[2020/Nr 8] Chemiczne odciski palca w analizie i ocenie jakości produktów roślinnych

(1)

Chemiczne odciski palca w analizie i ocenie jakości produktów roślinnych

Agata Walkowiak

¹

, Bogumiła Kupcewicz

¹

1 Katedra Chemii Nieorganicznej i Analitycznej, Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy, Polska

Farmacja Polska, ISSN 0014-8261 (print); ISSN 2544-8552 (on-line)

Chemical fingerprints in the analysis and quality assessment of plant products

Recently, many people have shown a growing interest in different kinds of herbal products perceived them as safe and harmless. The pharmaceutical market offers a wide range of these products, but it must be stated that not all the products are good quality. Strong competition, as well as an increasing need for quality control makes the traditional analytical methods less attractive. Therefore, the better and faster screening methods which facilitate quality control are still desirable.

Since the quality of such a preparation depends on many components of the sample, it requires a global approach. A chemical fingerprint of such a sample is a comprehensive, distinctive chemical profile of a plant product that can be used to assess the quality, identification, and authentication of the herbal product.

Most often, such fingerprint is obtained by spectroscopic or chromatographic techniques combined with chemometric methods. The aim of the article is to review the fingerprint methods in combination with multidimensional methods of data analysis used in the examination of authenticity and confirmation of the geographical origin of selected plant products such as herbs, spices and medicinal plants. Among the spectroscopic techniques, most often in the field of plant analysis, near (NIR) and mid (MIR) infrared, Fourier transform infrared (FTIR) and attenuated total reflection (ATR), Raman and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy are used. Whereas among the chromatographic techniques most often chosen for fingerprint analysis are high performance liquid (HPLC) or thin- layer (HPTLC) chromatography. Interpretation of chromatographic fingerprints is relatively simpler, but spectroscopic analyzes are less time-consuming, cheaper and do not require labor-intensive sample preparation processes. Recently has published a beneficial modification of correlation spectroscopy intended for the comparison of a pair of spectra, called two-trace two-dimensional correlation spectroscopy (2T2D-COS). FTIR spectroscopy and two-dimensional correlation spectroscopy has become a useful tool for qualitative analysis of plant samples.

A lot of papers on the use of fingerprint methods in combination with chemometric tools have been published recently and it seems that they can become an effective and convenient tool for controlling the quality of plant raw materials.

Keywords: spectroscopy, chromatography, chemometrics, fingerprint, plant products.

Agata Walkowiak, Katedra Chemii Nieorganicznej i Analitycznej, Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy, Jurasza 2, Bydgoszcz, 85-089, Bydgoszcz, Polska;

e-mail: agatawalkowiak1991@gmail.com

Źródła finansowania

Artykuł powstał przy wsparciu finansowym Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, Mikołaja Kopernika w Toruniu (MN-SDF/7/WF/ 2019 oraz PDB 514).

Konflikt interesów:

Nie istnieje konflikt interesów.

Otrzymano: 2020.08.23 Zaakceptowano: 2020.09.24 Opublikowano on-line: 2020.09.28

DOI

10.32383/farmpol/127825

ORCID

Agata Walkowiak

(ORCID id: 0000-0002-7029-859X) Bogumiła Kupcewicz

(ORCID id: 0000-0002-4480-7338)

Copyright

To jest artykuł o otwartym dostępie, na licencji CC BY NC

https://creativecommons.org/licenses/

by-nc/4.0/

(2)

Wstęp

Od najdawniejszych czasów człowiek czerpał ze świata roślin i to w nim szukał pomocy w walce z wieloma chorobami. Wszystko zmieniło się, kiedy w pierwszej połowie XX w. nastąpił inten- sywny rozwój chemii, a wraz z nim rozwój leku syntetycznego. O dynamice tego rozwoju może świadczyć fakt, że w 1872 r. Farmacopea Germa- nica zawierała 13 preparatów otrzymanych dzięki Wykaz skrótów

• 2D-COS – Two-dimensional Correlation Spectroscopy, dwuwymiarowa spektroskopia korelacyjna;

• 2T2D-COS – Two-Trace Two-dimensional Correlation Spectroscopy, dwuśladowa dwuwymiarowa (spektroskopia korelacyjna);

• ATR – Attenuated Total Reflectance, całkowite osłabione odbicie;

• CA – Cluster Analysis, analiza skupień;

• FTIR – Fourier Transform Infrared Spectroscopy, spektroskopia w podczerwieni z transformatą Fouriera;

• HPTLC – High-Performance Thin Layer Chromatography, wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa;

• HPLC-PDA – High-Performance Liquid Chromatography with Photodiode Array, wysokosprawna chromatografia cieczowa z detektorem z matrycą diodową;

• HPLC-MS – High-Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry, wysokosprawna chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas;

• IR – Infra-Red, podczerwień;

• iPLS-DA – interval PLS-DA, PLS-DA z przedziałową selekcją zmiennych;

• kNN – k-Nearest Neighbours, k-najbliższych sąsiadów;

• LDA – Linear Discriminant Analysis, liniowa analiza dyskryminacyjna;

• MIR – Mid Infrared, podstawowa podczerwień;

• MLR – Multiple Linear Regression, wielokrotna regresja liniowa;

• NIR – Near-Infrared, bliska podczerwień;

• NMR – Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego;

• OPLS-DA – Orthogonal partial least squares discriminant analysis, analiza dyskryminacyjna zmiennych ortogonalnych metodą cząstkowych najmniejszych kwadratów;

• PCA – Principal Component Analysis, analiza składowych głównych;

