Ajmalicineproductie door Catharantus roseus

•

•

•

•

•

•

•

•

adres:

Technische Universiteit Delft

~/~~.~

!~~~~u4)

F.V.O.Nr:

2717

Vakgroep Chemische Technologie

Verslag behorende

bij het fabrieksvoorontwerp

van Rogier Meulenberg Pim Neefjes onderwerp: Ajmalicineproductie door Catharantus roseus Prof. Bosschastraat 20 2628 HN Delft

Laan van Groenewegen 10 2635 EZ Den Hoorn

opdrachtdatum: maart 1987

verslagdatum: november 1987 "

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

.

'

'

.

AJMALIClNEPRODUCTIE

DOOR

CATHARANTHUS ROSEUS

Rogier M~ulenberg Prof. Bosschastraat 20 2628 HN Delft 015 - 621593 Pirn Neefjes

Laan van Groenewegen 10 2635 EZ Den Hoorn

015 - 125004

•

•

•

•

•

•

I

.

•

•

•

I

I

.

-1-SAMENVATTING

In dit fabrieksvoorontwerp is de productie van ajmalicine door Catharanthus roseus op industriele schaal beschreven. Uitgangspunt was om 33% van de huidige wereldomzet te produceren, hetgeen zou neerkomen op ruim 1000 kg per jaar. Het ontworpen proces heeft een productiecapaciteit van 1200 kg per jaar.

Het probleem van ajmalicine is dat het net als vele andere alkaloiden zich ophoopt in de vacuolen van de plantecellen. Om het ajmalicine toch in handen te krijgen hebben wij gekozen voor het permeabiliseren van de plantecellen. Aan de reactor met plantecellen wordt een DMSO-oplossing toegevoegd, die de plantecellen permeabiliseert. Na korte tijd wordt de DMSO-oplossing

uitgespoeld opdat de plantecellen niet helemaal kapot gaan. We zijn er van uitgegaan dat plantecellen vijf maal kunnen herstellen van een

permeabilisatie, zodat zes productiefases per culuture kunnen plaatsvinden. De plantecellen worden in een fermentatietrein batch opgekweekt, waarna ze in de productiefermentoren fed-batch tot 20 g.DW/l worden opgekweekt. Voor de productiefase wordt de inhoud van een fermentor bij een andere fermentor gevoegd en het geheel ingedikt tot 40 g.DW/l. Groei tot 40 g.DW/l is niet goed mogelijk omdat door de hierbij optredende hoge viscositeit de

beluchting problemen geeft.

Plantecellen groeien veel langzamer dan micro-organismen. het is daarom noodzakelijk om alles goed steriel te houden. De sterilisatie van de

apparatuur gebeurt met stoom. De verschillende oplossingen kunnen met batch-sterilisatie of met batch-sterilisatie door microfilters steriel gemaakt worden. Voor het steriliseren van de media voor het begin van de groeifase is batch-sterilisatie het goedkoopst, voor alle andere stromen wordt gekozen voor sterilisatie met microfilters.

De opwerking van aJmalicine kan door extractie met een organisch

oplosmiddel, zoals chloroform, en door adsorptie op een adsorptiekolom. Er zijn echter te weinig stofeigenschappen van ajmalicine bekend om de

opwerking op grote schaal goed uit te werken, zodat alleen een globale aanzet gegeven is in bijlage 4

De kostprijs van ajmalicine hangt sterk af van de investeringen en de arbeidskosten. Voor de prijzen van de fermentoren zijn de prijzen van

compact-units van een fabrikant genomen. Door de compleetheid van deze units kan eventueel volstaan worden met een aangepaste lagere Lang-factor voor

•

•

•

•

•

I

.

•

I

I

.

I

•

•

I

I

•

-2-berekening van de investeringskosten per jaar. Voor de arbeidskosten kan men uitgaan van ajmalicineproductie binnen een bestaande fermentatieindustrie of van ajmalicineproductie als een op zichzelf staand proces. De kostprijs van ajmalicine varieert dan van fl.6600.- tot fl. 9700.- per kg. Deze prijzen zijn hoger dan de huidige marktprijs van ajmalicine, namelijk fl.4400.- per kg.

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-3-INHOUDSOPGAVE. 1. Inleiding.

2. Karakterisering van de plantecel.

3. Procesindeling. 3.1. Groeifase. 3.2. Productiefase. 3.3. Permeabilisatiefase. 4. Fermentatietrein. 5. Tijdschema.

6. Keuze van de capaciteit.

7. Keuze van het medium.

8. Motivering van keuze en berekening van apparatuur. 9. Viscositeit. 10. Zuurstofoverdracht. 10.1. Groeifase. 10.2. Productiefase. 11. Verdamping. 12. Warmteoverdracht. 12.1. Groeifase. 12.1.1. Warmteproductie. 12.1.2. Warmteafvoer. 12.2. Productiefase. 13. Sterilisatie.

13.1. Batch-sterilisatie met stoom.

13.2. Sterilisatie met behulp van filters. 13.3. Keuze van de sterilisatie.

14. Afvalstromen. 15. Kostenberekening. 15.1. Apparatuurkosten. 15.2. Variabele kosten. 15.3. Kostprijs. 16. Conclusies.

17. Suggesties voor verder onderzoek. 18. Verklaring van tekstsymbolen. 19. Literatuur. Bijlagen. 4 6 8 8 8 9 10 11 12 13 18 21 23 23 29 31 34 34 34 37 39 41 42 48 49 51 52 52 55 62 65 66 67 71 74

•

I

,

.

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-4-1. INLEIDING.

Het doel van het in dit fabrieksvoorontwerp besproken proces is het produceren van ajmalicine door Catharanthus roseus plantecellen tegen minimale kosten.

Ajmalicine wordt in de geneeskunde als bloedvatverwijdend middel toegepast. Het is een secundair metaboliet, een alkaloide, en wordt door de genoemde plantecel normaal gesproken in zeer kleine hoeveelheden gesynthetiseerd en opgeslagen in de vacuole. Het probleem van industriele toepassing van deze productie is dan ook tweeledig. Ten eerste moet de productie geoptimaliseerd worden en ten tweede moet het product zo goedkoop, dus zo eenvoudig,

mogelijk uit de plantecellen gewonnen kunnen worden.

We zullen nu eerst een overzicht geven van de behaalde en gepubliceerde resultaten tot nu toe:

Cellen van hogere planten worden pas sinds 45 jaar in cultuur gebracht. Dit is relatief zeer kort in vergelijking met bacterien en andere

micro-organismen. In de eerste fase wilde men alleen een beter inzicht verkrijgen in de groeiwijze van de verschillende delen van de plant. Resultaten hiervan waren het kweken van worteltoppen, cambium en tumoren [1]. De tweede fase kenmerkte zich door onderzoek naar mediumsubstituenten, vooral voor

organische groeiregulatie, wat resulteerde in het kweken van plantecellen van alle delen van de plant. Dit resulteerde zelfs in de regeneratie van normale planten uit calluscultures [2].

Deze successen deden vermoeden dat plantecellen als aantrekkelijke

producenten van speciale organische stoffen konden dienen. Men dacht hierbij onder andere aan alkaloiden, aminozuren, eiwitten, enzymen, pigmenten,

antobiotica tegen Staphylococci en Mycobacteria en groeiregulatoren [3]. En omdat plantecellen ook in suspensiecultures konden worden gekweekt die veel op bacteriecultures in de fermentalieindustrie leken kon men veel al bekende technieken meteen toepassen bij het kweken van plantecellen.

Het op grote schaal kweken van plantecellen begon circa 25 jaar geleden met 20-liter fermentoren [4]. Het duurde echter nog 10 jaar totdat het op grote schaal kweken echt begon toen Japanse onderzoekers tabakcellen gingen kweken in gemodificeerde 650Q-liter geroerde-tank bioreactoren. Genoemde

onderzoeken toonden aan dat er grole morfologische en fysiologische verschillen bestonden tussen micro-organismen en plantecellen, die het

•

•

•

•

•

I

•

•

•

•

•

•

'

.

-5-kweken van plantecellen sterk beinvloedden. De voornaamste verschillen staan in tabel 1.

Tabel 1: Vergelijking van microbiele- en plantecellen.

