Detection of inversion mutations (INV22 and INV1) in F8 gene using IS-PCR method in Polish patients with severe hemophilia A

(1)

Praca oryginalna/Original research article

Wykrywanie mutacji inwersyjnych (INV22 oraz INV1) w genie F8 metod ą IS-PCR u polskich chorych na ci ężką hemo ﬁlię A

Detection of inversion mutations (INV22 and INV1) in F8 gene using IS-PCR method in Polish patients with severe hemophilia A

Edyta Odnoczko

^1,

*, Ewa Stefańska-Windyga

²

, Beata Baran

¹

,

Magdalena Górska-Kosicka

³

, Joanna Sowi ńska

³

, Ksenia Bykowska

¹

, Jerzy Windyga

^1,3

1ZakładHemostazyiChoróbMetabolicznych,InstytutHematologiiiTransfuzjologiiwWarszawie, kierownik:prof.zw.drhab.n.med.JerzyWindyga,Warszawa,Polska

2PrzychodniaSpecjalistyczna,InstytutHematologiiiTransfuzjologiiwWarszawie, kierownik:EwaStefańska-Windyga,Warszawa,Polska

3KlinikaZaburzeńHemostazyiChoróbWewnętrznych,InstytutHematologiiiTransfuzjologiiwWarszawie, kierownik:prof.zw.drhab.n.med.JerzyWindyga,Warszawa,Polska

informacje o artykule

Historiaartykułu:

Otrzymano:17.06.2015 Zaakceptowano:22.09.2015 Dostępneonline:01.10.2015

Słowakluczowe:

hemoﬁliaA

badaniagenetyczne

genF8

mutacjeinwersyjne

IS-PCR

Keywords:

HemophiliaA

Genetictesting

F8gene

Inversionmutations

IS-PCR

abstract

HemophiliaAisageneticallydeterminedbleedingdisorder,causedbydeﬁciency,lackor dysfunction ofplasma coagulationfactorVIII. Approximatelyin 45–50% ofseverehae- mophiliaApatientsexcessivebleedingtendencyiscausedbytheoccurrenceofinversion mutationintheintron22(INV22)F8geneandinabout1–5%–inversionmutationinthe intron1 (INV1).In thispaper wepresent theresults ofthestudy aimedto assessthe prevalenceofINV22andINV1insevereHApatientsinPolandandtoestimatetheinci- denceofFVIIIinhibitorinpatientswithINV1orINV22mutations.Moreover,theroleof genetictestinginthediagnosisofhemophiliaAaswellasmolecularmethodusedinthe currentstudytodetecttheinversionmutationsintheF8genewasdiscussed.

*Adresdokorespondencji:ZakładHemostazyiChoróbMetabolicznych,InstytutHematologiiiTransfuzjologii,ul.I.Gandhi14,02-776 Warszawa,Polska.Tel.:+480223496548;fax:+480223496159.

Adresemail:eodnoczko@ihit.waw.pl(E.Odnoczko).

ContentslistsavailableatScienceDirect

Acta Haematologica Polonica

journal homepage:www.elsevier.com/locate/achaem

http://dx.doi.org/10.1016/j.achaem.2015.09.001

zo.o.Allrightsreserved.

(2)

Wstęp

Hemoﬁlia A (HA) (OMIM #306700) jest wrodzoną skazą krwotocznąspowodowanącałkowitymlub częściowymbra- kiem bądź zaburzeniem funkcji czynnika krzepnięcia VIII (factorVIII;FVIII).HAobjawiasięnadmiernąskłonnościądo krwawień,którychnasileniewdużejmierzejestpodyktowa- nestopniemniedoboruFVIII.Chorobęzwyklerozpoznajesię na podstawie wyników pomiaru aktywności koagulacyjnej FVIII(FVIII:C)wosoczu.Wzależności odstopnianiedoboru FVIII wyróżnia się 3 postacie HA: a) ciężką, gdy FVIII:C wynosimniejniżjednajednostkamiędzynarodowa(Interna- tional Unit; IU)/dl, b) umiarkowaną, gdy FVIII:C mieści się w przedziale 1–5 IU/dloraz c) łagodną, gdy FVIII:C wynosi

>5–50IU/dl[1].

