63 Klaudia GustawEwa HabzaAdam Waśko

(1)

.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018 WWW.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018 WWW.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018

streszczenie

Białka typu “moonlighting” wykazują kilka funkcji, które są biologicznie niezależne i mogą być zlokalizowane w różnych struktu- rach komórki. Takie multifunkcyjne białka są niezwykle konserwatywne zarówno u prokari- ontów, jak i eukariontów. Białka te podlegają stałej ekspresji. Do tej grupy białek możemy zaliczyć enzymy szlaku glikolizy, w którym aż siedem enzymów wykazuje różne funkcje. Jednym z takich białek jest enolaza, która początkowo została sklasyfikowana jedynie jako enzym glikolityczny. Po wielu latach stwierdzono obecność enolazy także na powierzchni komórki, gdzie pełni zupełnie inną funkcję, niż w cytozolu. Stwierdzono, że jako białko powierzchniowe, enolaza pełni wiele zadań, z których kluczową funkcją jest adhezja do ścianek jelita. Wśród bakterii kwasu mlekowego zasied- lanie nisz przewodu pokarmowego wiąże się z koniecznością adhezji do enterocytów jelit.

Dlatego obecność białek powierzchniowych, takich jak enolaza jest coraz częstszym przed- miotem badań w celu pozyskania szczepów o najlepszych cechach probiotycznych.

abstract

Moonlighting proteins have several functions, that are biologically independent and can be located in different cell structures.

Such multifunctional proteins are extremely conservative in both prokaryotes and eukary- otes. These proteins are constantly expressed.

This group includes mainly enzymes of the glycolysis pathway, where 7 have different functions. Enolase is an example of such a protein, which was initially classified as an enzyme of the glycolysis pathway. After many years it was discovered on the cell surface, where it had a completely different function, than in the cy- tosol. It is estimated that surface protein enolase performs many tasks, of which the key function is its adhesion to the intestinal walls.

Among lactic acid bacteria, colonization of the digestive tract, requires adhesion to intestinal enterocytes. Therefore, the presence of surface proteins, including enolase, is an increasingly common subject of research in order to obtain strains with the best probiotic features.

Klaudia Gustaw Ewa Habza

Adam Waśko

Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie Wydział Nauk o Żywności i Biotechnologii

Katedra Biotechnologii, Mikrobiologii i Żywienia Człowieka Katedra Biochemii i Chemii Żywności

ul. Skromna 8, 20-704 Lublin e-mail: klaudiagustaw1@gmail.com

Znaczenie enolazy jako białka „moonlighting”

The significance of enolase as a “moonlighting” protein

Słowa kluczowe: enolaza, adhezja, bakterie kwasu mlekowego, białka powierzchniowe.

K^{ey words:}enolase, adhesion, lactic acid bacteria, surface proteins.

(2)

Wprowadzenie

Bakterie kwasu mlekowego zasiedlają bardzo wiele różnorodnych środowisk. Wiąże się to z dużym i szczególnym zapotrzebowaniem pokarmowym, dlatego najczęściej można je spotkać w środowiskach bogatych w aminok- wasy, węglowodany i pochodne nukleotydów.

W trakcie ewolucji bakterie kwasu mlekowego przystosowywały się do trudnych warunków życia, przez co wachlarz zamieszkiwanych przez nie nisz ekologicznych wraz z upływem czasu znacznie się powiększył. Występują one przede wszystkim w przewodzie pokarmowym, głównie w jelicie cienkim i okrężnicy człowieka, a także zwierząt, tworząc korzystną mikroflorę. Obecnie nie ma wątpliwości, iż zespół mikroorganizmów przewodu pokarmowego oraz pożądana modyfikacja ich składu przy użyciu preparatów i produktów probiotycznych może działać ochronnie przed pojawi- aniem się schorzeń jelitowych oraz wpływać na zwiększenie odporności organizmu (immuno- modulacja). Mechanizm ten warunkowany jest unikalną budową ściany komórkowej bakterii probiotycznych. Zawiera ona na swojej powierzchni wciąż niedocenianie, lecz coraz inten- sywniej badane białka powierzchniowe. Oka- zuje się, że posiadają one szereg właściwości, wpływając na: zdolności adhezyjne do entero- cytów jelit, zmniejszenie aktywności toksyn wydzielanych przez bakterie patogenne i za- hamowanie inwazji niekorzystnej mikroflory.

Do wspomnianych białek powierzchniowych zalicza się enolazę, powszechnie znaną jako enzym szlaku glikolizy. Enolaza jako białko adhezyjne wydzielana jest na zewnątrz komórki i uczestniczy aktywnie w tworzeniu agregatów i adhezji do nabłonka i śluzu jelitowego.

K^laudia Gûstaw, E^wa Hâbza, a^dam wâśKo

funkcyjna struktura, która nie tylko determinuje kształt mikroorganizmów, ale także chroni przed negatywnym wpływem środowiska zewnętrznego. Jest mocna, elas- tyczna i wytrzymała na wahania temperatu- ry i pH. Podsumowując, ściana komórkowa pełni głównie funkcje mechaniczne, ogranicza objętość komórki bakteryjnej i zapobiega jej pęknięciu. Ściana komórkowa bakterii Gram- dodatnich w swojej budowie zawiera głównie polisacharydy, kwasy (lipo-) tejchojowe, pepty- doglikan i białka. Ścianę komórkową od błony komórkowej oddziela sztywna warstwa z sieć peptydoglikanu (mureiny), która zbudowana jest z długich łańcuchów polisacharydow- ych, stabilizowanych przez mostki peptydowe.

