kliknij

(1)

Otrzymywanie i niektóre zastosowania unieruchomionych enzymów

Józef Synowiecki, Sylwia Wo³osowska

Katedra Chemii, Technologii i Biotechnologii ¯ywnoœci, Wydzia³ Chemiczny, Politechnika Gdañska, Gdañsk

Production and selected applications of immobilized enzymes

S u m m a r y

The presented data explain why application of immobilized enzyme sys- tems is advantageous in many modern industrial technologies. Also, this reviev article contains information concerning the main methods developed for enzyme immobilization, as well as characteristic, suitability and properties of dif- ferent carriers used for these purposes. Furthermore, the influence of immobilization process on changes of enzyme activity, selectivity, stability, conditions of catalysed reaction and other properties important in practical applications are described. Emphasis is placed on the choice of immobilized enzyme system ad- equate for the designed technology.

Key words:

enzyme immobilization, enzyme supports, biocatalysis, biosensors, biofuel cells.

1. Wstêp

Obni¿enie kosztu i usprawnienie wytwarzania wielu produk- tów mo¿na osi¹gn¹æ poprzez zapewnienie ci¹g³oœci, procesu stosuj¹c unieruchomione (immobilizowane) enzymy, których istot- n¹ zalet¹ jest mo¿liwoœæ ³atwego usuniêcia ze œrodowiska reakcji po jej zakoñczeniu. Ich zastosowanie pozwala na wielokrotne wykorzystanie tej samej porcji preparatu w kolejnych szar¿ach produkcyjnych lub w reaktorach przep³ywowych oraz eliminuje koniecznoœæ inaktywacji enzymu po osi¹gniêciu po¿¹danego stopnia konwersji substratu. Stosowanie unieruchomionych

Adres do korespondencji Józef Synowiecki, Katedra Chemii, Technologii

i Biotechnologii ¯ywnoœci, Wydzia³ Chemiczny, Politechnika Gdañska, ul. Gabriela Narutowicza 11/12,

80-952 Gdañsk;

e-mail:

synowiec@chem.pg.gda.pl

2 (77) 7–26 2007

(2)

enzymów jest tak¿e korzystne ze wzglêdu na lepsz¹ kontrolê warunków reakcji oraz brak zanieczyszczenia produktu enzymem i innymi substancjami pochodz¹cymi z nisko oczyszczonego preparatu biokatalizatora. W przypadku enzymów proteolitycznych immobilizacja zapobiega ich autodestrukcji, czêsto wystêpuj¹cej w roztworach natywnego preparatu (1).

2. Sposoby immobilizacji

Immobilizowanymi enzymami s¹ preparaty wytworzone przez po³¹czenie biokatalizatora z noœnikiem nierozpuszczalnym w œrodowisku reakcji, a tak¿e nierozpuszczalne agregaty cz¹steczek lub kryszta³ów bia³ka oraz enzymy zamkniête w strukturze ¿elu lub oddzielone od œrodowiska reakcji pó³przepuszczalnymi membranami (rys. 1). Najwczeœniej stosowane sposoby immobilizacji polega³y na przy-

³¹czeniu enzymu do powierzchni noœnika. Odbywa siê to przez fizyczn¹ adsorpcjê biokatalizatora, wi¹zanie z udzia³em oddzia³ywañ jonowych lub przez wytworzenie wi¹zañ kowalencyjnych (2-4). Jeœli bezpoœrednia reakcja pomiêdzy bia³kiem a noœni- kiem nie jest mo¿liwa stosuje siê substancje posiadaj¹ce co najmniej dwie grupy chemiczne zdolne do reakcji zarówno z noœnikiem jak i enzymem (5). Zwiêkszaj¹ one odleg³oœæ pomiêdzy cz¹steczkami unieruchomionego enzymu a powierzchni¹ noœnika, co u³atwia dostêp substratu do centrum katalitycznego.

Rys. 1. G³ówne sposoby immobilizacji enzymów.

(3)

W przypadku gdy nie ma potrzeby zbyt trwa³ego wi¹zania enzymu jako noœniki mo¿na wykorzystaæ rozmaite sorbenty, których zalet¹ jest nieskomplikowana pro- cedura immobilizacji oraz mo¿liwoœæ ³atwej regeneracji poprzez wymycie nieaktyw- nego ju¿ bia³ka (6). Nie nastêpuj¹ te¿ zazwyczaj zmiany struktury cz¹steczek enzymu, które mog¹ spowodowaæ zmniejszenie jego aktywnoœci. Niewielka energia uczestnicz¹cych w wi¹zaniu bia³ka oddzia³ywañ jest jednak przyczyn¹ doœæ szybkiej desorpcji enzymu podczas dzia³ania reaktora.

Silniejsze wi¹zanie zapewniaj¹ oddzia³ywania jonowe powstaj¹ce w zakresie pH przy którym zarówno enzym jak i noœnik uzyskuj¹ ³adunek elektryczny. Jeœli grupy funkcyjne enzymu i noœnika maj¹ ³adunek jednakowego znaku do zaistnienia wi¹zania niezbêdne s¹ dwuwartoœciowe kationy, sprzêgaj¹ce bia³ko za poœrednictwem mostków solnych. W przypadku stosowania silnych kationitów lub anionitów posze- rza to zakres wartoœci pH przy których nastêpuje jonowe wi¹zanie enzymu (7).

Przyk³adem tego s¹ noœniki z grupami sulfonowymi, które anga¿uj¹ kationy Me²⁺

w wi¹zanie –OSO₃^-+Me^+-OOC- zastêpuj¹ce bezpoœrednie oddzia³ywanie grup – OSO₃^-i⁺H₃N- wyeliminowane wskutek zaniku protonowania grup aminowych enzymu.

W celu ograniczenia desorpcji enzymów w œrodowisku o podwy¿szonej sile jonowej stosuje siê noœniki o du¿ej gêstoœci i dostêpnoœci ³adunku. Wytwarza siê je przez pokrycie sorbentu warstw¹ polietylenoiminy, chitozanu lub innego polimeru (6,8). Unieruchomiona w ten sposóbb-galaktozydaza traci³a tylko 5% pierwotnej ak- tywnoœci po inkubacji w 0,4 M roztworze NaCl, podczas gdy enzym zaadsorbowany na DEAE agarozie by³ w tych warunkach wymywany a¿ w 70% (6). Zwiêkszenie energii wi¹zania i poprawa stabilnoœci preparatu jest skutkiem wielopunktowego oddzia³ywania enzymu z noœnikiem uzale¿nionego od gêstoœci ³adunku oraz od wiel- koœci i struktury cz¹steczek bia³ka (8). Immobilizacjê bez udzia³u wi¹zañ kowalencyjnych z powodzeniem stosowano do unieruchamiania lipaz i innych enzymów katalizuj¹cych reakcje w œrodowisku zawieraj¹cym rozpuszczalniki organiczne (1,9,10).

Zmniejszenia aktywnoœci operacyjnej preparatu spowodowanego desorpcj¹ enzymu mo¿na unikn¹æ wykorzystuj¹c procedury immobilizacji polegaj¹ce na wytwa- rzaniu wi¹zañ kowalencyjnych w warunkach nie powoduj¹cych denaturacji bia³ka.

Niepo¿¹danemu sprzêganiu enzymu za poœrednictwem reszt aminokwasowych centrum katalitycznego mo¿na przeciwdzia³aæ blokuj¹c je przed immobilizacj¹ cz¹s- teczkami substratu lub kompetytywnych inhibitorów. Kowalencyjne wi¹zanie enzymu odbywa siê z udzia³em bia³kowych reszt lizyny, argininy, cysteiny, tyrozyny, kwasów glutaminowego i asparaginowego oraz aminokwasów znajduj¹cych siê w pozycji N- lub C-terminalnej (5). Zale¿nie od budowy chemicznej noœnika przepro- wadzane s¹ reakcje alkilowania, arylowania diazowania amidowania oraz tworzenia wi¹zañ amidowych lub zasad Schiffa. Niekiedy stosuje siê skojarzone metody immobilizacji polegaj¹ce na tworzeniu odrêbnych wi¹zañ kowalencyjnych z grupami funkcyjnymi ró¿nego rodzaju. Taki sposób wykorzystywano np. w celu zwiêkszenia

(4)

iloœci lipazy osadzonej na chitozanie. W pierwszym etapie procesu nastêpuje przy-

³¹czenie cz¹steczki enzymu do grupy hydroksylowej chitozanu aktywowanej 3-di- metyloaminopropylo karbodiimidem (EDC), a w kolejnym sprzêgniêcie nastêpnej cz¹steczki lipazy aldehydem glutarowym (11).

Jako noœniki przydatne s¹ m.in. polimery zawieraj¹ce wolne grupy aminowe, umo¿liwiaj¹ce sprzêganie bia³ka enzymatycznego w ³agodnych warunkach za po- œrednictwem aldehydu glutarowego (12). Jego wad¹ jest tendencja do tworzenia oli- gomerów o zró¿nicowanej d³ugoœci cz¹steczek, bêd¹ca przyczyn¹ niejednakowego oddalenia poszczególnych cz¹steczek biokatalizatora od powierzchni noœnika (13).

Nastêpuje wskutek tego zró¿nicowanie aktywnoœci preparatów wytwarzanych w od- rêbnych szar¿ach produkcyjnych zale¿ne od pochodzenia, czystoœci i okresu przechowywania aldehydu.

Noœniki pozbawione grup chemicznych tworz¹cych wi¹zania kowalencyjne z bia³- kiem lub substancj¹ sprzêgaj¹c¹, jak np. szk³o porowate, ¿el krzemionkowy, tlenki metali lub rozmaite substancje ceramiczne aktywuje siêg-aminopropylotrietoksysilanem (14,15). Uzyskane pochodne zawieraj¹ grupy aminowe umo¿liwiaj¹ce przy-

³¹czenie enzymu za poœrednictwem aldehydu glutarowego, tiofosgenu, chlorku p-nitrobenzoilu lub bezwodnika bursztynowego (16). Aktywacjê wymienionych noœ- ników mo¿na tak¿e osi¹gn¹æ stosuj¹c BCl₃lub SiCl₄, a w dalszym etapie alifatyczn¹ diaminê (16). Negatywnym skutkiem kowalencyjnego wi¹zania enzymu jest zmniejszenie aktywnoœci preparatu spowodowane zmianami struktury cz¹steczek bia³ka oraz ograniczeniem dostêpu substratu do centrum katalitycznego (17).

Inne sposoby otrzymywania nierozpuszczalnych preparatów enzymów polegaj¹ na miêdzycz¹steczkowym usieciowaniu biokatalizatora za poœrednictwem wi¹zañ wytworzonych z substancjami dwufunkcyjnymi, takimi jak aldehyd glutarowy i inne polialdehydy lub kwas bis-diazobenzydynosulfonowy. W zale¿noœci od sposobu przygotowania bia³ka i warunków sieciowania uzyskiwane s¹ preparaty ró¿ni¹ce siê aktywnoœci¹, termostabilnoœci¹, odpornoœci¹ na dzia³anie substancji denaturuj¹cych bia³ka, stopniem uwodnienia, wielkoœci¹ ziaren i wytrzyma³oœci¹ mechaniczn¹ (1,18).

Sieciowanie bia³ek znajduj¹cych siê w roztworze prowadzi do znacznego uwod- nienienia precypitatu oraz niewielkiej wytrzyma³oœci mechanicznej i zró¿nicowanej wielkoœci ziaren. Immobilizowany w ten sposób enzym charakteryzuje siê wpraw- dzie polepszon¹ termostabilnoœci¹, ale trudno jest wytworzyæ preparaty o powta- rzalnych w³aœciwoœciach ze wzglêdu na du¿y wp³yw niewielkich nawet zmian stê¿e- nia substancji sieciuj¹cej oraz pH, temperatury i si³y jonowej œrodowiska reakcji (18). Niekorzystnym skutkiem sieciowania rozpuszczonych bia³ek jest powolna pre- cypitacja wytworzonych agregatów cz¹steczek oraz znaczne, niekiedy nawet ponad 50% zmniejszenie aktywnoœci enzymu (18). Lepsze preparaty uzyskiwano natomiast podczas sieciowania kryszta³ów bia³ka lub te¿ agregatów jego cz¹steczek str¹co- nych wskutek zmniejszenia solwatacji enzymu lub zmiany sta³ej dieelektrycznej roztworu (19-22).

(5)

W³aœciwoœci katalityczne kryszta³ów bia³ka enzymatycznego agregowanych przewa¿nie za pomoc¹ aldehydu glutarowego by³y badane w wielu oœrodkach (19-25). Uzyskane preparaty (CLEC, ang. Cross-Linked Enzyme Crystals) sk³adaj¹ siê z prawie homogennego bia³ka i dziêki temu wykazuj¹ du¿¹ aktywnoœæ i odpornoœæ na dzia³anie czynników denaturuj¹cych, Wynika to z licznych oddzia³ywañ elektro- statycznych i hydrofobowych wystêpuj¹cych w kryszta³ach. Krystaliczna struktura preparatu utrudnia jego inaktywacjê spowodowan¹ degradacj¹ enzymu pod wp³y- wem proteaz znajduj¹cych siê w niektórych przetwarzanych surowcach (26). Immo- bilizowane tym sposobem lipazy z Candida rugosa i Burkholderia cepacia wykazywa³y wysok¹ stereoselektywnoœæ w reakcjach hydrolizy oraz zwiêkszon¹ aktywnoœæ podczas estryfikacji i transestryfikacji prowadzonej w œrodowisku zawieraj¹cym rozpuszczalniki organiczne (27).

Dalsze rozpowszechnienie wymienionej metody immobilizacji nast¹pi po polep- szeniu sposobów wydajnego uzyskiwania kryszta³ów bia³ek o optymalnym kszta³cie i wielkoœci oraz dostêpnoœci przenikaj¹cych ich strukturê kana³ów, u³atwiaj¹cych penetracjê roztworu substratu (26). Wad¹ preparatów tego rodzaju s¹ niewielkie rozmiary cz¹stek usieciowanych kryszta³ów bêd¹ce przyczyn¹ zwiêkszenia oporów przep³ywu substratu w reaktorach kolumnowych.

Kosztownej, d³ugotrwa³ej i trudnej niekiedy do przeprowadzenia krystalizacji enzymów mo¿na unikn¹æ sieciuj¹c precypitat str¹cony uprzednio w niedenaturu- j¹cych warunkach roztworami soli, rozpuszczalnikami organicznymi, b¹dŸ polimerami niejonowymi. Korzystn¹ cech¹ tak wytworzonych preparatów (CLEA, ang.

Cross-Linked Enzyme Aggregates) jest mo¿liwoœæ regulacji ich specyficznoœci poprzez wybór odpowiedniej substancji str¹caj¹cej i warunków procesu. Wynika to z charak- terystycznego i zró¿nicowanego wp³ywu ka¿dego sposobu str¹cania na strukturê bia³ek w precypitacie, utrwalon¹ nastêpnie wskutek sieciowania preparatu (28,29).

Istnieje zatem mo¿liwoœæ uzyskania z tego samego enzymu preparatów o ró¿nym powinowactwie do substratów i odpornoœci na dzia³anie inhibitorów.

Do immobilizacji enzymów mo¿na te¿ wykorzystaæ b³ony o selektywnej prze- puszczalnoœci, spe³niaj¹ce wy³¹cznie funkcjê separacyjn¹, b¹dŸ te¿ zarówno funkcjê separacyjn¹ jak i katalityczn¹ (30,31). Aktywnoœæ unieruchomionych w ten sposób enzymów zale¿y g³ównie od szybkoœci dyfuzji substratu i produktu reakcji przez stosowane membrany. Nie zawieraj¹ce enzymu membrany bierne s³u¿¹ do zamkniê- cia roztworu biokatalizatora w mikrokapsu³ce lub w module reaktora. Do mikrokapsu³kowania konieczne jest stosowanie b³on przepuszczaj¹cych zarówno cz¹steczki substratów jak i produktów reakcji. Membrany zatrzymuj¹ce tylko cz¹steczki substratu s¹ natomiast przydatne do oddzielenia produktów reakcji od zawieraj¹cej rozpuszczony enzym mieszaniny reakcyjnej (rys. 2).

Membrany aktywne katalitycznie, które zawieraj¹ enzym umiejscowiony w ich strukturze lub osadzony na powierzchni polimeru s¹ czêsto u¿ywane do katalizowania reakcji wytwarzaj¹cych produkty ró¿ni¹ce siê od substratów rozpuszczalnoœci¹ w fazie rozpuszczalnika organicznego i wody. Przyk³adem ich zastosowania jest wy-

(6)

odrêbnianie jednego ze sk³adników racematu, polegaj¹ce na katalizowaniu degradacji zbêdnego enancjomeru dzia³aj¹cym stereoselektywnie enzymem (rys. 3) (32).

Kolejn¹ metod¹ unieruchamiania enzymów jest pu³apkowanie (inkluzja) w strukturze ¿elu wytwarzanego po zmieszaniu roztworów enzymu i substancji ¿eluj¹cej.

Ma³a energia oddzia³ywañ wi¹¿¹cych enzym z tworz¹cym ¿el polimerem jest przyczyn¹ ³atwego wymywania biokatalizatora i doœæ szybkiego spadku aktywnoœci preparatu. Przechodzenie biokatalizatora do mieszaniny reakcyjnej, mo¿e byæ ponadto przyczyn¹ zmian w³aœciwoœci produktów spowodowanych nieca³kowitym zahamo- waniem przebiegu reakcji. W celu ograniczenia wymywania glukoamylazy,b-frukto- furanozydazy i b-amylazy z ¿elu poliakrylamidowego przeprowadzano polimeryza- cjê inicjowan¹ promieniowaniemg. Aktywnoœci wytworzonych w ten sposób prepa- ratów by³y tylko o 10-20% mniejsze od aktywnoœci wolnych enzymów (33). Czêsto stosowanym czynnikiem sieciuj¹cym jest aldehyd glutarowy, który próbowano wy- korzystaæ np. do unieruchamianiab-galaktozydazy z Aspergillus niger w ¿elach algi- nianowych i ¿elatynowych. Nastêpowa³o jednak doœæ znaczne zmniejszenie aktyw- noœci preparatu wynosz¹ce oko³o 44% pocz¹tkowej wartoœci (33). Pu³apkowanie w ¿elu nie nadaje siê do immobilizacji hydrolaz powoduj¹cych degradacjê jego

Rys. 2. Funkcje membran w reaktorach enzymatycznych (enzym – E, substrat – S, produkt – P).

Rys. 3. Rozdzielanie mieszaniny D- i L-estrów umieszczon¹ na granicy faz membran¹ z immobilizo- wanym, dzia³aj¹cym stereoselektywnie enzymem.

(7)

sk³adników i nie powinno byæ stosowane w przypadku gdy substraty lub produkty reakcji z trudnoœci¹ migruj¹ w strukturze polimeru, np. z powodu zbyt du¿ej masy cz¹steczkowej.

3. Zalety i wady unieruchomionych enzymów

Stosowanie immobilizowanych enzymów ogranicza siê tylko do substratów wy- stêpuj¹cych w stanie ciek³ym lub w formie roztworów. Przyczyn¹ tego jest brak mo¿liwoœci ³atwego oddzielenia biokatalizatora po zakoñczeniu procesu oraz prawie zupe³ne zahamowanie reakcji przebiegaj¹cej na granicy dwóch faz sta³ych.

Unieruchomienie enzymu zachodzi zwykle wskutek wytworzenia specyficznych oddzia³ywañ cz¹steczek enzymu z matryc¹ odpowiednio dobranego noœnika.

Ubocznym efektem tego procesu jest stabilizacja struktury biokatalizatora przeciwdzia³aj¹ca niekorzystnemu oddzia³ywaniu œrodowiska (5,34). Przejawia siê to wzro- stem termostabilnoœci preparatu bia³kowego, jego odpornoœci na warunki hydrofo- bowe i substancje denaturuj¹ce. Innym pozytywnym efektem immobilizacji enzy- mów jest obni¿enie inhibicji produktami oraz zmiana specyficznoœci wzglêdem inhi- bitorów, spowodowana prawdopodobnie przekszta³ceniami struktury trzeciorzêdo- wej centrum katalitycznego (34).

Negatywn¹ konsekwencj¹ procesu sprzêgania enzymu z noœnikiem jest utrud- nienie zmian oscylacyjnych podczas katalizowania reakcji oraz przestrzenne ograniczenie dostêpu substratu. Obni¿enie aktywnoœci biokatalizatora po unieruchomie- niu zale¿y od rodzaju noœnika, jego porowatoœci oraz od odleg³oœci cz¹steczek enzymu od powierzchni noœnika. W przypadku noœników porowatych na aktywnoœæ katalityczn¹ preparatu wp³ywa szybkoœæ dyfuzji substratu do wnêtrza sorbentu oraz szybkoœæ dyfuzji produktu do œrodowiska reakcji (17). Nasilenie oporów dyfuzyjnych spowodowanych du¿¹ lepkoœci¹ up³ynnionej skrobi jest przyczyn¹ ograniczo- nego u¿ycia immobilizowanych a-amylaz w produkcji syropów maltodekstryno- wych. Negatywne efekty immobilizacji przejawiaj¹ siê zwykle obni¿eniem powinowactwa enzymu do substratu (zwiêkszenie sta³ej Michaelisa oraz zmniejszenie V_max) (17).

Podczas d³ugotrwa³ego stosowania preparatu immobilizowanego enzymu nastê- puje stopniowe zmniejszanie jego aktywnoœci katalitycznej spowodowane prawdopodobnie czêœciow¹ desorpcj¹ biokatalizatora lub jego inaktywacj¹ pod wp³ywem zbyt wysokiej temperatury reakcji lub nieodpowiedniej kwasowoœci i si³y jonowej œrodowiska. Innymi przyczynami tego procesu mog¹ byæ: blokowanie enzymu cz¹s- teczkami produktu, adsorpcja zanieczyszczeñ dzia³aj¹cych jako inhibitory lub te¿

rozwój drobnoustrojów.

Stosowanie kationitów lub anionitów powoduje pozorn¹ zmianê optymalnego pH dzia³ania enzymu (35,36). £adunek powierzchniowy matrycy jest przyczyn¹ gra- dientu protonów w warstwie granicznej enzym/noœnik. Wskutek tego wartoœci wy-

(8)

znaczone podczas pomiaru optymalnego pH reakcji nie odzwierciedlaj¹ rzeczywi- stego stê¿enia H⁺w okolicy cz¹steczek enzymu (36). Oddzia³ywania elektrostatycz- ne z powierzchni¹ noœnika s¹ te¿ jedn¹ z przyczyn zmniejszenia powinowactwa enzymu do posiadaj¹cych ³adunek elektryczny cz¹steczek substratu.

Podstaw¹ dokonania wyboru noœnika i sposobu jego sprzêgania z enzymem powinny byæ warunki projektowanego procesu i przeznaczenie produktu. Unierucho- mione enzymy stosowane do wytwarzania sk³adników ¿ywnoœci nie powinny zanie- czyszczaæ œrodowiska reakcji nawet œladow¹ iloœci¹ substancji o niekorzystnym oddzia³ywaniu fizjologicznym.

4. Rodzaje noœników i ich przydatnoœæ

Aktywnoœæ, stabilnoœæ operacyjna i koszt preparatu immobilizowanego enzymu zale¿y w du¿ym stopniu od w³aœciwoœci noœnika, które powinny byæ dostosowane do temperatury, kwasowoœci, lepkoœci i polarnoœci œrodowiska reakcji oraz do kon- strukcji u¿ywanego reaktora. Oceniaj¹c przydatnoœæ substancji jako noœnika nale¿y uwzglêdniæ jej powierzchniê w³aœciw¹, rozmiary ziaren i ich porowatoœæ, wytrzyma³oœæ mechaniczn¹, iloœæ, dostêpnoœæ i rodzaj grup funkcyjnych wi¹¿¹cych enzym oraz zawartoœæ grup hydrofilowych i hydrofobowych.

Niekiedy konieczna jest modyfikacja powierzchni noœnika maj¹ca na celu wprowadzenie grup funkcyjnych reaguj¹cych z bia³kiem lub zmianê jej polarnoœci. Mo¿na j¹ przeprowadziæ pokrywaj¹c noœnik warstw¹ reaguj¹cego z bia³kiem polimeru lub te¿ wbudowuj¹c po¿¹dane grupy chemiczne podczas syntezy noœnika (37). Do immobilizacji enzymów stosowanych w œrodowisku wodnym przydatne s¹ polimery o w³aœciwoœciach hydrofilowych. Przyk³adem zastosowania noœników z ugrupowa- niami hydrofobowymi jest natomiast katalizowana lipazami produkcja rozmaitych emulgatorów, œrodków pianotwórczych, ¿eluj¹cych i surfaktantów (38). Hydrofilo- we w³aœciwoœci lipaz utrudnia³y przebieg reakcji w œrodowisku zawieraj¹cym apo- larne rozpuszczalniki. Problem ten rozwi¹zano ³¹cz¹c lipazê z monomerem winylo- wym, a nastêpnie sprzêgaj¹c uzyskany produkt z hydrofobowym noœnikiem (39).

Aktywnoœæ preparatów immobilizowanego enzymu zale¿y tak¿e od struktury noœ- nika. Zalet¹ substancji porowatych jest du¿a powierzchnia kontaktu ze œrodowi- skiem reakcji, umo¿liwiaj¹ca zwiêkszenie iloœci przy³¹czonych cz¹steczek enzymu.

Niepo¿¹danym skutkiem wzrostu porowatoœci jest nasilenie oporów dyfuzyjnych, utrudniaj¹cych transport substratów i produktów katalizowanego procesu przez warstwê graniczn¹ enzym/œrodowisko reakcji (17).

Substancje u¿ywane do immobilizacji enzymów powinny siê charakteryzowaæ stabilnoœci¹ w warunkach katalizowanej reakcji, odpornoœci¹ na degradacjê pod wp³ywem drobnoustrojów oraz gêstoœci¹ w³aœciw¹ i wytrzyma³oœci¹ mechaniczn¹ dostosowan¹ do rodzaju reaktora. Kszta³t, gêstoœæ i wielkoœæ ziaren noœnika oraz ich odpornoœæ na œcieranie determinuj¹ skutecznoœæ i czas oddzielania immobilizo-

(9)

wanego enzymu od cieczy poreakcyjnej w reaktorach ze z³o¿em fluidalnym. Noœniki przeznaczone do wykorzystania w reaktorach kolumnowych powinny natomiast wy- kazywaæ wytrzyma³oœæ mechaniczn¹ nie dopuszczaj¹c¹ do ich rozkruszenia pod wp³ywem ciœnienia wywieranego przez strumieñ substratu.

Noœnikami enzymów mog¹ byæ polimery syntetyczne lub naturalnego pochodzenia oraz wiele nieorganicznych adsorbentów, takich jak: szk³o porowate (40,41), ¿el krzemionkowy (42,43), tlenki metali (44,45), glinokrzemiany oraz rozmaite substancje ceramiczne poddawane czêsto modyfikacji maj¹cej na celu wprowadzenie grup funkcyjnych wi¹¿¹cych bia³ko (rys. 4). Produkowane aktualnie noœniki s¹ zazwyczaj nierozpuszczalne. Stosuje siê jednak tak¿e polimery, których rozpuszczalnoœæ zale-

¿y od warunków œrodowiska. Wi¹zanie bia³ka enzymatycznego z takimi substancjami daje mo¿liwoœæ katalizowania reakcji w fazie ciek³ej, a nastêpnie str¹cenia immobilizowanego biokatalizatora po zakoñczeniu procesu pod wp³ywem zmian temperatury, pH lub si³y jonowej mieszaniny reakcyjnej. Przyk³adem tworzywa ulega- j¹cego natychmiastowemu str¹ceniu po przekroczeniu progowej wartoœci temperatury jest poli-N-izopropyloakrylamid (46).

Szybkie przerwanie katalizowanego procesu zapewniaj¹ te¿ preparaty enzymów immobilizowanych na ferromagnetycznych noœnikach, usuwanych z cieczy poreakcyjnej pod wp³ywem pola magnetycznego. Stosuje siê w tym celu polimery zawieraj¹ce pu³apkowane cz¹stki metali lub ich ferromagnetycznych tlenków albo granu-

Rys. 4. Niektóre noœniki stosowane do unieruchamiania enzymów.

(10)

le tlenków tych metali aktywowanych g-aminopropylotrietoksysilanem lub pokry- tych warstw¹ substancji wi¹¿¹cej bia³ka (45).

Liczn¹ grup¹ produkowanych obecnie noœników s¹ syntetyczne polimery i kopo- limery o w³aœciwoœciach i pojemnoœci enzymatycznej (iloœci bia³ka zwi¹zanego przez jednostkê masy noœnika) dostosowanych do projektowanego procesu. Nale¿¹ do nich m.in. poliakryloamidy poliamidy, rozmaite pochodne polistyrenu, poliakry- lonitrylu lub alkoholu poliwinylowego oraz zawieraj¹ce grupy bezwodnikowe kopo- limery bezwodnika maleinowego z etylenem albo styrenem (47-50). Do unieruchamiania enzymów przez kopolimeryzacjê z odpowiednimi prepolimerami s¹ np.

przydatne ¿ywice poliuretanowe.

Podjêto tak¿e wiele prób stosowania noœników naturalnego pochodzenia, któ- rych zalet¹ jest niski koszt i wyeliminowanie niebezpieczeñstwa zanieczyszczenia produktu pozosta³oœci¹ substancji s³u¿¹cych do wytwarzania syntetycznych polime- rów. Wykorzystuje siê w tym celu rozmaite polisacharydy, bia³ka i zwi¹zki nieorga- niczne, takie jak szk³o porowate i ¿el krzemionkowy oferowany w handlu pod na- zwami: Spherosil, Promaxon lub Aerosil (5,16,51). Dostêpny jest tak¿e ¿el krzemionkowy aktywowany przez producentag-aminopropylotri-etoksysilanem (16). Wymie- nione noœniki wytwarzane sposobami zapewniaj¹cymi kontrolowan¹ liczebnoœæ i rozmiary porów, nie ulegaj¹ degradacji w szerokim zakresie pH i temperatury oraz s¹ odporne na mikrobiologiczn¹ degradacjê.

Dobrze zbadanym i ³atwo dostêpnym noœnikiem jest chitozan zawieraj¹cy grupy aminowe, wi¹¿¹ce enzym za poœrednictwem wi¹zañ jonowych lub wi¹zañ kowalencyjnych wytwarzanych z udzia³em aldehydu glutarowego. Skutecznoœæ immobilizacji zale¿y od zawartoœci wolnych grup aminowych, któr¹ mo¿na regulowaæ zmianami stê¿enia, temperatury i czasu oddzia³ywania roztworu NaOH powoduj¹cego de- acetylacjê chityny (51,52). Wad¹ chitozanu jako noœnika jest rozpuszczalnoœæ w kwaœnym œrodowisku. U³atwia to jednak formowanie ziaren lub b³on chitozano- wych, polegaj¹ce na str¹caniu wymienionego biopolimeru z roztworu przeniesione- go do alkalicznego œrodowiska. Rozpuszczalnoœæ tak uformowanego noœnika mo¿na nastêpnie ograniczyæ przez sieciowanie aldehydem glutarowyn lub innymi substancjami.

5. Przyk³ady zastosowañ w przemyœle

Jednym z wczeœniejszych zastosowañ immobilizowanego enzymu by³o wydziela- nie L-aminokwasów polegaj¹ce na hydrolizie tylko jednej N-acetylowej pochodnej znajduj¹cej siê w racemicznej mieszaninie N-acetylowanych aminokwasów. Reakcjê katalizowano dzia³aj¹c¹ stereoselektywnie aminoacylaz¹ unieruchomion¹ na z³o¿u DEAE-Sephadex, a uwolniony L-aminokwas oddzielano od cieczy poreakcyjnej przez krystalizacjê (53). Preparaty immobilizowanych enzymów charakteryzuj¹cych siê stereospecyficznoœci¹ maj¹ du¿e znaczenie w przemyœle farmaceutycznym. Wynika

(11)

to z bardzo zró¿nicowanego niekiedy oddzia³ywania fizjologicznego poszczegól- nych enancjomerów stosowanej jako lek substancji, powoduj¹cego koniecznoœæ usuniêcia niepo¿¹danego sk³adnika.

Innym przyk³adem zastosowañ w przemyœle farmaceutycznym jest produkcja kwasu 6-aminopenicylinowego wytwarzanego z penicyliny w procesie katalizowa- nym immobilizowan¹ amidaz¹ penicylinow¹ z Escherichia coli lub Bacillus megaterium.

Zainstalowane w firmie Rohm Co. reaktory przetwarzaj¹ w ka¿dej szar¿y produkcyj- nej oko³o 2 ton substratu. Stosowane do katalizowania procesu 300-gramowe por- cje preparatu enzymatycznego zawieraj¹ce oko³o 20 g unieruchomionego bia³ka charakteryzuj¹ siê du¿¹ stabilnoœci¹ operacyjn¹, umo¿liwiaj¹c¹ 1000-krotne ich u¿y- cie (54,55).

Immobilizowan¹ izomerazê ksylozow¹ stosuje siê od doœæ dawna w przep³ywowych reaktorach s³u¿¹cych do wytwarzania fruktozy. Produkowane obecnie preparaty umo¿liwiaj¹ konwersjê oko³o 45% glukozy znajduj¹cej siê w roztworze substratu (4,56,57). Wydajnoœci procesu nie mo¿na zwiêkszyæ ze wzglêdu na inaktywacjê enzymu w temperaturze przekraczaj¹cej 55-60°C oraz z powodu wzrastaj¹cego zanieczyszczenia wytwarzanego syropu produktami reakcji Maillarda (57). Oddziele- nie pozosta³oœci glukozy odbywa siê w kolumnie z kationitem adsorbuj¹cym frukto- zê z której jest ona nastêpnie wymywana wod¹. Preparaty immobilizowanej izomerazy glukozowej s¹ zazwyczaj eksploatowane przez 200-400 dni (58). Okres ten ulega skróceniu w przypadku gdy nie usuniêto pozosta³oœci bia³ek z przetwarzanego syropu glukozowego lub z powodu mikrobiologicznego zanieczyszczenia reaktora.

Zmniejszenie aktywnoœci preparatu nastêpuje tak¿e pod wp³ywem jonów Ca²⁺dzia-

³aj¹cych jako inhibitor enzymu (58). Chromatograficznego wzbogacania produktu mo¿na unikn¹æ w przypadku znalezienia izomerazy o lepszej termostabilnoœci, umo¿liwiaj¹cej zwiêkszenie stopnia konwersji przez podniesienie temperatury (59,60). Enzym ten powinien byæ ponadto aktywny w lekko kwaœnym œrodowisku ograniczaj¹cym niepo¿¹dane reakcje uboczne.

Wiele uwagi poœwiêcono badaniom przydatnoœci immobilizowanychb-galakto- zydaz do wytwarzania produktów mlecznych przeznaczonych dla ludzi cierpi¹cych na nietolerancjê laktozy lub syropów glukozowo-galaktozowych z permeatu serwatki. Stosowano w tym celub-galaktozydazy z ró¿nych Ÿróde³ unieruchomione na chi- tynie, chitozanie, rozmaitych sorbentach lub syntetycznych polimerach (6,62-65).

Znaczenie tych badañ wynika z koniecznoœci zagospodarowania oko³o 5 mln ton laktozy rocznie, pochodz¹cej z serowarstwa i produkcji kazeiny (64). Innym korzystnym skutkiem hydrolizy laktozy jest wyeliminowanie jej oddzia³ywania na jakoœæ produktów, wynikaj¹cego z krystalizacji w obni¿onej temperaturze, higroskopijnoœ- ci i zdolnoœci do adsorbowania niepo¿¹danych substancji zapachowych. Zast¹pienie preparatów unieruchomionej b-galaktozydazy, stosowanych obecnie w ograniczo- nym zakresie do wytwarzania pozbawionego laktozy mleka i serwatki, ich odpo- wiednikami zawieraj¹cymi enzym pochodz¹cy z psychrofili ograniczy ryzyko mikrobiologicznego zanieczyszczenia reaktora i cieplnej destrukcji termolabilnych sk³ad-

(12)

ników produktu. Preparaty tego rodzaju nie s¹ jeszcze produkowane na skalê przemys³ow¹. Opracowano jednak skuteczny sposób immobilizacji b-galaktozydazy z antarktycznej bakterii Pseudoalteromonas sp. 226 na chitozanie. Uzyskany biokata- lizator charakteryzuje siê dobr¹ stabilnoœci¹ operacyjn¹ i umo¿liwia konwersjê ponad 90% znajduj¹cej siê w mleku laktozy po 24 godz. hydrolizy w temperaturze 4°C (64).