• PLS – Partial Least Squares (regression), (regresja) metodą cząstkowych najmniejszych kwadratów;

• PLS-DA – Partial Least Square Discriminant Analysis, metoda cząstkowych najmniejszych kwadratów połączona z analizą dyskryminacyjną;

• SIMCA – Soft Independent Modelling of Class Analogies, metoda modelowania indywidualnych grup;

• SO-PLS – Sequential and Orthogonalized Partial Least Square, sekwencyjna i zortogonalizowana metoda częściowych najmniejszych kwadratów;

• SO-CovSel – Sequential and Orthogonalized Covariance Selection, sekwencyjny i ortogonalizowany wybór kowariancji;

• SPA-LDA – Successive Projections Algorithm - Linear Discriminant Analysis, algorytm kolejnych prognoz połączony z liniową analizą dyskryminacyjną;

• TLC– Thin Layer Chromatography, chromatografia cienkowarstwowa;

• UV-Vis – Ultraviolet-Visible, (zakres) ultrafioletu oraz światła widzialnego.

syntezie przemysłowej, a w roku 1910 już ponad 300. Medycyna „zachodnia” stała się skutecznym narzędziem w leczeniu chorób człowieka i popra- wie jakości życia. Natomiast ziołolecznictwo stało się „medycyną alternatywną”, a roślin używa się niestety częściej w produkcji suplementów diety niż leków [1].

Kontrola jakości jest podstawowym aspektem wytwarzania wszystkich produktów, jednak preparaty roślinne wymagają wprowadzenia szcze- gólnych procedur.

Zarówno Dobra Praktyka Rolnicza (Good Agricultural Practice, GAP) jak i Dobra Prak- tyka Wytwarzania (Good Manufacturing Prac- tice, GMP) to zbiory wytycznych, których celem jest zapewnienie bezpieczeństwa i wysokiej jako- ści wytwarzanych produktów, także ziołowych.

W przeciwieństwie do syntetycznych środków leczniczych, produkty ziołowe zawierają nie- rzadko setki związków chemicznych o synergi- stycznym działaniu, a na ich ilość mają wpływ geograficzne i sezonowe warunki środowiskowe takie jak: nawodnienie, czas siewu i zbioru, liczbę słonecznych dni w trakcie okresu wegetacyjnego.

Ponadto, surowiec nie powinien zawierać domieszek innych roślin bądź innych części tej samej rośliny. Niezmiernie ważnym etapem jest także ekstrakcja takiego surowca, tylko prowadzona we właściwy sposób zagwarantuje obecność prozdro- wotnych składników w odpowiedniej ilości oraz eliminację szkodliwych związków. [2] Niestety w Polsce tylko niewielka liczba suplementów diety dostępnych na rynku jest badana pod kątem bez- pieczeństwa ich stosowania, a przede wszystkim obecności substancji niezadeklarowanych w skła- dzie danego preparatu. Dla farmaceutów bardzo ważna jest świadomość braku stosownych badań jakościowych roślinnych suplementów diety, która uniemożliwia im dokonanie jednoznacznej oceny ich wpływu na organizm człowieka oraz potencjalnego ryzyka wystąpienia działań niepożąda- nych związanych z ich stosowaniem.

Wykorzystanie ziołowych surowców do produkcji preparatów leczniczych czy suplemen- tów diety wywołuje więc potrzebę zastosowania zaawansowanych technik analitycznych do oceny ich jakości. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) przyjęła analizę chemicznych odcisków palca (ang.

fingerprint) jako metodologię oceny jakości ziół oraz oceny bezpieczeństwa produktów ziołowych.

Chemiczny odcisk palca przedstawia komplek- sowy profil produktu roślinnego i stosowany jest w celu oceny jakości, identyfikacji, uwierzytel- nienia oraz specyfikacji taksonomicznej produktu ziołowego. Charakterystyczny profil chemiczny rośliny najczęściej uzyskuje się technikami spek- troskopowymi lub chromatograficznymi. Jednak

(3)

dopiero połączenie danych z analizy chemicznej z metodami chemometrycznymi wyodręb- nia informacje przydatne dla badania autentycz- ności lub wykrywania obecności niepożądanych składników. Najczęściej stosowane w tym celu wielowymiarowe techniki analizy danych można podzielić na dwie grupy: bez nadzoru (eksplo- racyjne) – analiza głównych składowych (PCA) oraz hierarchiczna analiza skupień (HCA) i analizy nadzorowane (dyskryminacyjne) – liniowa analiza dyskryminacyjna (LDA), k-najbliższych sąsiadów (KNN) lub analiza dyskryminacyjna zmiennych ortogonalnych metodą cząstkowych najmniejszych kwadratów (OPLS-DA), i wiele innych, które często są nowatorskim połączeniem lub mody- fikacją dobrze znanych metod. Podejście oparte na fingerprintach w połączeniu z analizą chemo- metryczną staje się potężnym narzędziem kontroli jakości preparatów roślinnych dostępnych na rynku farmaceutycznym. W latach 2018–

2020 ukazało się wiele prac przeglądowych doty- czących połączenia metod fingerprint z analizą chemometryczną [3, 4, 5, 6].

Celem artykułu jest przegląd metod fingerprint (spektroskopowych i chromatograficznych) stosowanych w badaniu autentyczności oraz potwier- dzenia pochodzenia geograficznego wybranych produktów pochodzenia roślinnego (ziół, przy- praw) w połączeniu z technikami chemometrycznymi.

Problem jakości preparatów roślinnych

Jedynie nieznaczna część preparatów roślin- nych jest zarejestrowana jako produkty lecznicze i posiada udokumentowaną jakość oraz dowie- dzioną skuteczność i bezpieczeństwo stosowania.

