnymi metodami uwzglêdnia czas etapów niezbêdnych do przeprowadzenia procesu, iloœæ dodat-kowych materia³ów i odczynników, a tak¿e ceny brutto zestawów. Podane kwoty odnosz¹ siê do cen rynko-wych z I kwarta³u 2009 r.

NucleoMag 96 Trace:

Czas inkubacji: 60 min

Czas wytrz¹sania: 26 min

Czas separacji: 8 min

Zu¿ycie materia³ów: 2 x probówka o poj. 1,5 ml, 10 x koñcówka 1000 μl

4 x koñcówka 100 μl Plastikowa 96-do³kowa p³ytka Square-well block

Dodatkowe odczynniki: brak

Koszt zestawu (96 izolacji): 900 PLN

Cena separatora magnetycznego: 2240 PLN

Koszt w przeliczeniu na 1 próbkê: 9,40 PLN £¹czny czas operacji niezbêdnych do przeprowa-dzenia izolacji DNA zestawem NucleoMag 96 Trace (inkubacja, wytrz¹sanie i separacja) wynosi 94 minuty. Zestaw zawiera wszystkie odczynniki potrzebne do wy-konania procedury. Niezbêdne jest zabezpieczenie do-datkowych materia³ów w postaci probówek o pojemno-œci 1,5 ml i plastikowych 96-do³kowych p³ytek Square--well block. S¹ one sprzedawane oddzielnie w zesta-wach po 4 lub 20 sztuk. Dodatkowym kosztem jest za-kup separatora magnetycznego, na którym umieszcza siê p³ytkê Square-well block. Separator nie ma bezpo-œredniego kontaktu z próbkami, wiêc mo¿e byæ stoso-wany wielokrotnie. Jednorazowo mo¿na umieœciæ na separatorze jedn¹ p³ytkê. W ca³ym procesie zu¿y-wanych jest 14 ró¿nych koñcówek do pipet.

Metoda jest bardzo trudna do wykonania manualne-go. Istnieje du¿e ryzyko wyst¹pienia kontaminacji ze wzglêdu na to, ¿e ca³y proces izolacji odbywa siê przy otwartej p³ytce Square-well block. Szczególne nie-bezpieczeñstwo zanieczyszczenia próbek wystêpuje na etapie wytrz¹sania. Operator musi zachowaæ przez ca³y czas szczególn¹ ostro¿noœæ. Ponadto niemo¿liwe jest rêczne wykonanie izolacji z pe³nym wykorzysta-niem p³ytki 96-do³kowej, co w przypadku mniejszej ilo-œci próbek czyni metodê ma³o op³acaln¹. Zestaw Nuc-leoMag 96 Trace jest dedykowany do izolacji DNA za pomoc¹ automatycznych stacji (robotów).

DNA IQ™ System:

Czas wirowania: 2 min

Zu¿ycie materia³ów: 3 x probówka o poj. 1,5 ml 7 x koñcówka 300 μl 6 x koñcówka 100 μl 1 x koñcówka 10 μl Dodatkowe odczynniki: 0,3 ml EtOH

0,3 ml iPrOH 2,5 μl 1M DTT Koszt zestawu (100 izolacji): 1874 PLN Koszt w przeliczeniu na 1 próbkê: 18,75 PLN

Metoda izolacji z zastosowaniem zestawu DNA IQ™ System wymaga przeprowadzenia etapów wirowania

(13)

i inkubacji, których ³¹czny czas wynosi 45 minut. Ze-staw zawiera zarówno statyw magnetyczny, jak i wy-starczaj¹c¹ iloœæ probówek o pojemnoœci 1,5 ml, jed-nak niektóre odczynniki nale¿y zabezpieczyæ we w³a-snym zakresie (etanol, izopropanol, 1 M roztwór DTT w buforze lizuj¹cym). W procesie zu¿ywanych jest 14 ró¿nych koñcówek do pipet.

Metoda jest doœæ ³atwa do wykonania manualnego w przypadku niewielkiej liczby próbek. Statyw magne-tyczny przewidziany jest na 12 probówek. Ryzyko kon-taminacji wystêpuje w niewielkim zakresie z tego wzglêdu, ¿e wszystkie próbki znajduj¹ siê w oddziel-nych probówkach typu safe-lock. Proces mo¿na prze-prowadzaæ równie¿ z zastosowaniem robota do izola-cji.