Łańcuch polisacharydowy składa się z naprze- miennych jednostek disacharydów kwasu N- acetylomuraminowego i N-acetyloglukozaminy połączonych wiązaniem β-1,4-glikozydow- ym. Ilość mostków peptydowych determinuje stopień usieciowienia tego polimeru, im więcej tym sztywniejsza ściana komórkowa. Zwykle wiązania poprzeczne występują pomiędzy trzecim aminokwasem pierwszego łańcucha, a czwartym drugiego łańcucha najczęściej D-al- aniny. Opisana budowa, a więc gęste usieciowie- nie nadaje sztywność konstrukcji i wytrzymałość na rozciąganie, czyli spełnia funkcje ochronne bakterii (SCHÄFFER I MESSNER, 2005).

Jednakże struktury te są częstym celem czyn- ników przeciwbakteryjnych, antybiotyków i lizozymów.

Warstwa peptydoglikanu ściany komórkowej bakterii kwasu mlekowego jest pokryta wieloma substancjami, gównie kwasem (lipo) tejchojowym. Jest to kolejny ważny po- limer w budowie ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich. Składa się z rybitolu i glic- erolu połączonych grupami fosforanowymi, czasami również z mannitolu, erytriolu lub innych cukrów.

Każdy z wymienionych monomerów połączony jest wiązaniem fosfodiestrowym,

s^tr. 63 - 73

Budowa ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich

Ściana komórkowa bakterii to wielo-

(3)

tworząc fosforany polioli, te zaś łączą się kowalencyjnie ze ścianą komórkową przez mureinę. W przypadku gdy polimery łączą się z lipidami błony poprzez fragment lipidowy, to noszą nazwę kwasów lipotejchojowych. Struk- tura ta w obu przypadkach nadaje kwasom wyjątkowo silny charakter polielektrolityczny.

Poza kwasami tejchojowym i lipotejchojowymi wyróżniamy także kwasu tejchuronowe które są pozbawione reszt fosforanowych, gdzie cukry łączą się wiązaniami glikozydowymi. Dlatego też niezbędnym składnikiem podczas syntezy kwasów tejchojowych jest fosfor, przy braku tego pierwiastka wytwarzane są kwasy tejchuronowe. Polisacharydy związane z bakteryjną ścianą komórki i zewnątrzkomórkowe polisacharydy bakterii kwasu mlekowego są obojętne lub kwasowe (SCHÄR-ZAMMA- RETTI I UBBINK, 2003). Ze względu na ich obfitość i obecność na zewnętrznej powierzchni ściany komórkowej oczekuje się, że polisacharydy pozakomórkowe i związane z ścianą komórkową w dużym stopniu będą określać właściwości powierzchniowe mikro- organizmów. Rodzaj Lactobacillus wydziela znaczące ilości pozakomórkowych polisacha- rydów zwanych egzopolisacharydami (EPS).

Egzopolisacharydy to liniowe biopolimery składające się z węglowodanów połączonych wiązaniami α i β-glikozydowymi. Występują na powierzchni komórek bakteryjnych budując otoczkę (CPS- Capsular Exopolysaccha- ride) lub mogą być wydzielane w postaci śluzu zewnątrzkomórkowo (slime exopolysaccha- ride). Wyróżniamy także tak zwane WPS (Cell Wall Polysaccharide), które związane są z warstwą peptydoglikanu za pomocą wiązań jonowych, bądź kowalencyjnych. Produk- cja egzopolisacharydów przez bakterie kwasu mlekowgo może wywierać wpływ na ich właściwości funkcjonalne w żywności poprzez poprawę reologii fermentowanych produktów mlecznych oraz przynosić korzystne efekty zdrowotne. Przykładowo EPS mają działanie

immunostymulujące (CHABOT I IN., 2001;

JOLLY I IN., 2002). Polimery te zwiększają kolonizację przewodu żołądkowo-jelitowego bakteriami probiotycznymi, oraz działają jak przeciwutleniacze (BADEL I IN., 2011).

Kolejnym rodzajem białek występujących u bakterii Gram-dodatnich jest sześcioaminokwasowy motyw (LPXTGX) zakotwiczony na powierzchni, specyficzny dla sortazy. Pierwszy opis motywu LPXTG został zgłoszony przez SCHNEEWIND I IN. (SCHNEEWIND I IN., 1990). Schara- kteryzowano białko powierzchniowe oporne na trypsynę (T6), bakterii Streptococcus pyogenes. Dopasowanie sekwencji C-końca T6, białka A i kilku innych białek Gram-dodatnich ujawniło zachowanie motywu LPXTG, po którym następował długi odcinek hydro- fobowych i dodatnio naładowanych reszt.