Pozostała część to suplementy diety lub zioła, które nie wymagają badań dotyczących skuteczności, a zapewnienie jakości i jej kontrola jest mniej efek- tywna. Długa historia ziołolecznictwa daje fałszywe poczucie bezpieczeństwa i niskiego ryzyka wystę- powania działań niepożądanych po zastosowaniu różnych produktów pochodzenia roślinnego, nie tylko leków roślinnych. Tymczasem niewła- ściwe działania związane z produkcją przemysłową mogą prowadzić do celowego bądź niecelowego zastępowania deklarowanych roślin leczniczych zupełnie innymi, z powodu niewłaściwej identyfikacji, deficytu w zasobach oryginalnego surowca bądź przyczyn ekonomicznych, gdy zamiast droż- szego surowca wybierany jest inny – tańszy, ale jednocześnie bardziej niebezpieczny dla zdrowia.

Podobieństwa taksonomiczne, fizykochemiczne i sensoryczne są wykorzystywane do podrabia- nia oryginalnych produktów, w wyniku dążenia do zwiększonego wpływu na organizm i szybszego

działania – dodatkiem „adulterantów” (ang. adul- terants), czyli niezadeklarowanych w składzie syn- tetycznych substancji bądź celowo zwiększonej ilo- ści znajdujących się w składzie surowca roślinnego związków [7]. Wykryte zafałszowania tego rodzaju jest oceniane jako naruszenie prawa żywnościo- wego UE [8]. Ze względu na zmiany geograficzne i sezonowe oraz na warunki środowiskowe, skład chemiczny aktywnych związków roślinnych także może się zmieniać. Na zawartość metabolitów może również wpływać wiele innych czynników, w tym dojrzałość (okres zbioru), procesy suszenia i prze- chowywanie. W tym względzie na jakość surow- ców, toksyczność i skuteczność działania roślin mogą wpływać zarówno warunki naturalne, jak i warunki przetwarzania [9, 10]. Gotowe preparaty zaś mogą być skażone ciężkimi metalami, pesty- cydami, mikroorganizmami i toksynami [11].

Każdy produkt pochodzenia roślinnego powinien być prawidłowo oznakowany, zwłaszcza w odnie- sieniu do listy użytych składników, metody ekstrakcji czy użytych rozpuszczalników, ponadto powinno być znane geograficzne pochodzenie surowca roślinnego. Świadomość konsumentów na ten temat zwiększa się, co wśród producentów wywołuje konieczność kontroli i uczciwość. Oszu- stwa powodują, że konsumenci tracą zaufania do produktu danego producenta, jednak najpoważ- niejszym problemem fałszowania jest zagrożenie dla zdrowia konsumentów, zwłaszcza w przypadku tańszych zamienników o działaniu alergizującym lub toksycznym lub obecności w składzie produktu niedeklarowanych substancji chemicznych [12].

Metody fingerprint i metody

chemometryczne w analizie produktów roślinnych

Ocena próbek o złożonym składzie chemicznym, takich jak produkty ziołowe, stanowi nie- wątpliwie wyzwanie dla chemii analitycznej.

Jakość takiego preparatu zależy od wielu skład- ników próbki i dlatego wymaga globalnego podej- ścia. Ponadto, wciąż rosnąca popularność metod chemometrycznych wspomagających eksplora- cję, klasyfikację i interpretację dużych macierzy danych przyczynia się do coraz częstszego stosowania technik analitycznych, będących źródłem złożonych sygnałów analitycznych, tzw. metod fingerprint. Podobnie jak w przypadku wykorzystania odcisków palców człowieka do rozpoznawa- nia ludzi, tak i w przypadku instrumentalnych fin- gerprintów produktów roślinnych ich ocena często opiera się na sprawdzeniu, czy sygnał jest zgodny z sygnałem odniesienia. Dlatego praktyczne zastosowanie, np. w wykrywaniu zafałszowań, wymaga ustalenia instrumentalnego odcisku palca, który

(4)

jest charakterystyczny dla produktu autentycznego, niezafałszowanego.

Właściwy wybór techniki analitycznej zależy od właściwości składników próbki oraz rodzaju materiału roślinnego. Do najczęściej wybieranych należą techniki spektroskopowe oraz chromatograficzne. Ogólny schemat postępowania pokazuje rycina 1.

Metody spektroskopowe

Do technik spektroskopowych znajdują- cych zastosowanie w analizie materiału roślin- nego można zaliczyć spektroskopię w bliskiej (NIR) i podstawowej podczerwieni (MIR) z trans- formatą Fouriera (FTIR), spektroskopię Ramana oraz magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Takie spektralne odciski palca zyskują coraz więk- sze zainteresowanie w dziedzinie metabolomiki i chemo-taksonomii roślin, a także do potwier- dzania ich autentyczności czy pochodzenia geograficznego. Analiza fingerprintów, zwłaszcza w połą- czeniu z metodami chemometrycznymi, może dostarczyć użytecznych informacji o składzie bio- chemicznym, strukturze i interakcjach w próbce.

Metody te nie są czasochłonne, rzadko wymagają przygotowania próbki przed analizą czy używa- nia drogich i toksycznych odczynników w porów- naniu z klasycznymi metodami analitycznymi [6].