PrzeciętnaczęstośćwystępowaniaHA,niezależnieodrasy czy grupy etnicznej, to 1:5000 urodzonych mężczyzn lub 1:10000osóbogólnejpopulacji[2,3].Wbadaniuepidemiolo- gicznym przeprowadzonym w 2004 roku w Polsce częstość występowania hemoﬁliiAiB oszacowanołączniena1:5600 mężczyzn[4].WOgólnopolskimRejestrze WrodzonychSkaz KrwotocznychprowadzonymwInstytucieHematologiiiTran- sfuzjologii (IHiT) w Warszawie znajduje się obecnie ponad 2200 mężczyzn z HA, z czego blisko 60% stanowią osoby zciężkąpostaciąchoroby(danezdn.15.05.2015).

Hemoﬁlia A jest chorobą uwarunkowaną genetycznie, któradziedziczysięwsposóbrecesywnysprzężonyzpłcią.

Oznaczato,żeobjawyskazykrwotocznejwystępujągłównie uhemizygotycznych mężczyzn,zaś kobiety będącehetero- zygotycznymi nosicielkami mutacji genowej w większości przypadkówniewykazująobjawówchoroby.

Gen kodujący FVIII (F8; Gene ID: 2157; NM_000132.3) znajduje się na długim ramieniu chromosomu X (Xq28), gdzie zajmuje blisko 186 kilopar zasad (kilobase pair; kbp) genomowegoDNA[5,6].Reprezentowaneprzez26eksonów DNA kodujące informację genetyczną stanowi około 4%

całego genu F8, zaś pozostałe 96% zajmują sekwencje intronowe. Wielkość eksonów F8 waha się w granicach od 69bp (ekson 5) do 3106bp (ekson 14) [7, 8]. Sekwencje intronoweF8mająrówniezróżnicowanąwielkość,aż6z25 mawielkość od14kbp do32 kbp,przyczymnajwiększym spośród nich jest intron 22 (IVS22) [3]. Charakterystyczną cechą genu F8 jest obecność w jego strukturze licznych powtarzających się sekwencji DNA bogatych w cytozynę iguaninę(tzw. wysp CpG)[9]. Duże skupieniaCpG obecne są w IVS22, gdzie tworzą 9,5 kbp region homologiczny (int22h-1). Regionten występuje w 2 dodatkowychkopiach (int22h-2orazint22h-3)pozagenemF8wobszarzetelomero- wymchromosomuX[10]. Sekwencjanukleotydowawszyst- kich trzech regionów homologicznych jest niemal w 99%

identyczna, przy czym sekwencja regionów int22h-1 oraz int22h-2 jest transkrybowana w odwrotnym kierunku niż sekwencja int22h-3. Dodatkowo region int22h-1 zawiera obszarowielkości3,5kbpszczególnieobﬁtującywparyCG, zczegoodcinekowielkościjednejkbpskładasięażw79%

z tych zasad [11]. W tym rejonie stwierdzono również obecność dwóch wewnętrznych genów F8A i F8B, których znaczenie biologiczne w hemostazie do dziś nie zostało wyjaśnione [3, 12]. Analogicznie, między pierwszym

a drugim eksonem genu F8 (w odległościokoło 15 kbp od eksonu 1) znajduje się region o wielkości 1041bp (int1h-1), który ma swoją homologiczną kopię pozagenową (int1h-2).

Kopia ta, oddalona o około 140 kbp w kierunku telomeru chromosomu X, jest także transkrybowana w przeciwnym kierunkuniżsekwencjawewnątrzgenu[13].

Opisane wyżej uwarunkowania odgrywają istotną rolę w patogenezie HA, gdyż sprzyjają powstawaniu mutacji inwersyjnych w intronie22(INV22)orazw intronie1(INV1) genu F8. Ponadto, w nielicznych przypadkach wynikiem rekombinacji z zaangażowaniem regionu int22h-1 może być również powstanie innych większychrearanżacjiw intronie 22, tj. delecji (Del22) czy duplikacji (Dup22) [13, 14]. Mecha- nizm powstawania mutacji INV22 oraz INV1 jest bardzo zbliżony.Wobuprzypadkachsąonenastępstwemnieallelicz- nej rekombinacji homologicznej pomiędzy sekwencją DNA znajdującą się w intronie F8 (odpowiednio 22 lub 1) ahomologicznąkopiąpozagenową(Ryc.1).Powstałarearan- żacja genuF8prowadzidonieodwracalnegoprzerwaniajego ciągłości,cowrezultacieuniemożliwiapowstaniefunkcjonal- negobiałka[15].WprzypadkuINV22,rekombinacjahomolo- giczna zachodzi pomiędzy regionem znajdującym się we- wnątrz intronu 22 (int22h-1) i jedną z dwóch identycznych pozagenowychkopii (int22h-2lubint22h-3)[16, 17]. Skutkiem tejrearanżacjijestobrócenieizmianabiegunowościsekwen- cji DNA oraz translokacja eksonów 23–26. W zależności od tego,którazpozagenowychkopiigenuuczestniczywcrossing- over,wyróżniasięinwersję:typuI–dystalną(int22h-1/int22h-3;

