Dierlijke celgroei RIVM poliovaccinproduktie

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

Adres:

IJ/vl/j]

VERTROUWELfJK

IVO

nummer:

2973

Vakgroep Chemische Procestechnologie

Verslag behorende bij het fabrieksvoorontwerp van

P.

van Londen

J.

de

Wijs Onderwerp: Dierlijke Celgroei RIVM Poliovaccinproduktie E. du Perronlaan 168 Delft 016-661961 van Hasseltlaan 516 Delft 015-568690 Opdrachtdatum: februari 1992 Faculteit der Scheikundige Technoldlj&r&b:lgè~I1B1lV811lber 1992 Technische Universiteit Delft

-TVO

ti>

_o

(ke~

1a.h

7

( ....

Hf scktrpl~ ~'" p\-lIbl~~

...

.)i. l-\Ool .. ~

o

o

o

o

o

o

o

Begeleiders

Samenstellers :

DIERLIJKE CELGROEI

RIVM POLIOVACCrn PRODUKTIE

o

K.ChAM. Luyben (TUD) M.C. Philippi (RIVM) B. Romein (TUD/RlVM) H. Brasser

J.

de Bruijn A. Hamming P. van Londen

J.

de Wijs

1 Samenvatting

Het proces ontwerp dat in dit verslag wordt beschreven, is gemaakt in het kader van het studieonderdeel IIfabrieksvoorontwerpll voor de studie Scheikundige Technologie aan de TU Delft, en voor het onderdeel IIprocesontwerpll voor de tweede fase opleiding BODL. Het ontwerp omvat de analyse en optimalisatie van een bestaand proces. Dit proces bestaat uit het kweken van dierlijke cellen ten behoeve van de produktie van een poliovaccin. Deze produktie wordt uitgevoerd bij het..RIV:M te Bilthoven. Het RIVM heeft ook de experimentele gegevens ter beschik-king gesteld.

De studie werd uitgevoerd omdat bij het RIVM de indruk bestaat dat de huidige proces opbrengst niet optimaal is.

De cellen die in dit proces gebruikt worden, zijn afkomstig van de nier van een aap. Het celmateriaal wordt in drie batchfermentaties achtereenvolgens opgekweekt tot een veelvoud van de oorspronkelijke enthoeveelheid. In de vierde stap van het proces worden de cellen geïnfecteerd met het poliovirus. Het virus vermenigvuldigt zich en de cellen gaan te gronde. Na opwerking en inactivatie van het virus is het vaccin gereed. De infectie, opwerking en inactivatie zijn niet bestudeerd.

Het doel van deze studie was het vinden van 'bottlenecks' in het bestaande proces en het optimaliseren van de huidige procesvoering. ~ de optimalisatie werd gekozen voor het vergroten van de celopbrengst aan het einde van de derde

(ter-~ .--...

---

---.--.

tiaire) kweek. Hierbij werd aangenomen dat deze verhoging van de opbrengst gevolgd wordt door een verhoging in het aantal virusdeelijes. Er werd geen rekening gehouden met de optimale fysiologische conditie van de cel op het moment van de infectie.

Tevens is gekeken of er een betere proces configuratie mogelijk is.

Het kweekproces is onderverdeeld in deelprocessen die ieder apart geanalyseerd zijn met behulp van hun karakteristieke tijden. De karakteristieke tijd van een proces geeft een indicatie van de snelheid waarmee het proces verloopt. Deelprocessen met een grote karakteristieke tijd kunnen snelheidsbepalend zijn in het gehele proces, en als zodanig optreden als 'bottleneck'. Uit de gevonden karakteristieke tijden kan geen 'bottleneck' in de procesvoering aangewezen orden.

2 Het medium bevat onder andere de substraten glucose en glutamine. Het glucose dient als koolstof- en energiebron en het glutamine ook nog als stikstofbron. Deze twee verbindingen kunnen onder bepaalde condities door de cellen omgezet worden in lactaat en ammonium, verbindingen die de groei remmen en in hogere concentraties zelfs toxisch zijn.

Voor de drie stappen van het proces zijn modellen opgesteld, met parameters die berekend zijn uit de gegevens van het RIVM. Het model bevat invloeden van glucose, glutamine, lactaat, ammonium en de bezetting van de micro-carriërs. Met behulp van deze modellen zijn de bestaande processen gesimuleerd. Uit deze simulaties bleekt dat er een verband is tussen de celopbrengst en de entconcentratie van de cellen. Groeilimitatie als gevolg van lactaatproductie treedt soms op. De ammoniumconcentratie daarentegen blijft zeer laag, en is daardoor niet remmend voor de groei. Er was een afname van de maximale groeisnelheid over de drie opeenvolgende kweken. In het model zijn enkele invloeden niet opgenomen, daardoor is het mogelijke dat de maximale groeisnelheid afneemt daar die invloeden daarin verdisconteerd zijn.

andere procesconfiguraties.

fu

het

b~de

proces kan de celopbrengst verhoogd worden door het constant houden van de glucose- en glutamine concentratie (S resp. 1.8 [mM]). Door glucose niet-pulsgewijs toe te voeren, blijft de schadelijke lactaatproduktie laag. Bij hoge glucose concentratie wordt een relatief groot deel daarvan omgezet naar lactaat. Als de carriers voor ongeveer 70 % bedekt zijn met cellen neemt de groeisnelheid af. Het heeft weinig zin om de kweek dan nog langer te handhaven.

Een nieuw proces ontwerp zou bestaan uit opeenvolgende batch-kweken met recirculatie, uitgevoerd in grotere volumina dan de huidige configuratie. De glucose- en glutamine concentratie worden geregeld op constant niveau. Het medium wordt belucht- in de recirculatie door doorborrelen met lucht of door vergroting van de oppervlakte/volume verhouding.

Dierlijke Celgroei - RIVM Poliovaccin Produktie

-3 Van het proces is een kosten-baten analyse gemaakt. Het bestaande proces levert een verlies op van /35100 per totale kweek, op jaarbasis wordt dus een verlies geleden van /702000 gulden.

Er kan winst gemaakt worden als de verkoopprijs van een vaccindosis verhoogd wordt, of als gewerkt gaat worden bij constante glucose- en glutamine concentratie. Dit vergt slechts minimale investeringen in het bestaande proces.

•

W

a Cl t 0 \v... f ":. \, 0 0

~

d

}-t ti

~

'3

h

~

t

(') '"

cl

-(> '( 7 . e""

4

ltt'-

~

t Zo <21 e k (J e l.-o.A

J

?

V

c

o~"er ~;e

slolPF'" (

k\''''eLe~

y)

f

1~,

·<~

{

·

Le

t\,"Q.W,)pot

l

'J~Y~L\..~

Inhoudsopgave ₄

Inhoudsopgave

Saznenvatting . . . 1

Inhoudsopgave Bijlage . . . 7

1. Inleiding Fabrieks VoorOntwerp. . . . 8

-2. Inleiding . . . 10

2.1. Algemene beschrijving proces . . . .. 10

2.1.1. Gedetailleerde beschrijving van de primaire kweek . . . .. 11

2.1.2. Gedetailleerde beschrijving van de secundaire kweek . . . 12

2.1.3. Gedetailleerde beschrijving van de tertiaire kweek . . . 13

2.1.4. Infectie door virus . . . 13

2.2. Onderzoeksaanpak .. . . .. 13 3. Kort literatuuronderzoek . . . .. 15 3.1. Oppervlaktegroei op microcarriërs . . . 15 3.2. Enting . . . .. 16 3.3. Roeren . . . 17 3.4. Celmassa . . . 18 3.5. Metabolisme . . . 18

3.6. Zuurstofopnaznesnelheid door de cellen . . . 21

3.7. Microcarriërs . . . 22

3.8. Arninozuurgebruik . . . .. 23

3.9. Glutazninedecompositie in het medium . . . 23

4. Deelprocessen . . . .. 26

4.1. Sedimentatie . . . 26

4.2. Afsterving door afschuifkrachten ontstaan door roeren . . . 26

4.3. Menging . . . 30

4.4. Zuurstofoverdracht van gas naar vloeistof . . . 31

4.5. Zuurstofconsumptie . . . .. 32

-,

1

4.6. Modelvorming"'. y. Gl'.k

.

l-UM

'

"

. . . ..