Jedną z najbardziej powszechnych i niedrogich technik analitycznych używanych w rutynowej analizie jest spektroskopia w zakresie nadfioletu

i światła widzialnego (UV-Vis). W połączeniu z analizą chemometryczną spektroskopia UV-Vis wykorzystana została do oceny pochodzenia geograficznego lub autentyczności produktów roślin- nych. Przykładem wykorzystania tej techniki jest praca, w której wykorzystano widma UV-Vis, flu- orescencyjne oraz wielowymiarowe metody analizy danych do badania komercyjnie dostępnych kaw. Większość to ziarna Coffea arabica i Cof- fea canephora var. robusta lub ich mieszanki.

Niestety, ze względu na wysoką cenę Coffea arabica w porównaniu z Coffea canephora var. robusta, w produktach z etykietą 100% Coffea arabica występują niezadeklarowane dodatki tańszych gatunków lub odmian kaw. Aby zredukować wielo- wymiarowość danych, zastosowano analizę głów- nych składowych, natomiast w celu obliczenia stężenia niezadeklarowanego dodatku, zastosowano modele wielokrotnej regresji liniowej (MLR).

Analiza PCA-LDA dla danych łączonych (wyniki pomiarów absorbancji i intensywności fluore- scencji) wykazała, że metoda ta pozwala osiąg- nąć ponad 96% prawidłowych klasyfikacji w zbiorze testowym i 100% prawidłowych klasyfikacji w zbiorze uczącym [13]. Drugim najczęściej spo- żywanym napojem bezalkoholowym na świecie (po wodzie) jest herbata. Rodzaje herbat (biała, żółta, zielona, oolong, czarna i Pu-ehr) zasadniczo róż- nią się chociażby pod względem zakresu fermen- tacji. Na światowych rynkach konkretne pochodzenie geograficzne tej rośliny może uzasadniać Rycina 1.Ogólny schemat analizy chemicznej fingerprint oraz metod chemometrycznych używany do badań materiału roślinnego.

Figure 1. The general analytical workflow and the chemometric tools used in the fingerprinting of plant material.

(5)

ceny wyższe od przeciętnych. Na przykład słynne logo „Lion” oznaczające „Ceylon” lub „Sri” Her- baty lankijskie (oferowane przez Sri Lankan Tea Board) są nadal uznawane za znak jakości i smaku.

Na przestrzeni lat zaproponowano różne metody analityczne służące do weryfikacji pochodzenia geograficznego herbaty zarówno dla jej sprzedaw- ców, jak i konsumentów, i aby zapobiec jej fałszy- wemu etykietowaniu. Okazuje się, że w połączeniu z metodami chemometrycznymi (algorytm SPA- -LDA i PCA-LDA) proste widmo UV-Vis może stać się skutecznym, szybkim oraz tanim narzędziem do weryfikacji pochodzenia geograficznego herbaty [14]. Innymi przykładami skutecznego wykorzystania spektroskopii w zakresie światła widzialnego i nadfioletu oraz metod chemometrycznych jest chociażby klasyfikacja geograficzna szafranu [15] czy wykrywanie zafałszowań w oliwie z oli- wek innymi, tańszymi olejami [16,17].

Z kolei spektroskopia w zakresie podczerwieni wykorzystująca metodę całkowitego osłabio- nego odbicia (ATR-FTIR) jest stosunkowo prostą, szybką, tanią i nieinwazyjną techniką stosowaną zarówno do cieczy, jak i ciał stałych, bez skom- plikowanej obróbki wstępnej próbki. W ostatnim czasie pojawiają się artykuły donoszące o moż- liwościach wykorzystania tej metody do oceny autentyczności oraz pochodzenia materiału roślin- nego. Zbadano między innymi cztery odmiany czosnku czerwonego (Allium sativum L.) upra- wiane w różnych rejonach Włoch. Wykonano widma ATR-FTIR dla bulw oraz łusek otulających cebulę, a uzyskane dane przetworzono, wykorzy- stując metodę częściowych najmniejszych kwadra- tów połączoną z analizą dyskryminacyjną (PLS- -DA), w celu sklasyfikowania próbek czosnku na podstawie ich pochodzenia geograficznego.

Sprawdzono, czy analiza dwóch rodzajów danych (widm bulw i łusek) może prowadzić do wyższych wskaźników predykcji. Zastosowano dwie strate- gie obliczeniowe SO-PLS (sekwencyjną i zortogo- nalizowaną metodę częściowych najmniejszych kwadratów) oraz SO-CovSel (sekwencyjną i orto- gonalizowaną selekcją kowariancji, w połączeniu z liniową analizą dyskryminacyjną Fishera). Naj- lepsze wyniki osiągnięto dzięki podejściu z wykorzystaniem SO-PLS. Autorzy uzyskali łączny wynik poprawnych klasyfikacji aż 95% [18].

Spektroskopię ATR-FTIR wykorzystaliśmy także w naszych poprzednich badaniach dotyczą- cych identyfikacji niezgodności w suplementach diety z ekstraktem miłorzębu japońskiego (Ginkgo biloba L.) dostępnych na polskim rynku farma- ceutycznym. Jest to jeden z najczęściej fałszowa- nych surowców roślinnych na świecie. Producenci, aby uzyskać wymaganą ilość glikozydów flawono- idowych (24%), uzupełniają ekstrakt dodatkową

ilością kwercetyny, kemferolu lub rutyny. Innym powszechnym sposobem fałszowania tego surowca jest użycie owoców lub liści perełkowca japoń- skiego (Sophora japonica). Na podstawie widm uzyskanych techniką ATR-FTIR zbudowano trzy modele klasyfikacyjne iPLS-DA, gdzie zastosowano przedziałową selekcję zmiennych, które osiągnęły 87,5%, 93,7% i 87,5% poprawnych klasyfikacji pod względem zafałszowania odpowiednio kemfero- lem, kwercetyną i rutyną [19].