Enzym sortaza rozkłada wiązanie peptydowe między glicyną, a treoniną w końcu kar- boksylowym motywu LPXTG, jednocześnie wiążąc białko w sposób kowalencyjny z pep- tydoglikanem (ŁYSAKOWSKA I IN., 2013).

Motyw LPXTG jest zachowany w sekwencji sygnałowej sortowania wszystkich znanych białek zakotwiczonych w ścianie komórkowej bakterii Gram-dodatnich. Białka powierzchniowe zakotwiczone motywem LPXTG przez enzym sortazę A (SrtA) odpowiadają za adhezję komórki (DAVIES I IN., 2009).

Do białek rozpoznawanych przez sortazę należą homologii: proteinazy, białka wiążącego się z nabłonkiem jelit, białek wiążących śluz, powierzchniowego białka enterokoków, białka wiążącego aglutyninę i białek hipotetycznych.

Do bakteryjnych białek powierzchniowych zaliczane są także adhezyny. W ostatnich latach udało się zidentyfikować wiele białek zaliczanych do tej grupy. Wśród nich można wyróżnić białko MAPP (mucinadhesion-pro- moting protein), które odpowiada za adhezję komórki do śluzówki jelita. Zostało ziden- tyfikowane u bakterii Lactobacillus fermen-

(4)

.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018 WWW.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018 WWW.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018 tum 104R i najprawdopodobniej jest białkiem

oligometrycznym o wielkości 29 kDa. W swojej budowie zawiera łańcuchy polipeptydowe lub podjednostki białkowe, połączone wiązaniami niekowalencyjnymi ze ścianą komórkową.

Kolejnym rodzajem adhezyn jest białkowy czynnik elongacji Tu. Odpowiedzialny jest za stymulację układu odpornościowego w stan- ach zapalnych jelit i adhezję do białek błony śluzowej przewodu pokarmowego. Białko Tu zostało zlokalizowane u bakterii Lactobacillus johnsonie (GRANATO I IN., 2004; ROJAS I IN., 2002).

Gatunek Lactobacillus reuterii 1063 na swojej powierzchni posiada białko o wyjątkowo dużej masie cząsteczkowej, bo sięgającej 352 kDa o nazwie Mub. Przypuszcza się, że tak jak wyżej wymienione białka uczestniczy w adher- encji do ścian jelita. Białko Mub zbudowane jest z powtarzających się podjednostek Mub1 i Mub2 i w swojej budowie zawiera motyw LPQTG odpowiedzialny za kotwiczenie białka do ściany komórkowej. W wielu badaniach potwierdzono występowanie u szczepu bakterii Lactobacillus rhamnosus GG białek piliny lecz ich funkcja nie jest dokładnie poznana, przypuszcza się, że uczestniczą w oddziaływaniach z komórkami gospodarza (ROOS I JONS- SON, 2002; SÁNCHEZ I IN., 2009). Wśród adhezyn bakteryjnych znajdują się także enzymy szlaku glikolitycznego. Jednym z nich jest dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAPDH), która indukuje fosforylację oksydacyjną aldehydu 3-fosfoglicerynowego.

Okazuje się jednak, że enzym ten posiada dodatkową funkcję, związaną z jego obecnością na powierzchni ściany komórkowej. Wykaza- no, iż uczestniczy w adhezji do śluzówki jelita, a także ma możliwość identyfikacji antygenów grupy krwi A i B. Niezrozumiałą dotąd kwestią jest transport tego białka na powierzchnię jak i jego mechanizm kotwiczenia. Drugim enzymem szlaku glikolitycznego, który pełni rolę adhezyny jest α-enolaza. W glikolizie katalizu-

je przemianę 2-fosfoglicerynianu w fosfoenolopirogronian, a jako adhezyna charakteryzuje się dużym powinowactwem do plazminogenu i fibronektyny. Zlokalizowana została na powierzchni Lactobacillus plantarum WCFS1 i osiąga masę cząsteczkową 48 kDa (ANTIKAINEN I IN., 2007b; KINOSHITA I IN., 2008).

Inne enzymy glikolityczne i ich funkcje związane z obecnością na powierzchni komór- ki są dokładnie poznane wśród streptokoków z grupy B, a więc Gram-dodatnich, oportunisty- cznych patogenów człowieka. Przypuszcza się, że fosfofruktokinaza, aldolaza, izomeraza tri- fosforanowa, kinaza fosfoglicerynianowa i fos- fogliceromutaza podobnie jak wyżej opisana enolaza wykazują powinowactwo do plazminogenu, jak również mają zdolność do adhezji do innych gatunków bakterii. Z kolei kinaza pirogronianowa ma możliwość wiązania mucyny, a izomeraza glukozofosforanowa wiąże lipopro- teiny. Jedynym enzymem szlaku glikolizy, który nie został zidentyfikowany na zewnątrz ściany komórkowej bakterii jest heksokinaza (HEN- DERSON I MARTIN, 2011; KINNBY I IN., 2008).

Warstwa S stanowi najliczniejszą grupę białek adhezyjnych, która osiąga około 10-15%

wszystkich białek powierzchniowych bakterii.