33 4.7. Celgroei . . . 36 4.8. Microcarriërbezetting . . . 37 4.9. Wanntehuishouding in reactor. . . .. 38

'.J

InhoudsoPQlMl 5

4.1 O. Resultaten en tijdconstanten van de deelprocessen . . . . .. 41

4.11. Overige invloeden . . . . . . . . . .. 46

5. Simulaties . . . 48

5.1.1. Inleiding . . . 48

5.1.2. De simulatie . . . 55

5.2. Resultaten van de simulaties . . . 55

5.2.1. Primaire kweek. . . . . . . . . . . . . .. 56

5.2.2. Secundaire kweek . . . . . . . . . . . . . .. 57

5.2.3. Tertiaire kweek . . . . . . . . . . . . . . .. 58

5.3. Conclusies van het simuleren. . . . . . . . . . .. 59

5.4. Het beluchten van de recirculatiestroom . . . . . . . . . . . .. 61

5.5~ Statistische analyse van de kweekgegevens . . . 62

5.5.1. Inleiding . . . 62 5.5.2. Theorie . . . 63 5.5.3. Resultaten . . . . . . . . . . . . .. 64 5.5.4. Conclusies . . . 65 6. Optimalisatie . . . 66 6.1. Primaire kweek . . . . . . . . . . . . .. 67

6.1.1. Opbouw model voor optimalisatie . . . 67

6.1.2. Resultaten van optimalisatie . . . . .. 68

6.1.4. Variatie in glucose- en glutarnineconcentraties . . . 71

6.2. Secundaire kweek . . . . . . . . . . . . .. 72

6.2.1. Model. . . . . . . . . . . . .. 72

6.2.2. Resultaten Optimalisatie . . . 73

6.2.3. Variaties bij de secundaire kweek . . . . . . . . . .. 73

6.2.4. Variatie in glucose- en glutarnineconcentraties . . . 75

6.3. Tertiaire kweek . . . . . . . . . . . .. 76

6.3.1. Model . . . . . . . . . . . . . . .. 76

6.3.2. Resultaten optimalisatie . . . . . . . . . . . . .. 77

6.3.3. Variaties bij de tertiaire kweek . . . 77

6.3.4. Variatie in glucose- en glutarnineconcentraties . . . 78

6.4. Voorstel nieuw proces . . . . . . . . . . . .. 80

6.5. Conclusies optimalisatie . . . 82

. - J

Inhoudsopgave ₆

7. Cost engineering en economische analyse . . . 83

7.1. Algemeen . . . 83

7.2. Procesvoering . . . . . . . . . . . . . . .. 84

7.2.1. Produktievolume afhankelijke kosten. . . . . . . . . . .. 84

7.2.2. Senrivariabel . . . 85

7.2.3. Investeringsafhankelijke kosten .. . . . . . . . . .. 81

7.2.4. Indirekte en algemene kosten. . . .. 91

7.2.5. Rente . . . .. . . 92

7.2.6. Samenvatting van de kosten . . . 92

7.3. Opbrengst. . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 93

7.4. WlIlSt/verlies . . . 94

7.5. Economische analyse . . . 94

7.6. Nieuw proces . . . 95

7.6.1. Veranderde kosten . . . 96

7.6.2 Samenvatting prijzen nieuw proces . . . 98

7.6.3 Opbrengst . . . 99

7.6.4 WlIlSt/verlies . . . 99

8. Discussie en aanbevelingen . . . . . . .. 100

8.1. Discussie . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 100

8.2. Aanbevelingen voor huidige procesvoering . . . .. 102

8.3. Aanbevelingen voor nader onderzoek 103 9. Conclusie .... . . 105

10. Literatuurlijst . . . 101

Bijlage I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 111

Inhoudsopqave ₇

J

Inhoudsopgave

Bijlage

Bijlage I : Processcherna Bijlage II : Symbolenlijst

I Bijlage

m

: Fonnules van uitgevoerde berekeningen

-Bijlage N : Grafische presentatie kweekgegevens Bijlage V : Numerieke waarde kweekgegevens Bijlage VI : Gibbsenergie en enthalpie berekening Bijlage. Vil : Zuurstofoverdracht in 350 litervat

--'

Bijlage

vm

: Zuurstofoverdracht in 40 litervat Bijlage IX : Simulaties van primaire kweek

Bijlage X : Verhoging celopbrengst primaire kweek Bijlage XI : Simulaties van secundaire kweek

Bijlage XII : Simulaties hogere cytodexconcentratie Bijlage

xm

: Simulaties van tertiaire kweek

Bijlage XIV : Simulaties constante glucose- glutarnineniveau Bijlage XV : Negatieve rangcorrelatie, kritieke waarden n < 16 Bijlage XVI : Kritieke waarde Spearrnan

Bijlage XVII : Optimalisatie gemiddelde kweken Bijlage

xvm

: Kostenberekening

'-..'

. J

Hoofdstuk 1 - Inleidino FVO ₈

1. Inleiding Fabrieks VoorOntwerp

Het hier beschreven project is uitgevoerd in het kader van het fabrieks YoorOntwerp voor 1 e fase studenten aan de TU Delft, bij de faculteit der

Scheikundige Technologie en der Materiaalkunde, en voor 28 _{fase studenten bij de} vakgroep Bioprocestechnologie, bij dezelfde faculteit. Het project is een onderdeel van het onderzoeksproject dat uitgevoerd wordt door een samenwerkingsverband van de Technische Universiteit Delft, Landbouw Universiteit Wageningen, Rijles

Instituut. voor Volksgezondheid . en Milieuhygiëne te Bilthoven (RIVM) , Applikon Dependable Instruments en Bird Engineering en wordt gesponserd door PBTSI. Het project werd begeleid door prof. ir. K.ChAM. Luyben en ir. B. Romein van de TU Delft en ir. M. Philippi van het RIVM.

Polio (Polio myelitis anterior acuta) is een ziekte die een verlammende werking heeft op mensen en die in extreme gevallen dodelijk kan zijn. De meeste gevallen worden aangetroffen bij kinderen tussen 2 en 4 jaar. Slechts één op de duizend keer leidt besmetting met het virus tot daadwerkelijke verlamming. Na in contact met het virus geweest te zijn treedt immuniteit op.

In Nederland is in 1957 besloten tot een algeheel vaccinatie programma, waarbij iedereen al op jonge leeftijd ingeënt wordt. Dit werd in 1966 bij Koninklijk Besluit verplicht.

Tot de ontwikkeling van vaccins is sterk bijgedragen door J.E. Salk en A.B. Sabin.

Sinds de invoering van het vaccinatieprogramma is de vraag naar vaccins sterk toegenomen. Ook de vraag naar vaccins voor het buitenland is gestegen. In Nederland wordt het vaccin geproduceerd door het RIVM .

Het virus wordt geproduceerd door apeniercellen te infecteren met het virus. De virusdeelijes vermeerderen zich ten koste van de cellen. Enkele dagen na de infectie kan het virus geoogst worden. Het virus wordt na scheiding en zuivering geïnactiveerd met formaldehyde. Na verscheidene testen wordt het vaccin vermengd met vaccins tegen andere ziekten, onder andere difterie, kinkhoest en tetanus. Mensen worden met dit DKTP-vaccin ingeënt zodat een resistentie ontstaat tegen deze ziekten.

-'-.J'

Hoofdstuk I -Inleidino FVO ₉

Een grote hoeveelheid apeniercellen wordt verkregen door uitgaande van niercellen deze in enkele stappen in een reactorvat op te kweken. De laatste jaren is door de voortschrijdende technologie het aantal benodigde apen sterk afgenomen. Het blijkt echter dat er tussen de verschillende kweken onderling een zo groot verschil is in opbrengst van de hoeveelheid cellen, dat er bij het RIVM gedacht wordt dat het proces nog niet optimaal verloopt. In bijlage I is een proces-schema opgenomen van de kweek zoals die momenteel uitgevoerd wordt bij het RIVM.

De opdracht is om het produktieproces van het poliovaccin nader te bekijken en te trachten een 'bottle-neck' in het proces te vinden. Er zal voornamelijk gekeken worden hoe men de celproduktie kan verhogen. De aanname die daarbij gemaakt is dat een hogere celproduktie correspondeert met een hogere virusopbrengst. De fysiologische toestand van de cel aan het begin van de daadwerkelijke virusproduktie wordt ondergeschikt geacht aan de absolute hoeveelheid apeniercellen.

Het vinden van die 'bottle-neck' vindt plaats op basis van het analyseren van verschillende produktie gegevens en door het vergelijken van de zogenaamde karakteristieke tijden van de verschillende deelprocessen. De karakteristieke tijd van een proces wordt gedefinieerd als een capaciteit (concentratie, aantal e.d.) gedeeld door de snelheid die daarbij hoort (overdrachtssnelheid, omzettings-snelheid e.d.). De berekende karakteristieke tijden van de verschillende deelprocessen kunnen met elkaar vergeleken worden. Deelprocessen met grotere karakteristieke tijden verlopen trager dan de processen met kleine tijden en kunnen daardoor snelheidsbepalend zijn voor het gehele proces. Als zodanig kunnen deze deelprocessen optreden als 'bottleneck'.