Kenmerk grootte verdubbelingstijd entdichtheid schuifspanning zuurstofbehoefte beluchting Microbiele cel klein, 2

(

1JII1

<

1 uur laag ongevoelig

hoog, 5 - 90 lJII101 Oz/l/h.

1 - 2 vvm Plantecel

o

, groot, 105

₍

_1JII1

₎

dagen 5 - 20% gevoelig

laag, 1.8 lJII10l Oz/l/h. 0.1 - 0.3 vvm

De hoge productiekosten maken de processen tot nu toe alleen rendabel voor productie van dure fijnchemicalien, maar de verwachting is dat in de

toekomst ook processen rendabel zullen worden voor minder exclusieve en goedkopere producten, zoals natuurlijke additieven voor de

•

•

•

•

•

•

•

•

I .

_I

•

•

•

-6-2. KARAKTERISERING VAN DE PLANTECEL.

Tot nu toe zijn cellen van vele plantesoorten al met succes in vloeibare suspensie als batchcultuur gekweekt [5). Plantecellen in cultuur vormen losse cellen en celaggregaten waarvan de onderlinge verhouding per culture sterk verschilt. In de meeste cultures tot nu toe is het percentage losse cellen en clusters van twee cellen ongeveer 60% [6). Deze vorming van aggregaten wordt veroorzaakt door de manier van delen van de plantecellen

[7]. De plantecel deelt namelijk door vorming van een interne dwarswand en dit kan leiden tot celclusters die bij elkaar worden gehouden door de gezamelijke celwand. Vaak zullen in een batchculture aan het eind van de fase van celdeling een deel van de aggregaten opbreken door de celvergroting die nog plaatsvindt. Vandaar dat het percentage losse cellen verandert

gedurende de groeifase.

Plantecellen in suspensiecultuur hebben een dunne, voornamelijk uit

cellulose bestaande, celwand, die de protoplast omsluit. De protoplast bevat onder andere verscheidene vacuolen die vaak onderling verbonden zijn en ook materie kunnen uitwisselen. De protoplast zal, zonder celwand in

cultuurmedium, water opnemen en barsten. De celwand heeft dus onder andere als functie om een tegendruk tegen de osmotische druk van de protoplast te leveren.

Plantecellen zijn veel groter dan bacterien en schimmels. Normaal gesproken zijn de afmetingen van in cultuur gebrachte plantecellen 20-40 ~ in

diameter en 100-200 ~ in lengte. Plantecellen zijn dus qua volume 105_-2*105

maal groter dan bacterien. Daarom zijn stofoverdrachtsprocessen in

plantecellen groot en de metabolische snelheden klein in vergelijking met bacterien. Andere nadelen van dit relatief grote volume zijn dat

plantecelsuspensies een vrij hoge viscositeit hebben en dat plantecellen vrij gevoelig zijn voor afschuifspanningen [8). Beide nadelen hebben een negatief effect op de mengtijd terwijl de roersnelheid niet te hoog mag worden vanwege de daarmee gepaard gaande hoge afschuifsnelheid. De

verdubbelingstijd van plantecellen is meestal tussen de 20-80 h., wat 60-200 maal groter is dan bij bacterien [10). Hieruit blijkt dan ook meteen de noodzaak tot sterilisatie van alle stromen die de reactor in gaan want zodra het medium geinfecteerd wordt met een bacterie zal deze binnen zeer korte tijd de plantecel overwoekeren door zijn veel kortere verdubbelingstijd.

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-7-De basis voor alle media voor plantecellen is een mengsel van anorganische zouten met een koolstof-(en energie-)bron, wat meestal glucose of sucrose is. Als glucose of sucrose koolstof- en energiebron is dan is tijdens het kweken geen licht nodig [lOJ. Vaak worden dan nog groeiregulatoren,

vitamines en aminozuren aan het medium toegevoegd. Verder is tijdens het kweken beluchting nodig.

De productie van secundaire metabolieten, zoals alkaloiden, vindt niet in de groeifase plaats. Pas als de cel in de groei gelimiteerd wordt door gebrek aan een, voor de groei onmisbaar, mediumbestanddeel komt de productie van alkaloiden op gang. Deze worden voor 90% in de vacuolen opgeslagen. Bij permeabilisatie of immobilisatie van de plantecellen worden de alkaloiden wel in het medium uitgescheiden.

De parameters van de, in dit procesontwerp gebruikte plantecel, Catharanthus roseus, worden hieronder gegeven [lIJ:

IJ

=

1. 16

10-

~

1, • __

y::x=

0.70 mol/C-mol,

yJL

t

tJlr

mo

=

4.2 10-3 _mol/C-mo1/h,

f'h'tMh~~U

~o-~

.

C-mo1

=

30 g, ~Ju.A-"e.· Verhouding fresh weight/dry weight

=

10,

I

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-8-3. PROCES INDELING

Het productieproces van Ajmalicine door Catharantus roseus plantecellen vindt plaats in drie fasen:

1. de groeifase 2. de productiefase

3. de permeabilisatiefase

3.1

GROEIFASE

De eerste fase is het opkweken van de culture tot een drooggewicht van 20 g.DWjl: de groeifase. Dit gebeurt in twee fermentoren gelijktijdig, zodat totaal 36 m3 medium met 20 g.DWjl Catharanthus verkregen wordt. Het medium dat gebruikt wordt is het M3 medium van P. Morris [12]. Er wordt begonnen met een ent van 1 m3 20 g.DWjl in 10 m3. Tijdens de groeifase wordt het volume constant opgevoerd totdat aan het einde van de groeifase een volume van 18 m3 is bereikt. Hiervoor wordt niet alleen medium toegevoegd maar ook water om voor het water dat tijdens de groeifase verdampt te compenseren. Voor de groeifase is een .periode van 250 uur aangenomen, gebaseerd op een delingstijd van Catharanthus rosues van 60 u~r

[13].

De inhoud

fermentor wordt bij de andere gevoegd, waarbij het medium teg

wordt ingedikt. We hebben dan een fermentor met een culture van 40 g. DWj1. Het is waarschijnlijk niet mogelijk om een culture van 40 g.DWjl in een fermentor te kweken aangezien Catharanthus tijdens de groei dermate veel zuurstof verbruikt dat bij hoge biomassaconcentraties niet voldoende zuurstof geleverd kan worden door beluchting, (zie hoofdstuk

10.1).

3.2 PRODUCTIEFASE

Tijdens de tweede fase van het proces wordt zo weinig zuurstof aan de culture geleverd dat er geen groei optreedt. Er is juist genoeg zuurstof voor de maintenancebehoefte van de culture. In deze fase komt de productie van ajmalicine op gang: de productiefase. De productiefase duurt 10 dagen. Hierbij valt het op dat gedurende de eerste dagen van de productiefase

weinig geproduceerd wordt (zie figuur 1 [12]). Men mag er daarom dan ook van

+/o~

-•

•

•

•

I

•

•

o

.

•

•

-9-uitgaan dat geen herstelfase nodig is, aangezien de cel aan het begin van de productiefase genoeg tijd heeft om zich te herstellen van de

permeabilisatie. Volgens Pareilleux [14] kan op een productie van 1.5% ruw alkaloide van het drooggewicht biomassa gerekend worden.