83% przypadków), typu II – proksymalną (int22h-1/int22h-2;

16%przypadków)oraztypuIII–mieszaną(dodatkowekopie pozagenowe;1%przypadków)[18,19].PodobnieINV1,powsta- jąca podczas homologicznej rekombinacji między znajdują- cym sięwewnątrz intronu 1 regionem int1h-1 oraz pozage- nowąkopiąint1h-2,prowadziwkonsekwencjidooddzielenia promotora i eksonu 1 od pozostałych sekwencji F8 [13].

Śledząc genezę mutacji inwersyjnych, warto podkreślić, że powstająonegłówniepodczaspodziałumejotycznegokomó- rek rozrodczych męskich,rzadko zaś de novo w komórkach rozrodczychżeńskich[20,21].

Wśródmutacjiodpowiedzialnychzawystąpienieciężkiej postaciHAzdecydowanienajczęściejwykrywanesąwłaśnie dużeinwersje.Wokoło45–50%przypadkówidentyﬁkujesię INV22, a w około 1–5% przypadków – INV1 [13, 16, 20].

W pozostałych przypadkach ciężkiej HA heterogenność mutacji sprawczych (ponad 1200 różnych wariantów F8) sprawia,żemogąonewystępowaćwłaściwiewewszystkich rejonach F8 [22]. Zrozumiałe jest zatem, że w praktyce diagnostykęmolekularnąupacjentówz ciężkąpostaciąHA rozpoczynasięodposzukiwaniawF8mutacjiinwersyjnych (odpowiednio INV22, a w sytuacji wyniku negatywnego – INV1).

Współcześnieuważasię,żediagnostykaHApowinnabyć uzupełnianaobadaniagenetyczne, umożliwiającepoznanie mutacji sprawczej. Znajomość defektu molekularnego F8 pozwalanawstępnąocenęryzykawytworzeniaprzeciwciał neutralizujących FVIII (tzw. inhibitora FVIII) oraz ułatwia rozpoznanie stanu nosicielstwa. Mutacje sprawcze wraz z czynnikami środowiskowymi przyczyniają się dowytwa- rzania(incidence)inhibitoraFVIIIprzezokoło20–30%chorych zciężkąHA[23,24].

(3)

Celemobecnegobadaniajestokreślenieczęstościwystę- powania mutacji inwersyjnych (INV22 i INV1) w populacji chorychnaciężkąHA w Polsceoraz oszacowanieczęstości wykrywaniainhibitoraFVIIIupacjentówzINV22lubINV1.

Materiał i metody

Dobadaniawłączanokolejnozgłaszającychsię,niespokrewnionych pacjentów z ciężką HA, którzy znajdowali się wRejestrze WrodzonychSkaz KrwotocznychIHiT. Pouzys- kaniu pisemnej świadomej zgody na udział w badaniu od każdego pacjenta pobrano próbki obwodowej krwi żylnej.

Rozpoznanie ciężkiej HA ustalono na podstawie pomiaru aktywnościFVIIIw osoczumetodąkoagulacyjnąjednostop- niową(wartościreferencyjne 50–150 IU/dl), zaśewentualną obecnośćinhibitorawobec ludzkiego FVIII określanostosu- jąc test Bethesda (wartości referencyjne <0.5 jednostki Bethesda[BethesdaUnit;BU]/ml).

Do badań molekularnych izolowano DNA genomowe zleukocytówkrwiobwodowejstandardowąmetodąwysala- nia[25]. Mutacji inwersyjnychINV22 i INV1w F8 poszuki- wano zmodyﬁkowaną metodą odwróconego PCR (Inverse Shifting PCR,IS-PCR), opracowaną pierwotnie przezRossetti iwsp.[26]zpóźniejszymimodyﬁkacjami[27–30].Genomowe DNA (2mg) trawiono, stosując 20 U enzymu restykcyjnego

BclI (Promega) przez 4h w temperaturze 508C. Uzyskane fragmenty DNA oczyszczano standardową metodą precypi- tacjietanolemwobecności3Moctanusodu.Ligacjępowsta- łych lepkich końców prowadzono z użyciem 5U T4 DNA Ligase (Promega) przez 16h w temperaturze 158C. Otrzy- mane produkty cyrkularyzacji oczyszczano jak poprzednio.