Do rozróżnienia czystego i zafałszowanego surowca roślinnego stosowano także finger- print w oparciu o widma protonowego rezonansu magnetycznego jądrowego (¹H NMR) oraz metody chemometryczne. Przykładem może być potwier- dzenie autentyczności Curcuma longa, która jest często fałszowana surowcem Curcuma heyneana, ze względu na niższą cenę, mocny żółty kolor i sze- roką dostępność tej rośliny. Analiza widm ¹H NMR z wykorzystaniem metod PCA i OPLS-DA wyraźnie wykazała różnicę między czystą C. longa a zafał- szowaną przez C. heyneana [20].

Techniki spektroskopowe wykorzystano także do oceny procesu ekstrakcji. Porównano profile polifenolowe rokitnika zwyczajnego, ekstra- howane różnymi technikami: ekstrakcją wspo- maganą ultradźwiękami, szybką ekstrakcją pod ciśnieniem i ekstrakcją cieczą w stanie podkry- tycznym oraz przy różnych proporcjach użytych rozpuszczalników. Następnie widma Ramana i FTIR oraz wartości aktywności przeciwutlenia- jącej zostały poddane analizie PCA i PLS-DA w celu rozróżnienia próbek zgodnie z metodą ich przygotowania [21].

W innej pracy spektroskopia ATR-FTIR oraz NIR została użyta do oceny preparatów roślinnych dla dziewięciu wybranych roślin występujących w ziołowych suplementach diety. Wyniki poka- zują, że badanie przesiewowe preparatów zioło- wych lub roślinnych suplementów diety pod kątem obecności określonych roślin za pomocą spektroskopii w podczerwieni jest skuteczne, a najlepszy model uzyskano na podstawie danych w zakresie podstawowej podczerwieni, wykorzystując SIMCA jako technikę modelowania [22]. W ostatnim czasie zostało opublikowanych także wiele innych prac dotyczących skuteczności połączenia technik spektroskopowych i metod chemometrycznych, m.in. do odróżniania czystego Gorzknika kanadyjskiego (Hydrastis canadensis L.) od jego czterech pospolitych domieszek [23], odróżniania dwóch gatunków cynamonu [24] czy charaktery- zowania ekstraktów Phaleria macrocarpa (roślina lecznicza szeroko stosowana w Malezji) pod wzglę- dem aktywności hamującej α-glukozydazę [25].

W 2018 r. Isao Noda, twórca dwuwymiaro- wej spektroskopii korelacyjnej, opublikował

(6)

modyfikację tej metody przeznaczoną do porów- nania tylko pary widm, zwanej dwuśladową dwu- wymiarową spektroskopią korelacyjną (2T2D) [26, 27]. Zastosowanie widm IR oraz spektroskopii korelacyjnej stało się użytecznym narzędziem do jakościowej analizy próbek roślin [28, 29], a dwu- wymiarowe mapy korelacyjne par widm (2T2D) zestawiono w trójwymiarową macierz danych do analiz chemometrycznych. Dwuwymiarowa spektroskopia korelacyjna w podczerwieni została już z powodzeniem zastosowana w analizie pro- duktów roślinnych pod kątem zafałszowań, tj.

wykrywania niedeklarowanych dodatków do suplementów diety ekstraktem z liści miłorzębu japońskiego [19], wykrywania zafałszowań Aqu- ilariae Lignum Resinatum [30] czy rozróżnie- nia autentycznego i zafałszowanego Polyporus umbellatus [31].

Chromatograficzne odciski palca

Chromatografia jest jedną z najczęściej stosowanych technik analitycznych wykorzystywa- nych do jakościowej i ilościowej analizy materiału roślinnego dzięki niewątpliwym zaletom, takim jak: wysoka rozdzielczość, selektywność, czu- łość oraz, coraz częściej, w pełni zautomatyzo- wany system pracy. Niestety analiza poszczegól- nych składników złożonych próbek jest zazwyczaj kosztowna, czasochłonna i często wymaga wie- loetapowego przygotowania. Rozdzielenie i iden- tyfikacja poszczególnych substancji w próbkach pochodzenia roślinnego, o zwykle bardzo złożo- nym składzie chemicznym, są skomplikowane, a czasami nawet niemożliwe. Dlatego w ostatnim czasie coraz częściej do analizy porównawczej próbek stosowane są całe sygnały instrumentalne (chromatogramy) jako fingerprinty lub profile reprezentujące skład chemiczny [32]. Niestety powoduje to konieczność odpowiedniego doboru warunków analizy, które są konsekwentnie stosowane dla całego zbioru próbek, jednak w odróż- nieniu od technik spektroskopowych, interpre- tacja chromatograficznych odcisków palca jest relatywnie prostsza [33]. Techniki separacyjne wykorzystywane do tworzenia uzyskania finger- printów to chromatografia cieczowa (LC), gazowa (GC) i cienkowarstwowa (TLC) oraz elektroforeza kapilarna (CE). W 2016 r. została opublikowana praca wykorzystująca połączenie wysokospraw- nej chromatografii cienkowarstwowej i chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas z analizą składowych głównych do badań Rosmarinus officinalis L. Na podstawie chro- matogramów HPTLC uzyskano szybkie wizualne porównanie metabolitów wtórnych w próbkach rozmarynu z różnych miejsc pobrania i przepro- wadzono analizę PCA, uzyskując w ten sposób

skuteczne narzędzie do rozróżniania i klasyfikacji różnych próbek zgodnie z obszarem geograficz- nym Sardynii [34].