Op basis van de gegevens moet een advies uitgebracht worden om de produktie te verhogen. Dit moet gekoppeld worden aan een kosten-baten analyse en een nieuw procesontwerp.

De infectie van de cellen met virus en de scheidings- en zuiveringsstappen zijn buiten beschouwing gelaten.

Hoofdstuk 2 • Inleidinq ₁₀

2.

Inleiding

2.1. Algemene beschrijving

proces

De cellen van de apenier worden met behulp van trypsine van elkaar losgemaakt. Vervolgens worden zij toegevoegd aan een geroerde reactor met 20 [1] medium voor de primaire kweek. In het nu volgende fed-batchproces wordt uiteindelijk een volume van 40 liter verkregen. Dit medium bestaat uit :

- glucose en glutamine, dit zijn de koolstof- en de energiebronnen waarop de dier-lijke cellen groeien, waarbij glutamine tevens als stikstofbron dient

- antibiotica, ter voorkoming van bacteriële besmetting van de dierlijke cellen - vitamines

- aminozuren

- metaalsporen, alle drie voor de groei van de cellen

- microcarriërs (180 ,urn) Cytodex 1. Deze bolletjes zijn bedoeld om de dierlijke cellen te binden en te dienen als ondergrond voor verdere groei. Tevens zorgen ze voor bescherming tegen afschuifkrachten, die door de roerder opgewekt worden.

- serum (10% van totale medium volume) van runderen.

Het serum wordt toegevoegd omdat dierlijke cellen door afwezigheid van een celwand gevoelig zijn voor mechanische afschuifkrachten. Het serum geeft daar bescherming tegen. Tevens bevinden zich voedingsstoffen in het serum.

Na 8 dagen worden de microcarriërs van het medium gescheiden. De cellen worden van de microcarriërs losgemaakt door toevoeging van trypsine, en vervolgens toegevoegd aan 40 [1] medium met de zelfde soort toevoegingen als hierboven, voor de secundaire kweek.

Ook dit vat wordt geroerd. Na een dag wordt een recirculatievat aangekoppeld waardoor het bachtvolume stijgt tot 180 [1]. Alleen het medium wordt gerecirculeerd, de cellen blijven in de reactor achter.

Na 5 dagen worden de cellen wederom met trypsine losgemaakt van de microcarriërs, nadat deze gescheiden waren van het medium. Vervolgens worden de cellen toegevoegd aan 350 [1] medium voor de tertiaire kweek. Ook deze kweek is een batchproces in een geroerd vat.

,-'

Hoofdstuk 2 - InleidinCJ ₁₁

Na !!eer 5 dagen wordt het medium vervangen door een medium met een andere samenstelling en zonder serum. Het medium bevat voldoende voedingsstoffen voor 'maintenance'. Dit medium wordt geënt met het virus. Na 3 dagen zijn alle cellen geïnfecteerd door het virus waarna het proces gestopt kan worden.

Via opwerking door middel van cl arificatie, concentratie, zuivering en inactivering en vervolgens verscheidene controles op het vaccin wordt het eindprodukt verkre-gen.

2.1.1. Gedetailleerde beschrijving van de primaire kweek

De niercellen worden toegevoegd aan het medium. De roersnelheid in het medium in de reactor kan niet hoog zijn, omdat de afschuifkrachten dan zo groot zouden worden dat de kwetsbare diercellen kapot gaan. Door de aanwezigheid van eiwit-ten in het serum zou tevens schuim kunnen ontstaan.

Alle niercellen worden in 1 keer aan het medium toegevoegd.

Door met zeer lage roersnelheid te beginnen worden de cellen zo min mogelijk beschadigd. Als de cellen aan de Cytodex bolletjes gehecht zijn, kan de roersnelheid verhoogd worden. Dit is nodig om de zuurstofoverdracht te verhogen; deze is ondermeer afhankelijk van de roersnelheid. De roersnelheid wordt ver-hoogd van 30-40 naar 40-100 [rpm].

Het volume wordt van 12-20 tot 40 [1] verhoogd door discontinu een bepaald volume medium aan het reactorvat toe te voegen.

Een aanname is dat de microcarriërs kunnen volgroeien met één enkele laag cel-len. Als deze laag volgegroeid is treedt er geen verdere groei op van de cellen.

Hoewel de microcarriërs poriën hebben, is de diameter van deze poriën te klein voor groei van de cellen binnen in de microcarriër. Het optreden van poriediffusielimitatie is daarmee niet aan de orde. De cellen hechten zich aan de microcarriërs doordat het oppervlak van de microcarriërs positief geladen is en de cellen negatief geladen zijn.

i \

t

---- - :.. --.::~ 0...

~

I/>.A ()."" '

~

A

v

IA.A.. { __ I

u

X

.:..J.-..r'''''

~ - ' ,

\

i I

I

~ T (J ~.

i

I ~ w. l/V\er:)

,-r

~'

Hoofdstuk 2 • Inleiding ₁₂

De cel zet glucose en glutamine, naast de omzetting naar celmassa, ook om in lactaat, ammonium en alanine. Lactaat en ammonium remmen de groei bij te hoge concentraties, voor lactaat en ammonium respectievelijk 40 en 6 [mM] (Miller e.a., 1989). Hogere ammoniumconcentraties zijn zelfs toxisch.

De pH wordt continu gemeten en bijgeregeld met bicarbonaat.

Zuurstof wordt toegevoerd door een mengsel van zuurstof en stikstof over de oplossing te laten stromen. Het percentage zuurstof in het gasmengsel wordt geregeld via de zuurstofconcentratie in het medium. De zuurstof kan niet met doerberrelea in het vat opgenomen worden. Dit zou onaanvaardbare- schuif-spanningen opleveren, doordat de bellen kapot springen aan het oppervlak, waar-door de cellen beschadigd worden. Tevens leidt het tot schuimvorrning vanwege de aanwezigheid van eiwitten in het serum.

De glucose concentratie wordt elke dag bepaald met een reagensstrip Clinitex. Deze strip geeft een indicatie van de nog aanwezige hoeveelheid glucose. Glucose wordt bij geregeld als de kleurindicatie de minimale concentratie aangeeft.

De produktie van virusvaccins is onderhevig aan stringente overheidsbepalingen. In deze is bepaald dat de kweek na acht dagen afgebroken moet worden. Afwijken van de voorschriften is slechts toegestaan in bepaalde omstandigheden.

2.1.2.

Gedetailleerde beschrijving

van

de secundaire kwaak

De cellen van de primaire stap worden met behulp van trypsine losgemaakt van de microcarriërs. Deze worden vervolgens toegevoegd aan 40 [1] van het medium

waarbij men een verhoging van de biomassaconcentratie wil bereiken.

c \

'r t l.J_~~\\.t'

7

- " S \, ~ \ Î.-.( :

(1

.

Het medium wordt gerecirculeerd met recirculatievolumina van 120 tot 140 [1], ~zie het processchema in bijlage I.

De pH wordt continu gemeten en bij geregeld. De glucoseconcentratie wordt af en toe bepaald en op het gewenste niveau gebracht als de reagensstrip de minimale waarde geeft.

Het toerental varieert van 30-100 in het begin tot 60-100 [rpm] aan het eind van de kweek.

Na 6 dagen groei in dit medium wordt deze fase afgesloten, overeenkomstig het voorschrift van het produktieschema.

Hoofdstuk Z • Inleiding ₁₃

2.1.3.

Gedetailleerde beschrijving van de tertiaim kweek

In de derde kweek wordt getracht de absolute hoeveelheid van de apeniercellen zo hoog mogelijk te krijgen. Dit wordt gedaan door de cellen van de secundaire kweek los te maken van de microcarriërs door toevoeging van trypsine. De cellen worden vervolgens toegevoegd aan 350 [1] medium, met dezelfde samenstelling als in de primaire en secundaire kweek, in een geroerde reactor.

De omwentelingssnelheid van de roerder moet groter worden. om sedimentatie te voorkomen, dit door de groter vatgeometrie. Deze gaat van ongeveer 50 in het begin tot aan 50-170 [rpm) aan het eind van de kweek.

Gedurende 5 dagen blijven de cellen groeien, waarna het medium afgescheiden wordt, volgens voorschrift van het produktieschema.

2.1.4. Infectie door virus

De microcarriërs met apeniercellen worden van het tertiaire medium gescheiden door het medium uit het vat te pompen. Er wordt een verarmd medium, dat geen serum bevat, toegevoegd aan de celsuspensie. Dit verarmd medium is alleen toerei-kend voor 'maintenance'. Het mengsel wordt geënt met het virus. Het virus dringt door in de cellen en vermenigvuldigt zich waarna de gastheercel vernietigd wordt.

De viruskweek duurt 3 dagen, waarna alle cellen geïnfecteer

2.2.