DlakażdejpróbkiDNApacjentadobadaniaobecnościINV22 przeprowadzono dwie reakcje multipleksowego PCR (tzw.

test diagnostyczny i test uzupełniający). Amplifikację frag- mentów DNA prowadzono z użyciem dwóch zestawów starterówspecyficznychdlakopiiwewnątrzgenowej(intrage- nic; I) i kopii pozagenowych (extragenic; E), tj. odpowiednio 22-[ID+1U+2U+3U]oraz22-[ED+1U+2U+3U][27].Jednocześnie produktyreakcjiligacjiwykorzystywanodobadaniaobecno- ści INV1, przyczym fragmenty DNA powielano z użyciem jednego zestawu specyficznych starterów 1-[ID+1U+2U+3U]

[27]. PCR do wykrywania INV22 lub INV1 prowadzono wobjętości25mloskładzie:1xbufordoPCR,2,5mMMgCl2, 2U Taq DNA polimerazy, 4200mM dNTP, 0,6mM każdego startera oraz 6ml DNA. Reakcje ampliﬁkacji prowadzono w termocyklerzeI-Cycler(Bio-Rad)wnastępującychwarun- kach: 948C–2min;[948C–30 s, 568C–1min,728C–1min] x 30, 728C – 5min. Rozdział produktów IS-PCR prowadzono w odniesieniu do markera wielkości 100bp DNA Ladder (Promega) w 2% żelu agarozowym zawierającym bromek etydynyprzy90Vprzezokoło2h.

Ryc.1–SchematstrukturygenuF8ijegootoczeniaorazmechanizmpowstawaniamutacjiinwersyjnych;a)allelprawidłowy (brakinwersji);b)inwersjawintronie1(INV1);c)inwersjawintronie22(INV22)typuI(dystalna);d)inwersjawintronie22 (INV22)typuII(proksymalna)

Fig.1–SchemeoftheF8genestructureanditsenvironmentandthemechanismofinversionmutations;a)thenormalallele(not inverted);b)theinversioninintron1(INV1);c)theinversioninintron22(INV22)typeI(distal);d)theinversioninintron22(INV22) typeII(proximal)

(4)

Wyniki

Badaniamiobjęto 56mężczyznz ciężkąHA wwieku 18–71 lat(średnia3913,mediana37).Obecnośćinhibitorawobec FVIII stwierdzonou 8/56 (14%) badanychpacjentów, a jego maksymalnehistoryczne mianozawierałosięw przedziale 5–7800BU/ml(Tab.I).

W teście diagnostycznym INV22 u pacjentów bez tej mutacjiuzyskanoproduktPCRwielkości487bp,upacjentów z obecną mutacją typu I (dystalna) – 333bp, zaś typu II (proksymalna) – 385bp. W teście uzupełniającym INV22 upacjentówbeztejmutacjiuzyskanoproduktPCRwielkości 405bp i 457bp,a u pacjentów z obecną mutacją: typuI – 457bp i559bp lub typuII– 405bp i 559bp. ŁącznieINV22 zidentyﬁkowano u 29/56 (52%) niespokrewnionych pacjen- tów.Obecność INV22typuI stwierdzonou25/29(86%),zaś typuII–u4/29(14%).U5/29pacjentów(17%)z INV22typu IwykrytoobecnośćinhibitoraFVIII,któregomianozawierało sięwprzedziale5–144BU/ml.U23/56mężczyznznieobecną INV22 badanoobecność INV1.U pacjentówbez INV1uzys- kano produkt PCR wielkości – 304bp, a u pacjentów z obecnąINV1(kontrola pozytywna)–224bp.MutacjiINV1 niewykrytoużadnegopacjenta.

Omówienie

Zasadnośćwykonywaniabadań genetycznych umożliwiają- cych zidentyﬁkowanie mutacji sprawczej u pacjentów z ciężkąHA jest ważna co najmniejz dwóchpowodów: 1) pozwala wstępnie ocenić ryzyko wytworzenia inhibitora FVIII i2) ułatwia ustaleniestanu nosicielstwaw rodzinach dotkniętych chorobą. Ponieważ blisko połowa przypadków ciężkiej HA jest spowodowana mutacjami inwersyjnymi

w F8, logiczne jestrozpoczynanie badań molekularnychod poszukiwaniaobecnościtychdefektów.