NucleoSpin®Tissue XS:

Zu¿ycie materia³ów: 2 x probówka o poj. 1,5 ml 2 x probówka o poj. 2 ml 2 x koñcówka 1000 μl 3 x koñcówka 300 μl 4 x koñcówka 100 μl Filtry NucleoSpin Dodatkowe odczynniki: 0,4 ml EtOH Koszt zestawu

(50 izolacji): 974 PLN

Koszt w przeliczeniu

na 1 próbkê: 19,50 PLN

£¹czny czas inkubacji i wirowania w procedurze izo-lacji DNA za pomog¹ zestawu NucleoSpin Tissue XS wynosi 89 minut. Niezbêdne jest zabezpieczenie do-datkowych materia³ów w postaci probówek o pojemno-œci 1,5 ml i 2 ml oraz filtrów NucleoSpin s³u¿¹cych do oddzielania lizatu od pod³o¿a. Nale¿y równie¿ przy-gotowaæ etanol do sporz¹dzenia buforu p³ucz¹cego. W ca³ym procesie zu¿ywanych jest dziewiêæ ró¿nych koñcówek do pipet.

Zestaw NucleoSpin Tissue XS jest dedykowany do manualnego wykonywania. Izolacja DNA t¹ metod¹ jest ³atwa do przeprowadzenia. Ryzyko kontaminacji próbek wystêpuje w bardzo niewielkim stopniu.

QIAamp® DNA Micro Kit:

Zu¿ycie materia³ów: 2 x probówka o poj. 1,5 ml 6 x koñcówka 1000 μl 2 x koñcówka 100 μl Kolumna QIAshredder Spin Dodatkowe odczynniki: 1,1 ml EtOH

Koszt zestawu

(50 izolacji): 1574 PLN

Koszt w przeliczeniu

na 1 próbkê: 31,50 PLN

Izolacja DNA za pomog¹ zestawu QIAamp® DNA Micro wi¹¿e siê z przeprowadzeniem inkubacji i wiro-wania, których ³¹czny czas wynosi 85 minut. Niezbêd-ne jest zabezpieczenie etanolu wchodz¹cego w sk³ad roztworów p³ucz¹cych, równie¿ dodatkowych materia-³ów w postaci probówek o pojemnoœci 1,5 ml oraz ko-lumn QIAshredder Spin s³u¿¹cych do oddzielania liza-tu od pod³o¿a. Probówki o pojemnoœci 2 ml znajduj¹ siê w zestawie. W ca³ym procesie zu¿ywanych jest osiem ró¿nych koñcówek do pipet.

Ryzyko wyst¹pienia kontaminacji w procesie izolacji

DNA za pomoc¹ zestawu QIAamp® DNA Micro jest

bardzo ma³e. Procedura jest ³atwa do przeprowadze-nia manualnie.

Metoda organiczna w uk³adzie fenol : chloroform : alkohol izoamylowy (25 : 24 : 1)

Czas inkubacji: > 150 min

Zu¿ycie materia³ów: 4 x probówka o poj. 1,5 ml 2 x koñcówka 1000 μl 1 x koñcówka 300 μl 5 x koñcówka 100 μl Mikrokoncentrator Micro-con®YM-100 Dodatkowe odczynniki: 300 μl 2% SDS 12 μl 1M DTT 15 μl proteinazy K (20 mg/ml) Koszt w przeliczeniu na 1 próbkê: oko³o 15 PLN

Izolacja z zastosowaniem metody organicznej wy-maga przeprowadzenia etapów wirowania i inkubacji, których ³¹czny czas wynosi co najmniej 185 minut. Wy-maga ona wczeœniejszego przygotowania odczynni-ków. Na ka¿d¹ próbkê nale¿y zabezpieczyæ 4 probów-ki o pojemnoœci 1,5 ml, zestaw mikrokoncentratora Mi-crocon®YM-100 firmy Millipore i osiem ró¿nych koñcó-wek do pipet.

Stosowanie metody organicznej do izolacji DNA jest dosyæ ³atwe, jednak¿e stwarza niebezpieczeñstwo na-ra¿enia operatora na dzia³anie par niebezpiecznych substancji organicznych: fenolu – substancji silnie ¿r¹-cej i toksycznej, chloroformu – substancji szkodliwej oraz groŸnej dla œrodowiska, a tak¿e alkoholu izoamy-lowego o dzia³aniu szkodliwym i dra¿ni¹cym. Ponadto zachodzi ryzyko wyst¹pienia kontaminacji krzy¿owej próbek przy operowaniu filtrami mikrokoncentratora na etapie elucji DNA.

(14)

Wnioski

1. W przypadku izolacji DNA z materia³u stanowi¹-cego 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno stwierdzono statystycznie istotne wy¿sze stê¿e-nie DNA przy zastosowaniu metody organicznej w porównaniu z metodami DNA IQ™ System, NucleoSpin®Tissue XS oraz QIAamp® DNA Mi-cro.