Onderzoebaanpak

Om tot een goed advies te komen worden de volgende deelprocessen bestudeerd:

- De invloed van roeren op de sedimentatie.

- De invloed van roeren op de afschuifkrachten en als gevolg daarvan op de afsterving.

- De invloed van roeren op overdracht van zuurstof naar het medium. - De beschouwing van de warmte produktie en warmte afvoer.

- De zuurstofconsumptie van de niercellen en de yield van biomassa op zuurstof. - De glucose- en glutamine consumptie van de niercellen en de yield van biomassa

~)

Hoofdstuk 2 • Inleiclinq

De produktie snelheden van de biomassa, lactaat, ammonium en alanine. - De kinetiek van de groei van biomassa.

14

- De invloed van de verschillende produktconcentraties, lactaat en ammonium, op de groeisnelheid.

- Simulatie van de groei in verschillende configuraties.

- Optimalisatie van het proces met behulp van het ontwikkelde groeimodel en de bestaande procesconfiguratie.

- Ontwikkeling van andere procesconfiguratie.

Getracht wordt om voor alle deelprocessen tijdconstanten af te leiden om te vinden wat de beperkende factor is in het produktieproces. Dit gebeurt op basis van gegevens van het RIVM en ook met schattingen op basis van literatuurgegevens.

4... ₍

l-\ •. (' r)( \

.l ,, , ' -)

. ,~

Hoofdstuk 3 -Kort literatuuronderzoek: ₁₅

3. ICort literatuuronderzoek

In dit hoofdstuk wordt de bestudeerde literatuur die relevant was voor de opdracht besproken. Uit de literatuur zijn voornamelijk waarden gehaald die gebruikt zijn bij vergelijking met de experimentele gegevens en de daaruit berekende waarden.

De literatuurstudie is zo breed mogelijk gehouden zodat de mogelijkheid bestond dat er andere aandachtspunten gevonden konden worden.

3.1.

Oppenlaktegroei op microcarriirB

Direct na enten groeit de cel exponentieeL .' Naarmate het oppervlak van de microcarriër meer begroeit raakt, gaat de groei langzamer. Als het hele oppervlak bezet is, stopt de groei. In de literatuur (Frame K., Hu W., 1988) is het volgende model gevonden voor deze groeisituatie:

c

x

x

-x

~

=

~ '(l-exp(-C' max

»

mu X = groeisnelheid = maximale groeisnelheid

= constante oppervlakte groei

=

celdichtheid = maximale celdichtheid \ _, ft=p"",().J <1~f'

'"

(~) [5"/] [5"/] [-] [cellen/mi] [cellen/mi]

Uit onderzoek met vele verschillende soorten cellen is gebleken dat C steeds de waarde I heeft.

Om de invloed van de microcarriërconcentratie en de entdichtheid te verdisconteren, wordt een dimensieloze celdichtheid ingevoerd:

x

=

x -x(O) (2)

X_mu -x(O)

Uitzetten van X (logschaal) tegen de tijd geeft een verzadigingskromme met een

asymptoot bij 1 (zie figuur 1) (Frame K., Hu W., 1988).

Meestal is de celdichtheid veel groter dan de entconcentratie, waardoor het niet nodig is gebruik te maken van X (Frame K., Hu W., 1988).

- - - ---

-Hoofdstuk 3 -Kort literatuuronderzoek

~

10

CiS

Z

W

C

I.

:::I

_w

0

-

-UJ

en

w

...J

~

-I Do

•

•

I ot

•

•

DIMENSIONLESS

TlMt--E--Figuur l: De dimensieloze celdichtheid als functie van de tijd

3.2.

Enting

16

la

Bij enten verdelen de cellen zich volgens een Poissonverdeling over de microcarriërs, afhankelijk van de entdichtheid. Een lage entdichtheid geeft dat er weinig cellen hechten per microcarriër zodat die veel delingen kunnen doonnaken. Een groot deel van de microcarriërs, blijft door de lage entdichtheid onbezet. Bij een hoge entdichtheid hechten zich veel cellen op een microcarriër, zodat de microcarriër snel volgegroeid is en de cellen weinig delingen kunnen doonnaken. Het percentage onbezette microcarriërs is veel lager. Het is belangrijk dat er zo weinig mogelijk lege microcarriërs zijn. Deze kunnen door extra botsingen voor cel-sterfte zorgen.

- - - . _

-Hoofdstulc 3 • Kort literatuuronderzoek ₁₇

Er is onderzoek gedaan met MRC-6 cellen (menselijke fetale long fibroblasten). Als medium werd gebruikt CMRL 1969

+

3% Foetale Bovin Serum (FBS), als microcarriërs Cytodex I [5 gil].

De maximale bezetting is 60 cellen per microcarriër, voor bovengenoemde cellen. Bij apeniercellen is de maximale bezetting 178 (berekend op basis van literatuurgegevens (Van Wezel, 1982).

Uit het literatuuronderzoek is het volgende gebleken:

- Het-aantal-onbezette rnicrocaniërsneemt.af naarmate er zwaarder geënt wordt. Het aantal celdelingen neemt ook af. De eindconcentratie cellen neemt toe tot een bepaald maximum.

- De initiële serumconcentratie en de pH hebben grote invloed op het hechtingsproces van de cellen. Bij 4% serum en een lage pH (7.0, normaal 7.7) worden de beste resultaten verkregen. Na 3 uur wordt het medium op de gewenste serumconcentratie en pH gebracht.

- Bij toenemende concentratie microcarriërs neemt het aantal cellen per microcarriër af en wordt het percentage onbezette microcarriërs hoger. De beste resultaten worden verkregen bij een startvolume van het medium van 60%, een microcarriërconcentratie van 6 [gil] (gebaseerd op 100% volume) en een zo hoog mogelijke entdichtheid (Forestell, e.a, 1992).

- De minimale initiele celdichtheid is ongeveer 10 cellen per carrier. 3.3. Roeren

Roeren zorgt voor betere menging (betere celdistributie over de microcarriërs), maar verhoogt de kans op schade door afschuifkrachten en botsingen. Uit onderzoek kwam naar voren dat bij sneller roeren het aantal cellen per microcarriër afnam en het percentage onbezette microcarriërs toenam (Forestell e.a, 1992).

Vrije, gesuspendeerde cellen kunnen beter beschermd worden tegen afschuifkrachten door toevoeging van polyethyleenglycol (pEG) aan het medium. Ook blijkt een hogere serumconcentratie een betere bescherming te geven (Michaels e.a, 1991)

-J

.'

Hoofdstuk 3 • Kort literatuuronderzoek

3.4.

Celmasaa

Er is geen celmassa gevonden voor niercellen. /""

Hybridoma's: 0.35 [mg/lOs cellen] (Frame K., Hu W., 1991 )

18

Hybridoma's: 2.63 10-10 _{Eg/cel], is 0.263 [mg/l0}s _cellen] 1989)

(Batt B., Kampala D.,

FS-4 cellen: 2.3 là9 _{[cellen/gram], is 0.435 [mg/lO}s _{cellen] (Glacken M. e.a., 1986)}

Met behulp van de celmassa kunnen verschillende parameters van de groei berekend worden. Echter de celmassa en het drooggewicht van de cel hangen van de conditie van de cel af. Het is beter de parameters weer te geven per aantal cellen.

3.6.

Metabolisme

De energie die nodig is voor de groei en 'maintenance' van de cel wordt voor het overgrote deel uit glucose en glutamine gehaald. De glucose die door de cel wordt opgenomen, kan op verschillende manieren worden omgezet:

- naar lactaat

- naar CO2 via de TCA cyclus

- naar biomassa, onder andere via de pentose fosfaat route

Het glutamine wordt omgezet naar glutamaat. Het glutamaat wordt omgezet via de TCA cyclus naar lactaat, waarbij ammonium vrijkomt. Lactaat en ammonium hebben een inhiberend effect bij hogere concentraties (Glacken e.a., 1986).

Bij de omzetting van glucose en glutamine komen de volgende hoeveelheden ATP vrij (per mol glucose of glutamine):

glucose ---> pyruvaat ---> lactaat glucose ---> TCA ---> CO2 glutamine ---> TCA ---> CO2 : 2ATP : 36 ATP : 21 ATP glutamine ---> TCA glutamine ---> TCA (Glacken e.a., 1986) ---> aspartaat : 12 ATP --- > lactaat : 6 ATP

De energie voor de groei is zowel afkomstig uit glutamine als uit glucose. Van het ATP is 70% afkomstig van de glutamine omzetting (Glacken e.a., 1986).

Hoofdatulc 3 • Kort üteratuuronderzoek ₁₉ De energiebehoefte wordt voor 30 tot 65% uit glutamine gehaald (voor hybridoma's

in continucultuur).