Niegdyś do wykrywania INV22 w F8 wykorzystywano główniemetodęhybrydyzacjiwedługSoutherna,którązasto- sowano także w polskich badaniach prowadzonych przez Saweckąiwsp.[31,32].Znanaod2005roku iudoskonalona trzy latapóźniej metoda IS-PCR jestalternatywą dla skom- plikowanejipracochłonnejmetodySoutherna[26,27].Zarów- no metodę Southerna, jak i IS-PCR charakteryzuje podobna czułość, gdyż obie umożliwiają identyﬁkację INV22 (łącznie z określeniem jej typu) orazwykrycie delecjiczy duplikacji obejmującejIVS22.PonadtowybórmetodyIS-PCRwobecnym badaniu jest podyktowany szeregiem innych zalet; IS-PCR umożliwiarównoczesnądiagnostykęINV22iINV1(wykorzy- stuje ten sam produkt reakcji ligacji do PCR), nie wymaga bezpośredniej ampliﬁkacji regionów bogatych w pary GC (przez co procedura jest bardziej powtarzalna) oraz nie ograniczasiędostosowaniawysokiejjakościDNA(możliwość stosowaniapróbeknawetczęściowozdegradowanych)[33].

PodłożegenetyczneciężkiejHAwPolsce byłoprzedmio- tem nielicznych badań. Dotychczas przeprowadzone przez Sawecką i wsp. badania molekularne objęły łącznie grupę 113 pacjentów z ciężką postacią choroby [31, 32, 34].

Wykazana w obecnym badaniu częstość występowania INV22 (52%) jest bardzozbliżona doczęstości stwierdzonej we wcześniejszym polskim badaniu (50,5%) [31]. Szeroko zakrojone badania europejskie wykazały, że prewalencja INV22wynosiod45%(naprzykładwNiemczechlubAnglii) donawet 52–54% (naprzykład naWęgrzech, weWłoszech, wHiszpaniiiPortugalii)[13,24,35–38].Najczęściejwykrywa- nymtypemINV22wobecnymbadaniubyłtypI(86%),dużo rzadziej identyﬁkowano typ II (14%), co jest zbieżne z wynikami uzyskanymi w uprzednio prowadzonym bada- niuwpolskiej(typI–82%;typII–18%)iinnychpopulacjach (typI–84%;typII–16%)[18,31].

BadaniaprzeprowadzonewinnychkrajachEuropywyka- zały,że częstość występowaniaINV1 upacjentówz ciężką HA wynosi 1–5% [13, 39]. Ponieważ w obecnym badaniu u żadnego pacjenta nie zidentyﬁkowano tego defektu, a uprzednio częstość występowania INV1w Polsce oszacowano na 0,9% (1/113), w celu sformułowania wiążących wnioskówniezbędnejestprzeprowadzeniebadańwwiększej populacjipolskichchorychnaciężkąHA[34].

Wobecnymbadaniuu8spośród56(14%)niespokrewnio- nychchorychnaciężkąHAwykrytoinhibitorFVIII.Wgrupie 29pacjentówzwykrytąINV22u5(17%)stwierdzonoobecność inhibitora FVIII. Ze względu na stosunkowo małą liczebnie grupę przebadanych pacjentów trudno wyciągnąć jedno- znaczne wnioski, ale trzebaprzyjąć zainnymi autorami,że INV22 należy do mutacji wyraźnie zwiększających ryzyko wystąpienia inhibitora FVIIIw odpowiedzina wstrzykiwany dożylnieczynnikVIII. Szacujesię,żeczęstośćwystępowania inhibitora FVIII jest 7–10-krotnie wyższa u pacjentów z obecnym „ciężkim” defektem molekularnym F8 (tj. dużą delecją, mutacjąnonsensowną, INV22) w porównaniu z pa- cjentami z „łagodnym” defektem (mutacją zmiany sensu, małądelecją,defektemskładaniatranskryptu)[23,40].Meta- analiza30badańprzeprowadzonychwgrupie1029pacjentów zHApowikłanąinhibitoremwykazała,żeryzykowystąpienia inhibitora FVIIIjestnajwiększew przypadku dużychdelecji, TabelaI–Prewalencjamutacjiinwersyjnych(INV22

iINV1)orazinhibitoraFVIIIwbadanejpopulacji TableI–Prevalenceoftheinversionmutations(INV22and INV1)andFVIIIinhibitorinthestudiedpopulation

Wskaźnik Wyniki

Liczbabadanychpacjentówzciężką hemoﬁliąA(FVIII:C<1IU/dl)

56

Liczbapacjentówzobecnym inhibitoremFVIII

8(14%)

Wiek(lata) 18–71(średnia3913,

mediana37) INV22

TypI(dystalna) TypII(proksymalna) ObecnyinhibitorFVIII MianoinhibitoraFVIII

29/56(52%) 25/29(86%) 4/29(14%) 5/29(17%) 5–144BU/ml

INV1 0

INV22–inwersjawintronie22genuF8;INV1–inwersjawintronie 1 genu F8; FVIII – czynnik krzepnięcia VIII; IU – jednostka międzynarodowa

INV22–inversioninintron22oftheF8gene;INV1–inversionin intron 1 of the F8 gene; FVIII – coagulation factor VIII; IU – InternationalUnit

(5)

mutacji nonsensownych i pośrednie w przypadku INV22, INV1 oraz mutacji splicingowych, zaś najmniejsze w przypadku małych delecji/insercji i mutacji zmiany sensu [41].

Jednak ryzyko powstania alloprzeciwciał wobec FVIII u pacjentów z HA powodowaną INV22 lub INV1 jest dużo mniejsze(około20–30%)niżnaprzykładwprzypadkuniektó- rych dużych delecji obejmujących wiele eksonów F8 (około 90%) [12, 24]. Ponieważ u większości pacjentów z INV22 inhibitor nie występuje, aktualnie prowadzone są badania, którychcelemjestposzukiwanie innychniż mutacjaspraw- cza w F8 czynników ryzyka (zarówno genetycznych, jak iśrodowiskowych)powstawaniainhibitoraFVIII[42].

Dotychczasw naszym krajudostępnośćbadań genetycz- nychw diagnostyceHA była znacznie ograniczona.Pionier- skie badanianaukowe w diagnostyce molekularnejtej choroby realizowane były do2009 rokuw Zakładzie Biochemii IHiT[31,32,34,43].Rezultatemaktualnieprzeprowadzonego badaniajestwprowadzeniew naszymośrodkunowoczesnej metody służącej do identyﬁkowania mutacji inwersyjnych wF8.KolejnymcelemjestwdrożeniewZakładzieHemostazy iChoróbMetabolicznych IHiTinnychmetod molekularnych wdiagnostyceHA,obejmującychsekwencjonowanieposzcze- gólnycheksonówgenuF8,jakibadanieobecnościwiększych rearanżacji genowych. Wśród najnowocześniejszych metod szczególnieobiecującajestsekwencjonowanienowejgenera- cji (Next Generation Sequencing; NGS). I tak, na przykład, technikętęzastosowanoupolskiegochoregonaciężką HA, dziękiczemuzidentyﬁkowanodelecjęgenuF8igenuBRCC3, co zaowocowało opisaniem nowego zespołu chorobowego:

hemoﬁliiAiangiopatiimoyamoya(SHAMsyndrome)[44].

Wdrożenierutynowegooznaczaniamutacjiinwersyjnych (INV22 oraz INV1) w F8 oraz realizacja opisanych powyżej zamierzeń pozwoli na kompleksową diagnostykę gene- tycznąhemoﬁliiAwnaszymkraju.

Wkład autorów/Authors’ contributions

EO – koncepcja pracy, analiza statystyczna, interpretacja danych, akceptacja ostatecznej wersji, przygotowanie piś- miennictwa. JW – koncepcja pracy, akceptacja ostatecznej wersji.ES-W,BB,MG-K,JS,KB–zebraniedanych.

Konﬂikt interesu/Conﬂict of interest

Niewystępuje.

Finansowanie/Financial support

FunduszBadań Własnych Instytutu Hematologiii Transfu- zjologiiwWarszawie.

Etyka/Ethics

Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami DeklaracjiHelsińskiej,dyrektywamiEUorazujednoliconymi wymaganiamidlaczasopismbiomedycznych.

pi smiennictwo/references

[1] WindygaJ,ChojnowskiK,KlukowskaA,etal.Polskie zaleceniapostępowaniawewrodzonychskazach krwotocznychnatleniedoboruczynnikówkrzepnięcia.

CzęśćI:ZasadypostępowaniawhemoﬁliiAiB.Acta HaematologicaPolonica2008;39(3):537–564.

[2] MannucciPM,TuddenhamEG.Thehemophilias–from royalgenestogenetherapy.NEnglJMed2001;344 (23):1773–1779.

[3] OldenburgJ,PezeshkpoorB,PavlovaA.Historicalreviewon geneticanalysisinhemophiliaA.SeminThrombHemost 2014;40(8):895–902.

[4] WindygaJ,LopaciukS,StefańskaE,KlukowskaA.Hemoﬁlia ipokrewneskazykrwotocznewPolsce.PolArchMedWew 2004;112:1197–1202.