Tworzy dwuwymiarową, krystaliczną strukturę, która znajduje się najbardziej na zewnątrz ściany komórkowej. Białka tworzące warstwę S u bakterii z rodzaju Lactobacillus osiągają masę cząsteczkową 25-71 kDa i wyróżniają sie wyso- kim punktem izoelektrycznym w granicach 9,35-10,40, co nadaje im charakter silnie zasa- dowy. Białka warstwy S, a więc głównie glikoproteiny kodowane są przez dwa geny: SlpA i SlpB. Do gatunków zawierających omawianą warstwę należą: L. crispatus, L. gallinarum, L. acidophilus, L. helveticus, L. johnsonii, L.

amylovorus i L. Gasperi (CHEN I IN., 2009;

SLEYTR I BEVERIDGE, 1999).

Oprócz białek związanych na powierzchni ściany komórkowej należy wspomnieć K^laudia Gûstaw, E^wa Hâbza, a^dam wâśKo s^tr. 63 - 73

(5)

o białkach wydzielanych na zewnątrz, które są specyficzne dla receptorów powierzchniowych innych komórek. Głównie są to bakteriocyny lub białka bójcze, które rozpoznają receptory na powierzchni atakowanej komórki. Bakteriocy- ny są peptydami o niskiej masie cząsteczkowej, wykazujące właściwości antybakteryjne, które są skierowane przeciwko gatunkom blisko spokrewnionym (KUMAR I IN., 2016). Do tej pory, zostało opisane kilkaset bakteriocyn.

Wśród bakteriocyn wytwarzanych przez bakterie Gramm-dodatnie, można wyróżnić następujące cztery klasy, I klasa to lantybio- tykii i obejmuje peptydy o masie cząsteczkowej poniżej 5 kDa. Klasa II to grupa nielantybio- tykowych bakteriocyn, które zawierają lantio- nine, o masie cząsteczkowej niższej niż 10 kDa.

Klasa III zawiera bakteriocyny o dużym ciężarze cząsteczkowym powyżej 30 kDa, dzieli się na dwie grupy czyli enzymy hydrolaz peptydog- likanowych oraz grupa nielitycznych przeciwbakteryjnych białek. Klasa IV obejmuje bakteriocyny które dla pełnej aktywności wymagają obecności części lipidu lub węglowodanowej części cząsteczki. Przykładem są glikoproteiny takie jak: leukocyna S. Mechanizm funkc- jonowania bakteriocyn polega na działaniu bakteriobójczym lub statycznym (GWI- AZDOWSKA I IN., 2005).

sumie zbadano 15 genów, z czego 5 należących do genów metabolizmu podstawowego: ef-Tu, eno, gap, groEl, strA, których obecność stwierdzono we wszystkich przebadanych gatunkach.

Pozostałe 10 genów identyfikowano z różną skutecznością, mianowicie geny apf, cnb, fpbA, mapA, mub1, mub2 odnaleziono u 86-100%

baterii kwasu mlekowego użytych w badaniach, a geny cbsA, gtf, msa, slpA jedynie u 0-8%.

Przeprowadzono również badania dotyczące zdolności adhezyjnych 30 wybranych szcz- epów bakterii LAB do enterocytów HT29 i komórek wytwarzających śluz jelitowy HT29- MTX. Miały one na celu wyszukanie szcz- epów posiadających potencjalne właściwości probiotyczne. Metodyka opierała się na reak- cji PCR, w celu identyfikacji wspominanych wyżej 15 genów kodujących białka adhezyjne.

Tak jak poprzednio geny metabolizmu podstawowego stwierdzono we wszystkich szczepach, różnice dotyczyły jednie pozostałych genów.

Geny cnb, mapA, mub1 i mub2 odnaleziono kolejno wśród 94.5%, 86.5%, 96.5% i 95.5%

przebadanych bakterii. Były zaangażowane w adhezję do komórek HT29, Caco-2 i komórek wytwarzających śluz. Aczkolwiek największym potencjałem wiążącym wykazywały się bakterie zawierające gen msa, kodujący adhezyny mannozo-swoiste. Przypuszcza się, iż mogą eliminować mikroflorę patogenną z przewodu pokarmowego na zasadzie konkurencji. Prz- eprowadzone badanie przesiewowe umożliwiło porównanie szczepów bakterii LAB pod względem najlepszych właściwości adhezyjnych, co ma przełożenie we właściwościach probiotycznych. Im więcej adhezyn białkowych znajduje na powierzchni komórki, tym dłużej kolonizuje ona jelita, poprawiając ich funkc- jonowanie (TURPIN I IN., 2012).

Białka „moonlighting”

W teorii jeden gen koduje jedno białko, pełniące tylko jedną funkcję w organizmie.

Biosynteza białek powierzchniowych

Projekt badawczy przeprowadzony w 2012 roku przez WILLIAMS’A, TURPIN’A I IN., dokładnie opisuje mechanizm syntezy białek powierzchniowych odpowiedzialnych za adhezję do śluzu jelitowego. Praca dotyczyła identyfikacji w 163 wybranych szczepach, należących do 7 gatunków bakterii LAB, genów odpowiedzialnych za kodowanie adhezyn białkowych. Gatunki bakterii dobierano bardzo skrupulatnie, tak aby różniły się jak najbardziej między sobą sekwencją genomu. W

(6)

.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018 WWW.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018 WWW.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018 Jednakże w ostatnich latach teoria ta została

obalona, na rzecz doniesień o istnieniu białek wielofunkcyjnych. Są to tak zwane białka

„moonlighting”. Wykazują one wysoki stopień konserwatywności wśród organizmów eukariotycznych i prokariotycznych (JEFFERY, 2009).

