OF ADDICTED PERSONS
R enata WIETECHA1, Roman STANASZEK2
1 Faculty o f Chemistry, Jagiellonian University, Cracow 2 In stitu te o f Forensic Research, Cracow
ABSTRACT: In the last decades advances in analytical methods have enabled de
term ination of drugs of abuse in alternative biological samples such as hair, sweat, saliva etc. One im portant feature of hair analysis is th a t it provides long-term infor
mation on an individual’s drug use, in contrast to the short-term information pro
vided by urinalysis. The analytical procedure of determ ination of opiates in hair which was previously developed in the Institute of Forensic Research was applied to the group of drugs of abuse mentioned in the title, in hair from patients who abused
“Polish heroin” and were undergoing detoxification and methadone treatm ent. This was a preliminary study in this field.
KEY WORDS: Hair; Gas Chromatography/Mass Spectrometry (GC/MS); Opiates;
Methadone Treatm ent Programme.
Z Zagadnień N a u k Sądowych, z. XLIX, 2002, 3 8 -50 Received 20 February 2002; accepted 7 M arch 2002
INTRODUCTION
D ru g ad d ictio n h a s b e e n in c re a sin g in P o la n d recen tly , a s h av e efforts to p re v e n t a n d c o u n te ra c t it. L aw s h av e b e e n ch a n g ed a n d m ad e m ore sev ere to help in th e fig h t a g a in s t th is problem . T h e r e s u lts of la b o ra to ry a n a ly s is are v ery o ften th e b a s is for ju d icial ru lin g s. N o w aday s forensic la b o ra to rie s are re q u e s te d n o t only to id e n tify seized illicit su b sta n c e s, b u t also to confirm d ru g u se o r ab u se. T h u s a n ee d for d eveloping n ew m eth o d s of d etec tio n a n d d e te rm in a tio n of d ru g s of a b u se a n d th e ir m e ta b o lite s in a lte r n a tiv e biologi
cal sp ecim en s su ch a s h a ir, saliv a, etc. [13] (as opposed to c lassical ones su ch a s blood a n d u rin e ) h a s arise n .
H a ir is a u se fu l d iag n o stic sp ecim en th a n k s to th e n o n -in v asiv e w ay of collecting sam p les, th e ir sta b ility , a n d also b ec au se of th e fact t h a t h a ir a n a l
ysis pro v id es in fo rm a tio n on sh o rt a n d lo n g -term h is to ry of ad d ictio n to or a b stin e n c e from psycho active s u b s ta n c e s in a n in d iv id u a l [2].
D eterm ination o f morphine, codeine 39
H a ir te s tin g p la y s a n especially sig n ifican t role in forensic toxicology.
V ery o ften a h a ir sam p le is th e only sp ecim en s u ita b le o r a v a ila b le for a n a ly sis: for exam ple, in p o st-m o rtem ex a m in a tio n s w h e re corp ses h av e b een found a long tim e a fte r d e a th (victim s of drow ning, traffic accid ents, a irc ra ft c a ta s tro p h e s victim s, ex h u m ed corpses etc.) a n d a re decom posed a n d it is n o t possible to collect body flu id s sam p les for a n a ly s is [9].
H a ir a n a ly s is c a n be u se d to s tu d y a n in d iv id u a l’s ex p osu re to xeno- biotics, for in sta n c e in ch ild re n liv ing am o n g st a d u lts ad d icte d to cocaine.
A n o th e r ex am p le is a n a ly s is of th e h a ir of n ew b o rn b ab ies to check for p r e n a ta l ex posure to d ru g s of a b u se a n d m e d ic a m e n ts ta k e n by th e m o th e r d u rin g p re g n an cy . T he re s u lts c a n ex p la in a n in fa n t’s add iction , w ith d ra w a l or d e fective dev elo p m en t sym ptom s. D e te ctio n of d ru g s in h a ir is m ore a n d m ore fre q u e n tly ap p lied in clinical stu d ie s, e.g. m o n ito rin g d ru g th e ra p y , ch eck in g a b stin e n c e in d ru g ad d ictio n tr e a tm e n ts p ro g ra m m e s [11] a n d ep id em io logical s tu d ie s [8].
A n o th e r field of a p p lic a tio n for h a ir te s tin g is civil cases su ch a s divorces, child custody, ad o p tio n or in s u ra n c e cases [7]. T h e re is also a p o ssib ility of its u se by in s titu tio n s is su in g d riv in g licences or by em p lo yers before h irin g s ta ff 14]. H a ir a n a ly s is ca n also be u se d to d etec t o th e r o rganic s u b s ta n c e s - e.g. doping con trol in a th le te s or sp o rts a n im a ls [5].
PURPOSE
T he aim of th is w ork w a s to ap p ly a n a ly tic a l p ro c ed u re of d e te rm in a tio n of op iu m a lk a lo id s in h a ir, w h ich w a s p rev io u sly developed in th e I n s titu te of F o ren sic R esearch , to th e d e te rm in a tio n of m o rp h in e, codeine, an d 6-m ono acety lm o rp h in e in h a ir s a m p le s collected from p a tie n ts tre a te d in th e Szczecin C e n tre for D etox ification a n d D ru g A dd iction T re a tm e n t [3], as w ell a s to a s se ss th e u se fu ln e ss of h a ir te s tin g in practice.