2. W przypadku izolacji DNA z materia³u stanowi¹-cego 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno stwierdzono statystycznie istotne wy¿sze stê¿e-nie DNA przy zastosowaniu metody Nucleo-Mag 96 Trace w porównaniu z metodami DNA IQ™ System oraz QIAamp® DNA Micro, a tak¿e metody organicznej w odniesieniu do QIAamp® DNA Micro.

3. W przypadku izolacji DNA z materia³u stanowi¹-cego 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno stwierdzono statystycznie istotne wy¿sze stê¿e-nie DNA przy zastosowaniu metody Nucleo Mag 96 Trace i metody organicznej, w porówna-niu z pozosta³ymi metodami.

4. Najwy¿sz¹ wydajnoœæ izolacji DNA z materia³u zdegradowanego uzyskano przy zastosowaniu metody organicznej oraz NucleoSpin®Tissue XS. Stwierdzono statystycznie istotne ni¿sze stê¿enie DNA w przypadku zastosowania zestawu QIA-amp® DNA Micro w porównaniu z pozosta³ymi metodami z wyj¹tkiem NucleoMag 96 Trace. 5. Izolacja DNA z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi

naniesionej na pod³o¿e zawieraj¹ce inhibitor re-akcji PCR wykaza³a najwiêksz¹ skutecznoœæ ze-stawu NucleoSpin®Tissue XS. Stwierdzono staty-stycznie istotne wy¿sze stê¿enie DNA w izolacie przy zastosowaniu tej metody w porównaniu

z metodami DNA IQ™ System oraz QIAamp®

DNA Micro. Ekstrakcja DNA metod¹ organiczn¹ skutkowa³a obecnoœci¹ inhibitora reakcji PCR w uzyskanym izolacie.

6. Stê¿enia DNA uzyskane w próbie kontrolnej po-twierdzaj¹ wyniki otrzymane w przypadkach eks-trakcji DNA z 1 μl, 2,5 μl oraz 5 μl krwi naniesio-nej na ja³owe p³ótno. Ró¿nice w iloœci wyizolowa-nego DNA, pomiêdzy prób¹ kontroln¹ a prób¹ stanowi¹c¹ 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno w przypadku izolacji zestawem NucleoMag 96 Trace, œwiadcz¹ o niskiej powtarzalnoœci tej me-tody wykonywanej technik¹ manualn¹.

7. Pe³ne profile genetyczne uzyskano we wszyst-kich przypadkach izolacji DNA z materia³u wyj-œciowego, jaki stanowi³y próbki o ró¿nej objêtoœci krwi naniesione na ja³owe p³ótno, tylko przy

za-stosowaniu metody organicznej oraz Nucleo--Spin®Tissue XS.

8. Najwiêkszy odsetek pe³nych profili genetycznych w izolacji DNA zdegradowanego oraz z pod³o¿a zawieraj¹cego inhibitor reakcji PCR uzyskano przy zastosowaniu zestawu DNA IQ™ System. 9. Najtrudniejsz¹ do wykonania manualnego

okaza-³a siê procedura ekstrakcji DNA metod¹ Nucleo Mag 96 Trace. Zestaw ten, w odró¿nieniu od in-nych, posiada wszystkie odczynniki niezbêdne do przeprowadzenia procedury. Koszt wykonania izolacji jednej próbki zestawem NucleoMag 96 Trace jest najni¿szy.

10. Najkrótszy czas wykonania ca³ego procesu eks-trakcji uzyskano dla zestawu DNA IQ™ System. Metoda ta jest ³atwa do rêcznego przeprowadze-nia przy niewielkiej iloœci próbek.

11. Najmniejsze zu¿ycie materia³ów wystêpuje w przypadku zestawu QIAamp® DNA Micro. We wszystkich analizowanych przypadkach zestaw QIAamp®DNA Micro charakteryzowa³ siê najni¿-sz¹ wydajnoœci¹ zarówno w aspekcie iloœciowym jak i pod wzglêdem jakoœci uzyskanych profili ge-netycznych.