Prowadzone s¹ obecnie badania preparatów immobilizowanej syntazy trehalozy (66). Enzym ten przekszta³caj¹c wystêpuj¹ce w maltozie wi¹zaniaa-1,4-glikozydowe umo¿liwia produkcjê trehalozy (a-D-glukopiranozylo-1,1-a-glukopiranozydu) z ³atwo dostêpnych syropów maltozowych (66-68). Uzyskany disacharyd jest cen- nym produktem przydatnym w lecznictwie, przetwórstwie ¿ywnoœci oraz kosmetyce i farmacji (69). Nie uda³o siê jeszcze uzyskaæ satysfakcjonuj¹cej wydajnoœci proce- su, bo zbadane dotychczas preparaty syntazy trehalozy z Thermus caldophilus, immo- bilizowanej na noœniku Eupergit C250L katalizowa³y w optymalnych warunkach kon- wersjê oko³o 42% maltozy znajduj¹cej siê w œrodowisku reakcji (66).

Du¿e znaczenie praktyczne ma zastosowanie unieruchomionych hydrolaz gliko- zydowych i enzymów modyfikuj¹cych lub tworz¹cych wi¹zania glikozydowe do syntezy oligosacharydów o korzystnych w³aœciwoœciach funkcjonalnych, leczniczych i prebiotycznych (70,71). Immobilizowane fruktozylotransferazy s¹ m.in. stosowane w instalacjach przemys³owych s³u¿¹cych do produkcji fruktooligosacharydów z sacharozy (72-74). Sk³ad mieszaniny oligosacharydów wytwarzanej z udzia³em unieruchomionych biokatalizatorów zale¿y od rodzaju enzymu i noœnika, czasu kontaktu substratu ze z³o¿em oraz temperatury reakcji. Immobilizacja stabilizuje strukturê enzymu i zapobiega spadkowi aktywnoœci w œrodowisku rozpuszczalników, doda- wanych czasami w celu obni¿enia aktywnoœci wody, a w konsekwencji przyœpiesze- nia transglikozylacji lub odwrotnej hydrolizy. Innym korzystnym skutkiem immobilizacji niektórych hydrolaz glikozydów jest intensyfikacja reakcji odwrotnej hydrolizy i zwiêkszenie wydajnoœci syntezy oligosacharydów (70). Do katalizowania tego procesu szczególnie przydatne s¹ enzymy termostabilne, dzia³aj¹ce w podwy¿szonej temperaturze powoduj¹cej zmniejszenie lepkoœci stê¿onych roztworów cukrów (40).

Du¿e perspektywy ma zastosowanie immobilizowanych lipaz katalizuj¹cych reakcje hydrolizy, estryfikacji, transestryfikacji i regioselektywnej acylacji (39). Ich zalet¹ jest znaczna aktywnoœæ katalityczna w œrodowisku rozpuszczalników organicz- nych i na granicy faz ró¿ni¹cych siê polarnoœci¹. Opracowano wiele sposobów immobilizacji lipaz od których wyboru zale¿y aktywnoœæ, specyficznoœæ i stabilnoœæ operacyjna biokatalizatora (10,75-77). Niektóre z tych preparatów s¹ ju¿ stosowane w przemyœle do produkcji strukturyzowanych lipidów, leków, substancji smako- wo-zapachowych i emulgatorów (39). Przyk³adem strukturyzacji lipidów jest wytwarzanie substytutu mas³a kakaowego. Opatentowany przez firmy Unilever i Fui Oil proces polega na enzymatycznej transestryfikacji olejów: palmowego, s³oneczniko- wego lub oliwkowego z udzia³em tristearynoiloglicerolu jako donora grup acylo-

(13)

wych (78,79). Immobilizowan¹ lipazê z Rhizomucor miehei zastosowano w koncernie Unichem International do wytwarzania estrów kwasów t³uszczowych (emolientów) s³u¿¹cych w kosmetyce do pielêgnacji skóry (80,81). Preparat zaadsorbowanej na celicie lipazy z Rhizopus arrhizus okaza³ siê natomiast przydatny do produkcji mono- acylogliceroli wykorzystywanych jako emulgatory oraz œrodki pianotwórcze i ¿e- luj¹ce (82). Spoœród wielu mo¿liwych zastosowañ immobilizowanych lipaz nale¿y wyró¿niæ prowadzon¹ w apolarnym œrodowisku syntezê estrów sacharydów u¿ywanych jako biodegradowalne surfaktanty oraz wytwarzanie nadtlenokwasów RCOOOH z kwasów karboksylowych utlenianych nadtlenkiem wodoru (39,83). Du¿e znaczenie praktyczne mo¿e te¿ mieæ przejawiana przez unieruchomione lipazy zdol- noœæ katalizowania reakcji przebiegaj¹cych w œrodowisku p³ynów nadkrytycznych (SCF). Przeprowadzone w tym zakresie badania dotyczy³y m.in. wytwarzania czyste- go enancjomerycznie ibuprofenu stosowanego jako lek przeciwzapalny i przeciwbó- lowy (84).

Unieruchomion¹ papainê, pepsynê lub neutrazê stosuje siê w celu zapobiegania zmêtnieniu piwa podczas przechowywania ch³odniczego. Wymienione proteazy hy- drolizuj¹ znajduj¹ce siê w piwie bia³ka wytwarzaj¹c oligopeptydy i wolne amino- kwasy mniej podatne na tworzenie kompleksów z polifenolami str¹caj¹cych siê w obni¿onej temperaturze (4).

Zdolnoœæ proteaz do katalizowania w pewnych warunkach syntezy wi¹zania amidowego wykorzystano w procesie przemys³owego wytwarzania aspartamu.

G³ówni producenci tej niekalorycznej substancji s³odz¹cej stosuj¹ preparaty unie- ruchomionej termolizyny z Bacillus thermoproteolyticus (85). Syntetyzowany enzy- matycznie dipeptyd zbudowany jest wy³¹cznie z kwasu L-asparaginowego i mety- lowego estru L-fenyloalaniny i nie zawiera reszt aminokwasowych o innej konfigu- racji, powoduj¹cych ograniczenie s³odkoœci aspartamu wytwarzanego metodami chemicznymi (54).

Procesy enzymatyczne okaza³y siê te¿ przydatne do produkcji akrylamidu CH₂=CHCONH₂z akrylonitrylu CH₂CHCN i wody (54). Zwi¹zek ten stosowany jako prekursor rozmaitych polimerów i flokulantów wytwarzano metodami chemicznymi, których wad¹ s¹ niepo¿¹dane reakcje uboczne. Znacznie wiêksz¹ czystoœæ pro- duktu zapewnia proces katalizowany hydrataz¹ nitrylow¹ z Rhodococcus rhodochrous wykorzystywany obecnie do produkcji akrylamidu w skali ponad 15 000 ton rocznie (54).

Odmiennym sposobem wykorzystania enzymów unieruchomionych w mikrokapsu³kach jest ich u¿ycie jako komponenta proszków do prania. Otoczka mikrokapsu³ki s³u¿y w tym przypadku jako bariera zabezpieczaj¹ca enzym przed inak- tywuj¹cym oddzia³ywaniem innych sk³adników detergentu podczas jego przechowywania i powinna ulegaæ destrukcji po wprowadzeniu œrodka pior¹cego do wody.

(14)

6. Przydatnoœæ immobilizowanych enzymów w analityce

Enzymy wchodz¹ w sk³ad uk³adu detekcyjno-pomiarowego kilku typów biosen- sorów charakteryzuj¹cych siê du¿¹ czu³oœci¹, szybkoœci¹ pomiaru i ³atwoœci¹ u¿ycia.

S¹ one przydatne do oznaczania cukrów, aminokwasów, kwasów karboksylowych, mocznika, polifenoli, pestycydów i wielu innych ma³ocz¹steczkowych analitów w mieszaninie ró¿nych, czêsto podobnych pod wzglêdem budowy chemicznej substancji. Ze wzglêdu na rodzaj generowanego sygna³u biosensory enzymatyczne mo¿- na podzieliæ na: elektrochemiczne, optyczne i termiczne (86).