Een gedeelte van het glucose wordt omgezet wordt naar lactaat:

continucultuur, hybridoma's : 83.8% (Glacken e.a., 1986)

HeLa cellen : 80% (Glacken e.a., 1988).

McQueen en Bailey (1990) hebben onderzoek gedaan naar de invloed van de pH en de initiële arnmoniumconcentratie op de yield van cellen op glucose, van lactaat

op glucose, van cellen op glutamine en van~ ammonium op glutamine.

Tabel I:

pH

6.8

7.2

7.6

Invloed van enkele factoren op de· yield van biomassa op glucose en

op de yield van lactaat op glucose.

amm. conc. _Ycellu/vluc [l08 _{Y lactaaVvluco ..}

[mM] cel/mmol] [mol/mol] 0 1.47/2.65 1.83/0.68 3 1.28/4.63 2.50 / 1.10 10 -- / 0.47 -- / 0.78 0 0.93/ 1.80 1.15 / 2.83 3 -- / 1.29 -- / 2.14 10 0.36/0.23 2.88/ 1.74 0 0.81 / 0.95 1.25/ 1.37 3 0.39/0.39 1.53/ 1.08

' J

-../

Hoofdstuk 3 0 Kort literatuuronderzoek

20

Tabel II: Invloed van enkele factoren op de yield van biomassa op glutamine

en van ammonium op glutamine.

pH amm.conc YCllllelllvlut [108 Y.mmorlium/vlut

[mo-[mM] cel/mmol] l/mol] 6.8

0

2.1

1.1

3

2.1

0.77 <7.2

0

4.4 1.3

10

0.88 0.68 7.6

0

4.8

1.1

3 2.2

0.90

Batt en Kampala (1988) vonden voor een continucultuur van hybridoma cellen een yield van biomassa op glucose van 1.6 [C-mol DW/C-mol glucose].

Glacken e.a. (1986) hebben het volgende model opgesteld voor de consumptie van glutamine:

d[glut]

- dt

=

k₁ • [glut] + Is.·X

en voor de produktie van ammonium (gekoppeld aan de glutamine produktie):

d[NHJ

=

k₁ • [glut] + YIlIII·"z·X (4)

dt gÜlt

[glut]

=

concentratie glutamine [mmol/l]

[NH4+]

=

concentratie ammonium [mmol/l]

t

=

tijd [hol]

kJ

=

snelheidsconstante voor glutamine afbraak [hol]

k_z

=

spec. glutamine opname snelheid [mmol/cel h]

X

=

biomassaconcentratie [cellen/l]

Y.nVglut

=

yield ammonium op glutamine [mol/mol]

Voor MDCK cellen (hondenier cellen) op microcarriër werden de volgende waarden gevonden:

kt = 0.0048

Hoofdatuk 3 • Kort literatuuronderzoek ₂₁ = 1

= 34 * [glut]

I

(4.0

+

[glut])

[mol ammonium/mol glutamine] (berekende waarde,dus niet gemeten) [mmol/l011 _{cellen /hl}

Verder is gevonden dat bij lage concentratie glucose en glutamine de produktie van lactaat en ammonium ook lager wordt (Glacken e.a., 1988).

3.6. Zuumtofopnamaanalhe door de cellen

De zuurstof opname snelheid (OUR) is evenredig met de celconcentratie (Yamada e.a., 1990). Voor de verzadigingsconcentratie van zuurstof in het medium worden de volgende waarden gegeven:

C· = 0.179 [mmol OJl] (Fleischaker, Giard, 1980) C· = 0.194 [mmo I OJl] (Ramirez, Mutharasan, 1990)

Voor de zuurstofopname snelheid (respiratiesnelheid) worden verschillende waarden gegeven in de literatuur, afhankelijk van het type cel:.

0.36 [mmol/l09 _{cellen h] (Backer e.a., 1988)}

0.232 [mmol/l09 _{cellen h] (gemiddelde van 18 waarden cellen van} menselijke organen) (Fleischacker, Sinskey,

1981)

3.6 [gig DW/h] (Fleischacker, Giard, 1980) 5.0 [ppm/l06 cellenlh] (hybridoma MPC 11) 3.2 [ppm/l06 cellenlh] (hybridoma HB4C5) 3.0 [ppm/l06 cellenlhl (hybridoma Namalwa)

2.4 [ppm/l06 cellenlh] (hybridoma HO 323) (Yamada, 1990) 0.350 [mmol/l09 _{cellenlhl (hybridoma's) (Wohlpart e.a., 1990)}

Frame en Hu (1985) hebben bij testiculaire varkenscellen gevonden dat de glu-coseconcentratie invloed heeft op de zuurstofopnamesnelheid. De cellen die ge-kweekt zijn op microcarrlërs, geven de volgende resultaten:

- Na het toedienen van een glucosepuls aan een cultuur met medium dat geen glucose bevatte, daalde de zuurstofopnamesnelheid direct. De daling was afhankelijk van de glucoseconcentratie: van 0% (geen glucose toevoegen) tot 60.7% (glucose concentratie 0.9 [gil]). Er blijkt een drempelwaarde te bestaan waar beneden geen invloed optreedt op zuurstofopnamesnelheid of glucoseopnamesnelheid: 0.5 [g glucosell] voor de zuurstofopnamesnelheid en

Hoofdstuk 3 • Kort literatuuronderzoeic ₂₂

14.4 [g glucose Il] voor de glucoseopnamesnelheid.

Wohlpart (1990) heeft de invloed van glucose en celdichtheid op de zuurstofopnamesnelheid van hybridoma's in suspensie cultuur onderzocht De volgende resultaten zijn gevonden. De glucoseconcentratie heeft geen invloed op de respiratiesnelheid bij concentraties lager dan 1 [gil]. Boven deze concentratie treedt een daling op van de respiratie snelheid tot gemiddeld 85% van de oorspron-kelijke snelheid. Er lijkt geen lineair verband te zijn tussen daling en concentratie.

Er is ook gevonden dat de celdichtheid invloed heeft op de respiratiesnelheid per cel. Dit wordt bevestigd door andere onderzoeken. Een verklaring voor dit feit is nog niet gevonden. Als mogelijke oorzaken worden genoemd: de hydrodynamische eigenschappen van de bulk veranderen door de hogere celdichtheid of de cellen produceren humorale factoren die invloed hebben op de groei. Het gaat hier om een suspensiecultuur, en niet zoals bij dit onderzoek, om groei op microcarriërs. De invloed die de celdichtheid heeft bij groei op microcarriërs moet nader onderzocht worden.

3.7. Microcarriërs

Kiremitci e.a. (1988) hebben gevonden dat een ander soort microcarriër mogelijk een oplossing kan geven voor het probleem dat alle kweken bij enting met grote celsterfte te maken hebben.

De celhechting kan als volgt weergegeven worden.

a X t k da = k·

X

.(1 -

~l

dt a_max

= conc. cellen gehecht door carriërs

= maximale mogelijke waarde van a

=

vrije celconcentratie = tijd

=

hechtingsconstante (B) [cellen/mI] [cellen/mI] [cellen/mI] [min] [l/min]

In deze studie werden cellen van een nier van een hamster bekeken. De volgende parameters gelden in het onderzoek.

Voor Cytodex I geldt k = 0.023 [I/min] en Cim.. = 5.0.105 _{[cellen/mI] bij een}

microcarriërconcentratie van 5 [gil].

__ I

Hoofdstuk 3 • Kort literatuuronder.welc

₂₃

Als de beginconcentratie 80.103 _{[cellen/ml] is, kan berekend worden dat na 4 uur}

nagenoeg alle cellen gehecht zouden zijn.

De PHEMA microcarriërs versnellen het proces enorm.

De cellen binden zich 3 maal zo snel.

Wat de waarde van de parameter k is bij de omstandigheden, zoals die heersen bij de virusvaccinproduktie, en bij gebruik van een apenier, is onbekend. Echter de grote sterfte na 1 dag wijst op te langzame hechting. Verder onderzoek zou uitge-voerd kunnen worden om te bekijken of met een ander typemicr.ocarriër een verbetering bereikt kan worden.

3.8.

Aminozuurgebruik

Buszaky e.a. (1988) hebben bekeken of er naast glutamine en glucose als voedingsstoffen nog andere stoffen in het medium beperkend zouden kunnen zijn.

Er is voornamelijk bekeken naar het verbruik van aminozuren. Het bleek dat de het aminozuur asparagine totaal verbruikt werd. Toevoegen van dit aminozuur verhoogde de produktie van rFVIII, een uitscheidingsprodukt. Bij het onderzoek werd gebruik gemaakt van hamstemiercellen.

Bij vergelijkbare onderzoeken werd ontdekt dat hybridomacellen ook andere aminozuren in behoorlijke mate gebruiken. Met name leucine, isoleucine, valine en tryptophaan werden in behoorlijke mate geconsumeerd. Het gebruik van aminozuren blijkt echter voor elk soort cel weer anders te zijn.

