Organizmy modelowe - drożdże

(1)

Organizmy modelowe - drożdże

Saccharomyces cerevisiae i nie tylko

(2)

Narzędzia genetyki molekularnej drożdży

• S. cerevisiae to jeden z najłatwiejszych w manipulowaniu organizmów

• Podstawowe właściwości

• bardzo wysoka wydajność rekombinacji homologicznej

• łatwość ukierunkowanej manipulacji genomem

(3)

Delecja i mutacje bez śladu

Metoda “pop in – pop out” Metoda “delitto perfetto”

(4)

System CRISPR/Cas9

• u S. cerevisiae ograniczona przydatność - dostępne techniki rekombinacyjne są

równie wydajne i tańsze

• wielkie projekty biologii syntetycznej

• analiza rekombinacji

• bardzo przydatny u innych drożdży

(5)

Postępy analizy funkcjonalnej

• Od lat 90. projekt badania fenotypów delecji genowych

• Wiele innych projektów na skalę genomu

• Najbardziej zaawansowana analiza funkcjonalna na skalę genomową wśród eukariontów

(6)

Postępy analizy funkcjonalnej

• Funkcje większości genów S. cerevisiae są znane

• nie zawsze dokładnie, nie zawsze ze znajomością mechanizmów

• czy drożdże zostaną wkrótce poznane (“rozwiązane”)?

(7)

Drożdże i biologia systemów

Drożdże w XXI wieku

(8)

Kolekcje

• Dostępne kolekcje szczepów delecyjnych

• Diploidalne heterozygotyczne >6000

• Homozygotyczne ~4000

• reszta – letalne u homozygot

(9)

Kolekcje

• Inne kolekcje

• fuzje ze znacznikami powinowactwa

• ORF pod regulowanym promotorem

• nadekspresja ORF ze znacznikiem powinowactwa

• i wiele innych

(10)

Projekty na skalę genomową

• Delecje (analiza fenotypowa)

• Nadekspresja białek (MORF)

• Zmiany ekspresji genów (mikromacierze, fuzje reporterowe)

• Lokalizacja białek w komórce (fuzje z GFP)

• Interakcje białek (system dwuhybrydowy)

• Interakcje genetyczne (np. syntetyczne letalne)

• Mapowanie QTL

(11)

Analizy wysokoprzepustowe – roboty laboratoryjne

©Singer Instruments, UK

(12)

Problem analiz wysokoprzepustowych

• Powtarzalność wyników w różnych badaniach jest niewielka

• Znaczny wpływ tła genetycznego i warunków doświadczalnych

(13)

Problem analiz wysokoprzepustowych

Merz & Westermann, 2009

Geny pet (niezbędne do oddychania)

(14)

Wykorzystanie kolekcji delecyjnych

CP - Common Primer - wspólny starter

UPTAG, DNTAG - “kody kreskowe”, unikatowe sekwencje

Steinmetz & Davis, 2004, Nat. Rev. Genet. 5: 190–201

(15)

Steinmetz & Davis, 2004, Nat. Rev. Genet. 5: 190–201

(16)

Fenotyp a analiza ekspresji

• Dwa najczęstsze podejścia genomiki funkcjonalnej:

• analiza ekspresji (transkryptomika) - zmiany poziomu mRNA w różnych warunkach

• analiza fenotypowa - defekt wzrostowy (fitness) w określonych warunkach

• Czy wyniki (zidentyfikowane geny) się pokrywają?

(17)

Fenotyp a ekspresja

Wzrost na galaktozie Giaever et al. Nature 418, 387–391 (2002)

(18)

Fenotyp a ekspresja

Tolerancja wysokiego stężenia soli

Giaever et al. Nature 418, 387–391 (2002)

(19)

Fenotyp a ekspresja

• Nakładanie się znaczącej zmiany ekspresji i defektu wzrostu

• <7% dla wzrostu na galaktozie i 1M NaCl

• ~7% dla wzrostu na niefermentowalnych źródłach węgla

• ~16% dla sporulacji

(20)

Poszukiwanie interakcji genetycznych

• Oddziaływania łagodzące (np. supresja)

• selekcja bezpośrednia

• Oddziaływania syntetyczne

• syntetyczna letalność:

• pojedyncze mutacje gen1 i gen2 nie są letalne, ale podwójny mutant gen1, gen2 nie przeżywa

• syntetyczne wzmocnienie

• pojedyncze mutacje gen1 i gen2 słaby fenotyp, podwójny mutant gen1, gen2 silny fenotyp (np.