Donno i in. [35] do kontroli składu chemicznego preparatów ziołowych malin (Rubus idaeus L.), stosowanych jako suplementy diety, zastosowali HPLC z detektorem z matrycą diodową w połą- czeniu z dwiema różnymi metodami chemometrycznymi – analizą skupień i analizą głównych składowych. Zidentyfikowano i oznaczono główne składniki, a także uzyskano specyficzny fitoche- miczny odcisk palca tych roślin, co pozwoliło na skuteczne charakteryzowanie ekstraktów z pącz- ków maliny z różnych odmian. W innym artykule [36] przedstawiono dwuetapowe podejście oparte o fingerprinty zarejestrowane zarówno za pomocą spektroskopii w podczerwieni, jak i chromatografii cieczowej z detekcją UV do badań przesiewowych pięciu, potencjalnie toksycznych, roślin stosowanych w produkcji suplementów diety na odchudza- nie i wzmocnienie potencji (Aristolochia Fanghi, Ilex Paraguariensisis, Epidemedium spp., Pausi- nystalia Yohimbe i Tribulus Terrestris). Pierwszy model klasyfikacyjny został obliczony na podstawie widm oscylacyjnych i służył do przesiewowej oceny badanych preparatów. Z kolei, na podstawie binarnych modeli klasyfikacyjnych obliczo- nych na podstawie danych chromatograficznych wykrywano obecność niebezpiecznej rośliny.

W pracy wykorzystano trzy metody chemometryczne SIMCA, PLS-DA i kNN.

Celem kolejnego badania [37] było sprawdze- nie potencjalnego zastosowania chromatograficznych odcisków palców (HPLC-PDA i HPLC-MS) do identyfikacji trzech roślin (Epimedium spp., Pau- sinystalia yohimbe i Tribulus terrestris) obecnych w preparatach ziołowych wpływających pozytyw- nie na potencję. Badanie to pokazuje, że chromatograficzne odciski palca mogą być przydatnym narzędziem do identyfikacji składników w złożo- nej mieszaninie roślinnej.

Stosowane metody oceny jakości olejków lawendowych są generalnie związane z procen- tową zawartością poszczególnych związków (lina- lol, octan linalylu), a ścisłe monitorowanie składu tych produktów uznano za obowiązkowe. W pracy [38] przedstawiono nowe podejście do oceny jako- ści olejków lawendowych. W tym celu metodą GC-MS zidentyfikowano i oznaczono 31 lotnych związków organicznych w 32 próbkach olejku lawendowego. Analiza skupień w oparciu o skład- niki lotne podzieliła próbki na dwie główne grupy.

Wyniki te w połączeniu z wynikami uzyskanymi przy zastosowaniu liniowej analizy dyskrymina- cyjnej pozwoliły na identyfikację czterech próbek handlowych, które zostały zafałszowane dodatkiem oleju gorszej jakości.

(7)

Podsumowanie

Produkty ziołowe są bardzo złożonymi mie- szaninami chemicznymi, których kompleksową ocenę jakości można przeprowadzić wykorzystu- jąc techniki fingerprint w połączeniu z metodami chemometrycznymi, zapewniając obiecujące moż- liwości dyskryminacji pochodzenia geograficznego, identyfikacji taksonomicznej, optymaliza- cji procesu ekstrakcji i kontroli jakości. Zgodnie z naturą chromatograficznego odcisku palca, tech- nika ta jest odpowiednia do analizy podobieństwa i rozróżnienia surowców roślinnych, np. pomię- dzy różnymi partiami, gatunkami, pochodze- niem czy metodami przetwarzania. Jest oczywi- ste, że ogromna zaleta chemicznego odcisku palca generowanego za pomocą chromatografii wynika z wielowymiarowej matrycy danych, zawierają- cej zarówno informacje jakościowe, jak i ilościowe dotyczące większości fitochemicznych składników w próbce. W porównaniu z procedurami chromatograficznymi analiza spektralna jest prostsza i nie wymaga pracochłonnych procesów przygotowania próbek. Widma IR, NMR czy UV-Vis zawierają niezbędne informacje do identyfikacji, klasyfikacji lub wykrywania zafałszowań w badanym mate- riale roślinnym. Połączenie technik spektralnych z zaawansowanymi metodami analizy danych roz- wiązuje problemy związane z szybką oceną dużej liczby próbek o złożonym składzie chemicznym.

Dlatego też połączenie analizy spektralnej z procedurami chemometrycznymi staje się coraz bardziej popularne w kontroli jakości produktów pochodzenia roślinnego. Na podstawie przeglądu dostępnych danych naukowych można stwierdzić, że najczęściej stosowane metody chemometryczne w kontroli jakości preparatów roślinnych to analiza składowych głównych (PCA) i hierarchiczna analiza skupień (HCA). Wydaje się, że zastosowanie metod fingerprint w połączeniu z narzędziami chemometrycznymi może pomóc w uzyskaniu wia- rygodnych wyników analitycznych i zapewnieniu odpowiedniej jakości surowca roślinnego.

Piśmiennictwo

1. Drozd J. Wczoraj i dziś ziołolecznictwa. Prz. Med. Uniw. Rzesz.

Inst. Leków, 2012: 2: 245–251.

2. Fu PP, Xia Q, et al. Nutraceutical and Functional Food Regulations in the United States and Around the World. 2nd ed, LWT- Food Sci. Technol.

2014; 10: 151–168. doi.org/10.1016/B978-0-12-405870-5.00010-4.