De rol van aminozuren in het medium is nog niet duidelijk of niet onderzocht. Het zou dan ook mogelijk zijn dat een ander aminozuur dan glutamine beperkend kan zijn. Een onderzoek naar het gebruik van aminozuren is noodzakelijk om de samenstelling van het medium te optimaliseren. Aanpassing van het medium kan niet zondermeer gebeuren omdat dat een aanpassing vergt van de wettelijke produktievoorschriften

3.9. Glutaminedecompoeitie in het medium

Behalve dat glutamine gebruikt wordt voor de celmassa vorming treedt ook spontane ontleding op. Een onderzoek naar de hoeveelheid glutamine is dan ook noodzakelijk. Het zou kunnen blijken dat glutamine de beperkende factor is met als gevolg dat de concentratie gevolgd dient te worden tijdens het proces.

,

'-.-'

Hoofdatuk 3 0 Kort literatuuronderzoelc 24

Glutamine kan op 2 manieren uit elkaar vallen, (Ozturk en Palsson, 1990). De eerste is chemisch :

glutamine

- - - - >

ammonium

+

pyrrolidonecarboxylzuur

De tweede manier is enzymmatisch en wordt veroorzaakt door in het serum aanwezige enzymen :

glutamine-·- - - - : > ammonium

+

glutamaat

Het uiteenvallen van glutamine is een eerste orde reactie :

[glut]

=

k· [glut] dt

(8)

k = dissociatieconstante [hol]

De constante k wordt beïnvloed door mediumsamenstelling, temperatuur, pH en ionensterkte.

Ozturk heeft voor vier verschillende media onderzocht wat de afbraak is als functie van de tijd (ThIDM, RPMI-1640, DMEM, OPTI-MEM).

De volgende afbraakfuncties zijn gevonden:

Hoofdstuk 3 -Kort literatuuronder%04llt

₂₅

IMDM

Ink = -18.31+1.685·pH (1)

OPTI-MEM

Ink = -16.76 + 1.458 'pH (8)

DMEM

Ink

=

-17.07 + 1.478 'pH

RPMI-1640

Ink

=

-13.85 + 1.133 'pH (10)

Tabel ill: Dissiociatieconstante k bij pH = 7.2

I

Medium

I

k [hel] IMDM 2.07.10-3 OP TI-MEM 1.91.10-3 DMEM 1.62.10-3 RPMI-1640 3.37.10-3

Het Eagle-MEM medium is niet onderzocht maar zal in de orde van 2.10-3 [h-I]

liggen.

De startconcentratie van glutamine in Eagle-MEM is 1.8 [rnrnol/l].

Na 5 dagen is volgens bovenstaande vergelijking hier nog 79% van de

. J

Hoofdstuk 4 -Deel~ ₂₆

4. Deelprocessen

In dit hoofdstuk worden alle deelprocessen die mogelijk een beperkende factor zijn in het produktie proces bestudeerd.

Alle gegevens die gebruikt zijn om de verschillende formules uit te rekenen zijn te vinden in bijlage II en de formules die gebruikt zijn om de parameters te berekenen in bijlage ill.

4.1. Sedimentatie.·

Om sedimentatie te voorkomen moet een minimale roersnelheid gebruikt worden. Deze minimale roersnelheid is afgeleid door Zwietering (1958) en is afhankelijk van vatgeometrie en roerdertype:

NmJn

C

=

minimale roersnelheid

= const.

afb. type en positie van de roerder

= kinematische viscositeit water

= diameter Cytodexdeeltje

=

valversnelling

=

dichtheid gezwollen Cytodex

=

dichtheid medium

= massapercentage carriërs

= diameter vat

4.2. Afstarving door afschuifkrachten ontBtaan door roeren

Mengen van microcarriërs in bioreactoren is belangrijk, omdat: - de microcarriërs in suspensie gehouden moeten worden; - de cellen een homogene omgeving moeten aantreffen;

(11) [5"1] [-] [rr!/s] [m] [m/s2] [kg/m'] [kg/m']

[%]

[m]

- de stofoverdracht van zuurstof en andere nutriënten naar de cellen verbeterd wordt.

Hoofdstuk 4 • Deelpro<:aMn

27

Door te roeren worden er hydrodynamische krachten opgewekt, die boven een bepaalde roerintensiteit de sheargevoelige, dierlijke cellen beschadigen, waardoor afsterving kan optreden. Een drietal mechanismen zijn te onderscheiden (Cherry, Papoutsakis, 1986, Cherry, Papoutsakis, 1988, Cherry, Papoutsakis, 1989, Croughan e.a, 1988):

- interactie tussen turbulente wervels en rnicrocarriërs; - botsing tussen rnicrocarriërs en de roerder;

- botsing of dichte nadering van de rnicrocarriërs onderling.

ad 1) De interactie tussen wervels en rnicrocarriërs is het belangrijkste. Echter wanneer de microcarriërconcentratie groter dan 4 - 5 [g/1] is, wordt ook de botsing tussen microcarriërs belangrijk (Croughan e.a, 1988). De botsingsfrequentie tussen de bolletjes neemt dan namelijk toe. Belangrijk is de verhouding wervellengte ten opzichte van diameter rnicrocarriërs. In de literatuur (Croughan e.a, 1987) wordt aangenomen, dat alleen wervels met een lengte kleiner dan de diameter van de microcarriërs een afschuifspanning op het oppervlak van de microcarriërs teweeg brengen die schadelijk is voor de cellen. Wervels groter dan de microcarriër omgeven de carriër volkomen, waardoor deze gaat roteren of transleren zonder al te grote afschuifspanningen te ondervinden.

Voldoende zuurstofoverdracht is één van de factoren die bepalend zijn voor een goed verloop van het dierlijke celkweek-proces. Door de roersnelheid te verhogen kan de zuurstof-overdracht verbeterd worden. Een hogere roersnelheid gaat gepaard met een grotere afsterving. Voor een maximale groei zal het optimum van deze twee zaken gevonden worden, voldoende zuurstofoverdracht bij minimale afsterving.

In de literatuur worden celgroei en afschuiving op verschillende wijze gecorreleerd (Croughan e.a, 1987):

I) Geïntegreerde Shear Factor:

= roerdersnelheid

=

roerderdiameter

=

vatdiameter 2'1t'N'D [SF

= - - - '

D-D

_,

(ll) [5"1]

rml

rml

Hoofdstuk 4 - Deelprocessen

2) Tijdsgemiddelde shear-snelheid (Re > 1000):

Rf

= ___

Re _ _ _

R, (100Q + 1.6 -Re)

2

N-D, 'P

Re

=

-=

straal van de roerder

= straal van het vat

=

straal van de vortexzone

3) Tipsnelheid:

v

_tip = 1t -N-D

28

(1S) (14) (16)

rml

rml

rml

(18)

Tot 2 liter zijn ISF en fluxie

rave

schaalonafhankelijk, dit in tegenstelling tot vllp_ De relatieve groei neemt in alle drie de gevallen als een stapfunctie af (Croughan e.a., 1981). Bij welke omwentelingssnelheid of welke afschuifsnelheid dit gebeurt, is afhankelijk van het type dierlijke cellen en de procescondities, met name het soort microcarriërs en de concentratie microcarriërs. Dit moet zowel op kleine als grote schaal experimenteel worden bepaald_

Tijdens het roeren wordt er energie van de roerder naar het medium overgedragen in de vonn van grote wervels_ Deze dragen op hun beurt weer energie over aan de kleine wervels, waarna tenslotte via visceuze dissipatie de energie als warmte verloren gaat. Het shear-schade mechanisme ten gevolge van wervel-microcarriër-interacties wordt voornamelijk veroorzaakt door wervels kleiner dan of ongeveer gelijk aan de microcarriër en is gerelateerd aan het universele

Hoofdstuk 4· Deelproceaen ₂₉ evenwichtsbereik van isotrope turbulentie. Het is karakteriseerbaar door middel van de kinetische energie van alle wervels op boldiameter-schaal of kleiner (Lakthatia, Papoutsakis, 1992).

De kleinste wervelgrootte wordt geschat met de Kolmogorov lengteschaal met de volgende formules:

é

=

Kolmogorov lengteschaal

= kinematische viscositeit

= gedissipeerde energie per massa

(11)

[mi

[m2/s]

[W!kg]

De gedissipeerde energie wordt met behulp van de volgende formule bepaald.