MATERIALS AND METHODS
Standards
S ta n d a rd com pounds (m o rph in e, codeine, 6-m on oacetylm o rp hin e) a n d th e ir d e u te riu m lab elled in te r n a l s ta n d a r d s (m orphine-D 3, codeine-D3, 6-m onoacetylm orphine-D 3, 6-MAM-D3) w ere p u rc h a s e d from P rom ochem (R adian).
R eagents
T he follow ing re a g e n ts, all of a n a ly tic a l grade, w ere u s e d in th e study:
trie th y la m in e (M erck), d ich lo ro m eth an e (M erck), a c e to n itrile (G rad ien t G ra d e for H PLC , M erck), p en taflu o ro p ro p io n ic acid a n h y d ra te - PFPA A (S u p elco ), 75% 2 ,2 ,3 ,3 ,3 -p e n ta flu o ro -1 -p ro p a n o l - P F P O H (S ig m a - A ldrich), 2 -propanol a n d aceton e (O środek Badaw czo-Rozwojowy P rz e m y słu R afineryjnego w Płocku), chloroform (P olskie O dczynniki Chem iczne), m e th a n o l (E urochem BGD). B ond E lu t C ertify solid p h a se e x tra c tio n col
u m n s w ith m ixed m ode so rb e n t (C8 a n d stro n g ca tio n exchan ge re s in - SCX), w ere p u rc h a s e d from V a ria n (USA).
Hair sam ples
H a ir s a m p le s w ere collected from 36 ad d icte d p e rso n s tr e a te d in th e Szczecin C e n tre for D etoxification a n d D ru g A d dictio n T re a tm e n t. H a ir u se d to p re p a re b la n k a n d c a lib ra tio n sa m p le s w a s collected from c h ild re n w ho h a d n o t b e e n exposed to th e s tu d ie d drugs.
In stru m en tation
A V a ria n g as c h ro m a to g ra p h (GC 3400 series) coupled to a F in n ig a n M a t M ag n u m ion tr a p m a ss sp e c tro m e te r (ITD) w as u s e d for d e te rm in a tio n of opium a lk alo id s in h a ir. C h ro m ato g ra p h ic s e p a ra tio n w a s ach iev ed on a H e w lett P a c k a rd H P-5M S F u sed Silica C ap illary C olum n (FSCC), le n g th - 30 m, in n e r d ia m e te r - 0.25 m m , film th ic k n e s s - 0.25 pm. H a ir sam p les w ere p u lv e rise d in a R etsch KG b a ll m ill. Solid p h a se e x tra c tio n w as done u sin g B a k e r v ac u u m a p p a ra tu s .
Hair sam ple p reparation
H a ir sam p les w ere cu t a s close a s p ossible to th e sk in from th e p o ste rio r v e rte x h e a d re g io n according to th e g u id elin es of th e Society of H a ir T e s tin g [12]. T he site of c u ttin g a n d top site of th e s tr a n d w ere m a rk e d w ith a w h ite th re a d . D e ta ile d d a ta co n cern in g selected p a tie n ts a n d th e ir h a ir sam p les a re p re s e n te d in T able I.
E ac h sam p le w as d e c o n ta m in a te d by w a sh in g h a ir s ta n d s w ith th e fol
low ing solvents: 2-propanol, p h o s p h a te b u ffer (pH = 7.4) a n d dichloro- m e th a n e . To p erfo rm se g m e n ta l h a ir a n a ly sis (a n a ly sis of p a r tic u la r h a ir s tr a n d segm en ts), p re v io u sly a ir-d rie d s a m p le s w ere d ivided in to 2 cm seg m e n ts from th e site of c u ttin g to th e en d of th e s tra n d . A ssu m in g av e rag e h a ir g ro w th r a te a s 1 cm p e r m o n th [9, 10] a n d k n o w ing th e d a te of sam p le collection, by a n a ly sin g ea ch se g m e n t of th e h a ir, se g m e n ta l h a ir a n a ly sis c a n pro vide in fo rm a tio n on ab u se h is to ry (a b stin en c e p eriods) in p a r tic u la r tim e p erio d s up to th e d ay of sam pling.
D eterm ination o f morphine, codeine 41
TABLE I. DATA CONCERNING SELECTED PATIENTS AND THEIR HAIR SAMPLES
N u m b e r o f p a tie n t
D a te of s am p le collection
H a ir s tr a n d le n g th [cm]
N u m b e r of h a ir s e g m e n ts
D ru g s a b u se d T r e a tm e n t Sex, age, h a ir colour
3 12.11.1999 21 9
O p iates, a m p h e ta m in e ,
e p h e d rin e
D eto x ificatio n M ale, 38, d a rk a u b u r n
4 12.11.1999 42 16 O p ia te s D eto x ificatio n F e m a le , 38,
re d (dyed)
28 3.01.2000 28 11 O p iates,
a m p h e ta m in e
M e th a d o n e p ro g ra m m e
F e m a le , 40, b lond
30 3.01.2000 7 3
O p iates, A m p h e ta m in e ,
m e d ic in al d ru g s
M e th a d o n e P ro g ra m m e
M ale, 27, a u b u r n
31 7.01.2000 38 13 O p ia te s
D e to x ific a tio n , M e th a d o n e P ro g ra m m e
M ale, 35, a u b u r n
34 7.01.2000 6.5 3 O p ia te s, b a rb i
tu r a t e s D eto x ificatio n M ale, 40, d a rk a u b u r n
F ir s t h a ir s a m p le s w ere c u t w ith scisso rs in to a b o u t 1 m m long pieces a n d th e n p u lv e rise d in a b a ll m ill. 50 m g of m illed h a ir o rig in a tin g from e a ch seg m e n t w a s w eighed o u t a n d su b jecte d to successive s ta g e s of an a ly sis. F or each se rie s of d e te rm in a tio n s , s ta n d a r d h a ir sa m p le s w ere p re p a re d in o rd e r to c re a te a c a lib ra tio n curve. F o r th is p u rp o se, five 50 m g p u lv e rise d b la n k h a ir sa m p le s (h a ir n o t c o n ta in in g a n a ly te s) w ere w eig hed o ut. T h e n w orking so lu tio n s of m o rp h in e a n d codeine in m e th a n o l (1 pg/ml) a n d 6-MAM in a c e to n itrile (10 pg/ml) w ere a d d e d in a m o u n ts so t h a t c o n c e n tra tio n of a n a ly te s in th e s ta n d a r d h a ir sa m p le s ra n g e d from 0 to 10 ng/m g. 10 pl of 10 pg/m l in te rn a l s ta n d a r d so lu tio n w as a d d e d to e a ch sam p le. T h e fin al con
c e n tra tio n of in te r n a l s ta n d a r d in each sam p le w a s 2 ng/m g.