3.3 PERMEABILISATIEFASE

Daar de plantecellen bijna alle ajmalicine opslaan moet er een manier gevonden worden om het product uit de plantecellen te krijgen. De

mogelijkheid die wij hiervoor willen gebruiken is permeabilisatie. De wand van de plantecel wordt permeabel gemaakt met een 5% DMSO-oplossing, waarna

0

de plantecel ajmalicine in het medium excreteert: de

permeabilisatiefase

v1~

De technische uitvoering hiervan gaat als volgt. Het medium van de

~;

productiefase wordt tot de helft afgezogen. De culture

bestaat

/

~

or

60% uit medium en voor 40% uit plantecellen. 5.4 m3 _{medium wordt afgezogen en daarna}

wordt 5.4 m3 _{10% DMSO-oplossing toegevoegd. De plantecellen bevinden zich}

dan in een 5% DMSO-oplossing. Wanneer de DMSO de plantecellen binnen dringt is de concentratie aan DMSO in de gehele culture 3%. De plantecellen mogen maar een half uur in deze oplossing aanwezig zijn en voor een goede

permeabilisatie dienen ze minstens 5 minuten in deze oplossing aanwezig te zijn [15]. Aangezien de mengtijd slechts enige seconden bedraagt [26,31] kan na 5 minuten met de afzuiging van de helft van het medium begonnen worden. Het afzuigen en opnieuw vullen van de reactor met een spoelmedium dient dan in 25 minuten te gebeuren. Het spoelmedium bestaat uit een sucrose-oplossing van 50 gram per liter. Dit is nodig om de osmotische waarde van het medium op peil te houden en verder wordt sucrose als voeding gebruikt. Na een goede menging wordt het halve medium weer afgezogen, waarna het weer aangevuld wordt met spoelmedium. Dit gebeurt nog driemaal, waarbij de laatste keer geen spoelmedium maar productiemedium wordt toegevoegd. De concentratie aan Dl'-ISO in de culture 1S dan 0.72%. We gaan er van uit dat dit niet meer

schadelijk voor de plantecellen is. Voor de volgende permeabilisatie dient rekening gehouden te worden met de concentratie DMSO die nog in het medium aanwezig is. We gaan er van uit dat elke culture 6 maal een produktiefase kan doorlopen. Na de laatste produktiefase kunnen de plantecellen eventueel wat langer in de DMSO-oplossing gehouden worden, ze worden daarna toch weggegooid .

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-11-5. TIJDSCHEMA

De groeifase voor de 25 m3 _{reactoren duurt ruim 10 dagen, namelijk 250 uur.} Met enige tijd voor het overpompen kan na elf dagen met de productiefase begonnen worden. De productiefase duurt 10 dagen, waarna er

gepermeabiliseerd en gespoeld moet worden, dit kan allemaal in een dag

gebeuren. De plantecellen kunnen 6 maal een productiefase doorgaan, zodat de totale produktieperiode 66 dagen duurt. Inclusief 11 dagen voor de groeifase en een dag voor het steriliseren van de reactoren komt een cyclus van 6

~

productiefasen op 78 dagen. Er zijn 6 produktiereactoren zodat er elk jaar

1

168 maal geproduceerd kan worden.

_t

_-

{}of/~&..o>~(a~,

/'I J ' De fermentatietrein dient tijdens een cyclus van 78 dagen 6 maal een,

Jroeifase te doorgaan. Voor de eerste en de tweede reactor duurt de groeifase 200 uur, ruim 8 dagen. Er is dus voldoende tijd om dit te

realiseren. Voor de derde reactor duurt een groeifase 250 uur. Er is voor deze reactor een periode van 2.5 dag om de reactor leeg te pompen, te steriliseren en weer vol te pompen. Dit is ook ruimschoots voldoende tijd. Voor een grafische weergave van het tijdschema zie figuur 2.

•

•

,.,

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-10-4. FERMENTATIETREIN

Gekozen is voor het gebruik van een zo groot mogelijke reactor voor de uiteindelijke productie. Gezien de teerheid van plantecellen werd een grotere reactor dan de in de biotechnologische industrie veel

gebruiktereactor van 25 m3 _{te riskant bevonden [16]. De groeifase wordt}

normaliter gestart met een 10% ent. Een 25 m3 _{reactor heeft een mediumvolume}

van 18 m3_{• Er wordt met een fed-batch systeem gewerkt met een beginvolume}

van 10 m3

, voor de ent is dus 2

*

1 m3 20 g.DW/l nodig voor de twee

reactoren, waarin de hoeveelheid plantecellen voor een productiefase wordt gekweekt. Deze ent van 2 m3 _{20 g.DW/l wordt opgekweekt in een reactor van}

2.7 m3

• Deze groeifase gaat batchgewijs, voor de ent is nu 0.2 m3 20 g.DW/l

nodig. Hiervoor is een reactor aanwezig met een volume van 0.27 m3_{, welke}

wordt beent met 20 liter 20 g.DW/l uit het bedrijfslaboratorium.

De verhouding tussen het mediumvo1ume en het reactorvolume is als volgt tot stand gekomen. Een geroerde tank met een beluchting heeft een gas hold-up van enkele procenten [30]. Een precieze hold-up valt niet te berekenen, daarom nemen we een hold-up aan van 5%. Het werkvolume van een reactor is 80% van het reactorvolume, zodat de verhouding mediumvolume staat tot reactorvolume 75% is. De afmetingen van de reactoren staan gegeven in tabel 2.

Tabel 2: Dimensies reactoren

Reactor 1 2 3 Volumel V (m32 .27 2.7 25 Diameter _{T (m2} .56 1.2 2.5 Hoogte Hr (m} 1.1 2.4 5.2 Vloeistofhoogte H (m} .82 1.8 3.7 Roerderdiameter D (m} .18 .38 .80 Toerental

N

(s- I} 5.7 2.7 1.3 Bafflediameter Db (m} .05

.11

.22

Voor de dimensies is gebruik gemaakt van tabel 1. 7: Product ion scale reactor dimensions uit Oosterhuis [31] .

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-11-5. TIJDSCHEMA

De groeifase voor de 25 m3 _{reactoren duurt ruim 10 dagen, namelijk 250 uur.} Met enige tijd voor het overpompen kan na elf dagen met de productiefase begonnen worden. De productiefase duurt 10 dagen, waarna er

gepermeabiliseerd en gespoeld moet worden, dit kan allemaal in een dag

gebeuren. De plantecellen kunnen 6 maal een productiefase doorgaan, zodat de totale produktieperiode 66 dagen duurt. Inclusief 11 dagen voor de groeifase en een dag voor het steriliseren van de reactoren komt een cyclus van 6 productiefasen op 78 dagen. Er zijn 6 produktiereactoren zodat er elk jaar

168 maal geproduceerd kan worden.

De fermentatietrein dient tijdens een cyclus van 78 dagen 6 maal een groeifase te doorgaan. Voor de eerste en de tweede reactor duurt de groeifase 200 uur, ruim 8 dagen. Er is dus voldoende tijd om dit te

realiseren. Voor de derde reactor duurt een groeifase 250 uur. Er is voor deze reactor een periode van 2.5 dag om de reactor leeg te pompen, te steriliseren en weer vol te pompen. Dit is ook ruimschoots voldoende tijd. Voor een grafische weergave van het tijdschema zie figuur 2.

•

•

•

•

I

\

·

'.

•

•

•

•

•

•

•

- - - -

-12-6. KEUZE VAN DE CAPACITEIT.

Om de apparatuur te kunnen dimensioneren is het noodzakelijk om eerst de productiecapaciteit vast te stellen.

Wij zijn er vanuit gegaan om met het 1n dit verslag beschreven

productieproces ongeveer 30% van de wereldomzet aan ajmalicine te gaan produceren. Dit komt neer op ongeveer 1000 kg ajmalicine per jaar. Aan de andere kant moet de dimensionering van de apparatuur wel reeel blijven. Te grote fermentoren geven grote problemen ten aanzien van zuurstofoverdracht en hoge roersnelheden en dus hoge afschuifkrachten.

Uiteindelijk hebben we gekozen voor geroerde tankreactoren van 25 m3 (V d = 18 m3

) . Hiervan hebben we er 6 voor productie met een me

biomassaconcentratie van 40 g.DW/l en 1 voor het kweken van biomassa tot 20

g. DW/l. Verder nemen we aan dat Catharanthus roseus per productiecyclus ongeveer 1.5% van zijn drooggewicht aan ajmalicine produceert. Hiervan blijft tweederde over na opwerking

(17].

Per productiecyclus komt dat neer op een ajmalicineproductie van 7.2 kg. Aangezien er 168 cycli per jaar plaatsvinden wordt per jaar dus ongeveer 1200 kg ajmalicine geproduceerd. Dit is wel iets boven de beoogde productiecapaciteit maar productie met minder reactoren zou leiden tot een minder rendabel gebruik van de

kweekreactor en andere apparatuur. In deze situatie met deze apparatuur is dit het productieoptimum.

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-13-7. KEUZE VAN HET MEDIUM.