spowolnienie wzrostu)

(21)

Ujęcie ilościowe

Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25

(22)

SGA

• Synthetic Gene Array

• Kolekcja delecji, krzyżowana z badanym genem

• Sporulacja,

• Selekcja haploidów MATa

• Selekcja pojedynczych i podwójnych mutantów

Boone et al. Nature Reviews Genetics, 2007 vol. 8 (6) pp. 437

(23)

SGA

http://www.utoronto.ca/boonelab/sga_technology/index.shtml

(24)

dSLAM

Diploid-based synthetic lethality analysis with microarrays (dSLAM)

(25)

Rekonstrukcja sieci interakcji

Dixon et al. 2009, Systematic mapping of genetic interaction networks. Annu Rev Genet 43:601-25

(26)

Interakcje genetyczne – ujęcie systemowe

• Interakcje genetyczne wskazują na związki funkcji

• Mogą wiązać elementy tego samego szlaku/kompleksu, ale też różnych szlaków, powiązanych funkcją

• Zestaw interakcji (pozycja na mapie interaktomu genetycznego) może wskazywać na funkcję genu

(27)

Sieci interakcji

• Sieć interakcji syntetycznych letalnych jest rzadka – około 1%

• Interakcje syntetyczne są jednak częste pomiędzy genami o powiązanej funkcji (18%-25%)

(28)

Interakcje genetyczne a fizyczne

• Interakcje fizyczne i genetyczne rzadko się nakładają, choć częściej, niż przewidywano by dla pełnej losowości

• Nakładanie się interakcji genetycznych i fizycznych częste dla interakcji

pozytywnych (epistaza)

• Interakcje negatywne z reguły pomiędzy różnymi kompleksami fizycznymi

(29)

Wyniki – sieci interakcji genetycznych

(30)

Costanzo i wsp., (2010) Science 327, 425

(31)

(32)

Co można badać na drożdżach?

• Praktycznie wszystkie podstawowe aspekty biologii molekularnej, biologii komórki, genetyki

(33)

Czego nie można badać na drożdżach

• Różnicowanie i rozwój

• Neurobiologia

• Regulacja przez małe niekodujące RNA (siRNA, miRNA)

• Alternatywny splicing

(34)

Drożdże i cykl komórkowy

Nobel dla drożdży

(35)

Drożdże i cykl komórkowy

Nobel 2001

(36)

Cykl komórkowy

(37)

Mutanty cdc S. cerevisiae

• Cykl komórkowy podobny do wyższych Eukaryota

• Fazy G1, S, G2, M i wrzeciono podziałowe

• Lee Hartwell – zastosowanie genetyki drożdży do badania cyklu komórkowego (1970-73)

• Mutanty temperaturowrażliwe (ts), analizowane za pomocą mikroskopii (zdjęcia poklatkowe)

• populacja zatrzymuje się w tej fazie, której dotyka mutacja

• stwierdzenie, której fazy cyklu dotyczy defekt w mutancie

(38)

Mutanty cdc S. cerevisiae

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2001/hartwell-lecture.pdf

(39)

Mutanty wee i cdc u S. pombe

• Podziały komórki skoordynowane z wzrostem komórek

• Mutant wee – komórki zaczynają się dzielić, kiedy są jeszcze małe – zaburzona kontrola startu cyklu

(40)

Regulacja cyklu

• wee1 – inhibitor podziałów

• utrata funkcji - małe komórki

• cdc25, cdc2 – aktywatory

• utrata funkcji – duże komórki

(41)

Regulacja cyklu komórkowego

(42)

Od drożdży do człowieka

• mutację cdc2 S. pombe można odwrócić wprowadzając na plazmidzie ludzki gen CDK1 (Cyclin Dependent Kinase)

(43)

Drożdże i transkrypcja

Kolejny Nobel dla drożdży

(44)

Drożdże i transkrypcja

(45)

Drożdże i transkrypcja

(46)

Drożdże i transkrypcja

(47)

Drożdże i transkrypcja

Łatwość hodowli – przydatne w projektach oczyszczania i krystalizacji białek

(48)

Drożdże i autofagia

Nobel 2016

(49)

Autofagia

• U człowieka uszkodzone organella są

degradowane w autofagosomach przez fuzję z lizosomami

• W drożdżach degradacja zachodzi w wakuoli

www.nobelprize.org

(50)