Białkami „moonlighting” nazywamy głównie enzymy szlaku glikolizy oraz chaperony, które dodatkowo mogą pełnić funkcję białek powierzchniowych komórki. Szacuje się, że spośród 10 enzymów szlaku glikolizy, aż 7 wykazuje multifunkcjonalność, a pozostałe trzy są w trakcie badań. Związane jest to ze ciągłym i wyso- kim poziomem ekspresji tych białek. Pierwszą proteiną określoną mianem „moonlighting”

przez PIATIGORSKY’EGO I WISTOW’A w roku 1989 była krystalina, która pełni funkcje strukturalne w soczewce kręgowców, a dodatkowo jako α-enolaza funkcje glikoli tyczne (HUBERTS I VAN DER KLEI, 2010).

Termin „moonlighting” dokładnie pre- cyzuje jakie cechy powinno posiadać białko zaliczanej do tej grupy. Przeważnie musi mieć charakter autonomiczny, gdzie poszczególne domeny nie pełnią oddzielnych funkcji tylko działają jako całość. Funkcje białka „moonlighting nie mogą inaktywować się nawzajem.

Mianem „moonlighting” nie można nazwać białek, które pełnią tą samą funkcję w różnych typach komórek, bądź w różnych organel- lach subkomórkowych. Pierwszym opisanym białkiem typu „moonlighting” w przypadku prokariotów była dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAPDH), która jest enzymem szlaku glikolizy oraz adhezyną białkową. Do badań nad aktywnością GAP- DH wykorzystano bakterie Streptococcus pyogenes (PANCHOLI I FISCHETTI, 1992).

Natomiast wśród bakterii Gram-dodatnich udało się scharakteryzować około 40 białek typu „moonlighting”, przykładowo: czynnik wydłużania Tu, białko szoku cieplnego GroEL, kinaza i oksydaza pirogronianowa, mutazafos- foglicerynianowa, syntetaza glutaminowa, al-

dolaza (KAINULAINEN I IN., 2012).

Enolaza, jako białko

„moonlighting”

Enolaza została po raz pierwszy opisana w 1934 roku i znana jest głównie jako enzym szlaku glikolizy. W odwracalny sposób katali- zuje przedostatnią reakcję szlaku Embdena- Meyerhofa-Parnasa, powodując dehydratację 2-fosfoglicerynianu w fosfoenolopirogronian.

Struktura enolazy stabilizowana jest przez jony magnezu, dlatego zaliczana jest do met- alooenzymów. Wśród organizmów prokariotycznych i eukariotycznych wykazuje wysoki stopień konserwatywności aminokwasowej jak również nukleotydowej, na poziomie około 40- 90% (SEWERYN I IN., 2007). W komórkach eukariotycznych enolaza zbudowana jest z homo-, bądź heterodimerów utworzonych z monomerów α, β, γ. W przypadku organizmów prokariotycznych, enolaza występuje w postaci dimerów lub oktamerów utworzonych tylko z podjednostki α. Budowa strukturalna enolazy jest cechą gatunkową podobnie jak masa cząsteczkowa i liczba genów które ją kodują.

W zależności od organizmu może występować jeden gen odpowiedzialny za syntezę enolazy (eno) lub aż trzy, czego przykładem jest Lac- tobacillus johnsonii (ANTIKAINEN I IN., 2007a). Z kolei masa cząsteczkowa dla gatunku Lactobacillus osiąga wielkość 46-48kDa.

Opisanie enolazy jako białka „moonlighting” rozpoczęło się w momencie, gdy poza cytozolem zaobserwowano jej obecność na powierzchni komórek organizmów prokariotycznych i eukariotycznych. Wiele wskazuje na to, iż w organizmie ludzkim enolaza może pełnić dodatkowe nieenzymatyczne funkcje, wynikające z jej zakotwiczenia w ścianie komórkowej jako: białko szoku cieplnego, białko stresu hipoksyjnego (HAPs), negaty- wny regulator protoonkogenu c-myc, ligand łączący estry cholesterolu i receptor plazmino- K^laudia Gûstaw, E^wa Hâbza, a^dam wâśKo s^tr. 63 - 73

(7)

genu (FEO I IN., 2000; SEWERYN I IN., 2007). Obecność enolazy na powierzchni komórek prokariota stwierdzono po raz pierwszy na streptokokach. Badania dotyczyły zdolności wiązania plazminogenu ludzkiego przez bakterie Streptococcus pyogenes, jako jeden z mechanizmów ich inwazyjności, który ułatwia kolonizację zaatakowanego organizmu.

Plazminogenem określa się białko wydzielane do osocza, jako nieaktywny prekursor plazmi- ny. Okazało się, że za wiązanie plazminogenu na powierzchni komórek patogenów odpowiada nie tylko C-końcowa reszta lizyny (BS1) w monomerze enolazy, ale także nanopeptyd 248FYDKERKVY256, nazwany obszarem BS2. Wykazywał on znacznie większe powinowactwo do plazminogenu, niż motyw BS1 (BERGMANN I IN., 2004). Właściwości enolazy opierają się głównie na mechanizmie wiązania przez nią plazminogenu i dotyczą w większości bakterii patogennych Gram-dodatnich, a ostatnio dodatkowo Gram- ujem- nych z rodziny Enterobacteriaceae (WIT- KOWSKA I IN., 2005). Okazuje się jednak, że enolaza jako białko powierzchniowe bakterii kwasu mlekowego może wywierać korzystne efekty zdrowotne dla gospodarza. Po pierwsze wpływa na adhezję do ścian jelita, co powoduje efektywną i dłuższą kolonizację, a po drugie wpływa na koagregację bakterii probiotycznych z chorobotwórczymi (ANTI- KAINEN I IN., 2007b). Transport enolazy z cytoplazmy komórki na jej powierzchnię nie został całkowicie poznany, gdyż w białku nie odnaleziono sekwencji sygnałowej, która pow- inna znajdować się na N-końcu cząsteczki. W białku nie zidentyfikowano również domeny dokującej, typowej dla białek zakotwiczonych w ścianie komórkowej. Przypuszcza się, że za migrację enolazy na powierzchnię odpowiada wewnętrzna sekwencja sygnałowa 33AAVPS- GASTGIY44 utworzona z reszt aminokwasów N-końcowej domeny hydrofobowej. Z kolei asocjacja ze ścianą komórkową bez sekwencji

dokujących może zachodzić w wyniku potranslacyjnej asocjacji (REDLITZ I IN., 1995).

Niewielkie zmiany w sekwencji aminokwasowej tego samego białka powodują całkowite zmiany w pełnionych przez niego funkcjach. Przykładem jest białko GroEL, które w larwach mrówkolwów funkcjonuje jako silna toksyna wytwarzana przez Entero- bacter aerogenes, a już u bakterii E. coli pełni funkcję białka opiekuńczego. Różnice w sekwencji aminokwasowej dotyczą jedynie 11 podjednostek z czego tylko 4 odpowiadają za toksyczność u Enterobacter aerogenes. Zatem wystarczy zmiana tylko kilku aminokwasów w sekwencji białka, a już pełni ono całkowicie inną funkcję (HUBERTS I VAN DER KLEI, 2010). Poszerzanie wiedzy na temat białek

„moonlighting” może przyczynić się w efekty- wnym wyborze docelowych składników leków.

Inhibicja jednej z funkcji w trakcie produkcji farmaceutyków może spowodować wytworze- nie leku zawierającego potencjalną toksynę.

Dlatego też, w analizie budowy białka, a przez to mechanizmu jego działania może posłużyć krystalografia rentgenowska (JEFFERY, 2009).

Adhezja u bakterii z rodzaju Lactobacillus

Z biologicznego punktu widzenia, adhezją nazywamy zintegrowanie się komór- ki mikroorganizmu z powierzchnią ciała stałego. Temu zjawisku poświęcono wiele badań, które dotyczyły adhezji do powierzchni skóry, implantów, zębów, gleby, osadu czyn- nego, urządzeń, produktów spożywczych itd.

Analizy dowiodły, że część zjawisk z wyżej wymienionych powinno uznać się za zjawiska niekorzystne, wywołujące: zakażenia szpitalne, korozję mikrobiologiczną i skażenia żywności.

Jednak większość wykazuje charakter korzyst- ny, wpływając na: tworzenie próchnicy w glebie, kolonizację jelit i pożądaną fermentację pasz i

(8)

.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018 WWW.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018 WWW.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018 żywności (FLINT I IN., 2000). Właściwości

adhezyjne bakterii z rodzaju Lactobacil- lus należą do najbardziej pożądanych cech tych mikroorganizmów, bowiem wpływają na ich efektywną i trwałą kolonizację jelit. Zro- zumienie mechanizmów odpowiadających za adhezję stanowi podstawowy temat prac naukowych w tej dziedzinie. Pierwszą teorią wyjaśniającą interakcje towarzyszące pro- cesowi adhezji była teoria DLVO, pochodząca od nazwisk autorów, Derjaguin, Landau, Ver- wey, Overbeek. Założenie DLVO początkowo zostało sformułowane dla mechanizmu adhezji kolodiów, jednakże okazało się równie trafne dla określenia procesu adhezji drobnoustrojów.

Stwierdzono, że w tym procesie najistotniejsze znaczenie mają dwa rodzaje oddziaływań:

przyciągające siły van der Waalsa i odpychające oddziaływania elektrostatyczne, które decydują o zbliżeniu komórki do powierzchni i utworze- niu wiązań chemicznych (HERMANSSON, 1999).