12. W ¿adnej z opisanych metod ekstrakcji DNA nie stwierdzono wyst¹pienia kontaminacji.

Streszczenie

Celem przeprowadzonych badañ by³o porównanie efektyw-noœci ró¿nych metod izolacji kwasów nukleinowych w aspekcie iloœciowym, jakoœciowym i ekonomicznym. Przetestowano dwa zestawy przeznaczone do izolacji DNA opieraj¹ce siê na separa-cji magnetycznej: NucleoMag 96 Trace i DNA IQ™System oraz dwa zestawy kolumienkowe z membran¹ silikonow¹: Nuc-leoSpin®Tissue XS i QIAamp®DNA Micro. W artykule przed-stawiono wyniki analizy testowanych zestawów do izolacji DNA. Badanym materia³em biologicznym by³a wysuszona krew na pod³o¿u ja³owym oraz na pod³o¿u zawieraj¹cym inhibitor re-akcji PCR, a tak¿e materia³ zdegradowany. Po izolacji DNA z ró¿nych objêtoœci krwi na ja³owym pod³o¿u najbardziej wydaj-nymi pod wzglêdem jakoœciowym by³y metody organiczna oraz Nucleospin®Tissue XS. W przypadku materia³u zdegradowane-go oraz przy ekstrakcji DNA z pod³o¿a zawieraj¹cezdegradowane-go inhibitor reakcji PCR najwiêcej pe³nych profili uzyskano przy zastosowa-niu metody DNA IQ™System. Badania t¹ metod¹ wykonano w najkrótszym czasie. Najni¿szy koszt w przeliczeniu na jedn¹ próbkê uzyskano dla zestawu NucleoMag 96 Trace.

S³owa kluczowe:metody izolacji DNA, separacja magne-tyczna, kulki paramagnetyczne, membrana silikonowa, œlady biologiczne, kryminalistyczne badania DNA.

Summary

The purpose of the research was to compare the efficiency of different DNA extraction methods from arranged forensic

(15)

sam-ples. There were tested four commercial kits: two of them based on magnetic separation: NucleoMag 96 Trace i DNA IQ™ Sys-tem and two of them based on silica membrane: Nucleo--Spin®Tissue XS and QIAamp® DNA Micro. In the article were presented results of extraction from dried blood spots on sterile linen as well as on jeans contained PCR inhibitor and also from degraded DNA. The best results in the quality aspect were obtained from dried blood spots on sterile linen using Nucleospin®Tissue XS and organic method. DNA IQ™ Sys-tem was the most effective method in case of degraded DNA and samples contained PCR inhibitor. These method required also the shortest time to perform the whole procedure of extraction. The lowest overall cost per one sample were in NucleoMag 96 Trace.

Keywords:DNA extraction methods, magnetic separation, paramagnetic beads, silica membrane, forensic biology.

BIBLIOGRAFIA

1. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Dy-nal.html

2. Macherey-Nagel User Manual, NucleoMag 96 Trace – Genomic DNA from Forensic Samples, Germany 2006, 1–29. 3. Montpetit S.A., Fitch I.T., O’Donnell P.T.: A simple au-tomated instrument for DNA extraction in forensic casework, Journal of Forensic Science 2005, 50, 1–9.

4. Nagy M., Otremba P., Krüger C. [et al.]: Optimization and validation of a fully automated silica-coated magnetic be-ads purification technology in forensics, Forensic Science In-ternational 2005, 152,13–22.

5. Paw³owski R.: Medyczno-s¹dowe badanie œladów bio-logicznych, Wydawnictwo IES, Kraków 1997.

6. Promega Technical Bulletin, DNA IQTM System – Small Sample Casework Protocol, USA 2006, 1–14.

7. Qiagen QIAamp® DNA Micro Handbook, Germa-ny 2003, 1–47.

8. Skagestad V., Reitan E., Stacy R. [et al.]: Innovative automated nucleic acid isolation by the key use of magnetic silica particles, European Cells and Materials 2002, 3, 199.

9. Macherey-Nagel User Manual, NucleoSpin®Tissue XS – Genomic DNA from Tissue, Germany 2007, 1–29.

Nagrody w konkursie prof. Tadeusza Hanauska

Z przyjemnoœci¹ informujemy, ¿e decyzj¹ Jury X Edycji Konkursu im. T. Hanauska na Pracê Roku z Dziedziny Kryminalistyki z dnia 27 marca 2009 r. nagrodzone zosta³y w kategorii publikacje

nastêpuj¹ce artyku³y pracowników Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego KGP: „N,N-dietylobenzyloamina – produkt utleniania benzoesanu denatonium podchlorynem sodu”

– nagrodê otrzyma³ £ukasz Matyjasek, specjalista Wydzia³u Fizykochemii

„Analiza sekwencji nowego markera STR zlokalizowanego w lokus ludzkiego hormonu wzrostu i jego wykorzystanie w identyfikacji osobniczej”

– wyró¿nienie otrzyma³a dr Magdalena Spólnicka, ekspert Wydzia³u Biologii

„Badania zawartoœci morfiny w p³ynach ustrojowych osób po spo¿yciu produktów spo¿ywczych zawieraj¹cych mak oraz jej oznaczanie w tych wyrobach

– dyplom Polskiego Towarzystwa Kryminalistycznego otrzyma³a