De verschillen tussen de media uiten zich vooral in de keuze van de toegevoegde stoffen als groei- en productieregulatoren. Onder een

basismedium wordt een medium verstaan waar alleen de minerale bestanddelen aan zijn toegevoegd. Ook hiervan zijn er echter een aantal in omloop. Het meest toegepast wordt het MS-medium, wat werd samengesteld door Murashige en Skoog [18] (zie bijlage 1). Verder zijn er nog het LS-medium van Lin en Staba [19], het NN-medium van Nitsch en Nitsch [20] en het Bs-medium van Gamborg [21]. Als koolstofbron wordt over het algemeen sucrose gebruikt omdat het goedkoper is en dezelfde resultaten geeft als glucose [22, 23, 24].

Vaak worden voor groei- en productiefase verschillende media gebruikt. Er wordt daarbij gebruik gemaakt van hormonen die een gunstige invloed hebben op de groei dan wel de productie. Ook wordt er wel gebruik gemaakt van een hogere suikerconcentratie voor een hogere productie.

De hormonen lAA (indool-3-azijnzuur), NAA (naftaleenazijnzuur) en kinetine stimuleren zowel de groei als de alkaloideproductie [22, 23]. Benzyladenine stimuleert alleen de groei en 2,4-D (2,4-dichloorfenoxyazijnzuur) stimuleert de groei maar remt de alkaloidesynthese [23].

In tabel 3 worden de resultaten van een vergelijkend onderzoek door Morris [12] van verschillende media gegeven. Het NBs-medium geeft hier een hogere ajmalicineproductie maar de ajmalicinehoeveelheid bouwt zich langzamer op dan bij productie in het M₃-medium. Daarom hebben wij voor productie in het M3-medium gekozen. Voor groei- en productiefase kan nu hetzelfde medium

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-14-tabel 3: Alkaloideproductie door celsuspensies van Catharanthus roseus op verschillende productiemedia.

Medium Basaal Groei Sucrose Biomassa

medium regulatoren conc. conc.

(mg/I. ) (g;l.) (g.OW;l.) Bs Bs 2,4-0 1.0 20 8.5 kinetine 0.1 8% S NI Z IBs Bs MS sucrose 8% MS NN LS Bs MS 2,4-0 0.1 IAA 0.1 kinetine 2.0 IAA 2.0 IAA 0.175 lAA 1.0 kinetine O. 1 NAA 1.0 kinetine 0.1 NAA 1.0 kinetine

O.

20 20 80 20 20 20 20 50 20 20 20 7.5 8.0 2.0 13.0 15.0 13.2 7.0 10.3 12.5 10.0 10.0

Max. ajmalicine Productie

opbrengst snelheid (mg/g.OW) (mg/l/dag)

o

0 0.31 0.4

o

0.01

o

o

0.19 1.2 0.8 1.7 1.5 0.55 0.48

o

0.04

o

o

0.03 0.7 0.4 1.4 4.1

Alle celsuspensies werden gedurende 14 dagen gekweekt in Bs-medium alvorens

ze in de verschillende productiemedia werden overgebracht. Basis media: Bs : Gamborg [21].

MS: Murashige en Skoog [18]. NN: Nitsch en Nitsch [20]. LS: Lin en Staba [19].

We zullen nu eerst de benodigde beginconcentralie sucrose berekenen om tot een celdichtheid van 20 g.OW/l te kweken. We gaan hierbij uit van de

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

I

•

I

-15-tabel 4: Groeigegevens van Catharanthus roseus.

D (l0-3h-1 • ) C (l0-3C-mol/1. ) r (10-3C-mol/l/h.) r (10-3C-mol/l/h.

x x s

3.6 76 0.27 0.96

4.3 78 0.34 l.15

6.0 83 0.50 1.60

8.1 92 0.75 2.16

Voor de berekening van de beginconcentratie sucrose gaan we nu uit van de volgende vergelijking:

r s = r x y sx + m _s

*

C _x

Met de gegevens uit tabel 4 lossen we nu Y en m op, we vinden: sx s

Y

_sx

=

0.42 C-mol/C-mol.

m

=

4.2 10-3 _{C-mol/C-mol/h.}

s

Verder geldt4'

~

~L~fA4~

dC s r

₌

s dt r

₌

_p

*

_C x x C _x

₌

C

_O

*

exp(p

*

_t) waarin: _Co

₌

3.7 10-2 _C-mol/l. p

₌

1.16 10-2 _h- 1_•

Voor de groeifase wordt vergelijking (7.1) dan:

- dC s = ( __ p __ + ms)

*

C

o

*

exp(p

*

t)

*

dt Y randvoorwaarde: t

=

0: C

So

sx

C

_s

=

O.

(7.1) (7.2) (7.3) (7.4) (7.5)

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-16-Integratie voor t

=

0 tot 250 h. levert:

Co

C = ( __ ~ __ + m )

*

*

exp(~

*

t) - 0.1

s y s

sx ~

Na invullen van de constanten vinden we voor t

=

250 h.:

C = 1. 74 C-mo1. s

(7.6)

Als we stellen dat aan het einde van de groeifase het medium uitgeput mag zijn moet dus minimaal 1.74 C-moi/i. sucrose (~ 50 gil. sucrose) in het medium opgelost zijn.

We herhalen nu de berekening voor de productiefase. Voor de productiefase geldt het volgende:

~

=

0

C = 1.33 C-moi/i. x

Vergelijking (7.5) gaat dan over in:

- dC _s

=

m _s

*

C _x

*

dt

randvoorwaarde:

t

=

0: C

so

C s =

o.

Integratie over t

=

0 tot 240 h. levert:

(7.7)

(7.8)

Daar we in de groei- en productiefase hetzelfde medium gebruiken geldt:

C = 50 gil.

=

1.75 C-moi/l.

so

•

•

•

•

•

•

•

•

•

e

=

0.41 e-mol/l. s

-17-Voor de productiefase is dus ruim voldoende sucrose aanwezig.

Na de groeifase in twee reactoren wordt de inhoud van beide reactoren in een reactor ingedikt. Vervolgens wordt nog 5.4 m3 _{uitgeput medium afgetapt wat}

wordt vervangen door vers medium. Dit verse medium moet dan wel 3.3 maal geconcentreerd zijn om in de hele reactor het onverdunde medium te krijgen. Hetzelfde geldt voor na elke permeabilisatiefase als de volgende

productiefase begint want ook dan wordt maar 5.4 m3 _{medium afgetapt. Er is}

dus een voorraadvat met 3.3 maal geconcentreerd medium waarvan het medium alleen verdund wordt tot het onverdunde medium als een reactor wordt gevuld voor een nieuwe groeifase.

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-18-8. MOTIVERING VAN KEUZE EN BEREKENING VAN APPARATUUR.

We dimensioneren nu eerst achtereenvolgens de fermentoren, de voorraadvat en , de pompen en de compressor.

De grote fermentoren hebben een volume van 25 m3 _{en een mediumvolume van 18}

m3

• Dit volume voor plantecelfermentoren is momenteel het maximaal haalbare

bij de gebruikte celdichtheden, als we kijken naar de zuurstofoverdracht en de afschuifkrachten op de plantecellen. Daar gewerkt wordt met een 1:10

entverhouding en er vanuit de fermentatietrein steeds twee reactoren met, op dat moment, 9 m3 _{medium moeten worden geent, zal de tweede fermentor uit de}

fermentatietrein 2 m3 _{entvolume moeten bevatten. Het volume van deze}

fermentor wordt dan 2.7 m3_{• De eerste fermentor uit de fermentatietrein moet}

dan 0.2 m3 _{entvolume bevatten en heeft dus een volume van 0.27 m}3 _(zie

hoofdstuk

4

)

.

Er moeten voorraadvat en zijn voor het medium, de sucrose-oplossing en de DMSO-oplossing. In het mediumvoorraadvat moet voldoende medium zitten voor de groeifase en 6 productiefasen. Daar het medium 3.3 maal geconcentreerd is moet dit voorraadvat dus een volume hebben van

44

m3_{• Het voorraadvat met}

DMSO hoeft maar voor 1 permeabilisatiefase DMSO-oplossing te bevatten. Het heeft dus een volume van 5.4 m3_{• Uit het voorraadvat met sucrose-oplossing}

moet na elke permeabilisatiefase drie maal gespoeld worden. Dit vat moet dus een volume van 16.2 m3 _hebben.