H ydrolysis and extraction
H a ir s a m p le s sp ik ed w ith s ta n d a r d su b s ta n c e s w ere d ig ested by acid h y drolysis. 1 m l of 0.1 M h ydrochlo ric acid w as a d d e d to ea ch sam p le a n d th e n in c u b a te d for 16 h o u rs a t a te m p e r a tu re of 50°C. A fte r hy droly sis, th e a q u e ous p h a se w a s e x tra c te d w ith solid p h a s e e x tra c tio n u s in g a B ond E lu t C er
tify C olum n a n d e x tra c tio n a p p a ra tu s . F irs t, in c u b a te d sa m p le s w ere cooled to room te m p e r a tu re a n d ce n trifu g e d a t a sp eed of 4000 cycles/m in for 2 m in.
T hen, th e acidic p h a s e w as s e p a ra te d from h a ir re s id u e a n d tra n s f e rre d to a p p ro p ria te ly m a rk e d 20 m l g lass vials. H a ir re s id u e s w ere th e n rin s e d w ith 1 m l of p h o s p h a te b u ffe r (pH = 7.4) a n d a g a in c e n trifu g e d for 2 m in a t 4000 re v o lu tio n s/m in . T he b u ffer p h a se w a s com bined w ith th e acid p h ase, a n d th e n 1 m l of p h o sp h a te b u ffe r w a s added. B efore ap p ly in g s u p e r n a ta n t
to th e e x tra c tio n colum ns, th e y w ere co nd ition ed w ith 2 m l of m e th a n o l a n d 2 m l 0.0115 M of hyd rochloric acid. A fte r co nditioning, th e v a c u u m w as tu rn e d off a n d p h o sp h a te b u ffe r w a s a p p lie d onto th e colum ns, allow ing it to freely flow th ro u g h th e b ed u n d e r g ra v ita tio n . N ext, to rem ove th e in te r f e r in g m a trix from th e sam p les, th e colu m ns w ere w a sh e d w ith 2 m l of 0.0115 M HCl, 2 m l of 0.012 M H 3P O 4, 2 m l of 0.087 M C H 3COOH a n d 2 m l of 2-propanol. A fte r th is step, th e co lu m n s w ere d ried u n d e r v a c u u m for 30 m in. F in a lly , a n a ly te s w ere elu ted , w ith o u t u se of v acu um , w ith 2 m l of m ix tu re of d ich lo ro m eth an e , iso propanol, a n d trie th y la m in e (78:20:2, v/v/v) in to 2 m l of sila n ise d g lass vials.
D erivatisation
E x tra c ts w ere d e riv a tis e d by in c u b a tio n a t 70°C for 30 m in w ith 50 |il P F P A (p e n ta flu o ro p ro p io n ic ac id a n h y d r a te ) a n d 50 |il 75% P F P O H (2,2,3,3,3-penta-fluoro-1-propanol). T he d e riv a tisin g a g e n t w a s ev a p o ra te d u n d e r n itro g en . A fte r e v a p o ra tio n th e d rie d re s id u e w a s dissolved in 50 |il of d ried chloroform . T he fin a l sam p les w ere a n a ly se d by m e a n s of g as c h ro m a to g ra p h y coupled to m a s s sp e c tro m e try (GC/MS).
GC/MS an alysis
H a ir a n a ly s is w as p erfo rm ed w ith a V a ria n s e rie s 3400 g as ch ro m a to g ra p h coupled to a F in n ig a n M a t M a g n u m ion tr a p d etector. T he gas c h ro m a to g ra p h w as eq u ip p ed w ith a sp lit/s p litle ss injector. T he sam ple (2 ql) w a s in jected in sp litle ss m ode (1 m in). C h ro m ato g ra p h ic s e p a ra tio n w a s ach iev ed on a H e w le tt P a c k a rd H P-5M S F u se d S ilica C ap illa ry (len g th 30 m, in n e r d ia m e te r 0.25 m m , film th ic k n e s s 0.25 qm). T h e flow of th e c a r rie r gas (heliu m 6.0) w as 1.2 cm 3/m in . T he in jecto r te m p e r a tu re w a s s e t to 260°C. T he colum n te m p e r a tu re p ro g ra m m e w a s m ad e u p of 3 stag es: 130°C m a in ta in e d for 1 m in, th e n ra is e d lin e a rly by 20°C /m in u p to 275°C a n d m a in ta in e d a t 275°C for 4.5 m in. T he tr a n s f e r lin e w a s m a in ta in e d a t 280°C a n d th e ion tr a p w as o p e ra te d a t a te m p e r a tu re of 220°C in p o sitive electro n im p a c t io n isa tio n m ode (EI). T he en e rg y of th e b o m b a rd in g elec tro n b ea m w a s 70 eV. T he elec tro n m u ltip lie r voltag e w a s s e t to 1900 V. Io n tr a p w as o p e ra te d in a full sca n m ode (m ass ra n g e 50 to 600 m/z).