[5] TantravahiU,MurtyVVVS,JhanwarSC,etal.A.Physical mappingofthefactorVIIIgeneproximaltotwo polymorphicDNAprobesinhumanchromosomeband Xq28:implicationsforfactorVIIIgenesegregationanalysis.

CytogeneCellGenet1986;42:75–79.

[6] KeeneyS,CummingT,JenkinsPV,etal.Clinicalutilitygene cardfor:haemophiliaA.EurJHumGenet2011;19(11).

[7] ShenBW,SpiegelPC,ChangCH,etal.Thetertiarystructure anddomainorganizationofcoagulationfactorVIII.Blood 2008;111(3):1240–1247.

[8] Kemball-CookG,GomezK.MolecularBasisofhemophilia A. W:ChristineA,LeeCA,BerntorpEE,HootsKW,reds.

TextbookofHemophilia.ThirdEdition,Willey-Blackwell;

2014.p.23–32.

[9] GrawJ,BrackmannHH,OldenburgJ,etal.HaemophiliaA:

frommutationanalysistonewtherapies.NatRevGenet 2005;6(6):488–501.

[10] BagnallRD,GiannelliF,GreenPM.Int22h-relatedinversions causinghemophiliaA:anovelinsightintotheiroriginand anewmorediscriminantPCRtestfortheirdetection.

JThrombHaemost2006;4(3):591–598.

[11] LiuQ,NozariG,SommerSS.Single-tubepolymerasechain reactionforrapiddiagnosisoftheinversionhotspotof mutationinhemophiliaA.Blood1998;92(4):1458–1459.

[12] OldenburgJ,El-MaarriO.Newinsightintothemolecular basisofhemophiliaA.IntJHematol2006;83(2):96–102.

[13] BagnallRD,WaseemN,GreenPM,GiannelliF.Recurrent inversionbreakingintron1ofthefactorVIIIgeneisa frequentcauseofseverehemophiliaA.Blood2002;99 (1):168–174.

[14] DeBrasiCD,BowenDJ.Molecularcharacteristicsofthe intron22homologsofthecoagulationfactorVIIIgene:an update.JThrombHaemost2008;6(10):1822–1824.

[15] SaunaZE,LozierJN,KasperCK,etal.Theintron-22- invertedF8locuspermitsfactorVIIIsynthesis:explanation forlowinhibitorriskandaroleforpharmacogenomics.

Blood2015;125(2):223–228.

[16] LakichD,KazazianJrHH,AntonarakisSE,GitschierJ.

InversionsdisruptingthefactorVIIIgenearea commoncauseofseverehaemophiliaA.NatureGenet 1993;5:236–241.

[17] NaylorJ,BrinkeA,HassockS,GreenPM,GiannelliF.

CharacteristicmRNAabnormalityfoundinhalfthe patientswithseverehaemophiliaAisduetolargeDNA inversions.HumMolecGenet1993;2:1773–1778.

[18] AntonarakisSE,RossiterJP,YoungM,etal.FactorVIII inversionsinseverehemophiliaA:resultsfroman internationalconsortium.Blood1995;86:2206–2212.

[19] BagnallRD,GiannelliF,GreenPM.Polymorphismand hemophiliaAcausinginversionsindistalXq28:acomplex picture.JThrombHaemost2005;3(11):2598–2599.

(6)

[20] OldenburgJ,AnanyevaNM,SaenkoEL.Molecularbasisof haemophiliaA.Haemophilia2004;10:133–139.

[21] OldenburgJ,RostS,El-MaarriO,etal.DenovofactorVIII geneintron22inversioninafemalecarrierpresentsasa somaticmosaicism.Blood2000;96(8):2905–2906.

[22] RallapalliPM,Kemball-CookG,TuddenhamEG,GomezK, PerkinsSJ(2014)-ManuscriptunderPreparation.http://

www.factorviii-db.org/.

[23] SchwaabR,BrackmannHH,MeyerC,etal.HaemophiliaA:

mutationtypedeterminesriskofinhibitorformation.

ThrombHaemost1995;74:1402–1406.

[24] OldenburgJ,PavlovaA.Geneticriskfactorsforinhibitorsto factorsVIIIandIX.Haemophilia2006;12(Suppl6):15–22.

[25] MillerSA,DykesDD,PoleskyHF.Asimplesaltingout procedureforextractingDNAfromhumannucleatedcells.

NucleicAcidsRes1988;16(3):1215.

[26] RossettiLC,RadicCP,LarripaIB,DeBrasiCD.Genotyping thehemophiliainversionhotspotbyuseofinversePCR.