E

=

=

roersnelheid

=

diameter roerder = volume vloeistof

= vermogenskental

= dichtheid vloeistof (18) [5"1] [mi [rrr]

[-i

{kg/rrI]

Het vermogenskental hangt af van het Reynoldskental en bij Re > 300 ook van de roerdersnelheid in het geval van een propeller roerder (Coulson, Richardson, 1976). Voor N = 100 [rpm] is Np ongeveer 0.6 voor zowel het 40 liter als het 360 liter vat.

De specifieke afstervingsnelheid Qd is aan de wervelconcentratie gerelateerd:

(19)

= afstervingssnelheid

Hoofdstuk 4 -Deelprocessen ₃₀ In deze formule is

ke

een eerste orde afsterfsnelheid, die specifiek is voor het soort cellen en microcarriërs (voor dierlijke cellen bedraagt

ke

ongeveer 0.75 [m3_/sl).

Meestal treedt er een schadelijk effect op, wanneer de Kolmogorov lengte schaal de helft van de microcarriër afmeting is geworden, veiligheidshalve is twee derde van de diameter aangenomen.

De Kolmogorov wervellengte hangt slechts van de energiedissipatie en de kinematische viscositeit ai en niet van de reactorgeometrie en geeft een zekere indicatie -omtr-ent. dS-ItlaximaaLtoepasbare roersnelheid. Om. dit met meer zekerheid te kunnen zeggen, zijn experimentele gegevens onmisbaar.

4.3. Menging

De menging en de snelheid van de menging in het vat, hangt ai van de roer-snelheid en van de vatgeometrie.

Het verzet van de roerder wordt gegeven door de volgende formule.

Fp ·

F = 'Jt·v. • A = 'Jt2. N· D . A

p tl.p r r r

=

verzet roerder

=

tipsnelheid van de roerder

= opperviakte roerder

~)

[m'ls}

[m/s}

[Irt}

De circulatiestroom is twee maal het verzet van de roerder vanwege entrainment (de insluiting van de vloeistof in de wervels).

F _c = 2'F _p ~1)

= circuJatiestroom [m'ls}

De circulatietijd is als volgt te berekenen.

(JR)

re

=

circuJatietijd [sj

De karakteristieke mengtijd wordt weergegeven door 4 maal de circulatietijd te nemen.

-I

i

_I

~I

I

I

Hoofdstuk 4 • Deel~n ₃₁

(Ja)

= mengtijd [sj

4.4. Zuumtcfavardra.cht van gas naar vloeistof

De zuurstof overdrachtssnelheid (OTR) geeft de overdracht van zuurstof van de gasfase naar de vloeistoffase.

=

oxygen transfer rate

=

overdrachtscoëfIicient

=

evenwichtsconcentratie zuurstof medium

=

concentratie zuustof medium

= speciiiek oppervlak

Het specifiek oppervlak wordt als volgt berekend:

Alg

a =

-V,

=

grensvJak tussen gas en vloeistof

=

volume van de vloeistof

~) [mol/m'-s] [mis] [mol/ar] [mol/ar] [rrr/m'] ~) [rrr] [ar]

De karakteristieke tijd van de overdracht van zuurstof van de gasfase naar vloeistof wordt met de volgende formule berekend.

1 't =

-OTR k a

L

(JB)

In alle berekeningen waarin een kLa nodig is, is gebruik gemaakt van een kLa die uit experimentele gegevens van het RIVM berekend is. Aangenomen is dat de kLa in

de vaten alleen afhankelijk is van de roersnelheid en het specifiek oppervlak.

De evenwichtsconcentratie van de opgeloste zuurstof in het medium is bepaald met:

'~' Hoofdstuk 4 • Deelprocesaen

c-R T m p = evenwichtsconcentratie = gasconstante

=

temperatuur = Henry coëfficiënt = druk P 0.21

*

-RT m 32 [mol/zrr3] [J/mol

KJ

[KJ

[-i

[pa]

Door de aanwezigheid van suikers, zouten en eiwitten wordt de evenwichtsconcentratie met 10% verlaagd.

In de literatuur (Glacken, e.a., 1986) wordt een waarde van 0.18 [mM] als verzadi-gingsconcentratie gegeven, voor dierlijke cellen bij 37° C.

4.6.

Zuurstofconsumptie

ro

=

zuurstofconsumptiesnèiheid-- - / [mol/zrr3·s]

lima

=

maximale speciiiekegroeisnelheid [:;-1]

C"

=

biomassa concen tra tie [C-mol/zrr3]

4"

=

yield van biomassa op zuurstof [C-mol/mol]

De karakteristieke tijd voor de zuurstofconsumptie kan dan als volgt berekend worden.

c:,

'tOUR

=

-'0

(JIJ)

=

karakteristieke zuurstofopnamesnelheid

[hl

Hoofdstuk ~lproc~ ._ ~

7

4.~~~

_~

__ .. _-) \ICt." W .

-~-_.~---

.-33

Niercellen zijn gedifferentieerde cellen. Ze groeien daarom alleen op een compleet medium (MEM) waarin alle bouwstenen voor de groei aanwezig zijn. Het opnemen van componenten uit het medium naar de cel toe vindt plaats door middel van actief transport, dit proces heeft energie nodig. De polymerisatie tot biomassa van deze componenten kost ook energie. Het blijkt nu dat de niercellen uit het aanbod aan aminozuren een factor 10 à 20 meer glutamine opnemen dan van de overige aminozuren. Glutamine en glucose zijn de belangrijkste substraten. Uit deze substraten zal door verbranding en/of fermentatie de energie voor het in stand houden van de cel en voor verdere groei van de cellen gehaald worden.

De niercellen groeien op Cytodex carriërs en worden batchgewijs gekweekt. Het opstellen van een groeimodel voor deze batchkweken is complex omdat de fysio-logisch condities waarin de cellen verkeren tijdens een batchkweek steeds veranderen. De concentraties in het medium veranderen, de bezetting op de carriër wordt anders en de hydrodynamische condities veranderen. Door deze veranderingen 'ziet' de cel andere condities, wat invloed kan hebben op de groeisnelheid en de yields.

Bij het opstellen van de elementenbalansen is de eerste afweging, welke substraten en uitscheidingsprodukten meegenomen moeten worden. Serum, met vaak een ongedefinieerde samenstelling, heeft invloed op de opnamesnelheden van glucose en glutamine. (Lee e.a., 1991). In de elementenbalans zijn de relevante componenten meegenomen, zie voor de elementenbalansen verderop in deze para-graaf.

Voor een metabolisch model is het nodig te weten via welke reacties ATP gevormd wordt. Dit houdt in dat de verhoudingen tussen de bijdrage van de oxidatieve fosforylering en de substraat fosforylering en de verhouding tussen de bijdrage van glucose en glutamine bekend moeten zijn. Tevens is een waarde van de ATP behoefte voor de groei per hoeveelheid cellen nodig.

Het glutamine is een donor van NH. + in de synthese van de purines en pirirnidines

die in het erfelijke materiaal worden ingebouwd en voor de eiwitsynthese. Het glutamine wordt dan omgezet tot glutamaat (Stryer, 1981). Om ATP uit glutamine te halen moet het eerst in glutamaat omgezet worden zodat het de citroenzuurcyclus

34 in kan treden. Het enzym glutaminase hydrolyseert het glutamine tot glutamaat en

NH. +. Een deel van het glutamaat wordt, net zo als een deel van het glutamine, in de biomassa ingebouwd. Maar aangezien er veel glutamine opgenomen wordt, moet glutamaat op een andere wijze verbruikt worden. Via een transaminering met een a-ketozuur zou het glutamaat in een ander aminozuur en a-ketoglutaraat omge-zet kunnen worden. Waarschijnlijk is deze fractie niet groot aangezien alle aminozu-ren ook uit het medium opgenomen kunnen worden en de noodzaak tot synthese gering is.

Het glutamaat kan door het enzym glutamaatdehydrogenase gedeamineerd worden tot a-ketoglutaraat, een intermediair van de citroenzuurcyclus (TCA) en

NH.+.

glutamaat + NAD+ - - - > NH. + + a-ketoglutaraat + NADH

Via de TCA cyclus wordt het a-ketoglutaraat uiteindelijk omgezet in oxaal acetaat en 3 NADH. De concentratie oxaalacetaat in de mitochondriën bepaalt mede de snelheid van de TeA cyclus. Als deze verkleind kan worden zal het oxaalacetaat omgezet worden in pyruvaat. Dit pyruvaat kan dan weer de TCA cyclus omgezet worden in lactaat afhankelijk van de energie toestand in de cel.

MilIer (1989) heeft gevonden dat dierlijke cellen alanine produceren. Dit zou betekenen dat als de concentraties glutamaat en pyruvaat in de cel erg hoog zijn

(dus een overschot) via alaninetransaminase alanine geproduceerd wordt.

glutamaat

+

pyruvaat

- - - - >

alanine

+

a-ketoglutaraat.