Badanie autofagii u drożdży

• Mutanty z defektami enzymów wakuolarnych

• Komórki głodzone (indukcja autofagii)

• W mutantach w wakuoli dochodzi wtedy do akumulacji niezdegradowanych

autofagosomów

• Analizując kolekcje mutantów można identyfikować geny, których produkty uczestniczą w autofagii (ATG9, PI3K, VPS34), VPS15, ATG6, ATG14 itp.)

www.nobelprize.org

(51)

Drożdże i mitochondria

(52)

Profil metaboliczny S. cerevisiae

• Fakultatywne aeroby

• Efekt Pasteura – tlen hamuje fermentację, ale…

• Efekt Crabtree – w obecności glukozy (C6) fermentacja anaerobowa nawet w obecności tlenu

• Glukoza hamuje oddychanie

• Etanol jest następnie wykorzystywany (jeżeli nadal jest tlen)

• Strategia “akumulacja i konsumpcja”

(53)

S. cerevisiae i mitochondria – co szczególnego?

• Przeżywa bez funkcji oddechowej

(fakultatywny tlenowiec, fermentacja)

• Mutanty z defektywnym oddychanie, – petite (lata 1960.)

• Przeżywa bez genomu mitochondrialnego (“petite positive”)

glukoza

(fermentacja)

glicerol

(oddychanie)

(54)

Fenotyp petite u S. cerevisiae

•

Zmiany w mtDNA

•

ρ

⁰

– całkowita utrata mtDNA

•

ρ

^-

– częściowa utrata mtDNA, znaczne delecje i reamplifikacja

•

mit

^-

- mutacje punktowe, prawidłowa struktura genomu

•

Zmiany w nDNA – mutanty pet

(55)

Oddziaływania jądrowo mitochondrialne

• Proteom mitochondrium ~500-800 białek

• 8-9 kodowane w mtDNA

• Ponad 150 genów jądrowych niezbędnych do utrzymania mitochondrialnego systemu genetycznego

Ucieczka genów

jądro mitochondrium

Utrata genów Ewolucja nowych funkcji

(56)

Drożdże jako model dla genetyki człowieka

(57)

Genomy

S. cerevisiae H. sapiens

~1,2 x 10⁷ bp ~3 x 10⁹ bp

~6500 genów ~25 000 genów

~1800 genów wykazuje homologie z genami H.

sapiens (30%)

~ 4000 genów wykazuje homologie z genami S.

cerevisiae (13%)

Wiele podstawowych funkcji komórki jest zachowanych.

Niekiedy możliwa wymienność białek drożdżowych i ludzkich (np. Ras, Oxa1)

(58)

Baza danych

(59)

Przykładowe drożdżowe modele chorób

• Progerie Wernera i Blooma

• Choroby związane z defektami naprawy DNA (HNPCC, ataksja-telangiektazja)

• Ataksja Friedreicha

• Zaburzenia komunikacji jądrowo - mitochondrialnej (PEO)

• Choroby wywołane mutacjami w mtDNA (NARP)

• Poszukiwanie leków za pomocą drożdży

(60)

Zaburzenia komunikacji jądrowo-mitochondrialnej

• Mutacje w genach kodujących białka odpowiedzialne za utrzymanie mtDNA

• ANT1 (transporter ADP/ATP)

• POLG (polimeraza DNA)

• Choroby dziedziczone autosomalnie, objawiają się delecjami w mtDNA lub deplecją mtDNA

(61)

PEO

• PEO -postępująca zewnętrzna oftalmoplegia (porażenie mięśni gałki ocznej)

• Postać dominująca (adPEO) lub recesywna (arPEO)

• Objawy

• opadanie powiek (ptosis),

• niezdolność do poruszania gałkami oczu,

• ogólne osłabienie mięśni,

• zaburzenia neurologiczne,

(62)

Inne choroby związane z mutacjami POLG

• Zespół Alpersa (ciężka postępująca choroba neurodegeneracyjna)

• SANDO (sensory ataxic neuropathy, dysarthria, and ophthalmoparesis)

(63)

Mutacje i modele drożdżowe

• POLG (mitochondrialna polimeraza DNA)

• drożdżowy homolog MIP1

• ANT1 (mitochondrialny transporter ATP/ADP

• drożdżowy homolog AAC2

(64)

http://tools.niehs.nih.gov/polg

(65)