RESULTS AND CONCLUSION
F ig u re 1 show s ch ro m a to g rap h ic s e p a ra tio n of ta r g e t com pounds (rang e from 600 to 800 scans) in a s ta n d a r d h a ir sam p le c o n ta in in g 5 ng /m g of a n a ly te s a n d 2 ng/m g of in te r n a l s ta n d a rd s . Id e n tific a tio n of ch ro m a to
D eterm ination o f morphine, codeine . 43
g ra p h ic p e a k s co rresp o n d in g to m o rp h in e-d i-P F P , m orph in e-D 3-di-P F P , co- d ein e-P F P , codeine-D 3-PF P , 6-M A M -PFP a n d 6-M A M -D 3-PFP w as b ase d on th e ir re te n tio n tim e s a n d com p ariso n of th e m ass sp e c tra of e lu te d com p o u n d s w ith refere n ce m a ss sp e c tra from th e M ag n u m so ftw are lib rary .
Fig. 1. C hrom atograp hic s e p a ra tio n of a n a ly te s (m orphine-di-P F P , mor- phine-D3-di-PFP, codeine-PFP, codeine-D3-PFP, 6-MAM-PFP, 6-MAM-D3-PFP) in a range from 600 to 800 scans - standard hair sample containing 5 ng/mg of analytes and 2 ng/mg of internal standards.
Q u a n tita tiv e a n a ly sis w as b a se d on c a lib ra tio n cu rves in a co n c en tratio n ra n g e 0 -1 0 ng/m g. I n te r n a l s ta n d a r d s w ere d e u te riu m lab elled d eriv a tiv e s of a n a ly te s. T he co n c e n tra tio n s of xenobiotics in h a ir sam p les collected from 36 p a tie n ts (12 d etoxification a n d 24 m e th a d o n e m a in te n a n c e p ro g ram m e p a tie n ts ) w ere c a lc u la te d u sin g c a lib ra tio n d a ta files c re a te d w ith M ag n u m S oftw are. In 20 cases, th e c a lc u la te d c o n c e n tra tio n s w ere below th e d e te c tio n lim its of th e ta r g e t su b s ta n c e s (m o rp h in e - 0.3 ng/m g, codeine - 0.6 ng/m g, 6 -m o noacetylom orp hin e - 0.6 ng/m g), so th e fin a l re s u lts w ere r e corded as n e g a tiv e a n d th e c o n c e n tra tio n v a lu e w as re g a rd e d as 0.0 ng/m g.
T he c o n c e n tra tio n s of th e a n a ly te s in th e re m a in in g p a tie n ts ’ h a ir sam p les w ere in th e follow ing ra n g es: m orp hine: 0 .3 -3 2 .5 ng/m g, codeine 0.6
8.5 ng/m g, a n d 6-m onoacetylom orfiny 0 .6 -2 .4 ng/m g. T he c o n c e n tra tio n of th e ta rg e t xenobiotics found in h a ir of selected p a tie n ts a re show n in F ig u re 2.
T he m eth o d of d e te rm in a tio n of opium alk alo id s in h a ir allow s a s c e rta in m e n t of o p iates c o n c e n tra tio n in p a r tic u la r se g m e n ts of h a ir s tra n d s c o rre sp o n d in g to p a r tic u la r tim e periods. C o n tra rily to blood a n d u rin e an a ly sis, w hich gives only gives sh o rt-te rm in fo rm a tio n on “p re se n c e ” of xenobiotics (hours - days), h a ir te s tin g en a b le s d e te rm in a tio n of chronic d ru g u se
(w eeks - m on th s), id e n tific a tio n of th e ty p e of d ru g, a n d d etec tio n of th e tim e period in w hich th e d ru g s w ere ta k e n .
Fig. 2. Concentrations of xenobiotics (S1 — 6-MAM, S2 — codeine, S3 — morphine) in hair segments of: a) patient 3, b) patient 4, c) patient 8 and d) patient 28.
The concentrations of m orphine, codeine a n d 6-m onoacetylm orphine found in th e h a ir of selected p a tie n ts a re p re sen ted in F igure 2; th ese in dicate opiates use h isto ry (e.g. p a tie n t 3 - F igure 2a, p a tie n t 4 - F igure 2b, p a tie n t 8 - F ig
u re 2c) or abstinence periods (p atien t 28 - segm ent 10 - F igure 2d).