ClinChem2005;51(7):1154–1158.

[27] RossettiLC,RadicCP,LarripaIB,DeBrasiCD.Developinga newgenerationoftestsforgenotypinghemophilia-causative rearrangementsinvolvingint22handint1hhotspotsinthe factorVIIIgene.JThrombHaemost2008;6(5):830–836.

[28] HeZH,ChenSF,ChenJ,JiangWY.AmodiﬁedI-PCRto detectthefactorVIIIInv22forgeneticdiagnosisand prenataldiagnosisinhaemophiliaA.Haemophilia2012;18 (3):452–456.

[29] FujitaJ,MiyawakiY,SuzukiA,etal.Apossiblemechanism forInv22-relatedF8largedeletionsinseverehemophiliaA patientswithhighrespondingfactorVIIIinhibitors.

JThrombHaemost2012;10(10):2099–2107.

[30] RoozafzayN,KokabeeL,ZeinaliS,KarimipoorM.

Evaluationofintron22andintron1inversionsofthefactor 8geneusinganinverseshiftingPCRmethodinsevere haemophiliaApatients.ScienceAsia2013;(39):174–178.

[31] SaweckaJ,SkulimowskaJ,WindygaJ,etal.Prevalenceof theintron22inversionofthefactorVIIIgeneandinhibitor developmentinPolishpatientswithseverehemophiliaA.

ArchImmunolTherExp(Warszawa)2005;53(4):352–356.

[32] SaweckaJ,SkulimowskaJ,KościelakJ.Mutacjeinwersyjne upacjentówchorychnaciężkąhemoﬁlięA.Acta

HaematologicaPolonica2000;31(1):47–50.

[33] RossettiLC,RadicCP,AbelleyroMM,etal.Eighteenyearsof moleculargenotypingthehemophiliainversionhotspot:

fromsouthernblottoinverseshifting-PCR.IntJMolSci 2011;12(10):7271–7285.

[34] SaweckaJ,SkulimowskaJ,WindygaJ,KościelakJ.Inwersja intronu1genuczynnikaVIIIupacjentówchorychna ciężkąhemoﬁlięA.ActaHaematologicaPolonica2006;37 (1):61–65.

[35] CasanaP,CabreraN,CidAR,etal.Severeandmoderate hemophiliaA:identiﬁcationof38newgeneticalterations.

Haematologica2008;93(7):1091–1094.

[36] DavidD,VenturaC,MoreiraI,etal.Thespectrumof mutationsandmolecularpathogenesisofhemophiliaAin 181Portuguesepatients.Haematologica2006;91(6):840–843.

[37] AndrikovicsH,KleinI,BorsA,etal.Analysisoflarge structuralchangesofthefactorVIIIgene,involvingintron 1and22,inseverehemophiliaA.Haematologica2003;88 (7):778–784.

[38] MargaglioneM,CastamanG,MorﬁniM,etal.TheItalian AICE-GeneticshemophiliaAdatabase:resultsand correlationwithclinicalphenotype.Haematologica2008;93 (5):722–728.

[39] GuilletB,LambertT,d’OironR,etal.Detectionof95novel mutationsincoagulationfactorVIIIgeneF8responsiblefor hemophiliaA:resultsfromasingleinstitution.HumMutat 2006;27(7):676–685.

[40] OldenburgJ,El-MaarriO,SchwaabR.Inhibitordevelopment incorrelationtofactorVIIIgenotypes.Haemophilia2002;8 (Suppl2):23–29.

[41] GouwSC,vandenBergHM,OldenburgJ,etal.F8gene mutationtypeandinhibitordevelopmentinpatientswith severehemophiliaA:systematicreviewandmeta-analysis.

Blood2012;119(12):2922–2934.

[42] AstermarkJ,AltisentC,BatorovaA,etal.Non-geneticrisk factorsandthedevelopmentofinhibitorsinhaemophilia:a comprehensivereviewandconsensusreport.Haemophilia 2010;16(5):747–766.

[43] SaweckaJ,SkulimowskaJ,WindygaJ,KościelakJ.Ocena przydatnościpolimorﬁzmudwunukleotydowych powtórzeńwintronach1i24genuczynnikaVIIIdo wykrywanianosicielstwahemoﬁliiA.ActaHaematologica Polonica2009;40(1):97–101.

[44] JanczarS,FogtmanA,KoblowskaM,etal.Novelsevere hemophiliaAandmoyamoya(SHAM)syndromecausedby Xq28deletionsencompassingF8andBRCC3genes.Blood 2014;123(25):4002–4004.