Zdolności adhezyjne w dużej mierze zależą od kształtu komórki i obecności na jej powierzchni struktur w postaci rzęsek lub fim- brii. Okazało się, że organizmy posiadające najmniejszy promień w miejscu styku z powierzchnią, cechują się najlepszą adhezją, a więc są to organizmy o wydłużonych kształtach jak np. pałeczki z rodzaju Lactobacillus. Teo- ria DLVO kilka lat później została rozszer- zona przez VAN OSS’A. Dowiódł on, że na proces adhezji duży wpływ mają oddziaływania hydrofobowe i ruchy Browna, a założenie nosi nazwę XDLVO. Dodatkowo istotne znaczenie w połączeniu mikroorganizmu z powierzchnią danego ciała mają białkowe adhezyny znajdujące się na powierzchni bakterii. W przewodzie pokarmowym wiążą się one swoiście z rozpoznawanymi receptorami en- terocytów i śluzu jelitowego. Istotne znaczenie mają także polimerowe wydzieliny komórkowe tworzące otoczkę. Zawierają głównie polisacharydy, lipopolisacharydy, kwasy uronowe i

glikoproteiny (AZEREDO I IN., 1999).

Podsumowanie

Obecnie trudno jest zidentyfikować w organizmie zarówno eukariotycznym jak i pro- kariotycznym wszystkie białka „moonlighting”.

Jednakże zostały poczynione duże postępy w zrozumieniu drogi syntezy i późniejszej obrób- ki potranslacyjnej tych białek. Dalsze badania białek „moonlighting” są całkowicie uzasad- nione, gdyż umożliwią nam zrozumienie istoty białka, jego funkcji, drogi ewolucji i poziomu złożoności w komórce (JEFFERY, 2003).

Białka „moonlighting” są zjawiskiem, który ilustruje pomysłowość i złożoność natury.

Okazuje się bowiem, iż niewielkie zmiany w sekwencji aminokwasowej tego samego białka powodują całkowite zmiany w pełnionych przez niego funkcjach.

Literatura

ANTIKAINEN J., KUPANNEN V., LÄH- TEENMÄKI K., KORHONEN T. K. 2007a.

pH-dependent association of enolase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase of Lactobacillus crispatus with the cell wall and lipoteichoic acids. Journal of Bacteriology. 189, 4539–4543.

ANTIKAINEN J., KUPARINEN V., LÄH- TEENMÄKI K., KORHONEN T. K. 2007b.

Enolases from Gram-positive bacterial patho- gens and commensal lactobacilli share functional similarity in virulence-associated traits.

FEMS Immunology and Medical Microbiol- ogy. 51, 526–534.

AZEREDO J., VISSER J., OLIVEIRA R.

1999. Exopolymers in bacterial adhesion: In- terpretation in terms of DLVO and XDLVO theories. Colloids and Surfaces B: Biointerface K^laudia Gûstaw, E^wa Hâbza, a^dam wâśKo s^tr. 63 - 73

(9)

s 14, 141–148.

BADEL S., BERNARDI T., MICHAUD P.

2011. New perspectives for Lactobacilli exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 29, 54–66.

BERGMANN S., ROHDE M., CHHAT- WAL G. S., HAMMERSCHMIDT S. 2004.

Characterization of plasmin(ogen) binding to Streptococcus pneumoniae. Indian Journal of Medical Research, Supplement. 119, 29–32.

CHABOT S., YU H.L., DE LÉSÉLEUC L., CLOUTIER D., VAN CALSTEREN M.

R., LESSARD M., ROY D., LACROIX M., OTH D. 2001. Exopolysaccharides from Lac- tobacillus rhamnosus RW-9595M stimulate TNF, IL-6 and IL-12 in human and mouse cultured immunocompetent cells, and IFN- in mouse splenocytes. Le Lait. 81, 683–697.

CHEN X., CHEN Y., LI X., CHEN N..

FANG W. 2009. Characterization of surface layer proteins in Lactobacillus crispatus isolate ZJ001. Journal of Microbiology and Biotech- nology. 19, 1176–1183.

DAVIES J. R., SVENSÄTER G., HERZ- BERG M. C. 2009. Identification of novel LPXTG-linked surface proteins from Strep- tococcus gordonii. Microbiology. 155, 1977–

1988.

FEO S., ARCURI D., PIDDINI E., PASSAN- TINO R., GIALLONGO A. 2000. ENO1 gene product binds to the c-myc promoter and acts as a transcriptional repressor: Relationship with Myc promoter-binding protein 1 (MBP- 1). FEBS Letters. 473, 47–52.

FLINT S. H., BROOKS J. D., BREMER P. J.

2000. Properties of the stainless steel substrate, influencing the adhesion of thermo-resistant

streptococci. Journal of Food Engineering. 43, 235–242.

GRANATO D., BERGONZELLI G. E., PRIDMORE R. D., MARVIN L., ROUVET M., CORTHÉSY-THEULAZ I. E. 2004.

Cell Surface-Associated Elongation Factor Tu Mediates the Attachment of Lactobacillus johnsonii NCC533 (La1) to Human Intestinal Cells and Mucins. Infection and Immunity. 72, 2160–2169.

GWIAZDOWSKA D., TROJANOWSKA K.

2005. Bakteriocyny – właściwości i aktywność przeciwdrobnoustrojowa. Biotechnologia. 1, 114–140.

HENDERSON B., MARTIN A. 2011. Bac- terial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infection and Immunity. 79, 3476–3491.

HERMANSSON M. 1999. The DLVO theo- ry in microbial adhesion. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 14, 105–119.