Tijdens de groei van de cellen worden intermediairen uit de TCA cyclus en de glycolyse gehaald om als bouwstenen voor de biomassa te dienen. Deze intermediairen kunnen zowel door het glutamine metabolisme als door het glucosemetabolisme weer aangevuld worden. Het hangt af van het aanbod van de substraten en de onderlinge evenwichten in de actieve enzymconcentraties in de cel hoe dit aanvullen gebeurt.

Om een metabool model op te stellen zijn onderlinge verhoudingen nodig: - Opname glucose ten opzichte van glutamine

ener-35 gie

· Afgifte alanineINH. + (houdt verband met welk deel van glutamine wordt omgezet naar biomassa)

· Hoeveel ATP er via oxidatieve fosforylering geproduceerd wordt

· Hoeveel ATP nodig is voor groei en hoeveel voor 'maintenance' bij bepaalde groeisnelheid

Factoren zoals de pH. concentraties in het mediwn en groeisnelheid beïnvloeden deze onderlinge relaties.

Zuurstof Glucose Glutamine Water waterstof carbonaat protonen ammonium biomassa alanine lactaat

Figuur 3: De belangrijkste uitwisselingsstromen van en naar een niercel.

De biomassa heeft de volgende samenstelling, waarbij uitgegaan is van een gemiddelde waarde die in de literatuur aangehouden wordt:

CH1.aNo.20o.!J

-....!

Hoofdstuk 4 - Deelproc-.t ₃₆

Uitgaande van bovenstaande kunnen de volgende vergelijking opgesteld worden waarbij uitgegaan wordt van C-mol eenheden:

a glucose

+

b glutamine

+

c lactaat

+

d zuurstof

+

e ammonium

+

f alanine

+

g

waterstofcarbonaat

+

h water

+

i protonen

+

biomassa = 0

Deze vergelijking in chemische notatie:

a CH20 + b CH200.6No.4 + c CHt.670o.33- + d O₂ + e NH; +

f

CH2.330 0."..,No.33 (JO)

+ g _HC03- + h _H20 + i H+ + CH1.aNO.200.5 = 0 C-balans: a+b+c+f+g+l

=

0 (31) H -balans: 2· a + 2 . b + 1.67 . c + 4 . e + 2.33 'f + g + 2 . h + i + 1.8 = 0 (38) O-balans: a + 0.6 . b + c + 2 . d + 0.67

'

f

+ 3 . g + h + 0.5

=

0 (38) N-balans: 0.4· b + e + 0.33 'f + 0.2 = 0 (34) lading-balans: - 0.33 . c + e - g + i = 0 (38)

Als de verschillende yields berekend zijn, is het mogelijk om deze vergelijkingen op

te lossen. Er zijn 9 variabelen met S balansen, dus er zijn 4 stoïchiometrische coëfficiënten nodig. De berekende yields gaven geen aanleiding om dit model te

gebruiken.

Wo3

J

«",\,.

~H''''~

~

\i

II

f\ ?y>€N\

cl

i

x

w.-~

4.7. Celgroei

Uit de gegevens van het RIVM is berekend hoe de cellen groeien tijdens de

kweken. In bijlage N is van alle kweken een grafische presentatie gegeven. Tevens

\ ... .-1

Hoofdstuk 4 -Deel~ ₃₇

Duidelijk is dat er tijdens de eerste dag een sterfte plaats vindt. Deze sterfte is niet te voorspellen. Dik enten levert een grotere kans op gehechte cellen na de eerste dag op.

Uit de gegevens valt te berekenen hoeveel maal de cellen zich vermenigvuldigen bij elke kweek. Ook kan hieruit de groeisnelheid berekend worden.

4.8. Microcarriirbuetting

Het aantal plaatsen dat door cellen bezet kan worden per microcarner is berekend uit waarden voor de vrije oppervlakte per microcarriër (Van Wezel, 1982). Bij suspenderen van 1 mg Cytodex per mI medium is er een oppervlakte van 5 cm2

per mI medium beschikbaar. De maximale concentratie cellen die dan bereikt kan worden is 0.75 tot 1 • lOS [cellen/mI].

Hieruit is de oppervlakte van 1 cel te berekenen, 5 tot 6.6 • 10-6 _[cm2_/cel].

De microcarriërs hebben een diameter van 180 ,urn.

Door de oppervlakte van een microcarriër te delen door de oppervlakte van 1 cel wordt het aantal beschikbare plaatsen per microcarriër bepaald.

Het aantal microcarriërs per volume eenheid is als volgt te berekenen.

volumecytodex N ~r6 = ' -carriervolume = aantal carriërs

c

-canvr .~

=

Pcytodu

1.

'1t ·d3 6 P

=

concentratie carriërs in droge vonn

=

dichtheid Cytodex = zweJgraad Cytodex = diameter carriër (Je) [carriërs/m' j [kg/m'j [kg/m'j

[-J

[mJ

Door nu het totale aantal cellen in een kweek te berekenen en dit te delen door het aantal microcarriërplaatsen is de bezettingsgraad uit te rekenen.

Hoofdstuk 4 • Deelproc:eseen

() _{= canriërbezeNing}

=

aantal plaatsen op canriër

= beginvolume kweek = kweekvolume = concentratie cellen 4.9. Warrntehuishcn1d

in

reactor 38

[-J

[-J

[rrrJ [rrrJ [aantaJ!rrr ]

De produktie van de niercellen moet bij een constante temperatuur van 37° C bedreven worden. Bij temperatuur beheersing van een reactorvat spelen de volgende zaken een rol:

- De vonning van cellen, en de daarmee samengaande omzetting van substraten in

produkten, zal energie opleveren in de vonn van wannte. Deze zal aan het medium overgedragen worden. H1'NC

=

reactiewannte

=

reactiesnelheid

=

reactieenthalpie

=

volume H _re« :: r _c ·/lH ·V _r

- Wanntetoevoer door energiedissipatie van de roerder.

=

Warmte door energiedissipatie roerder

=

Vennogenskental

=

dichtheid medium = roersnelheid

=

vatdiameter (JB) [kJ/C-moIJ [C-mol/rrrhJ [kJ/mol] [rrrJ (JIJ) [kJ/C-molJ

[-J

[kg/rrr] [S-IJ [mJ

Hoofdstuk 4 -Deel~

- Warmteverlies door het temperatuurverschil met de omgeving.

= uitwisselingscoëfIiciënt wand = oppervlak van de buitenwand

=

omgevingstemperatuur

=

vattemperatuur 39 (40) fW/znZK] [znZ] [KJ [KJ

Voor het 40 liter vat is het oppervlak van een bol genomen; voor het 350 liter vat is het oppervlak van een cilinder genomen, verminderd met het oppervlak aan de bovenkant.

- Warmte uitwisseling met behulp van de wanntewisselaar.

= uitwisselingscoëfIiciënt wisselaar

=

opp. wisselaar, gelijk aan opp. vat

=

temperatuunnediwn in wisselaar

(41)

[W/znZK] [znZ]

[KJ

In het 40 liter vat is de oppervlakte van de wisselaar gelijk genomen aan het oppervlak van de reactor. De wisselaar is gemaakt van roestvrij staal en het vat van glas. In het 350 liter vat is de wisselaar uitgevoerd als 'jacket', mantel. Er is dan geen directe uitwisseling van het vat met de omgeving, deze term verdwijnt dan uit de balans.

Als de warmteproduktie in de reactor in een pseudo-steady state is, geldt de volgende vergelijking voor het 40 liter vat:

UwAw{Tw

-n

=

-rr!:"Hr 'Y-NppN

3

DS - UoAo{To-n

Voor het 350 liter vat geldt de volgende warmte balans:

U A (T _{w w w}

-n

=

-r _r !:..H _r 'Y-N pN_p 3Ds

(48)

(43)

Met behulp van de oplossing van de elementbalansen en de vormingsenthalpieën kan de enthalpie van de reactie berekend worden, zie tabel IV.

~)

Hoofdstuk 4 - Deelprocessen

Tabel IV: Vormingsenthalpie en Gibbsenergie van produkten en reactanten.

I

Hf [kJ/C-

G

r mol] [kJ/C-mol] 1G1ucose -211 -153 plutamine -165 -106 lWater - -285 -237 !Zuurstof 0 0 Niercellen -90 -67 iUactaat -229 -172 iAIanine -188 -123 Waterstofcarbonaat -692 -587 Ammoniumionen -133 -79

IW

aterstofionen 0 0 40

De reactieënthalpie geeft een waarde van ~ = 1844 [kJ/C-mol], (~Gr = -1790 [kJ/C-mol]), zie bijlage VI. De reactieënthalpie komt vrij als warmte.

Y'. f Ct

cA-,'

.

~

...

~

.) \)

i

r

~

i

û Vv-.

v\

l

i ('

?