Homologia POLG i MIP1

• Mutacje w MIP1 powodują niestabilność genomu mitochondrialnego

• spontaniczne delecje

• mutacje punktowe

• całkowita utrata mitochondrialnego DNA

• Fenotyp w drożdżach dobrze koreluje z objawami u pacjentów

• najcięższe objawy - całkowita utrata mtDNA w mutancie

(66)

Homologia POLG i MIP1

• Mutacje w MIP1 powodują niestabilność genomu mitochondrialnego

• spontaniczne delecje

• mutacje punktowe

• całkowita utrata mitochondrialnego DNA

(67)

Choroby wywołane mutacjami w mtDNA

• Np. NARP – Neurogenic Ataxia Retinitis Pigmentosa

• Mutacja w genie ATP6

• W komórkach 70-90% zmutowanego DNA

• Obniżona aktywność syntezy ATP

(68)

Drożdżowe modele chorób mitochondrialnych

• S. cerevisiae – jedyny organizm modelowy, u którego można wprowadzać DNA do

mitochondriów – ukierunkowana mutageneza mtDNA

Rak, M. et al. J. Biol. Chem. 2007;282:34039-34047

(69)

Poszukiwanie nowych leków

(70)

Identyfikacja substancji aktywnych

Drożdże na szalce (murawa)

Testowane związki nakraplane na krążki filtrów

Drugs are

deposited on filters

Związki aktywne kontrola negatywna

(71)

Długowieczność i starzenie

(72)

Długowieczność drożdży

• Zastosowanie drożdży S. cerevisiae jako modelu zjawisk związanych ze starzeniem proponowano od lat 60. (Mortimer & Johnson)

• Dwa mechanizmy

• starzenie replikatywne – limit podziałów komórki-matki (~30)

• starzenie chronologiczne – przeżywalność w fazie spoczynkowej hodowli (wyczerpane źródła energii)

(73)

Mechanizmy kontrolujące długowieczność mogą być konserwowane

w ewolucji

(74)

Genomika cech wieloczynnikowych

• Dziedziczenie wieloczynnikowe - fenotyp zależy od interakcji alleli wielu genów oraz środowiska

• W odróżnieniu od fenotypów mendlowskich mają zwykle charakter zmienności ciągłej (ilościowej), a nie dyskretnej

• QTL - Quantitative Trait Loci - loci cech ilościowych - obszary genomu w istotny sposób wpływające na fenotyp cechy wieloczynnikowej

(75)

QTL u drożdży

• QTL u drożdży można badać wykorzystując szczepy o różnym tle genetycznym

• S. cerevisiae - bardzo duża zmienność, nawet wśród szczepów laboratoryjnych

(76)

QTL u drożdży - 3 strategie

• Bulk Segregant Analysis (BSA) - masowa analiza segregantów

• Individual Segregant Analysis (ISA) - analiza pojedynczych segregantów (równoległa)

• Reciprocal Hemizygosity Scanning (RHS) - analiza hemizygotycznych delecji

(77)

QTL u drożdży

Wilkening et al. (2014), Genetics, 196:853-865

(78)

QTL u drożdży

Wilkening et al. (2014), Genetics, 196:853-865

(79)

QTL u drożdży

• Metoda ISA pozwala na mapowanie cech, których nie można selekcjonować (np. kształt kolonii)

• Skuteczność zależy od liczby pojedynczych segregantów, które można przeanalizować

• Obecnie do ~1000

(80)

Genotypowanie szczepów

• Co można dziś

• Do 384 bibliotek/tydzień

• <15€/próbka

• 30x pokrycie

Wilkening et al. BMC Genomics 2013 14:90

(81)

Inne zastosowanie metody ISA

Mapa częstości rekombinacji homologicznej w skali genomu

Wilkening et al. BMC Genomics 2013 14:90

(82)

Ewolucja eksperymentalna

(83)

Ewolucja eksperymentalna

• Możliwość prowadzenia wielu hodowli równolegle przez wiele pokoleń

(84)

Ewolucja wielokomórkowości

• Selekcja w hodowlach S. cerevisiae w kierunku szybkiego opadania osadu

• Pojawiają się grupy komórek (“płatki śniegu”)

(85)

Ewolucja wielokomórkowości

wyjściowe - jednokomórkowe po 14 pokoleniach selekcji

po 60 pokoleniach selekcji

(86)

Ewolucja specjalizacji

• Pod koniec w zgrupowaniach pojawił się podział funkcji – niektóre komórki inicjują programowaną śmierć by ułatwić podział grupy przez fragmentację

(87)

Wzrost kolonii

(88)