Het mediumvoorraadvat moet dus zes maal per cyclus opnieuw gevuld worden en het DMSO- en sucrosevoorraadvat 36 maal. Dit komt omdat bij de

laatstgenoemde vaten steeds voldoende tijd beschikbaar is voor het vullen tussen de fasen door, terwijl dit niet geldt voor het mediumvoorraadvat (zie figuur

2).

Voor de berekening van de benodigde pompvermogens wordt uitgegaan van een gemiddeld totaalrendement van ntot = 0.5 en een gemiddelde drukval van

óP = 3 bar [29). Het asvermogen van de pomp wordt dan berekend volgens [29): P

P = e =

as (8.1)

ntot ntot

We stellen dat de mediumpomp P9 de fermentoren binnen 2 uur volgepompt moet hebben. Daar het medium 3.3 maal geconcentreerd is wordt het debiet dan: ~ = 2.72 m3_{/h. Het asvermogen wordt dan: P = 455 W.}

•

•

•

..

•

•

•

•

•

•

•

•

-19-Het debiet bij de mediumpomp (PlO) voor het fed-batch opvullen van de groeifermentoren wordt: f = 1.92 10-z m3_{/h. Het as vermogen wordt dan:}

v P = 3.2 W.

as

De eis bij de DMSO/sucrosepomp (P16) is hetzelfde als voor de DMSO-afvoerpomp (P21). Deze is dat de 5.4 m3 _{zowel binnen 12 min. bij- als} weggepompt moet worden. Het debiet wordt dan: f

=

27 m3_{/h. Het asvermogen}

v wordt dan: P = 4500 W.

as

De eis voor de pomp die wordt gebruikt voor het indikken van de inhoud uit beide groeifermentoren in een groeifermentor (P13) is dat dit binnen 2 uur moet gebeuren. Het debiet wordt dan: f

=

11.7 m3_{/h. Het asvermogen wordt}

v dan: P = 1950 W.

as

Het overpompen van de ent van de eerste fermentor naar de tweede fermentor uit de fermentatietrein mag 10 min. duren. Het debiet wordt dan:

f

=

1.2 m3_{/h. Het asvermogen wordt dan: P}

=

_{200 W.}

v as

Het overpompen van de ent van de tweede fermentor uit de fermentatietrein naar de twee groeifermentoren mag een uur duren. Het debiet wordt dan: f

=

2 m3_{/h. Het as vermogen wordt dan: P}

=

_{335 W.}

v as

De eisen ten aanzien van de tijdsduur van het overpompen van de

verschillende vloeistoffen zijn nergens anders op gebaseerd dan op de redelijkheid ervan. Het is beslist goedkoper om allemaal pompen met minder vermogen te installeren maar dan komen we tot merkwaardig lange pomptijden

die waarschijnlijk zelden toegepast worden. Vandaar de keuze om het pomp~n ~A. /

.

-k

;'"

~I tot redelijke tijden te beperken.

>u,

tAj",::,/

,e.

(..

\

We berekenen nu het benodigde compressorvermogen. bere{ening van het

luchtdebiet gaan we uit van het maximum, d.w.z. i de fermentatietrein en in twee grote fermentoren wordt gekweekt (v =

s 0.9 cm/s. ) en in vijf grote fermentoren vindt een productiefase plaats (v = 1.0 cm/s.): _s

eerste fermentor uit fermentatietrein (T

₌

0.55 m.): f_l = 2.14 10-3 _m3_/s. tweede fermentor uit fermentatietrein (T = 1. _{19 m.): fl} = 1. 00 10-z m3_/s. twee grote fermentoren in de gr'oeifase (T---= _{2.5 m.): f}

l = 8.84 10-z m 3_/s. vijf grote fermentoren in de productiefase: _{f l} = 2.45 10-1 _m3_/s.

I

Totaal benodigd luchtdebiet: _{f l} = 3.46 10-1 _m3_/s.

,,-•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-20-Het as vermogen van een compressor kan uitgerekend worden volgens [29]:

waarin: Pas

=

-l1tot

Po

= luchtdruk = 1 105 _N/mz. llt t = 0.5.

P

0 2

= quotient van persdruk en aanzuigdruk van de compressor =

(8.2)

2.3.

Het berekende asvermogen van de compressor komt hiermee op: P

=

57.6 kW. as

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

- -- - - _._---_._-_ ..

- -21-9. VISCOSITEIT.

In het afstudeerverslag van Markx [25] werd de viscositeit van

plantecelcultures van Catharanthus roseus gemeten tot 500 g.FW/l. Dit kwam

echter overeen met een maximum van 12 g.DW/l. Tegen het einde van de groeifase loopt, zoals beschreven in het verslag van Markx, de FW/ DW-verhouding op tot 50, terwijl deze verhouding nooit onder de 25 komt. Wij willen proberen de FW/DW-verhouding op 10 te houden door de osmotische druk van het medium hoog te houden (eventueel met mannitol) zodat het strekken van de cellen aan het eind van de groeifase wordt tegengegaan. We bereiken dan een maximale plantecelconcentratie van 400 g.FW/l. Er van

uitgaande dat de viscositeit grotendeels bepaald wordt door het versgewicht, wat in overeenstemming is met de experimenten van Markx, stellen we de

viscositeit van plantecelcultures met eenzelfde versgewichtconcentratie hetzelfde. Om toch tot een figuur te komen waarin de viscositeit tegen het drooggewicht is uitgezet, hebben we de bij Markx gegeven versgewichten, met de, bij ons ontwerp behorende, versgewicht/drooggewicht verhouding van 10, omgerekend naar de drooggewichten die in figuur 3 gegeven zijn.

In figuur 3 wordt de viscositeit tegen de biomassaconcentratie uitgezet. De punten uit deze figuur zijn afkomstig uit de figuren 32 en 33 uit het

verslag van Markx [25].

Markx gebruikte bij zijn bepaling van de viscositeit een roersnelheid van 27 rpm waar in ons ontwerp een roersnelheid van 78 rpm gebruikt wordt. Figuur 30 uit zijn verslag leert echter dat de viscositeit bij hogere toerentallen niet veel meer veranderd zodat we waarschijnlijk zonder problemen deze waarden kunnen gebruiken (de figuren 30, 32 en 33 uit het verslag van Markx zijn opgenomen in bijlage 2).

Om met de viscositeit als functie van de biomassaconcentratie te kunnen r'ekenen hebben we de in figuur 3 gegeven kromme benaderd. We hebben hiertoe een drietal functievormen geprobeerd:

II = _a

*

_CZ + b

_*

C + c,

(9.1)

x x II = exp(a

*

C + b) en (9.2) x II = exp(a

*

CZ + b

*

C + c).

(9.3)

x x - - - -- - --_ ..

•

•

•

•

I

•

•

•

•

•

•

•

•

-22-De laatste voldeed het beste. -22-De benadering van de viscositeit als functie van de biomassaconcentratie werd bepaald op:

11 = exp ( -6 . 211 10-4

*

CZ + 0.102

_*

C + 1.529) (9.4) x x met: 11 in mPas en C in g. OW/I. x en uitgezet in figuur 3.

-•

•

•

I

I

-•

•

•

•

-23-10. ZUURSTOFOVERDRACHT. 10.1 GROEIFASE.

Voor het opkweken van de plantecelculture tot een dichtheid van 40 g.DW/l wordt eerst de zuurstofbehoefte berekend. Tegen het einde van de groeifase zal de zuurstofbehoefte het grootst zijn. We gaan hier uit van het maximum, dat wil zeggen de hoeveelheid zuurstof nodig voor maximale groeisnelheid bij

een plantecelconcentratie van 40 g.DW/l [26]. zuurstofbehoefte: r Oz = r x y ox + m _o

*

C _x waarin: r

=

biomassaproductiesnelheid

=

~

*

C x x zodat: r

= ( __

~

__

+ m )

*

C Oz Y 0 x ox

Invullen van de in hoofdstuk 2 gegeven parameters geeft:

r = 2.77 10-z mol/l./h. oz

(10.1)

(l0.2)

(10.3)

Wc kunnen nu de zuurstofoverdrachtscoefficient (kla) berekenen die minimaal nodig is om deze hoeveelheid zuurstof van de doorgeblazen lucht in het medium te brengen: waarin: zodat: r oz r oz C* oz C oz kla k

*

(C

*

=

la _oz

=

2.77 10-z

c

)

Oz mol/l. /h.