3. Kharbach M, Marmouzi I, El Jemli M, Bouklouze A, Vander Heyden Y. Recent advances in untargeted and targeted approaches applied in herbal-extracts and essential-oils fingerprinting - a review. J.

Pharm. Biomed. 2020; (177): 112849. https://doi.org/10.1016/j.

jpba.2019.112849.

4. Zhang C, Zheng X, Ni H, Li P, Li HJ. Discovery of quality control markersfrom traditional Chinese medicines by fingerprint-effi- cacy modeling:current status and future perspectives. J. Pharm.

Biomed. Anal. 2018; 159: 296–304. http://dx.doi.org/10.1016/j.

jpba.2018.07.006.

5. Kucharska-Ambrożej K, Karpinska J. The application of spectroscopic techniques in combination with chemometrics for detection adulteration of some herbs and spice. Microchem. J. 2020; (153):

104278. https://doi.org/10.1016/j.microc.2019.104278.

6. Li Y, Shen Y, Yao CL, Guoa D. Quality assessment of herbal medicines based on chemical fingerprints combined with chemometrics approach: A review. J. Pharm. Biomed. Anal. 2020; (185): 113215.

https://doi.org/10.1016/j.jpba.2020.113215.

7. Skalicka-Woźniak K, Georgiev MI, Orhan IE. Adulteration of herbal sexual enhancers and slimmers: The wish for better sexual well- -being and perfect body can be risky. Food Chem. Toxicol. 2017;

108: 355–364. doi: 10.1016/j.fct.2016.06.018.

8. Spink J, Moyer DC. Defining the public health threat of food fraud. Journal of Food Sci. 2011; 76: 157–163. https://doi.

org/10.1111/j.1750-3841.2011.

9. Chambers ChS, Holečková V, Petráskováa L, Biedermann D, Valen- továa K, Buchta M, Křena V. The silymarin composition… and why does it matter??? Food Res. Int. 2017; 100: 339–353. https://doi.

org/10.1016/j.foodres.2017.07.017.

10. Granato D, Putnik P, Kovačević DB, Santos JS, Calado V, Rocha RS, Gomes A, Cruz D, Jarvis B, Rodionova OY, Pomerantsev A. Trends in chemometrics: food authentication, microbiology, and effects of processing. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2018; 3: 663–677.

https://doi.org/10.1111/1541-4337.12341.

11. Steinhoff B. Review: Quality of herbal medicinal products: State of the art of purity assessment. Phytomedicine 2019; (60):153003.

https://doi.org/10.1016/j.phymed.2019.153003.

12. Ekar T, Kreft S. Common risks of adulterated and mislabeled herbal preparations. Food Chem. Toxicol. 2019; 123, 288–297.

DOI: 10.1016/j.fct.2018.10.043.

13. Dankowska A, Domagała A, Kowalewski W. Quantification of Cof- fea arabica and Coffea canephora var. robusta concentration in blends by means of synchronous fluorescence and UV-Vis spectroscopies. Talanta 2017; 172; 215–220. http://dx.doi.org/10.1016/j.

talanta.2017.05.036.

14. Gonçalves Dias Diniz PH, Barbosa MF, Tavares de Melo Milanez KD, Pistonesi MF, Ugulino de Araújo MC. Using UV–Vis spectroscopy for simultaneous geographical and varietal classification of tea infu- sions simulating a home-made tea cup. Food Chem. 2016; 192: 374–

379. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.07.022.

15. D’Archivio AA, Maggi MA. Geographical identification of saffron (Crocus sativus L.) by linear discriminant analysis applied to the UV–visible spectra of aqueous extracts. Food Chem. 2017; 219:

408–413. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.09.169.

16. Ferreiro-González M, Barbero GF, Álvarez JA, Ruiz A, Palma M, Ayuso J, Authentication of virgin olive oil by a novel curve resolution approach combined with visible spectroscopy. Food Chem. 2017; 220; 331–336. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.10.015.

17. Danielle K, Milanez TM, Nobrega TCA, Nascimento DS, Insausti M, Fernandez Band BS, Coelho Pontes MJ. Multivariate modeling for detecting adulteration of extra virgin olive oil with soybean oil using fluorescence and UV-Vis spectroscopies: A preliminary approach. LWT-Food Sci. Technol. 2017; 85; 9–15. http://dx.doi.

org/10.1016/j.lwt.2017.06.060.

18. Biancolillo A, Marinia F, D’Archivioc AA. Geographical discrimination of red garlic (Allium sativum L.) using fast and non-inva- sive Attenuated Total Reflectance-Fourier Transformed Infra- red (ATR-FTIR) spectroscopy combined with chemometrics J.

Food Compost. Anal. 2020; (86): 103351. https://doi.org/10.1016/j.

jfca.2019.103351.

19. Walkowiak A, Ledziński Ł, Zapadka M, Kupcewicz B. Detection of adulterants in dietary supplements with Ginkgo biloba extract by attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy and multivariate methods PLS-DA and PCA, Spectrochim.

Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2018; 208: 222–228. https://doi.

org/10.1016/j.saa.2018.10.008.

20. Windarsih A, Rohman A, Swasono RT. Application of 1H-NMR based metabolite fingerprinting and chemometrics for authentication of Curcuma longa adulterated with C. heyneana. J. Appl. Res.

Med. Aromat. Plants 2019; 13: 100203. https://doi.org/10.1016/j.

jarmap.2019.100203.

21. Radulescu C, Olteanu RL, Stihi C, Florescu M, Lazurca D, I Dulama ID, Stirbescu RM, Teodorescu S. Chemometric assessment of spectroscopic techniques and antioxidant activity for Hippophae rhamnoides L. extracts obtained by different isolation methods.