Biosensory elektrochemiczne zawieraj¹ enzym osadzony na powierzchni czujnika przetwarzaj¹cego zmiany zawartoœci substratu lub produktu katalizowanej reakcji na proporcjonalne zmiany potencja³u elektrody, natê¿enia pr¹du pomiêdzy elektrodami referencyjn¹ i pomiarow¹ lub przewodnoœci elektrycznej œrodowiska (87). Jeœli powstaj¹cy produkt nie pobudza detektora stosuje siê kilka immobilizowanych enzymów katalizuj¹cych nastêpuj¹ce kolejno reakcje, a¿ do powstania substancji wywo³uj¹cej sygna³. Biosensor przeznaczony do oznaczania sacharozy zawiera na przyk³adb-fruktofuranozydazê katalizuj¹c¹ hydrolizê disacharydu oraz oksydazê glukozow¹ utleniaj¹c¹ wytworzon¹ w poprzedniej reakcji glukozê pod wp³ywem tlenu. Zawartoœæ sacharozy wyznacza siê poœrednio mierz¹c stê¿enie nadtlenku wodoru lub jonów wodorowych uwolnionych podczas dysocjacji kwasu glukonowego albo przez pomiar ubytku tlenu zu¿ywanego do utlenienia glukozy (88,89).

Do odrêbnej grupy klasyfikuje siê biosensory z osadzonymi na powierzchni czujnika komórkami drobnoustrojów lub fragmentami tkanek roœlinnych lub zwierzê- cych. S¹ one sensu stricte biosensorami katalitycznymi ze wzglêdu na zaanga¿owanie aparatu enzymatycznego immobilizowanych komórek do generowania sygna³u czujnika. Procesy metaboliczne zachodz¹ce w komórkach s¹ przyczyn¹ spadku stê¿enia tlenu w ich otoczeniu lub wydzielania substancji o w³aœciwoœciach elektrolitu (jak np. kwas mlekowy), powoduj¹cych wzrost mierzonego konduktometrycznie przewodnictwa próbki. Mikrobiologiczne biosensory s¹ mniej wra¿liwe na zmiany temperatury i pH próbek od elektrod z immobilizowanymi enzymami i charakteryzuj¹ siê d³u¿szym okresem eksploatacji. Ich wad¹ jest jednak mniejsza selektywnoœæ oraz doœæ du¿e opóŸnienie reakcji czujnika (90).

Biosensory elektrochemiczne zawieraj¹ zazwyczaj enzymy wytwarzaj¹ce substancje, które w œrodowisku wodnym wystêpuj¹ w postaci jonów. Tak dzia³aj¹ np.

elektrody s³u¿¹ce do oznaczania mocznika, których potencja³ zmieniaj¹ kationy NH₄⁺powstaj¹ce pod wp³ywem ureazy (91). Drug¹ grup¹ czêsto u¿ywanych bioka- talizatorów s¹ oksydoreduktazy stosowane w elektrodach s³u¿¹cych do amperome- trycznego pomiaru stê¿enia analitu. W przypadku immobilizacji oksydoreduktaz wa¿ne jest zapewnienie transportu elektronów pomiêdzy cz¹steczkami enzymu a elektrod¹. Przeprowadza siê w tym celu modyfikacjê powierzchni czujnika substancjami poœrednicz¹cymi w przekazywaniu elektronów lub pu³apkuje siê enzym

(15)

w polimerach redoksowych tworz¹cych warstwê oddzielaj¹c¹ wnêtrze elektrody od analizowanej próbki (92).

Selektywnoœæ i powtarzalnoœæ pomiarów zale¿y g³ównie od specyficznoœci immobilizowanego enzymu, ale mo¿na j¹ dodatkowo zwiêkszyæ oddzielaj¹c enzym od roztworu próbki membranami o selektywnej przepuszczalnoœci ograniczaj¹cymi do- stêp substancji przeszkadzaj¹cych lub pokrywaj¹c enzymem elektrody jonoselek- tywne. Nowsze generacje czujników elektrochemicznych zawieraj¹ enzym immobilizowany na membranie maj¹cej kontakt z baz¹ tranzystora polowego. Zmiana potencja³u bazy wywo³ana jonami generowanymi podczas katalizowanej reakcji wywo³uje zale¿ne od stê¿enia analitu zmiany natê¿enia pr¹du przep³ywaj¹cego przez tranzystor (86,93).

Biosensory z przetwornikami amperometrycznymi lub potencjometrycznymi s³u¿¹ m.in. do oznaczania ró¿nych sk³adników i zanieczyszczeñ ¿ywnoœci. Elektrody z unieruchomionymi oksydoreduktazami stosuje siê np. do pomiaru zawartoœci eta- nolu i kontroli przebiegu fermentacji piwa i wina (94). Skonstruowano te¿ analizato- ry przydatne do okreœlania œwie¿oœci ryb, wykorzystuj¹c w tym celu immobilizowan¹ 5’nukleotydazê, fosforylazê nukleotydów i oksydazê ksantynow¹ lub oksydazy umo¿liwiaj¹ce oznaczenie zawartoœci histaminy, putrescyny i kadaweryny (94).

Zmiany przewodnictwa elektrycznego pod wp³ywem wytwarzanych przez drobnoustroje metabolitów wykorzystano w zestawach u¿ywanych do pomiaru zanieczyszczenia mikrobiologicznego ¿ywnoœci przekraczaj¹cego 10⁶ komórek/ml (86,95).

W biosensorach katalitycznych mo¿na wykorzystaæ enzymy generuj¹ce substancje nie nadaj¹ce siê do oznaczenia metodami elektrochemicznymi. ród³em sygna³u odzwierciedlaj¹cego stê¿enie analitu s¹ w tym przypadku przetworniki optyczne lub kalorymetryczne. Do pomiarów kalorymetrycznych stosuje siê termistory z unie- ruchomionym na ich powierzchni enzymem, które mierz¹ zmiany temperatury spowodowane wydzielaniem ciep³a katalizowanej reakcji. Niedogodnoœci¹ tych urz¹- dzeñ jest du¿y wp³yw ewentualnych strat ciep³a na dok³adnoœæ pomiarów bardzo ma³ych zmian temperatury, rzêdu 0,005-0,03°C (96).

Immobilizowane biokatalizatory znajduj¹ siê te¿ w biosensorach optycznych s³u¿¹cych do pomiaru stê¿enia analitu na podstawie wywo³anych reakcj¹ enzyma- tyczn¹ zmian luminescencji, fluorescencji lub absorpcji promieniowania UV-VIS (97).

Zalet¹ takich biosensorów jest mo¿liwoœæ badania próbek o bardzo ma³ej objêtoœci.

Umo¿liwia to miniaturyzacja sondy, któr¹ stanowi koñcówka œwiat³owodu z unieru- chomionym enzymem. Na drugim koñcu œwiat³owodu znajduje siê natomiast system detekcji analizowanego promieniowania oraz Ÿród³o promieniowania wzbudzaj¹- cego fluorescencjê lub œwiat³a niezbêdnego do spektrofotometrycznego pomiaru zmian stê¿enia chromoforów, zanikaj¹cych lub wytwarzanych podczas reakcji enzymatycznej. Sonda niektórych biosensorów optycznych zawiera oprócz immobilizowanego enzymu luminofory emituj¹ce promieniowanie pod wp³ywem produktów reakcji lub mikroorganizmy przejawiaj¹ce zdolnoœæ do bioluminescencji (86,98).

Biosensory optyczne s¹ m.in. przydatne do oznaczeñ zwi¹zków biologicznie czyn-

(16)

nych i aktywnoœci enzymów oraz do œledzenia przebiegu procesów biochemicznych zwi¹zanych np. z przemianami ATP i NADH (86).

7. Bioogniwa

Drobnoustroje lub immobilizowane oksydoreduktazy s¹ wykorzystywane w ogniwach paliwowych wytwarzaj¹cych energiê elektryczn¹ z alkoholi, kwasu mlekowe- go, glukozy lub innych substratów (99-101). Zasilane etanolem ogniwo paliwowe zawiera np. dehydrogenazê alkoholow¹ unieruchomion¹ na z³otej folii pe³ni¹cej funk- cjê anody. Izolacyjne w³aœciwoœci bia³ka praktycznie uniemo¿liwiaj¹ bezpoœredni¹ wymianê elektronów pomiêdzy elektrod¹, a centrum katalitycznym enzymu. Ko- nieczne jest zatem stosowanie substancji poœrednicz¹cych (mediatorów) ulegaj¹- cych pod wp³ywem enzymu utlenianiu albo redukcji (rys. 5). Stosuje siê w tym celu fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego, b³êkit metylenowy lub inne substancje, których wybór zale¿y od rodzaju u¿ywanej oksydoreduktazy (102). Skut- kiem utlenienia alkoholu jest redukcja mediatora, regeneruj¹cego siê po przekaza- niu pobranego elektronu na anodê. Kationy H⁺uwalniane podczas reakcji przenikaj¹ przez przepuszczaln¹ dla protonów membranê do przestrzeni katodowej, gdzie ³¹cz¹ siê z tlenem atmosferycznym, który przejmuj¹c elektrony dop³ywaj¹ce przez obwód zewnêtrzny redukuje siê do jonu tlenkowego, a ten ³¹czy siê z proto- nami tworz¹c wodê (102). Katalizatorem tej reakcji jest np. wykonana z platyny ka- toda. Zasilane etanolem ogniwo paliwowe wytwarza si³ê elektromotoryczn¹ 0,34 V przy gêstoœci pr¹du 0,53 mA/cm² elektrody (103).

Opracowano ju¿ wiele typów elektrod ró¿ni¹cych siê rodzajem immobilizowanej oksydoreduktazy i mediatora (104). S¹ one przydatne w miniaturowych ogniwach paliwowych dostarczaj¹cych energii dla telefonów komórkowych i przenoœnych komputerów. Ogniwa zasilane znajduj¹c¹ siê we krwi glukoz¹ mog¹ byæ wykorzy- stane w medycynie, np. do zasilania rozruszników serca lub monitorowania stanu fizjologicznego organizmu. Anoda tych ogniw zawiera oksydazê glukozow¹ immobilizowan¹ na warstwie polimeru o w³aœciwoœciach oksydacyjnoredukcyjnych (104).

Mikrobiologiczne ogniwa paliwowe sk³adaj¹ siê te¿ z odrêbnych przedzia³ów anodowego i katodowego oddzielonych przepuszczaln¹ dla jonów membran¹.

W przedziale anodowym odbywa siê przeprowadzana w warunkach beztlenowych hodowla wzglêdnego tlenowca. Wskutek braku tlenu elektrony wytwarzane w pro-

Rys. 5. Schemat przekazywania elektronu z substratu na elektrodê enzymatycznego ogniwa paliwowego (M zre- generowana forma mediatora).

(17)

cesie glikolizy substratu, s¹ podczas fosforylacji przenoszone na wprowadzony do pod³o¿a hodowlanego zewnêtrzny akceptor elektronów (mediator), którym mo¿e byæ: ¿elazicyjanek potasu, fiolet metylowy, czerwieñ obojêtna, kwasy huminowe lub 2-hydroksy-1,4-naftochinon (105,106). Podobnie jak w ogniwach enzymatycznych, transfer elektronów na anodê wywo³uje regeneracjê mediatora, co umo¿liwia ponow- ne jego wykorzystanie. Stosowanie mediatora jest zbêdne w przypadku Shewanella putrefaciens, Aeromonas hydrophila i innych bakterii korzystaj¹cych z energii uzyski- wanej podczas redukcji zwi¹zków Fe(III) (107,108). Cytochromy tych mikroorganiz- mów s¹ wbudowane w b³onê komórkow¹ i mog¹ przekazywaæ elektrony bezpoœred- nio na anodê ogniwa (109). Jednym z wielu mo¿liwych zastosowañ mikrobiologicz- nych ogniw paliwowych jest ich wykorzystanie do otrzymywania energii elektrycznej z rozmaitych substancji odpadowych i œcieków.

8. Podsumowanie

Dalszy postêp w zakresie stosowania immobilizowanych enzymów bêdzie przy- puszczalnie polega³ na szerszym ni¿ dotychczas wykorzystaniu ma³o dotychczas po- znanych enzymów z ekstremofili, dzia³aj¹cych w warunkach umo¿liwiaj¹cych opra- cowanie nowych lub udoskonalenie dotychczas istniej¹cych technologii. Rozpow- szechni siê te¿ stosowanie enzymów o strukturze udoskonalonej metodami in¿ynie- rii genetycznej w celu poprawienia ich aktywnoœci, specyficznoœci, termostabilnoœci i odpornoœci na dzia³anie czynników denaturuj¹cych bia³ka oraz enzymów z se- kwencjami aminokwasów wprowadzonymi w celu u³atwienia immobilizacji. Du¿e znaczenie bêdzie mia³o sprzêganie bia³ka z polimerami, których w³aœciwoœci mo¿na regulowaæ pod wp³ywem odpowiednich bodŸców wywieranych na œrodowisko reakcji.

Literatura

1. Tischer W., Kasche V., (1999), TIBTECH, 17, 326-335.

2. Goldststein L., (1970), Methods Enzymol., 19, 935-995.

3. Melrose G., (1971), Rev. Pure Appl. Chem., 21, 83-98.

4. Kilara A., Shahani K. M., (1979), Crit. Rev. Food Sci. Nutrit., 12(2), 161-197.

5. Tischer W., Wedekind F., (1999), Topics Cur. Chem., 200, 97-126.

6. Pessela B. C., Fernandez-Lafuente R., Fuentes M., Vian A., Garcia J. L., Carrascosa A. V., Mateo C., Guisan J. M., (2003), Enzyme Microb. Technol., 32, 369-374.

7. Batista-Viera F., Manta C., Carlson J., (1994), Appl. Biochem. Biotechnol., 44, 1-14.

8. Pessela B. C., Torres R., Fuentes M., Mateo C., Filho M., Carrascosa A. V., Vian A., Garcia J. L., Guisan J. M., Feranandez-Lafuente R., (2004), Biotech. Prog., 20, 1507-1511.

9. Balcao V. M., Paiva A. L., Malcata F. X., (1996), Enzyme Microb. Technol., 18, 392-397.

10. Malcata F. X., Reyes H. R., Garcia H. S., Hill C. G., Amundson C. H., (1992), Enzyme Microb. Tech- nol., 14, 426-446.

11. Hung T. C., Giridhar R., Chiou S. H., Wu W. T., (2003), J. Molec. Catalysis, 26, 69-78.

(18)

12. Richards M., Knowles J. R., (1968), J. Mol. Biol., 37, 232-247.

13. Muzzarelli R. A. A., (1977), Chitin, Pergamon Press, New York, Toronto, 131-137.

14. Haller W., (1983), Solid phase biochemistry, in: Analytical and Synthetic Aspects, Ed. Scouten W. H., Wi- ley, New York, 535-599.

15. Weetal H. H., Filbert A. M., (1974), Methods Enzymol., 34, 59-78.

16. £obarzewski J., Ginalska G., (1994), Biotechnologia, 1(24), 44-63.

17. Aiba S., Humprey A. E., Mills N. F., (1973), Immobilized enzymes, in: Biochemical Engineering, Universi- ty of Tokyo Press, 421-444.

18. Cao L., van Langen L., Sheldon R. A., (2003), Cur. Opin. Biotechnol., 14, 387-394.

19. Haring D., Schreier P., (1999), Cur. Opin. Chem. Biol., 3, 35-38.

20. Margolin A. L., (1996), Trends Biotechnol., 14, 223-240.

21. Cao L., van Langen L. M., van Rantvijk F., Sheldon R. A., (2001), J. Mol. Catal. B Enzym., 11, 665-670.

22. Lopes-Serrano P., Cao L. M., van Rantvijk F., Sheldon R. A., (2002), Biotechnol. Lett., 24, 1379-1383.

23. St Clair N. L., Navia M. A., (1992), J. Am. Chem. Soc., 114, 7314-7316.

24. Noritomi H., Koyama K., Kato S., Nagahama K., (1998), Biotech. Technol., 12, 467-469.

25. Visuri K., Oastrinen O., Wu X. Y., Maekinen K., Leisola M., (1999), Biotechnol. Bioeng., 64, 377-380.

26. Turkiewicz M., Makowski K., (2004), Biotechnologia, 3(66), 129-139.

27. Khalaf N., Govardhan C. P., Lalonde J. J., Persihetti R. A., Wang Y. F., Margolin A. L., (1996), J. Am.

Chem. Soc., 118, 5494-5495.

28. Cao L., van Langen L. M., van Rantvijk F., Sheldon R. A., (2001), J. Mol. Catal. B Enzym., 11, 665-670.

29. Tomimatsu Y., Jansen E. F., Gaffield W., Olson A. C., (1971), J. Colloid Interface Sci., 36, 51-64.

30. Ceynowa J., (1994), Biotechnologia, 24, 64-77.

31. Chang H. N., Furusaki S., (1991), Adv. Biochem.Eng. Biotechnol., 44, 27-64.

32. Tosa T., Mori T., Fuse N., Chibata I., (1967), Biotechnol. Bioeng., 9, 603-615.

33. Tanriseven A., Dogan S., (2002), Process Biochem., 38, 27-30.

34. Pessela B. C., Mateo C., Fuentes M., Vian A., Garcia J. L., Carrascosa A. V., Guisan J. M., Fernan- dez-Lafuente R., (2003), Enzyme Microb. Technol., 33, 199-205.

35. Schmidtke J. L., Wescott C. R., Klibanov A. M., (1996), J. Am. Chem. Soc., 118, 3360-3365.

36. Goldststein L., (1976), Methods Enzym., 44, 397-414.

37. Mateo C., Abian O., Fernandez-Lafuente R., Guisan J. M., (2000), Enzyme Microb. Technol., 26, 509-515.

38. Bednarski W., Adamczak M., (2005), W³aœciwoœci lipaz i ich zastosowanie, w: Enzymatyczna modyfikacja sk³adników ¿ywnoœci, Ko³akowski E., Bednarski W., Bielecki S., (red), Warszawa, Szczecin.