=

verzadigingsconcentratie Oz

=

=

concentratie Oz uit fermentor

=

123.1 h-1

₌

_{3.4 10-z} S - I .

(10.4)

0.25 10-3 _mol/l.

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-24-We stellen de minimale superficiele gassnelheid op 0.6 cm/s [27]. Voor we nu de superficiele gassnelheid v kunnen berekenen die nodig is om deze waarde

s

voor de kla te te bereiken, moeten we eerst een schatting maken van de viscositeit. In figuur 3 vinden we voor een biomassaconcentratie van 40

g.DW/ l een apparent viscosity van:

dus:

n

_app

v

app

=

100 mPas.

=

kinematische apparent viscosity

=

1.0 10-4 _mZ/s.

We kunnen nu de superficiele gassnelheid uitrekenen met behulp van de formule voor CMC-oplossingen [26]:

voor: 16

<

n

<

1500 mPas. waarin: en: en: kla

=

3.4 10-z S-1 VI = vloeistofvolume in reactor = 18 m3

p = dichtheid van reactormedium = 1000 kg/m3

g = 9.8 m/sz

Pg

=

0.4

Proerders + Pbeluchting

P

_roerders = a

*

N

_p

*

p

*

N

3

*

D

5

waarin: a = aantal roerders = 3 N

=

roerkental

=

6 p N = roersnelheid = 1.3 S- I. D = roerderdiameter = 0.8 m. (l0.5) (l0.6) (10.7)

•

!

I '

•

•

I

.

•

•

•

•

•

•

-25-zodat: P roerders = 1.3 10 4

w.

en:

P

_beluchting

=

Pot

'Pg

*

ln{

(

PO

waarin:

_Po

~ druk bovenin de reactor

H ::: _{vloeistofhoogte in de}

med

+ _p

*

_g

*

_Hmed)

/

PO}

=

1.1 lOs N/m2.

reactor .= _{3.67 m.}

en: 'Pg ::: luchtdebiet door de re_{actor ::: 0.25}

*

TI

*

T2

*

V

S waarin: T = reactordiameter

=

2.5 m. zodat: Pb 1 ht' _{e. uc lng} = 1.53 lOs v _s (l0.8) (l0.9) (10.10)

Invullen van vergelijking (10.7) en (10.10) in vergelijking (10.6) levert:

=

5.2 103 _{+ 1.53 lOs v}

s (l0.11)

Oplossen van vergelijking (10.5) levert voor de superficiele gassnelheid:

v

=

8.6 cm/s.

s

Dit is te hoog. De superficiele gassnelheid mag niet groter worden dan

enkele cm/s

[26].

Tegen het einde van de groeifase kunnen we dus niet

voldoende zuurstof in de reactor mengen om de culture op te groeien tot een

celdichtheid van 40 g.DW/l. We kunnen nu een aantal alternatieven bedenken

om toch deze celdichtheid te bereiken:

1. Bijmengen van zuivere zuurstof in de luchtstroom. Nadeel hiervan is dat

we veel zuurstof mueten bijmengen voordat resultaat zichtbaar wordt.

Verder zijn er weinig gegevens beschikbaar over extra beluchting met

zuivere zuurstof.

2. Niet met maximale groeisnelheid groeien, zodat minder zuurstof per

tijdseenheid nodig is. We zullen dit alternatief eerst doorrekenen.

We stellen dat de superficiele gassnelheid maximaal 4 cm/s wordt. Uit figuur

4, waar de benodigde superficiele gassnelheid voor maximale groei is

uitgezet tegen de biomassaconcentratie, zien we dat met deze waarde tot een biomassaconcentratie van 31.5 g.DW/l met de maximale groeisnelheid gekweekt

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-26-door zuurstofbeperking. Uit figuur 5 kunnen we zien dat een celdichtheid van 31.5 g.OW/l na ongeveer 288 uur bereikt wordt. We veronderstellen het volume van de groeireactor constant tijdens de zuurstoflimitatie.

Uitgaande van vergelijking (10.5) en (10.11) met een superficiele

gassnelheid van 4 cm/s vinden we voor de zuurstofoverdrachtscoefficient de

volgende relatie:

(10.12)

Uit vergelijking (10.3) en (10.4) volgt:

(10.13)

Combinatie van vergelijking (10.12) en (10.13) levert:

1. 888 10-5

- 8.167 10-7 _(10.14)

waarin: ~

=

0.001

*

exp(-6.211 10-4

*

_CZ _{+ 0.102}

*

_{C + 1.529) in Pas.}

x x

C in g. OW/I. x

We willen nu weten hoelang de groeifase gaat duren met deze lagere

groeisnelheden. We schatten deze tijdsduur af door de groeisnelheid tijdens een concentratietoename van 1 g.OW/l constant te stellen. Oe tijdsduur van zo'n concentratietoename wordt dan berekend met:

(10.15)

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-27-Tabel 5: Groeisnelheid bij groeilimitatie met v _s

₌

4 cm/s.

max Co (gil. ) C (gil. ) _Jl

*

10-6 (s-1. ) t (h. ) x 31.5 32.5 2.89 3.00 32.5 33.5 2.63 3.20 33.5 34.5 2.40 3.40 34.5 35.5 2.19 3.62 35.5 36.5 2.00 3.86 :36.5 37.5 1. 82 4.13 37.5 38.5 1.66 4.40 38.5 39.5 1. 51 4.72 39.5 40.0 1.40 2.50

Voor de groeisnelheid werd steeds de groeisnelheid op de helft van het concentratieinterval genomen.

De totale tijdsduur van de groeifase wordt nu ongeveer 320 uur.

We voeren deze berekening nog eens uit voor een maximale superficiele gassnelheid van 3 cm/s. In figuur 4 zien we dat de culture dan tot een celdichtheid van 28.5 g.DW/l met de maximale groeisnelheid groeit. Hierna treedt weer zuurstoflimitatie op. Een celdichtheid van 28.5 g.DW/1. wordt met maximale groeisnelheid bereikt na 270 uur (figuur 5). We veronderstellen het volume van de groeireactor weer constant tijdens de zuurstoflimitatie. Uitgaande van vergelijking (10.5) en (10.11) met een superficiele

gassnelheid van 3 cm/s vinden we voor de zuurstofoverdrachtscoefficient:

k a

*

~O.67 = 3.242 10-3 1

Combinatie van vergelijking (10.13) en (10.16) levert nu:

Jl = 1.532

10-5

- 8.167 10-7

Op dezelfde manier berekenen we weer de tijdsduur van de groeifase.We krijgen dan de volgende tabel:

(10.16)

I

.

•

•

•

•

'

.

•

•

•

-28-tabel 6: Groeisnelheid bij groei limitatie met v

₌

3 cm/s. s max Co (g/l. ) C _x (g/l. ) J.l

*

10-(5 (S-I.) t (h. ) 28.5 29.5 2.95 3.25 29.5 30.5 2.67 3.47 30.5 31.5 2.42 3.70 31.5 32.5 2.19 3.96 32.5 33.5 1. 98 4.25 33.5 34.5 1. 79 4.56 34.5 35.5 1.62 4.90 35.5 36.5 1.46 5.29 36.5 37.5 1.32 5.69 37.5 38.5 1.19 6.14 38.5 39.5 1. 07 6.66 39.5 40.0 0.99 3.53

Voor de groeisnelheid werd steeds de groeisnelheid op de helft van het concentratieinterval genomen.

De totale tijdsduur van de groeifase wordt nu ongeveer 325 uur.

3. Gebruik van een speciale sparger die veel kleinere zuurstofbelletjes geeft. Hierdoor neemt het effectief oppervlak van de zuurstofbelletjes toe zodat v kan dalen om dezelfde zuurstofoverdracht te halen.

s

4. De groeifase in twee reactoren laten plaatsvinden tot 20 g.DW/l en dan de reactorinhoud van beide reactoren in een reactor indikken tot een

celdichtheid van 40 g. DW/l. We rekenen voorstel 4 eerst even door. We berekenen eerst weer de zuurstofconsumptiesnelheid met vergelijking

(lO.3) en de zuurstofovcrdrachtscoefficienl met vergelijking (10.4): r = 1.38 10-z mol/l/h.

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

I

.