T he o b ta in e d re s u lts to a la rg e deg ree re flect th e clinical p ic tu re of th e p a tie n ts . F or in sta n c e , th e y confirm in fo rm a tio n g ain ed from in te rv ie w s c a r rie d o u t w ith p a tie n ts u n d erg o in g tre a tm e n t, co n cerning th e ty p e of d ru g s of a b u se u se d a n d th e p eriod of d ru g ad dictio n. M oreover, h a ir a n a ly s is h a s e n ab led th e m o n ito rin g of a b stin e n c e of p a tie n ts in d eto xificatio n a n d m e th a done m a in te n a n c e p a tie n ts tr e a te d in th e Szczecin C e n tre for D etoxification a n d D ru g A ddiction T re a tm e n t.
To d ra w m ore conclusions, h a ir a n a ly s is of a g re a te r n u m b e r of p a tie n ts m u s t be perform ed. T his w ill en a b le d e te rm in a tio n of th e av e ra g e concen
tr a tio n of p a r tic u la r o p iate com pounds in lig h tly a n d stro n g ly a d d icte d p e r sons u sin g liq u id “P olish h e ro in ”, w hose com position differs from solid h e r
D eterm ination o f morphine, codeine 45
oin (brow n su g ar) found in w e s te rn co u n trie s [1, 6]. F u rth e rm o re , it w ill fa c ilita te ad ju d ic a tio n in c o u rt cases in w h ich ad d ictio n m u s t be a s c e rta in e d .
References:
1. B a r n f i e l d C., B u r n s S. , B y r o n D. L. [et al.], The routine profiling of forensic heroin sam ples, Forensic Science International 1988, vol. 39, pp. 107—117.
2. B a u m g a r t n e r W. A., Discussion of hair analysis for drugs of abuse, Journal of Forensic Sciences 1990, vol. 35, pp. 778—779.
3. B r e w e r C., Hair analysis as a tool for monitoring and managing patients on m ethadone m aintenance, Forensic Science International 1993, vol. 63, pp. 277—283.
4. C h i a r o t t i M, S t r a n o - R o s i i S. , O f f i d a n i C. [et al.], Evaluation of co
caine use during pregnancy through toxicological analysis of hair, Journal of Analytical Toxicology 1996, vol. 20, pp. 555—558.
5. G a i l l a r d Y. , V a y s s e t t e F. , P e p i n G., Compared interest between hair analysis and urinalysis in doping controls. Results for amphetamines, corti
costeroids and anabolic steroids in racing cyclists, Forensic Science Interna
tional 2000, vol. 107, pp. 361—379.
6. K a i a M. , L e c h o w i c z W. , S t a n a s z e k R., Kompot — the Polish source of opium alkaloids, Problems of Forensic Sciences 1998, vol. 37, pp. 45—54.
7. L e w i s D. , Mo o r e C., M o r r i s s e y P. [et al.], Determination of drug expo
sure using hair: application to child protective cases, Forensic Science Interna
tional 1997, vol. 84, pp. 123—128.
8. R i c o s s a M. C., B e r n i n i M. , de F e r r a r i F., Hair analysis for drivingli- cense in cocaine and heroin users. An epidemiological study, Forensic Science International 2000, vol. 107, pp. 301—308.
9. S a c h s H., Forensic applications of hair analysis, [in:] Drug testing in hair, Kintz P. [ed.], CRC Press, Boca Raton 1996.
10. S a c h s H., Theoretical limits of the evaluation of drug concentrations in hair due to irregular hair growth, Forensic Science International 1995, vol. 70, pp. 53—61.
11. S m e r e k J. J . , B a u m g a r t n e r W. A. , T o l l o s J. A. [et al.], Hair analysis for detection of phencyclidine in newly adm itted psychiatric patients, Am eri
can Journal of Psychiatry 1985, vol. 142, pp. 950—959.
12. Society of Hair Testing, Statem ent of the Society of Hair Testing Concerning, the examination of drugs in hum an hair, Forensic Science International 1997, vol. 84, pp. 3—6.
13. S u z u k i S. , I n o u n e T. , H o r i H. [et al.], Analysis of metham phetam ine in hair, nail, sweat, and saliva by mass fragmentography, Journal of Analytical Toxicology 1989, vol. 13, pp. 176—178.
14. T a g l i a r o F. , de B a t t i s i Z. , L u b l i G. [etal.], Integrated use of hair analy
sis to investigate the physical fitness to obtain the driving license: a casework study, Forensic Science International 1997, vol. 84, pp. 129—135.
R enata WIETECHA, Roman STANASZEK
WPROWADZENIE
W ostatnich latach w Polsce problemy związane z narkom anią i jej zapobiega
niem uległy nasileniu. Spowodowało to zmianę i zaostrzenie przepisów prawa regu
lującego zapobieganie narkomanii. Wielokrotnie podstawą do sądowego orzekania w tych sprawach s ą wyniki badań laboratoryjnych. Od laboratoriów sądowych wy
maga się obecnie nie tylko identyfikacji skonfiskowanych narkotyków, ale potwier
dzenia ich używania. Pojawiła się więc potrzeba opracowania procedur oznaczania narkotyków i ich metabolitów w nowych, alternatywnych w stosunku do klasycznych (krwi i moczu) materiałach biologicznych takich jak włosy, ślina i inne [13].
Włosy stanowią cenny m ateriał diagnostyczny ze względu na nieinwazyjność pobierania próbek, ich trwałość, a także fakt, że analiza włosów dostarcza informacji na tem at bliskiej i dalszej historii uzależnienia lub abstynencji danej osoby od substancji psychoaktywnych [2].