39. Pilarek M., Szewczyk K. W., Wrona M., (2002), Biotechnologia, 2(57), 146-164.

40. Ettalibi M., Baratti J. C., (2001), Enzyme Microb. Technol., 28, 596-601.

41. Robinson P. J., Dunnil P., Lilly M. D., (1971), Biochim. Biophys Acta, 242, 659-661.

42. Burteau N., Burton S., Crichton R. R., (1989), FEBS Lett., 258, 185-189.

43. Synowiecki J., Wo³osowska S., (2006), Enzyme Microb. Technol., 39, 1417-1422.

44. Bouin J. C., Atallah M. T., Hultin H. O., (1976), Biotechnol. Bioeng., 18, 179-187.

45. Varlan A. R., Sansen W., van Loey A., Hendrick M., (1996), Biosensors Bioelectronics, 11(4), 443-447.

46. Park T. G., Hoffman A. S., (1990), Biotechnol. Bioeng., 35, 152-159.

47. Ginalska G., Belcarz A., £obaszewski J., Wolski T., (1999), Biotechnologia, 44, 226-237.

48. Manecke G., (1972), Biotechnol. Bioeng. Symp., 3, 185-187.

49. Bryjak J., Kolarz B. N., (1998), Biochemistry, 33, 409-417.

50. Katchalski-Katzir E., Kraemer D. M., (2000), J. Mol. Catal. B Enzym., 10, 157-176.

51. Synowiecki J., Sikorski Z. E., Naczk M., (1982), Food Chem., 8, 239-246.

52. Maciuñska J., Scibisz M., Synowiecki J., (2000), J. Food Biochem., 24, 299-310.

53. Chibata I., Tosa T., (1977), Adv. Appl. Microbiol., 22, 1-12.

54. Katchalski-Katzir E., (1993), Trends Biotechnol., 11, 471-478.

55. Self D. A., Kay G., Lilly M. D., Dunill P., (1969), Biotechnol. Bioeng., 11, 337-345.

56. Crabb D. W., Mitchinson C., (1997), TIBTECH, 15, 349-353.

(19)

57. Synowiecki J., (2007), The use of starch processing enzymes in the food industry, in: Industrial Enzy- mes, Eds. Polaina J., Mac Cabe A., Springer, Dordrecht, the Netherlands, 19-34.

58. Novozymes application sheet, Starch/2002-01443-04, Use of Sweetzyme IT in the production of high fructose syrup.

59. Gomes J., Steiner W., (2004), Food Technol. Biotechnol., 42, 223-235.

60. Vieille Z., Zeikus G. J., (2001), Microbiol. Molec. Biol. Rev., 65, 1-43.

61. Katchalski E., Silman I. H., Goldman R., (1971), Adv. Enzymol. Mol Biol., 34, 445-458.

62. Whetal H. H., Havewala N. B., Pitcher H. W., Detor C. C., Vonn W. P., Yavergaum S., (1974), Biotech- nol. Bioeng., 16, 95-108.

63. Pessela B. C., Mateo C., Fuentes M., Vian A., Garcia J. L., Carrascosa A. V., Guisan J. M., Fernan- dez-Lafuente R., (2003), Enzyme Microb. Technol., 33, 199-205.

64. Turkiewicz. M., Bia³kowska A., Tkaczuk K., Ka³u¿ewska M., Makowski K., Cieœliñski H., Wanarska M., Kur J., Bujnicki J. M., (2005), Antarktycznab-galaktozydaza – w³aœciwoœci i wykorzystanie w hydro- lizie laktozy, w: Enzymatyczna modyfikacja sk³adników ¿ywnoœci, Ko³akowski E., Bednarski W., Bielecki S. (red.), Warszawa, Szczecin, 397-414.

65. Greenberg N. A., Mahoney R. R., (1981), Proc. Biochem., 2-8.

66. Co Y. J., Park O. J., Shin H. J., (2006), Enzyme Microb. Technol., 39, 108-113.

67. Gainnesi G. C., Polizeli M., Terenzi H. F., Jorge J. A., (2006), Proc. Biochem., 41, 1729-1735.

68. Zdzieb³o A., Synowiecki J., (2006), Food Chem., 96, 8-13.

69. Richards A. B., Krakowska S., Dexter L. B., Schmid H., Wolterbbek A. P. M., Waalkens-Berendsen D. H., Arai S., Kurimoto M., (2002), Food Chem. Toxicol., 40, 871-898.

70. Olesienkiewicz A., Grajek W., (2005), Enzymatyczna synteza oligosacharydów, w: Enzymatyczna modyfi- kacja sk³adników ¿ywnoœci, Ko³akowski E., Bednarski W., Bielecki S., (red.), Warszawa, Szczecin, 431-449.

71. Krastanov A., Blazheva D., Yanakieva I., Kratchanova M., (2006), Enzyme Microb. Technol., 39, 1306-1312.

72. Yun J. W., (1996), Enzyme Microb. Technol., 19, 107-117.

73. Yun J. W., Jung K. H., Jeon Y. J., Lee J. H., (1992), J. Microb. Biotechnol., 2, 98-101.

74. Yun J. W., Jung K. H., Oh J. W., Lee J. H., (1990), Appl. Biochem. Biotechnol., 24/25, 299-308.

75. Balcao V. M., Paiva A. L., Malcata F. X., (1996), Enzyme Microb. Technol., 18, 392-416.

76. Lalonde J., (1997), CHEMTECH, 38-45.

77. Cao L., Bornscheuer U. T., Schmid R. D., (1999), J. Mol. Catal. B, Enzym., 6, 279-285.

78. Matsuo T., Sawamura N., Hashimoto Y., Hoshida W., (1981), US Patent 4268527.

79. Macrae A. R., (1983), J. Am. Oil Chem. Soc., 60, 291-294.

80. Vulfson E. N., (1994), Industrial application of lipases, in: Lipases, Structure, Biochemistry and Applica- tions, Eds. Wooley P., Petersen S. P., Cambridge University Press, 271-278.

81. Salka B. A., (1997), Cosmetics Toiletries, 112, 101-105.

82. Millqvist A., (1994), Enzyme Microb. Technol., 16, 1042-1047.

83. Adelhorst K., (1990), Synthesis, 2, 112-115.

84. Rantakyla M., Aaltonen O., (1994), Biotechnol. Lett., 16, 825-830.

85. Ajinomoto Coop. Inc., (1985), Japan Patent 60-62998.

86. Mello L. D., Kubota L. T., (2002), Food Chem., 77, 237-256.

87. Thevenot D. R., Toth K., Durst R. A., Wilson G. S., (2001), Biosensor Bioelectronics, 16, 121-131.

88. Davis J., Vaughan D. H., Cardosi M. F., (1995), Enzyme Microb. Technol., 17, 1030-1035.

89. Updike S. J., Hicks G. P., (19967), Nature, 214(5092), 986.

90. Phadke R. S., (1992), Biosystems, 27, 203-206.

91. Guilbault G. G., Montalvo J. G., (1970), J. Am. Chem. Soc., 92, 2533-2536.

92. Leman J., (1998), Materia³y kongresowe Food Nutrition and Health, Warszawa, 274-279.

93. Desphande S. S., Rocco R. M., (1994), Food Technol., 48, 146-150.

94. Jêdrychowski L., Leman J., (2001), Biotechnologiczne metody analizy ¿ywnoœci, w: Biotechnologia ¿ywno- œci, Bednarski W., Reps A., (red.), WNT, Warszawa.

95. Ivnitski D., Hamid I. A., Atanasov P., Wilkins E., (1999), Biosensors Bioelectronics, 14, 599-624.

(20)

96. Wagner G., Schmid R. D., (1990), Food Biotechnol., 4, 215-240.

97. Seitz W. R., (1988), CRC Crit. Rev. Anal. Chem., 19, 135-173.

98. Mehrvar M., Bis C., Scharer J. M., Mao-Young M., Luong J. H. T., (2000), Anal. Sci., 26, 677-692.

99. Bardea A., Katz E., Buckmann A. F., Willner I., (1997), J. Am. Chem. Soc., 119, 9114-9122.

100. Katz E., Shipway A. N., Willner I., (2003), Biochemical fuell cells, in: Handbook of Fuell Cells-Fundamen- tals, Technology and Applications, Eds. Vielstich W., Gasteiger H. A., Lamm A., Willey and Sons, Ltd., New York.

101. Garza L. G., Jeong P. A., Liddell T., Sotomura T. A., Moore A. L., Gust D., (2003), J. Phys. Chem., 107, 10252-10273.

102. Bullen R. A., Arnot T. C., Lakeman J. B., Walsh F. C., (2005), Biosensors Bioelectronics, 21, 2015-2045.

103. Chen T., Barton S. C., Binyamin G., Gao Z., Zhang Y., Kim H. H., Heller A., (2001), J. Am. Chem.

Soc., 123, 8630-8631.

104. Materia³y konferencyjne, Biofuell Cells, (2005), Division of Fuel Chemistry, Washington D.C.

105. Bennetto H. P., Stirling J. L., Tanaka K., Vega C. A., (1983), Biotechnol. Bioeng., 25, 559-568.

106. Allen R. M., Bennetto H. P., (1993), Appl. Biochem. Biotechnol., 39/40, 27-40.

107. Kim H. J., Park H. S., Hyun M. S., Chang I. S., Kim M., Kim B. H., (2002), Enzyme Microb. Technol., 30, 145-152.

108. Pham C. A., Jung S. J., Phung N. T., Lee J., Chang I. S., Kim B. H., Chun J., (2003), FEMS Microb.

Lett., 223, 129-134.

109. Myers C. R., Myers J. M., (1992), J. Bacteriol., 174, 3429-3438.