HUBERTS D. H. E. W., VAN DER KLEI I. J. 2010. Moonlighting proteins: An intrigu- ing mode of multitasking. Biochimica et Bio- physicaActa - Molecular Cell Research. 1803, 520–525.

JEFFERY C. J. 2003. Moonlighting proteins:

Old proteins learning new tricks. Trends in Genetics. 19, 415–417.

JEFFERY C. J. 2009. Moonlighting proteins—

an update. Molecular BioSystems. 5, 345-350.

JOLLY L., VINCENT S. J. F., DUBOC P., NEESER J. R. 2002. Exploiting exopolysaccharides from lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, International Journal of Gener-

(10)

.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018 WWW.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018 WWW.NAUKOWCY.ORG.PL 3 (21)/2018 al and Molecular Microbiology. 82, 367–374.

KAINULAINEN V., LOIMARANTA V., PEKKALA A., EDELMAN S., ANTI- KAINEN J., KYLVÄJÄ R., LAAKSONEN M., LAAKKONEN L., FINNE J., KORHO- NEN T. K. 2012. Glutamine synthetase and glucose-6-phosphate isomerase are adhesive moonlighting proteins of Lactobacillus crispatus released by epithelial cathelicidin LL-37.

Journal of Bacteriology. 194, 2509–2519.

KINNBY B., BOOTH N. A., SVENSÄTER G. 2008. Plasminogen binding by oral streptococci from dental plaque and inflammatory lesions. Microbiology. 154, 924–931.

KINOSHITA H., UCHIDA H., KAWAI Y., KAWASAKI T., WAKAHARA N., MAT- SUO H., WATANABE M., KITAZAWA H., OHNUMA S., MIURA K., HORII A., SAITO T. 2008. Cell surface Lactobacillus plantarum LA 318 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) adheres to human colonic mucin. Journal of Applied Mi- crobiology. 104, 1667–1674.

KUMAR V., SHEORAN P., GUPTA A., YADAV J., TIWARI S. K. 2016. Antibacterial property of bacteriocin produced by Lactobacil- lus plantarum LD4 isolated from a fermented food. Annals of Microbiology. 66, 1431–1440.

ŁYSAKOWSKA M., BIGOS M., WASIELA M. 2013. Budowa, regulacja i znaczenie czyn- ników wirulencji szczepów Streptococcus aga- lactiae. Postepy Mikrobiologii. 52, 41–52.

PANCHOLI V., FISCHETTI V. A. 1992. A major surface protein on group A streptococci is a glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase with multiple binding activity. The Journal of experimental medicine. 176, 415–26.

REDLITZ A., FOWLER B. J., PLOW E. F., MILES L. A. 1995. The Role of an Enolase Related Molecule in Plasminogen Binding to Cells. European Journal of Biochemistry. 227, 407–415.

ROJAS M., ASCENCIO F., CONWAY P.

L. 2002. Purification and characterization of a surface protein from Lactobacillus fermen- tum 104R that binds to porcine small intestinal mucus and gastric mucin. Applied and environ- mental microbiology. 68, 2330–6.

ROOS S., JONSSON H. 2002. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lacto- bacillus reuteri 1063 adheres to mucus compo- nents. Microbiology. 148, 433–442.

SÁNCHEZ B., SCHMITTER J. M., UR- DACI M. C. 2009. Identification of novel proteins secreted by Lactobacillus rhamnosus GG grown in de Mann-Rogosa-Sharpe broth. Let- ters in Applied Microbiology. 48, 618–622.

SCHÄFFER C., MESSNER P. 2005. The structure of secondary cell wall polymers: How Gram-positive bacteria stick their cell walls to- gether. Microbiology. 151, 643–651.

SCHÄR-ZAMMARETTI P., UBBINK J.

2003. The Cell Wall of Lactic Acid Bacteria:

Surface Constituents and Macromolecular Conformations. Biophysical Journal. 85, 4076–

4092.

SCHNEEWIND O., JONES K. F., FISCH- ETTI V. A. 1990. Sequence and structural characteristics of the trypsin-resistant T6 surface protein of group A streptococci. Journal of Bacteriology. 172, 3310–3317.

SEWERYN E., PIETKIEWICZ J., SZAM- BORSKA A., GAMIAN A. 2007. Enolase on the surface of prockaryotic and eukaryotic cells K^laudia Gûstaw, E^wa Hâbza, a^dam wâśKo s^tr. 63 - 73

(11)

is a receptor for human plasminogen. Postȩpy Higieny I Medycyny Doświadczalnej. 61, 672–

682.

SLEYTR U. B., BEVERIDGE T. J. 1999.

Bacterial S-layers. Trends in Microbiology. 7, 253–260.

TURPIN W., HUMBLOT C., NOORDINE M. L., THOMAS M., GUYOT J. P. 2012. Lac- tobacillaceae and cell adhesion: Genomic and functional screening. PLoS ONE. 7, 38034.

WITKOWSKA D., PIETKIEWICZ

J., SZOSTKO B., DANIELEWICZ R., MASŁOWSKI L., GAMIAN A. 2005. Anti- bodies against human muscle enolase recognize a 45-kDa bacterial cell wall outer membrane enolase-like protein. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 45, 53–62.