Szczególne znaczenie analiza włosów odgrywa w toksykologii sądowej. Bardzo często zdarza się, że jedynym materiałem do badań toksykologicznych, nadającym się do nich lub w ogóle dostępnym, s ą włosy. Przykładem mogą być znalezione po długim czasie zwłoki (ofiary utonięć, wypadków drogowych, katastrof lotniczych, zwłoki po ekshumacji itp.), które s ą tak silnie rozłożone, że nie można z nich pobrać płynów ustrojowych [9].
Dzięki analizie włosów można przeprowadzić badania narażenia osób na działa
nie ksenobiotyków. Przykładem są badania dzieci, które żyją wśród dorosłych uza
leżnionych od kokainy, lub też analiza włosów noworodka w celu kontroli narażenia na narkotyki lub leki spowodowanego przyjmowaniem ich przez matkę w czasie ciąży. Dzięki tej analizie można wyjaśnić objawy uzależnienia, abstynencji lub nie
dorozwoju noworodka [4]. Coraz większe zastosowanie zdobywa analiza włosów w badaniach klinicznych, np. monitorowaniu terapii lekami, kontroli abstynencji w programach leczenia uzależnień [11] oraz badaniach epidemiologicznych [8].
Analiza włosów ma także zastosowanie w sądowych sprawach cywilnych, takich jak rozwody, przyznanie opieki nad dzieckiem, adopcje oraz ubezpieczenia [7].
Istnieje możliwość wykorzystania jej przez instytucje wydające prawo jazdy oraz przez pracodawców przed zatrudnieniem pracowników [14]. Poprzez możliwość oznaczania innych organicznych substancji, analizę włosów wykorzystuje się także do kontroli stosowania środków dopingujących u sportowców i zwierząt sportowych [5].
CEL PRACY
Przedmiotem niniejszej pracy było zastosowanie opracowanej w Instytucie Eks
pertyz Sądowych procedury oznaczania alkaloidów opium we włosach do badania
O znaczanie morfiny, kodeiny 47
pacjentów leczonych w Oddziale Detoksykacji Przychodni dla Osób Uzależnionych od Środków Psychoaktywnych Centrum Psychiatrycznego Publicznego Psychia
trycznego Zakładu Opieki Zdrowotnej w Szczecinie oraz uczestników programu metadonowego [3] na obecność alkaloidów opium (morfiny, kodeiny i 6-monoacetylo- morfiny — 6-MAM) oraz ocena jej przydatności w praktyce.
MATERIAŁY I METODY
Substancje w zorcow e
Substancje wzorcowe (morfina, kodeina i 6-monoacetylomorfina) oraz ich deute
rowe pochodne używane jako standardy wewnętrzne (morfina-D3, kodeina-D3, 6-monoacetylo-morfina-D3 - 6-MAM-D3) zostały zakupione w firmie Promochem (Radian).
O dczynniki
W badaniach wykorzystano następujące oddczynniki: trietyloam ina (cz.d.a., Merck), dichlorometan (cz.d.a., Merck), acetonitryl (Gradient Grade for HPLC, M erck), bezw odnik kw asu pentafluoropropionow ego - PFPAA (Supelco), 75% 2,2,3,3,3-pentafluoro-1-propanol - PFPOH (Sigma - Aldrich), 2-propanol (cz.d.a) oraz aceton (cz.d.a, Ośrodek Badawczo-Rozwojowy Przemysłu Rafineryjnego w Płocku), chloroform (cz.d.a., Polskie Odczynniki Chemiczne), metanol (cz.d.a., Eurochem BGD). Kolumny ekstrakcyjne Bound Elut Certify, których złoże składało się z mieszaniny sorbenta C8 i silnego wymieniacza kationowego (SCX), nabyto w fir
mie Varian.
M ateriał do badań
M ateriał do badań stanowiły próbki włosów pobrane od 36 uzależnionych pacjen
tów leczonych w Oddziale Detoksykacji Przychodni dla Osób Uzależnionych od Środków Psychoaktywnych Centrum Psychiatrycznego Samodzielnego Publicznego Psychiatrycznego Zakładu Opieki Zdrowotnej w Szczecinie oraz uczestników progra
mu metadonowego. Próbki włosów używane do przygotowania ślepej próby oraz próbek kalibracyjnych były pobrane od dzieci nie narażonych na działanie badanych związków.
Sprzęt i aparatura
Do oznaczania alkaloidów opium we włosach zastosowano chromatograf gazowy (GC) serii 3400 firmy Varian sprzężony ze spektrometrem mas (MS) wersji Magnum firmy Finnigan Mat typu pułapka jonowa (ITD). Rozdział chromatograficzny składni
ków próbki prowadzono na kolumnie kapilarnej FSCC (Fused Silica Capilary Column, HP-5MS, długość - 30 m, średnica wewnętrzna - 0,25 mm, grubość filmu - 0,25 pm).
Próbki włosów mielono w młynie kulowym firmy Retsch KG. Ekstrakcję na fazie stałej wykonywano przy użyciu aparatu podciśnieniowego firmy Baker.
P rzygotow an ie próbek w łosów do analizy
Próbki włosów zostały ucięte przy skórze w potylicznej części głowy według zaleceń Towarzystwa Badania Włosów [12]. Miejsce cięcia i końcówkę kosmyka oznaczono b iałą baw ełnianą nitką. Szczegółowe dane dotyczące wybranych pacjen
tów i pobranych od nich próbek zamieszczono w tabeli I.