I

i

-29-Markx [25] vindt voor een celdichtheid van 20 g.DW/l een viscositeit van:

Tl == 25 mPas.

dus: v = 2.5 10-5 _mZ/s.

Als alle andere parameters hetzelfde verondersteld worden vinden we met vergelijking (10.5) voor de superficiele gassnelheid:

v = 0.9 cm/s. s

Dit is een zeer redelijke waarde.

De groeifase met vertraagde groei door zuurstoflimitatie lijkt dus de goedkoopste methode. Een ander onderzoek [28] leert echter dat de

viscositeit veel sneller oploopt met de celdichtheid (Tl == 100 mPas. bij 17 g.DW/l.) dan in het verslag van Markx beschreven wordt. Uitgaande van deze viscositeit zou groei tot 40 g.DW/l tot een onaanvaardbaar lange groeifase leiden wat ook de reden is dat we voor alternatief 4 hebben gekozen. Mocht de viscositeit nu inderdaad veel hoger worden dan we aannemen, dan leidt dit wel tot hogere superficiele gassnelheden, maar behoort nog wel tot de

mogelijkheden. Uiteraard leidt alternatief 4 wel tot hogere kosten (extra kweekfermentor) dan groei tot 40 g.DW/l. in een fermentor.

Voor dit ontwerp zijn we verder uitgegaan van de gegevens uit het verslag van Markx. Blijkt de viscositeit toch sneller op te lopen zoals beschreven in [28] dan leidt dit niet tot spectaculaire veranderingen in de

investeringskosten.

10.2. PRODUCTIEFASE.

Er vanuit gaande dat tijdens de productiefase geen groei optreedt, hebben we hier alleen te maken met de zuurstofbehoefte voor de maintenance van de plantecellen. Volgens de vergelijkingen (10.3) en (10.4) met een

celdichtheid van 40 g.DW/l en ~

=

0 geldt: r = 5.59 10-3 _mol/I/h.

Oz

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

_ .. _ - - -- - - -- -- - -- - - -- - -- - -_ .

-30-Berekening van de benodigde superficiele gassnelheid, met ~

=

100 mPas, volgens vergelijking (10.5) levert:

v

=

1.0 cm/s.

s

Het is dus goed mogelijk om voldoende zuurstof in de reactor te krijgen tijdens de productiefase.

•

•

•

•

•

\

•

•

•

•

•

•

-31-11.

VERDAMPING

Zowel tijdens de groeifase als tijdens de productiefase wordt het medium belucht. Tijdens de productiefase heeft de luchttoevoer een superficiele gassnelheid van l.O cm/s, hetgeen neerkomt op een debiet van 0.049 m3_/s.

Tijdens de groeifase iS in de eerste twee reactoren de superficiele

gassnelheid 0.9 cm/s en in de 25 m3 _{reactoren is de superficiele gassnelheid}

gedurende de eerste 235 uur 0.6 cm/s en daarna 0.9 cm/s. De verdamping 1S

evenredig met de beluchting en zal verder uitgewerkt worden voor de

productiefase.

De lucht wordt geleverd door de compressor en op een druk gebracht van 2.3 bar. Om condensatie te voorkomen moet de aangezogen lucht zover gedroogd worden dat het maximale verzadigingspercentage bij 2.3 bar ca. 70% bedraag Dit komt overeen met ca. 30% verzadiging bij 1 bar. Er wordt aangenomen bij deze luchtvochtigheden geen condensatie van water optreedt.

De druk van 2.3 bar na de compressor is nodig om de drukval over het

sterilisatiefilter (0.8 bar) en de fermentorvloeistofhoogte (0.4 bar) te

overwinnen en een lichte overdruk (0.1 bar) in de fermentor te handhaven. Deze overdruk dient om in geval van lekkages de kans op infectie te verkleinen.

Omdat de waterconcentratie bij verschillende drukken wordt berekend, zullen deze worden uitgedrukt in kg H

20/Nm3 (Nm

3 _{= normaal m}3_{) . Indien de waterdamp}

beschouwd wordt als een ideaal gas, dan wordt de waterdampconcentratie, p , beschreven door: x p

=

100 met: x

₌

P

₌

n P

t

- -P

₌

~~O

=

R

=

T

₌

*

P n

*

verzadiginspercentage genormaliseerde druk heersende druk temperatuur-afhankelijke verzadigde waterdampspanning molecuulmassa HzO gasconstante temperatuur (11.1) Pa Pa Pa kg/mol J/mol/K K

?

•

•

•

•

•

•

•

•

•

I

.

I

•

-32-Er is aangenomen dat de lucht na de compressor 70% verzadigd is. Onder die

omstandigheden en met p*= 2.43 kPa [39] is de waterconcentratie:

70 100

*

1 2.3

*

2.43 103

*

18 10-3 8.31

*

293 = 5.56 10-3 _(11.2)

Na de reactor is delucht op een temperatuur van 28

oe

gekomen en voor 100%

verzadigd met water. Met p* -; 3.85 103 _{(Pa) levert dit een} waterdamp-concentratie op van: 1 P_uit=--

*

1.1 3.85 103

*

_{18 10-}3 8.3]

*

301 = 25.19 10-3 _(11.3)

De hoeveelheid water, die uit het medium is verdampt, wordt gevonden door het concentratieverschil voor en na de reactor te vermenigvuldigen met de gasstroom:

(11. 4)

Voor de productiefase betekent dat:

~HzO

₌

0.96 10-3

kg/s.

Gedurende 10 dagen productie verdampt er dan 829 kg water. Aangezien aan het medium hoge eisen gesteld worden dient voor deze hoeveelheid water

gecompenseerd te worden. Dit kan het eenvoudigst door gedurende de productiefase 829 kg water toe te voegen.

Voor de groeifase is de verdamping niet sleeds constant, aangezien de beluchting na 235 uur verhoogd wordt. Voor de eerste 235 uur is de verdamping:

~HzO

=

0.58 10-3

kg/s en

x

= 490 kg HzO

Voor de laatste 15 uur geldt:

~HzO

=

0.86 10-3 kg/s en

x

= 46.6 kg

•

-33-•

Een overzicht van de verdamping in de reactoren wordt gegeven in tabel 7.

•

Tabel 7: Overzicht van de verdamElng uit de reactoren

reactor _'f'lucht verdamping verdamping per fase

( -) _00-3 _{Nm/s) (kg HzO/s) (kg HzO)}

•

R19 2.5 4.9 10-5 _35.3 R20 11. 3 2.2 10-4 ₁₆₀ R2P 29.5 5.8 10-4 ₄₉₀

•

R21 z 44.2 8.6 10-4 _46.6 R223 _{49.1 9.6 10-}4 ₈₂₉

1: groeifase tijdens de eerste 235 uur

•

2: groeifase tijdens de laatste 15 uur 3: productiefase

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-34-12. WARMTEOVERDRACHT

De warmtebalans over een reactor luidt in het algemeen:

warmtetoevoer + warmteproductie = warmteafvoer + warmteophoping (12.1)

Voor een fermentor met plantecellen kan de warmtebalans iets specifieker

opgesteld worden:

warmtetoevoer via mantel +

r

\"armtever 1 ies omgeving +

I

warmteproductie cellen + ' warmteverlies verdamping +

~

=

_<

roerwarmte + : warmteverlies decompressie + (12.2)

warmte t. g. v. expansie I _! warmteophoping

./ _I..

De warmteophoping kan nul gesteld worden en de hoeveelheid energie die vrij komt door expansie van opstijgende luchtbellen is gelijk aan de energie die wordt opgenomen door de isothermische decompressie van de lucht [32].

Vergelijking (12.2) kan dan verkort worden tot:

~antel + qproductie + qroer

=

qomgeving + ~erdamping (12.3)

Om te berekenen hoeveel warmte er door de mantel opgenomen dient te worden,

worden de overige termen van vergelijking (12.3) ieder voor zich uitgerekend

voor zowel de groeifase als voor de productiefase. Alle berekeningen zullen

uitgevoerd worden voor een 25 m3 _reactor.