Anal. Lett. 2019; 52: 1–23. https://doi.org/10.1080/00032719.201 9.1590379.

22. Deconinck E, Sokeng Djiogo CA, Bothy JL, Courselle P. Detection ofregulated herbs and plants in plant food supplements and traditional medicines using infrared spectroscopy. J. Pharm. Biomed.

Anal. 2017; 142: 210–217. doi: 10.1016/j.jpba.2017.04.051.

(8)

23. Liu Y, Finley J, Betz JM, Brown PN. FT-NIR characterization with chemometric analyses to differentiate Golden Seal from common adulterants. Fitoterapia 2018; 127: 81–88. https://doi.org/10.1016/j.

fitote.2018.02.006.

24. Farag MA, Labib RM, Noleto C, Porzel A, Wessjohann LA. NMR approach for the authentication of 10 cinnamon spice accessions analyzed viachemometric tools. LWT 2018; 90; 491–498. https://

doi.org/10.1016/j.lwt.2017.12.069.

25. Easmin S, Sarker MZI, Ghafoor K, Ferdosh S, Jaffri J, Ali ME, Mir- hosseini H, Al-Juhaimi FY, Perumal V, Khatib A. Rapid investiga- tion of – glucosidase inhibitory activity of Phaleria macrocarpa extracts using FTIR-ATR based fingerprinting. J. Food Drug Anal.

2017; 25: 306–315. https://doi.org/10.1016/j.jfda.2016.09.007.

26. Noda I. Two-trace two-dimensional (2T2D) correlation spectroscopy – a method of extracting useful information from a pair of spectra. J. Mol. Struct. 2018; 1160: 471–478. https://doi.org/

10.1016/j.molstruc.2018.01.091.

27. Yang RJ, Liu ChY, Yang YR, Wu HY, Jin H, Shan HY, Liu H. Two- -trace two-dimensional (2T2D) correlation spectroscopy application in food safety: A review. J. Mol. Struct. 2020; (1214): 128219.

https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2020.128219.

28. Azlaha MAF, Chua LS, Abdullaha FI, Yamc MF. A fast and relia- ble 2D-IR spectroscopic technique for herbal leaves classification.

Vib. Spectrosc. 2020; (106): 103014. https://doi.org/10.1016/j.vib- spec.2019.103014.

29. Chen J, Wang Y, Rong L, Wang J. Integrative two-dimensional correlation spectroscopy (i2DCOS) for the intuitive identification of adulterated herbal materials. J. Mol. Struct. 2018; 1163: 327–335.

https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2018.02.061.

30. Qu L, Chen J, Zhang G, Sun S, Zheng J. Chemical profiling and adulteration screening of Aquilariae Lignum Resinatum by Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy and two-dimensional correlation infrared (2D-IR) spectroscopy. Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2017; 174: 177–182. doi: 10.1016/j.

saa.2016.11.008.

31. Chen X, Choong YK, Zhang W, Li G, Lan J. Discrimination of authentic Polyporus umbellatus and counterfeit by Fourier Transform Infrared and Two Dimensional Infrared Correlation

Spectroscopy. J. Mol. Struct. 2020; (1199): 126917. https://doi.

org/10.1016/j.molstruc.2019.126917.

32. Cuadros-Rodríguez L, Ruiz-Sambl C, Valverde-Som L, Perez- -Castano E, Gonzalez-Casado A. Chromatographic fingerprinting:

An innovative approach for food ‘identitation’ and food authentication e A tuto rial. Anal. Chim. Acta 2016; 909: 9–23. http://dx.doi.

org/10.1016/j.aca.2015.12.042.

33. Estekia M, Shahsavaria Z, Simal-Gandarab J. Food identification by high performance liquid chromatography fingerprinting and mathematical processing. Food Res. Int. 2019; 122: 303–317.

https://doi.org/10.1016/j.foodres.2019.04.025.

34. Maldiniad M, Montorob P, Addisa R, Tonioloc C, Petrettoa GL, Foddai M, Nicoletti M, Pintorea G. A new approach to discrimi- nate Rosmarinus officinalis L. plants with antioxidant activity, based on HPTLC fingerprint and targeted phenolic analysis combined with PCA. Ind. Crops. Prod. 2016; 94: 665–672. https://doi.

org/10.1016/j.indcrop.2016.09.042.

35. Donno D, Beccaro GL, Carlen C, Ancay A, Cerutti AK, Mellano MG, Bounous G. Analytical fingerprint and chemometrics as phytoche- mical composition control tools in food supplement analysis: Cha- racterization of raspberry bud preparations of different cultivars.

J. Sci. Food Agric. 2016; 96(9): 3157–3168. https://doi.org/10.1002/

jsfa.7494.

36. Deconinck E, Vanhamme M, Bothy JL, Courselle P. A strategy based on fingerprinting and chemometrics for the detection of regulated plants in plant food supplements from the Belgian market: Two case studiem. J. Pharm. Biomed. Anal. 2019; 166; 189–196. https://doi.

org/10.1016/j.jpba.2019.01.015.

37. Custersab D, Van Praag N, Coursellea P, Apersb S, Deconinck E.

Chromatographic fingerprinting as a strategy to identify regulated plants in illegal herbal supplements. Talanta 2017; 164: 490–502.

https://doi.org/10.1016/j.talanta.2016.12.008.

38. Marincas O¸ Feher I. A new cost-effective approach for laven- der essentialoils quality assessment. Ind. Crops Prod. 2018; 125:

241–247. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2018.09.010.