Każda próbka została poddana procesowi dekontaminacji, który obejmował mycie włosów przy użyciu sekwencji rozpuszczalników: 2-propanolu, buforu fosfora
nowego (pH = 7,4) oraz dichlorometanu. W celu przeprowadzenia analizy segmen
towej (analizy poszczególnych odcinków włosów), wcześniej wysuszone próbki wło
sów poddano podziałowi na dwucentymetrowe segmenty, zaczynając od miejsca ucięcia włosów, aż do końca kosmyka. Znając datę pobrania próbki oraz średnią szybkość wzrostu włosów (ok. 1 cm/miesiąc [9, 10]) i analizując kolejne sekwencje włosów, można uzyskać informacje na tem at historii używania (lub czasu absty
nencji) danego związku chemicznego w poszczególnych odcinkach czasu od momentu pobrania próbki.
W celu wstępnego rozdrobnienia próbki włosów, pocięto je nożyczkami na części 0 długości ok. 1 mm, a następnie zmielono w młynku kulowym. Do analizy odważano po 50 mg zmielonych włosów pochodzących z każdego segmentu i poddano kolejnym etapom analizy. Dla każdej serii oznaczeń przygotowano próbki wzorcowe służące do sporządzenia krzywej kalibracyjnej. W tym celu odważono pięć 50 miligramowych zmielonych próbek „ślepych” (włosów nie zawierających analitów). Następnie dodawano do nich takie objętości roztworów roboczych morfiny i kodeiny w metanolu oraz 6-MAM w acetonitrylu o stężeniu 1 oraz 10 pg/ml, by stężenia analitów w próbkach wzorcowych wynosiły od 0 do 10 ng/mg. Ponadto do każdej analizowanej próbki dodano po 10 pl roztworów wzorców wewnętrznych o stężeniu 10 pg/ml.
Ostateczne stężenie standardu wewnętrznego w każdej próbce wynosiło 2 ng/mg.
H ydroliza i ekstrakcja
Próbki włosów wraz z dodanymi substancjami wzorcowymi poddawano kwaśnemu roztwarzaniu hydrolitycznemu. Do każdej próbki dodawano po 1 ml 0,1 M kwasu sol
nego i inkubowano przez 16 godzin w tem peraturze 50°C. Po zakończonej hydrolizie fazę wodną ekstrahowano na fazie stałej przy użyciu kolumn Bond Elut Certify oraz aparatu do ekstrakcji. W pierwszej kolejności próbki po hydrolizie doprowadzano do tem peratury pokojowej, po czym odwirowywano przez 2 min przy prędkości 4000 ob
rotów/min. Następnie oddzielano fazę kw aśną od próbki włosów i przenoszono do od
powiednio opisanych szklanych fiolek o pojemności 20 ml. Próbki następnie prze
mywano 1 ml buforu fosforanowego (pH = 7,4) i ponownie odwirowywano przez 2 min przy 4000 obr./min. Fazę buforową dołączano do fazy kwaśnej. Następnie do połączo
nych faz dodawano 1 ml buforu fosforanowego. Przed naniesieniem supernatantu na kolumny ekstrakcyjne poddawano je kondycjonowaniu 2 ml metanolu oraz 2 ml 0,0115 M kwasu solnego. Po etapie kondycjonowania złoża wyłączano podciśnienie 1 naniesiono fazę buforową na kolumny, pozwalając jej swobodnie przepłynąć przez wypełnienie kolumn ekstrakcyjnych pod wpływem sił grawitacji. W dalszej kolej
ności kolumny poddawano myciu za pomocą2 ml 0,0115 M HCl, 2 ml 0,012 M H3PO4, 2 ml 0,087 M CH3COOH oraz 2 ml 2-propanolu w celu usunięcia interferującej m a
trycy znajdującej się w ekstrahowanym roztworze. Po wymyciu kolumny osuszano
O znaczanie morfiny, kodeiny 49
pod pełnym podciśnieniem przez 30 min. Analizowane substancje eluowano bez użycia podciśnienia 2 ml mieszaniny dichlorometanu, izopropanolu trietyloaminy w stosunku i objętościowym 78:20:2 do oznaczonych, szklanych, wcześniej silanizo- wanych fiolek o pojemności 2 ml.
D eryw atyzacja
E kstrakty poddawano derywatyzacji przez dodanie 50 pl PFPA (bezwodnika kwasu pentafluoropropionowego) oraz 50 pl 75% PFPOH (2,2,3,3,3-penta-fluoro- 1-propanolu) oraz inkubowaniu przez 30 min w tem peraturze 70°C. Następnie odparowywano odczynnik derywatyzujący w strum ieniu azotu. Po odparowaniu suchą pozostałość rozpuszczano w 50 pl wcześniej osuszonego chloroformu. Tak przygotowane próbki poddawano analizie metodą chromatografii gazowej sprzężo
nej ze spektrom etrią mas (GC/MS).
W arunki an alizy GC/MS
Analizę przeprowadzano, stosując chromatograf gazowy (Varian, model 3400) sprzężony ze spektrometrem masowym (pułapka jonowa wersji Magnum) firmy Finnigan Mat. Chromatograf gazowy wyposażony był w dzielnik strum ienia gazu nośnego. N astrzyku próbki (2 pl) dokonywano przy odpowiedniej konfiguracji dozow
nika, przy której próbka nie jest dzielona (1 min). Rozdział składników próbki następował na kolumnie kapilarnej HP-5MS o długości 30 m, średnicy wewnętrznej 0,25 mm i grubości filmu 0,25 pm). Gazem nośnym był hel, którego przepływ przez kolumnę wynosił 1,2 cm3/min. Tem peratura injektora wynosiła 260°C. Program temperaturowy kolumny chromatograficznej składał się z 3 etapów: początkowo kolum na była utrzym yw ana w tem peraturze 130°C przez 1 min, następnie tem peratura w zrastała liniowo z szybkością 20°C/min do 275°C i przez 4,5 minuty nie zmieniała swojej wartości. Linia transferowa była utrzymywana w tem peraturze 280°C, a pułapka jonowa pracowała w tem peraturze 220°C. Jonizacja następowała w wyniku bombardowania strum ieniem elektronów (EI) o energii 70 eV. Powielacz jonowy pracował pod napięciem 1900 V. Zakres skanowania pułapki jonowej wynosił od 50 do 600 m/z.
WYNIKI I WNIOSKI
Na rycinie 1 przedstawiono chromatogram obrazujący rozdział chromatograficz
ny badanych związków w zakresie od 600 do 800 liczby skanów na przykładzie próbki wzorcowej o stężeniu analitów 5 ng/mg i standartów wewnętrznych o stężeniu 2 ng/mg. Identyfikacji pików chromatograficznych morfiny-di-PFP, morfiny-D3- di-PFP, kodeiny-PFP, kodeiny-D3-PFP, 6-MAM-PFP oraz 6-MAM-D3-PFP dokonano na podstawie czasów retencji oraz na drodze porównania widm masowych eluowa- nych związków z widmami masowymi substancji wzorcowych znajdującymi się w bi
bliotece widm, wchodzącej w skład oprogramowania Magnum.
Analizę ilościową przeprowadzono w oparciu o krzywe kalibracyjne w zakresie stężeń 0-10 ng/mg. Standard wewnętrzny stanowiły deuterowane pochodne anali- tów. Na podstawie utworzonych zbiorów danych kalibracyjnych z wykorzystaniem oprogramowania aparatu obliczono zawartość poszczególnych ksenobiotyków w b a
danych próbkach włosów 36 pacjentów, w tym 12 pacjentów poddanych detoksykacji i 24 pacjentów objętych programem metadonowym. W przypadku 20 pacjentów otrzymane wyniki mieściły się poniżej granicy wykrywalności analizowanych kseno- biotyków (morfina - 0,3 ng/mg, kodeina - 0,6 ng/mg, 6-monoacetylomorfina - 0,6 ng/mg) i w tych przypadkach przyjęto, iż wynik jest „ujemny” i jego wartość wynosi 0,0 ng/mg. We włosach pozostałych pacjentów stężenie morfiny mieściło się w przedziale 0,3-32,5 ng/mg, kodeiny 0,6-8,5 ng/mg, a 6-monoacetylomorfiny 0,6-2,4 ng/mg. Zawartość określonych ksenobiotyków dla wybranych pacjentów zamieszczono na rycinie 2.
Wykorzystując metodę oznaczania alkaloidów opium we włosach, można określić stężenie opiatów w poszczególnych segmentach włosów, które odpowiadająkolejnym przedziałom czasu. Dzięki tem u istnieje możliwość stwierdzenia chronicznego uży
wania określonych narkotyków, ich rodzaju oraz okresu przyjmowania w prze
ciwieństwie do tych metod, w których jako m ateriał biologiczny stosuje się krew i mocz. W tych przypadkach otrzymujemy wynik określający tylko „obecną” (okres od kilku godzin do paru dni) zawartość ksenobiotyków w organizmie.
Zamieszczone na rycinie 2 wyniki stężeń morfiny, kodeiny oraz 6-monoacetylo- morfiny wyznaczonych dla poszczególnych pacjentów przedstaw iają historię przyj
mowania (np. pacjent nr 3 - ryc. 2a, pacjent n r 4 - ryc. 2b, pacjent nr 8 - ryc. 2c) lub okresy abstynencji (np. pacjentka nr 28 - segment 10 - rycina 2d) środków odurza
jących z grupy alkaloidów opium.
Uzyskane wyniki w dużym stopniu odzwierciedlają obraz kliniczny pacjenta, m.in. potwierdzają informacje pochodzące z wywiadu przeprowadzonego z leczonymi pacjentami, a dotyczące rodzaju stosowanych substancji odurzających, tj. „kompo
tu” - „polskiej heroiny” oraz okresu uzależnienia. Ponadto umożliwiająmonitorowa- nie abstynencji pacjentów poddanych detoksykacji i objętych programem metadono- wym w Oddziale Detoksykacji Przychodni dla Osób Uzależnionych od Środków Psychoaktywnych Centrum Psychiatrycznego Publicznego Psychiatrycznego Zakła
du Opieki Zdrowotnej w Szczecinie.
W celu sformułowania dalszych wniosków, konieczne jest przebadanie większej liczby pacjentów. Pozwoli to także określić średnie stężenia poszczególnych związ
ków u średnio i silnie uzależnionych osób przyjmujących tzw. „polskąheroinę”, której skład różni się od stałej heroiny, tzw. brown sugar, spotykanej w krajach zachodnich [1, 6] oraz ułatwi orzekanie w sprawach sądowych, w których istnieje konieczność stwierdzenia uzależnienia.