12.1. GROEIFASE

12.l.I.WARMTEPRODUCTIE

Warmleproductie door groei

De warmlepr'oductie is evenredig met de zuurs tofconsumptie. Deze

zuurstofconsumptie is bij maximale groei van de plantecel 0.69 mol O~/kgDW/h

De warmteproductie is: w

=

455 kj/mol O~. De warmteproductie is hiermee

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-35-het einde van de groeifase met een planteceldichtheid van 20 g.DW/l in 18 m3

bedraagt:

w - 31. 5 kW.

max

Aan het begin van de groeifase is de warmteproductie:

w. = 1.8 kW

mln

Voor de warmteproductie gedurende de gehele groeifase moet eerst de

hoeveelheid plantecellen berekend worden. De plantecellen groeien de gehele

tijd met maximale groeisnelheid, de delingstijd bedraagt 60 uur. De

hoeveelheid plantecellen kan weer gegeven worden door:

X 1

=

X

o

*

2

(

t/~)

oftewel

X

1

=

20

*

2(t/60) kg.

p .c p .c (12.4)

De warmteproductie uitgedrukt in kW wordt dan:

w

=

0.69

*

455

*

(1/3600)

*

20

*

2(t/60)= 1.75

*

2(t/60) (12.5)

hierbij is de tijd uitgedrukt in uren, voor een grafische weergave van de

vergelijkingen (12.4) en (12.5) zie figuur 6 en 7.

Roerwarmte

Voor zowel het toegevoerd vermogen van de roerders als het vermogen van de luchttoevoer wordt aangenomen dat het gehele vermogen wordt gedissipeerd tot

warmte. Voor het vermogen van een roerder geldt de volgende vergelijking:

p _{= N}

*

p

*

N

3

*

D5 _(12.6)

p

waarin P = vermogen roerder W

N _p = roerkental

-

6

p = dichtheid = 1000 kg/m3

N = toerental = 1.3 S-1

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-36-Het vermogen per roerder komt dan op: 1.7 kW.

De reactor bevat drie roerders. Het mediumvolume loopt tijdens de groeifase

lineair op van 10 m3 _{tot 18 m}3_{• aan het begin van de groeifase worden}

slechts twee roerders effectief gebruikt, zodat het roervermogen in de tijd

oploopt van 3.5 kW to1. h.~W .

...

Warmteproductie door beluchting

Het vermogen door beluchting wordt gegeven door de volgende vergelijking:

P + p

*

g

*

Hmed )

P

=

Po

*

'Pg* In ( --=-0 _ _ _ _ _ _ _ Po

(12.7)

Aan het einde van groeifase bedraagt de superficiele gassnelheid 0.9 cm/s.

Het luchtdebiet is dan: 'P = 44 10-3 _m3_/s.

g

Het vermogen door beluchting is:

P = 1.4 kW

gas

Gedurende de eerste 235 uur (v

=

0.6 cm/s) is het vermogen door beluchting:

s

P

=

0.9 kW

gas

De totale warmteproductie is de som van de door de plantecellen

geproduceerde warmte, de roerwarmte en de warmte geleverd door beluchting.

De maximale warmteproductie is:

w + W + W

=

31.5 + 5.2 + 1.4

=

38.1 kW

pl.max roer.max gas.max

De warmteproductie als functie van de tijd is:

w

=

1.75

*

2(t/60) + (1.7/250)

*

t + 0.9 (t<235)

1.4 (t>235)

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-37-12. 1. 2. WARMTE AFVOER

Warmteverlies aan omgeving

Het warmteverlies aan de omgeving vindt plaats door het oppervlak van de

reactor dat niet afgeschermd LS door de mantel. Voor de mantel is de

mediumhoogte van 10 m3 _{medium aangenomen, dit naar aanleiding van het}

afkoelen van het medium na sterilisatie. Het oppervlak van de mantel, de

totale reactor en de totale r~actor min de mantel zijn respectievelijk:

A ::: _14.1 mZ

mantel

Atot ::: 49.9 mZ

A' ::: 35.8 _mZ

Het warmteverlies aan de omgeving is met de volgende vergelijking te

berekenen:

::: U'

*

A'

*

CT - T . )

qomg reactor omgevlng (12.9)

Met U' ::: 0.01 kW/mz [33] en een gemiddelde buitentemperatuur van 20°C,

levert dit op:

::: 2.86 kW

Warmteverlies door verdamping

in hoofdstuk 11 is uitgerekend dat op het einde van de groeifase aan water

0.86 10-3 _{kg/s verdampt. Daar de verdampingswarmte van water bij 1.1 bar en}

28

°c

1936 kj/kg bedraagt is het warmteverlies ten gevolge van verdamping:

qverd.max ::: 1. 7 kW

Gedurende de eerste 235 uur wordt er minder belucht, zodat dan ook de verdamping minder is. Voor deze periode is het warmteverlies door verdamping:

•

•

•

•

•

I

•

•

•

•

•

•

•

-38-Voor het verdampte water wordt gecompenseerd met een extra waterstroom. Deze

stroom komt met een temperatuur van 20

oe

de reactor binnen en wordt in de

reactor opgewarmd tot 28

oe.

Deze compensatiestroom bedraagt op het einde

van de groeifase 0.86 10-3 _{kg/s. De warmte nodig om deze stroom op te warmen}

bedraagt:

q

=

4.2 * 8 * 0.86 10-3

=

_{29 W}

comp

Deze warmtestroom is eenvoudig te verwaarlozen.

Tijdens de groeifase is er nog een extra inkomende stroom die van 20

oe

naar

28

oe

opgewarmd dient te worden, namelijk de mediurnstroom. Deze stroom bedraagt 8.9 10-3 _{kg/s. De benodigde warmte voor het opwarmen van deze}

stroom bedraagt:

qfed.b = 0.30 kW

Deze warmtestroom wordt wel opgenomen in de verder berekeningen.

Warmteafvoer door mantel

Aan het begin van de groeifase is de warmteproductie door groei, roeren en

beluchten 6.2 kW. Dit is meer dan de de warmteafvoer van de reactor, wanneer deze geen mantel zou hebben, van 5.1 kW. Een koelmantel is noodzakelijk.

Zowel de warmtetoevoer als de warmteafvoer is afhankelijk van de

beluchtingsstroom, deze beluchtingsstroom wordt na 235 uur opgevoerd van een

superficiele gassnelheid van 0.6 cm/s naar 0.9 cm/s. Het verschil in de

warmteloevoer en de warmteafvoer afhankelijk van de beluchting is nagenoeg

constant, namelijk 0.2 kW.

Of:' warmteafvoer door de mantel tijdens de groeifase is:

~Jantel - 1.75*2(t/60)+ 3.5 + 1.7*t - 2.86 -0.3 -0.2

250

kW (12.10)

De warmte die de koelmantel moet afvoeren loopt op van 1.9 tot 33.3 kW. Aangezien er steeds meer warmte wordt geproduceerd, zal de koelmantel ook steeds meer warmte moeten afvoeren. Dit is mogelijk door de koelwaterflux op te laten lopen. De koelwaterflux is te berekenen met vergelijking 12.11:

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

-39-Q _ïnan.

=

A*U*(T _me d- Tkw _. 't) Ul

=

Pk *fk *c _{w w} Pkw (Tkw , - Tkw . 1n • Ul 't) (12.11) Met: A = 14. I mZ U = 1.175 kW/mz/K C C P_kw c - 4.2 kJ/kg/K Pkw

Allereerst valt de temperatuur van de uitgaande koelwaterstroom te

berekenen, waarna men de koelwaterfl~~ kan berekenen. De koelwaterfl~~ loopt op van 0.06 lis tot 1.3 lis. Wanner we de warmteafvoer door de mantel in de tijd integreren, blijkt dat gedurende de groeifase 6512 kWh door de mantel moet worden opgenomen. Dit is een gemiddelde warrnteafvoer van 26 kW, wat een gemiddelde warmtestroom oplevert van:

= 1.1 lis.

12.2 PRODUCTIEFASE

Tijdens de productiefase groeien de plantecellen niet, hun zuurstofbehoefte

1S gelijk aan hun maintenance: m = 4.2 10-3 mol/C-mol/h. o

De warmte productie is evenredig met het zuurstofgebruik en is:

~rod

=

12.74 kW.

De roerwarmte is hetzelfde als op het einde in de groeifase:

q -= 5.2 kW. roer

De superficiele gassnelheid van 1.0 cm/s van de beluchting levert een warmte door beluchting van: