De synthese van secretine volgens de repetitieve overmaat gemengd anhydride methode

DE SYNTHESE VAN SECRETINE

VOLGENS

DE REPETITIEVE OVERM AAT

GEMENGD ANHYDRIDE METHODE

A. VAN ZON

o

U o ovn nil

m

mm 1

_{i l l}

l i i i

_nil

ill

III L llil '1 n i l li llil

!l 111 1'

I I I I L ;

1 lull, ill

V

_{III 1}

nil

•0

De synthese van secretine

volgens de repetitieve overmaat

gemengd anhydride methode

BIBLIOTHEEK TU Delft P 1818 5445

De synthese van secretine

volgens de repetitieve overmaat

gemengd anhydride methode

PROEFSCHRIFT ter verkrijging van

de graad van doctor in de

technische wetenschappen

aan de Technische Hogeschool Delft,

op gezag van de rector magnificus

ir. H. B. Boerema, hoogleraar

in de afdeling der elektrotechniek,

voor een commissie aangewezen

door het college van dekanen

te verdedigen op

woensdag 27 novemher 1974

te 16.00 uur door

ARTE VAN ZON

scheikundig ingenieur,

geboren te Sliedrecht

/S>/& trVVtr

Dit proefschrift ii> goedgekeurd door de promotor P R O F . DR H, C. B E Y E R M A N

Aan niijn ouders Aan Francien

Het onderzoek, dat in dit proefschrift wordt beschieven, is uitgevoerd ondei auspicien van de Stichting 'Scheikundig Onderzoek in Nederland (SON) met financiele steun van de Nederlandse Organisatie voor Zuiver-Wetenschappelijk Onderzoek (ZWO)

Inhoud

AFKORTINGEN XI INLEIDING EN DOELSTELLING 1

1. ALGEMENE INLEIDING 3 1.1 De ontwikkeling van de gemengd anhydride methode 3

1.2 De repetitieve overmaat gemengd anhydride methode

(repetitive excess mixed anhydride, REMA, method) 11 1.3 Besturing van de REMA-synthese met fluorescamine 14

1.3.1 Inleiding 14 1.3.2 Fluorescamine 15 1.3.3 Besturing van de REMA-synthese 16

2. HET GASTRO-INTESTINALE HORMOON SECRETINE 18

2 . 1 Natuurlijk s e c r e t i n e 18 2.2 Synthetisch s e c r e t i n e 23 3. SYNTHESE VAN HET C-TERMINALE HEXADECAPEPTIDE

VAN SECRETINE (S 12-27) 26

3.1 Inleiding 26 3.2 Synthese volgens de REMA-methode 28

3.3 Verwijdering van beschermende groepen en Zuivering 31

3.4 Experimenteel gedeelte 31 4 . SYNTHESE VAN SECRETINE (S 1-27) 40

4 . 1 Inleiding 40 4 . 2 Synthese van beschermd secretine 41

4 . 3 Verwijdering van de beschermende groepen 46

4.4 Zuivering van ruw REMA-secretine 46 4. 5 Fysisch en chemisch onderzoek van gezuiverd

REMA-s e c r e t i n e 48 4 . 6 Biologische activiteit van gezuiverd REMA-secretine 51

4 . 7 Experimenteel gedeelte 52 5. STABILITEIT VAN GEMENGDE ANHYDRIDEN 59

5.2 Resultaten en discussie 5.3 Experimenteel gedeelte

59 61

6. OMLEGGINGEN VAN ASPARTYL-GLYCYLPEPTIDEN 62

6.1 Inleiding 62 6.2 Resultaten 63 6 . 3 Discussie en conclusies 64 6.4 Experimenteel gedeelte 67 SAMENVATTING 68 SUMMARY 70 LITERATUUR 72 V I I I

Afkortingen

In de gebruikte afkortingen zijn zoveel mogelijk de aanbevelingen van de lUPAC-IUB-commissie voor biochemische nomenclatuur gevolgd (J. Biol. Chem. 247(1972)977). Boc i-BuOCOCl t-Bu Bzl DCCI DCHA DLC DMF DMSO Dnp Et HOAc HOBt HOOBt HOSu Me NMM Np Nps ORD TFA THE Z tert-butyloxycarbonyl 1 sobutyl chl oorc arbonaat tert-butyl benzyl N, N' -dicyclohexylcarbodumide dicyclohexylamine dunnelaagchromatografie N, N-dimethylformamide di methyl sulfoxide 2,4-dinitrofenyI ethyl azijnzuur 1-hydroxybenzotriazool 3 - h y d r o x y - 4 - o x o - 3 , 4 - d i h y d r o - l , . ' N-hydroxysuccinimide methyl N -methyl morfolme 4-nitrofenyl 2-nitrofenylsulfenyl

optische rotatie dispersie trifluorazijnzuur

tetrahydrofuran benzyloxycarbonyl

Inleiding en doelstelling

De repetitieve overmaat gemengd anhydride methode (repetitive e_xcess mixed anhydride, REMA, method) i s een ten dele m Delft ont-wikkelde methode van stapsgewijze of sequentiele peptidesynthese, die is gebaseerd op het bekende gebiaiik van gemengde anhydriden van N-beschermde ammozuren met monoalkylcarbonaten.

Bi] een stapsgewijze synthese dient te worden gestreefd naar kwan-titatieve koppelingen. Dit kan worden bereikt door een overmaat aan acylerend agens toe te passen, hetgeen bij de gemengd anhydride methode e e r s t mogelijk werd, nadat een snelle en eenvoudige wijze van vernietigen van het gemengde anhydride was gevonden. R a c e m i -satie tijdens een gemengd anhydride koppeling bleek onder bepaalde voorwaarden te kunnen worden vermeden

Bij gebruik van de overmaat gemengd anhydride methode kon in Delft een decapeptide en e l d e r s een nonapeptide worden gesyntheti-s e e r d . Bij deze gesyntheti-synthegesyntheti-sen bleek dat de omzetjtinggesyntheti-sgraad p e r koppe-Imgsstap z e e r hoog was, zodat de methode zonder zuivering van de tussenprodukten - repetitief - kon worden toegepast.

Een belangrijke vraag was die naar de toepasbaarheid van de m e t h o de bij de synthese van grote peptiden, mede met het oog op m d u s t r i -ele bereiding van peptiden en synthese van proteinen. Hier zij opge-merkt dat volgens sommige auteurs de g r e n s met betrekking tot de peptidelengte, die bereikbaar is met een veel gebruikte methode van sequentiele synthese, namelijk de vaste-fase peptidesynthese, bij 12-15 ammozuurresten ligt.

Mijn doel was dan ook de mogelijkheden en beperkingen van de REMA-methode bij de synthese van een langere peptideketen te onderzoeken. Als modelstof diende het gastrointestmale peptidehormoon s e c r e tine. De keuze viel op secretine omdat dit peptide met zijn 27 a m m o

-zuurresten ongeveer drie maal zo lang is als de r e e d s met de REMAmethode gesynthetiseerde sequenties en omdat op grond van de a m i n o -zuursamenstelling geen onoverkomelijke moeilijkheden, die los staan van de gebruikte koppelingsmethodiek, werden verwacht.

Secretine is t e r bevestigmg van de structuur door twee groepen van onderzoekers langs verschiUende wegen gesynthetiseerd. Door zoveel mogelijk gebruik te maken van dezelfde beschermende groepen zouden de fy sische eigenschappen van de tussenprodukten van de REMA-synthese van secretine met de literatuurgegevens kunnen worden vergeleken.

Een efficiente synthese van secretine is gewenst, omdat het hormoon nauwelijks toegankelijk is uit natuurlijke bron, terwijl er van m e -disch-biologische zijde grote vraag naar bestaat.

1. Algemene inleiding

1.1 DE ONTWIKKELING VAN DE GEMENGD ANHYDRIDE METHODE De gemengd anhydride methode is een oude koppelingsmethodiek m de peptidesynthese, die echter lang in onbruik is geweest. Al bij de e e r -ste synthese van een peptide - door Curtius m 1881 (1, 2) - w e r d , zij het onbedoeld, gebruik gemaakt van de methode (fig. 1.1). Bij s y n -these van hippuurzuur - door reactie tussen benzoylchloride en het zilverzout van glycine werden enige bijprodukten gevonden, w a a r -van benzoyldiglycine als zodanig werd gei'dentificeerd. Ondanks de bevindmgen van Kraut en Hartmann (3) die al in 1865 wezen op het b e -staan van het gemengde anhydride van glycine en benzoezuur, gaf Curtius als verklaring voor de vorming van dit dipeptide het ontstaan van hippuroylchloride als reactief tussenprodukt.

OVc-ct

O H 0 / / ^ \ II I II ' O V - C - N - C H 2 - C - O H 0 H,N-CH,-C H j N - C H 2 - C - 0 A g 0 Bz-Cl Bz-Ct O H 0 / ^ ^ \ II I II \ 0 \ ^ ^ / II 0 0 II H j N - C H j - C - O A g O H O H 0 / ^ - N \ II 1 II I II ( J ) — C - N - C H 2 - C - N - C H 2 - C - O H

Fig. 1.1 Vorming van een peptide bij Curtius' synthese van hippuur-zuur (1881).

Dat het proces via het gemengde anhydride van benzoylglycine en ben-zoezuur verloopt, werd m 1950 aangetoond door Wieland ct al. (4, 5), die een systematische studie ondernamen naar de toepasbaarheid van gemengde anhydriden in de doelgerichte peptidesynthese. Hierbij wer-den de gemengde anhydriwer-den van beschermde ammozuren met

benzoe-zuur, respectievelijk azijnbenzoe-zuur, onderzocht. Dergelijke anhydriden bleken zelfs m waterig milieu m staat met een e s t e r of een a l k a l i -zout van een tweede aminozuur de peptidebindmg te vormen (fig. 1.2). Er kon met worden aangetoond dat binding met het hulpzuur ('anomale koppeling'), zij het m mmdere mate, eveneens optrad (fig. 1.2).

H Rj 0 0 I I II , - C - N-CH-C-OH + R3-C-CI 0 H R2 0 H R4 0 II I I II I I II - C - N - C H - C - N - C H - C - R 5 0 H R2 0 II I I II ^ ' - / 0 R , - C - N - C H - C R n / II \ 1 ' M / + R3"C OH 0 + H2N-CH-C-R •c •^ - •> II I I II 0 H Ri 0 - ' - ' ' A R3-C-N-CH-C-R5 0 H Rj 0 II I I II + R , - C - N - C H - C - 0 H

Fig. 1.2 Vorming van de peptidebindmg (getrokken pijlen) en koppe-ling met het hulpzuur (gestippelde pijlen).

Voorts werd gevonden dat vooral de gemengde anhydriden met a z i j n -zuur de neiging vertonen te disproportioneren tot de s y m m e t r i s c h e anhydriden (fig. 1.3). Werd benzoezuur als hulpzuur gebruikt dan bleek deze tendens minder uitgesproken, hoewel bij hogere t e m p e r a -tuur duidelijk disproportionering viel te onderkennen.

Bijna gelijktijdig waren onderzoekmgen gaande waarbij, naar a n a -logie van de biosynthese van protei'nen, derivaten van anorganische

zuren a l s hulpzuur werden gebruikt. Chantrenne (6, 7) gebruikte daartoe fenylfosfaat en Sheehan en Frank (8) dibenzylfosfaat als h u l p -zuur (fig. 1.4). O H R O O H R , 0 0 II I I II II I I II II R,-C-N-CH-C R -C-N-CH-C R3-C, \ \ \ 0 *• 0 + 0 / / / Ri-C R,-C-N-CH-C R3-C II II I I II II 0 0 H R2 0 0

Fig. 1.3 Disproportionering van gemengde anhydriden.

Ondanks de bevredigende resultaten van deze onderzoekmgen werd bij de v e r d e r e ontwikkeling van de gemengd anhydride methode toch

hoofdzakelijk voortgebouwd op het werk van Wieland (4, 5). 0 H R j 0 II I I II R,-C-N-CH-C < § ^ C H 2 - 0 ^ / ° < ^ C H 2 -P 0- ^ „

Fig. 1.4 Gemengd anhydride van een N-beschermd aminozuur met dibenzylfosfaat.

Hoewel Wieland geen meldmg maakt van anomaal gekoppeld produkt, leek het belangrijk om na te gaan of dit regel danwel uitzondering b e trof. Derhalve werd door Vaughan en Osato (9) een 25tal v e r s c h i l -lende organische zuren onderzocht op hun m e r i t e s als hulpzuur. Als maatstaf bij deze vergelijkmg gold de hoeveelheid gekoppeld produkt die kon worden geisoleerd. Gevonden werd dat met alifatische zuren met vertakte ketens zoals isovaleriaan- en pivalinezuur (10) de beste koppelmgsrendementen konden worden verkregen.

De grootste praktische betekenis komt toe aan de methode waarbij de koolzure halfesters als hulpzuren worden gebruikt. Deze methode werd in 1951 bijna gelijktijdig door d r i e onafhankelijk van elkaar w e r -kende groepen, die van Wieland, Boissonnas en Vaughan, geintrodu-ceerd (11, 12, 13). Het voordeel van deze methode boven het gebruik van zuren als pivalinezuur i s , dat het hulpzuur mstabiel is en o v e r gaat in de corresponderende alkohol en kooldioxide, waardoor o p -werkmg van het reactiemengsel wordt vereenvoudigd. Bovendien is de koppeling aan de ongewenste kant van het gemengde anhydride m zeer vele gevallen mmimaal of nihil. Ethyl chloorcarbonaat werd v o o r gesteld door Wieland en Bernhard (11) en door Boissonnas (12), i s o -butylchloorcarbonaat door Vaughan (13). Uit l a t e r e onderzoekmgen van Vaughan en Osato (14) bleek dat isobutyl en secbutyl chl oorc a r -bonaat de beste resultaten opleverden, methyl-, benzyl- en fenylchloor-carbonaat bleken ongeschikt (11, 14). Ethylchloorfenylchloor-carbonaat l e v e r t eveneens acceptabele resultaten en wordt tezamen met de isobutyl-chloorcarbonaat, voornamelijk vanwege de stabiliteit, het meest m de peptidesynthese gebruikt (fig. 1.5)

De vorming van het gemengde anhydride is zelfs bij lage t e m p e r a tuur een zeer snelle r e a c t i e . De snelheid van acylering van het c a r boxylaat ion is g r o t e r dan die der aminen, zij ligt in de orde van g r o o t -te van die der s-terke nucleofielen zoals hydroxylamine en hydrazine (15). Toepassingen van de gemengd anhydride methode in waterige media IS derhalve mogelijk. Zelfs aanwezigheid van de aminocomponent t i j -dens de anhydridevorming blijkt met nadelig te zijn. Als voorbeelden

mogen dienen de cyclisermg van leucylglycylglycine en de koppeling van phthaloylglycine aan do ethylester van glycine, wanneer a c t i v e -ring plaats vmdt in aanwezigheid van laatstgenoemde verbmding (16).

0 II R C -H R2 0 1 1 II N - C H - C - O H + R3-O-0 H R2 R3-O-0 R - C - N - C H - C ^

/

0 0 II - c - c i R, + H 2 N - C H - C - R 5 0 II c -+

+

H R, 0 H R, 0 1 r II 1 1 II N - C H - C - N - C H - C - R 5 R30H + C02 0 H R,. 0 II 1 1 II R 3 - O - C - N - C H - C - R 5 0 H R2 0 II 1 1 II R , - C - N - C H - C - O H

Fig. 1.5 Vorming van de peptidebindmg (getrokken pijlen) en koppe-ling met het hulpzuur (gestippelde pijlen).

De beperkingen van de methode zijn de volgende het gebruik van g e -formyleerde (17) en getrifluoracetyleerde (18) te koppelen ammozuren is af te raden vanwege de geringe opbrengsten. Voorts kunnen slechts de N-tritylderivaten van glycine en alanine worden gekoppeld (19, 20). Beschermmg van zijketens i s wenselijk, vooral bij gebruik van een overmaat aan acylerend agens.

Acylimiden kunnen soms worden gevormd bij koppeling van glycine. Zaoral en Rudinger (21) toonden aan dat imidevorming in belangrijke mate optreedt bij koppeling van tosylglycme. Door Kopple (22) en door Schellenberg (23) kon worden aangetoond dat deze diacylermg even-eens optreedt bij gebruik van benzyloxycarbonylglycine als carboxyl-component. Het daarbij gevormde bijprodukt kan zowel de in figuur 1. 6 afgebeelde structuur A als B bezitten. Gezien het relatief sterke nucleofiele k a r a k t e r van de urethaan stikstof lijkt structuur A de meest waarschijnlijke. Steun hiervoor werd verkregen door middel van volgreacties (22).

Bij koppeling van asparagme meet rekening worden gehouden met het optreden van nevenprodukten. Deze kunnen ontstaan door d e h y d r a -tering van asparagme tot 3-cyanoalanine of door imidevorming (24-26).

Urethaanvormmg, dus reactie aan de ongewenste kant van het g e -mengde anhydride, is in slechts weimg gevallen geconstateerd (17, 27-30). Battersby en Robinson (27) opperden de mogelijkheid dat urethaanvormmg het gevolg is van reactie met alkylchloorcarbonaat, dat met heeft gereageerd met de te activeren carboxylcomponent (fig. 1.5).

O H 0 / 7 A \ II I II ( ^ Q V C H j - O - C - N - C H j - C ^ < Q ^ C H 2 - 0 - c ' 0 H R, 0 II I I II - C H 2 - C - N - C H - C - R 2 0 O H 0 /—\ II I II ( ^ O / ~ C H 2 - 0 - C - N - C H 2 - C ^ < 0 ) - C H 2 - 0 - C - N - C H 2 - C ' \ 1 _ / II I II R 0 I II N-CH-C-R2 O H 0

Fig. 1. 6 Diacylimiden die kunnen ontstaan bij koppeling van glycine. Wieland heeft gevonden dat de disproportionering, in tegenstelling tot anomale koppeling, kan worden voorkomen door bij lage t e m p e r a t u u r (< 0°) te werken (11). De disproportionering, die gemakkelijk o p -treedt bij gebruik van azijnzuur als hulpzuur, kon ook worden geconstateerd bij gebruik van alkylchloorcarbonaat (31). Het bij deze r e a c tie gevormde dialkylpyrocarbonaat (fig. 1.7) zou, ondanks de v e r o n derstelde instabiliteit (11), aanleiding kunnen geven tot u r e t h a a n v o r -mmg (32), O H R 2 O O H R 2 O 0 II I I II II I 1 II II - C - N - C H - C R , - C - N - C H - C R 3 - O - C -I-R 3 - O - C -I-R 2 - C - N - C H - C -I-R 3 - O - C II II I I II II 0 0 H R2 0 0

Fjg. 1.7 Thermische ontleding (disproportionering) van gemengde anhydriden.

Een onderzoek naar de t h e r m i s c h e ontleding van gemengde anhydriden van benzoezuur en p r i m a i r e en secundaire alkylcarbonaten werd u i t -gevoerd door Tarbell et al. (33-35) Bij dit onderzoek werden boven-genoemde anhydriden, al of met in aanwezigheid van een oplosmiddel, blootgesteld aan t e m p e r a t u r e n van 9 0 - 1 5 0 ° . De ontleding bleek te verlopen via twee wegen (33) (fig. 1. 8)

len (34) Van de mechamsmen die a p r i o r i tot de mogelijkheden b e hoorden, kwamen e r enige te vervallen, omdat bij gebruik van een o p -tisch actief alkylcarbonaat de ontleding met behoud van configuratie bleek te verlopen Bovendien bleek de produktsamenstelling onafhan-kelijk te zijn van het oplosmiddel, de temperatuur en de aanwezig-heid van katalysatoren. Hieruit moest worden geconcludeerd dat de ontleding via wegen A en B (fig. 1. 8) gen en dezelfde snelheidsbepalende stap bezit. Een mechanisme dat aan bovenvermelde v o o r w a a r -den voldoet (fig. 1.9), verloopt via een aantal lonogene m t e r m e d i a i r e n die kunnen r e c o m b m e r e n tot de in figuur 1. 8 weergegeven produkten. De snelheidsbepalende stap bij de ontleding is de aanval van het nu-cleofiele agens, zoals weergegeven in 1.9a en b, terwijl 1.9c, d en e zeer snelle volgstappen voorstellen. Een aanvullende bevestigmg voor

+ CO2 ( A )

0

+ R 2 - 0 - C - 0 - R 2 + COj ( B )

Fig. 1.8 Ontleding van gemengde anhydriden.

dit mechanisme werd gevonden door te merken met -"^^ O (35). Uit dit onderzoek bleek namelijk dat bij de ontleding de alkylzuurstofbinding intact bleef.

Een dergelijk mechanisme zou ook kunnen gelden voor de bij t e m -p e r a t u r e n boven 0° geconstateerde dis-pro-portionering van gemengde anhydriden van N-beschermde ammozuren en alkylcarbonaten Bij geldigheid van bovengenoemd mechanisme lijkt de vorming van diakylpy roc arbonaat, zoals voorgesteld door Wieland (11) (fig. 1.10), w e i -mg waarschijnlijk.

Een andere nevenreactie die een enkele maal (36, 37) bij een kop-peling van een aminozuur volgens de gemengd anhydride methode is geconstateerd, de e s t e r v o r m m g , kan ook met het m figuur 1 9 opge-stelde mechanisme worden verklaard

Een probleem w a a r m e e men vooral m de beginperiode van de g e mengd anhydride methode te kampen had, was het optreden van r a c e -misatie bij koppeling van acylpeptiden, wanneer deze geen glycine of proline als C t e r m m a a l aminozuur bezaten. De ervaring heeft g e -leerd dat bij koppeling van N-acylammozuren de r a c e m i s a t i e sterk v e r m m d e r t , wanneer acylgroepen van het urethaantype, zoal s de benzyl

-oxycarbonyl- en de t-butyloxycarbonylgroep, worden gebruikt Door

0 II R,-C R 2 - 0 - C II 0 AT AT II R , - C - 0 - R 2 0 II R - C \ R - C II 0

0 II R , - C \ 0^ + R 2 - 0 - C II 0 0 II ( R , - C - B 0 II e -I- R 2 - O - C - O

i (a)

R2O -I- CO2

0 II i R , - 0 - C - B 0 II e> + R , - C - 0 ® ( b ) R 2 - O - C - • R i - C - O - R , 0 11 - e -I- R 2 - O - C - O

1 ( c )

R2O + CO2 0 II R , - C R 2 - O - C ,

i ^ ,

-I- R2O -» R , - 0 - C - 0 - R , 0 II fi + R,-C-0 ( d ) R , - C R 2 - O - C II ^ e + R , - C - 0 R,-C R , - C \ 0 II e 0 + Rj-O-C-G (e R2O -I- CG, F i g . 1.9 M e c h a n i s m e v a n d e o n t l e d i n g v a n g e m e n g d e a n h y d r i d e n .

Vaughan (38) werd gevonden dat bij koppeling van Z-Gly-L-Phe-OH in chloroformvrijwelvoUedige r a c e m i s a t i e optrad, terwijl bij gebruik

R2-G-C G II ( R , - C - B 0 II e R , - G - C - G

i

(a) R 2 0 ' ^ -(-CO2 0 II R 2 - O - C \ ? 2 - 0 - C II 0 -I- R , - C - 0 (b)

Fig. 1.10 Mechanisme van de vorming van dialkylpyrocarbonaat. van tetrahydrofuran geen r a c e m i s a t i e kon worden aangetoond. Deze resultaten konden l a t e r worden bevestigd door Determann en Wie-land (39) en door Anderson (40). Laatstgenoemde onderzoeker vond dat de koppeling van een acylpeptide ' r a c e m i s a t i e v r i j ' en m hoge o p -brengst kon worden bewerkstelligd, wanneer als anhydridevormer isobutylchloorcarbonaat en als t e r t i a i r e base N-methylmorfoline m equimolaire hoeveelheden worden gebruikt. De keuze van de t e r t i a i r e base IS zeer belangrijk, gezien de grote verschiUen in opbrengst en m mate van r a c e m i s a t i e die werden waargenomen Verondersteld wordt dat de t e r t i a i r e base met slechts fungeert als zoutzuuracceptor doch e e r s t met het isobutylchloorcarbonaat reageert om d a a r -mee een q u a t e r n a i r e verbinding te vormen die op haar beurt r e a g e e r t met de carboxylcomponent. Ook de aanwezigheid van anionen, het o p -losmiddel, de activeringstijd en de reactietemperatuur spelen een rol van betekenis. Voor een ' r a c e m i s a t i e v r i j e ' koppeling m hoge o p -brengst wordt een t e m p e r a t u u r van -15° en een activeringstijd van 30 s e c . geadviseerd en als oplosmiddel worden ethylacetaat en t e t r a -hydrofuran aanbevolen, hoewel ookdioxaan, acetonitril,

dimethyl-aceetamide en dimethylformamide kunnen worden gebruikt. Houdt men zich aan bovenvermelde eisen dan kan zelfs met de zeer g e v o e -lige isotoopverdunningsmethode van Kemp (41) bij de Young- en Andersontest geen significante r a c e m i s a t i e (0,39, r e s p . 0,0l7o) w o r -den aangetoond. Hiermee behoort de gemengd anhydride methode, mits juist toegepast, tot de ' r a c e m i s a t i e - v r i j e ' methoden. Het enige bezwaar dat nog aan de methode kleefde buiten de al e e r d e r V e r m e l

-de nevenreacties, was het niet aflopend zijn van -de koppelingsreactie bij equimolaire verhouding der reactanten. De hieruit voortvloeiende noodzakelijke zuiveringsstappen geven bij langere peptiden vaak a a n -leiding tot problemen.

De ontwikkeling van de overmaat anhydride methode als methode voor stapsgewijze (sequentiele) peptidesynthese, w a a r m e e het bovenvermelde bezwaar kan worden vermeden, zal in hoofdstuk 1. 2 w o r -den uiteengezet.

Recent is door Belleau en Malek (42) als koppelingsreagens N -ethoxycarbonyl-2-ethoxy-l, 2-dihydrochinoline (EEDQ) voorgesteld. De activering van het aminozuur verloopt hierbij ook via een gemengd anhydride (fig, 1.11). In tegenstelling tot de ' k l a s s i e k e ' gemengd a n -hydride methode wordt hierbij het an-hydride langzaam in situ gevormd.

Vele methodische varianten en hulpzuren, die bij de gemengd anhy-dride methode kunnen worden toegepast, zijn uitvoerig beschreven door Albertson (43). 0 H R2 II I I ^ < ; ; \ , . ^ R , - C - N - C H - C 0 0 H f ^ ^ * " V ^ ^ * * ^ N ' ^ 0 - C H 2 - C H 3 ^ ^ ^ N / ^ O ^ R2 H 0 C = 0 r " " l ' - M 0 C2H5 C2H5 C - C H - N - C - R , 0 0 H R2 G II I I II R , - C - N - C H - C / C 2 H 5 - O - C II G

Fig. 1.11 Koppeling van een aminozuur volgens de EEDQ-methode.

1.2 DE REPETITIEVE OVERMAAT GEMENGD ANHYDRIDE METHODE (REPETITIVE EXCESS MIXED ANHYDRIDE, REMA, METHOD) Bij de ten dele in Delft ontwikkelde REMA-methode (29, 30, 52) wordt gebruik gemaakt van gemengde anhydriden van N-beschermde amino-zuren met alkylcarbonaten. In hoofdstuk 1,1 werd gesteld dat bij equimolaire toepassing de koppeling niet in redelijke tijd zal aflopen, h e t -geen kan leiden tot moeilijkheden bij opwerking en zuivering. Derhalve

gebruikten Weygand et al. (44, 45) als e e r s t e n een overmaat s y m m e -t r i s c h anhydride. De overmaa-t werd gebruik-t om de koppeling voUedig te doen zijn en e r werd gebruik gemaakt van s y m m e t r i s c h e anhydriden om de r e e d s aangegeven nevenreacties, die kunnen optreden bij g e -bruik van gemengde anhydriden, te vermijden. Symmetrische anhy-driden zijn echter soms moeilijk toegankelijk. Uit een recent onderzoek van Wieland et al. (46, 47) blijkt dat de resultaten van de o v e r -maat s y m m e t r i s c h anhydride methode in vergelijkmg met de over-maat gemengd anhydride weliswaar bevredigend zijn, doch het grote b e -zwaar van eerstgenoemde methodiek blijft de moeilijke toegankelijk-heid. De gemengd anhydride methode werd toegepast door Sarges en Witkop (48) bij hun synthese van Valine- en Isoleucine Gramicidine A, Er werd geen overmaat gebruikt, hetgeen aanleiding was tot het ont-staan van produkten die uitvoerig gezuiverd dienden te worden. Hun conclusie was dan ook dat op deze wijze slechts kleine peptiden kon-den workon-den bereid. Tilak, een leerling van Weygand, gmg over tot het gebruik van een overmaat gemengd anhydride (49, 50) Hij vond dat een relatief geringe overmaat (0, 5 molair) snel kon worden v e r -nietigd met behulp van een waterige oplossmg van kaliumhydrogeen-carbonaat. Het gevormde peptide werd geprecipiteerd met behulp van water of van een waterige oplossmg van keukenzout. Wateroplosbare peptiden werden geisoleerd door extractie. De opbrengsten per stap bleken zo hoog dat de methode zonder tussentijdse zuivering r e p e -titief - kon worden toegepast.

Tilak et al. konden op deze wijze een nonapeptide synthetiseren(49, 50). In dit Laboratorium werd door Floor de sequentie 1-10 van het menselijk groeihormoon (HGH 1-10) met behulp van de REMA-methode bereid (29, 30), het produkt bleek na afsplitsing van de beschermende groepen identiek aan het overeenkomstige peptide dat werd gesynthe-t i s e e r d megesynthe-t behulp van de vasgesynthe-te-fase megesynthe-thode (51). Ook lugesynthe-teiniserend hormoon - releasing hormoon (LH-RH), een decapeptide, werd m dit Laboratorium met behulp van de REMA-methode bereid (52).

Het principe van de overmaat aan acylerend agens werd r e e d s met succes door anderen toegepast. In het bijzonder door Bodanszky (53-56) en door Morley (57) bij hun repetitieve sequentiele synthesen, waarbij gebruik gemaakt werd van actieve e s t e r s . Het gebruik van een overmaat is essentieel om kwantitatieve koppeling te krijgen a n -d e r s zullen bij een repetitieve sequentiele synthese, zoals o. a. -de REMAmethode, foute sequenties (58) ontstaan. De relatieve s t a t i s tische verdeling van het peptidemengsel, dat wordt gevormd bij m e t -kwantitatieve koppeling, kan worden berekend, bijvoorbeeld als func-tie van de constante koppelingsopbrengst (58, 59). Een met mijn on-derzoek verband houdend voorbeeld, berekening van de statistische verdeling van het peptidemengsel dat ontstaat bij de stapsgewijze synthese van s e c r e t i n e , een heptacosapeptideamide, zal l a t e r t e r sprake komen (hoofdstuk 3.1).

De sequentiele methode is onder te verdelen in de stapsgewijze s y n -these in oplossmg, waarbij tussenprodukten worden geisoleerd en de

synthese aan een vaste d r a g e r . Voordelen van de eerstgenoemde m e -thode zijn

1 controle op zuiverheid van tussenprodukten en eventueel noodzake-lijke tussentijdse zuivering i s mogelijk,

2 vervolging van de koppelingsreactie i s op verschiUende wijzen m o -gelijk (hierbij zij fluorescamine, het in hoofdstuk 1.3 te bespreken reagens op aminogroepen, genoemd),

3. afsplitsing van de polymere drager, hetgeen soms aanleiding kan geven tot grote moeilijkheden, is met noodzakelijk.

Een nadeel is dat eerstgenoemde methode arbeidsintensief en moeilijk te m e c h a m s e r e n i s .

Naast de hiergenoemde sequentiele synthesestrategie wordt ook de strategic van de fragmentcondensaties bij de peptidesynthese g e bruikt * (60) Beide methoden bezitten v o o r en nadelen, die bij o p -zet van een synthese tegen elkaar dienen te worden afgewogen. De m e r i t e s van de stapsgewijze synthese in vergelijkmg met de fragment-methode zijn aangetoond (loor Bodanszky (61). Bij de synthese van secretine werden door hem de twee genoemde strategieen toegepast. Zowel stapsgewijze synthese m oplossmg (55, 56) als fragmentsyn-these (62) leidden tot produkten, die na zuivering identiek bleken aan natuurlijk s e c r e t i n e . De stapsgewijze synthese aan een vaste d r a g e r was m de gebruikte vorm ongeschikt omdat de afsplitsing van de p e p -tideketen van de polymere d r a g e r onoverkomelijke moeilijkheden bleek op te leveren (61, 63) De moeilijkheden die bij de fragmentsynthese werden ondervonden (langzame koppelingen in geringe opbrengst en

zuiveringsproblemen) waren voor Bodanszky aanleiding de s t a p s g e -wijze synthese in oplossmg via activermg met nitrofenytesters als meest geschikte methode voor de bereiding van secretine aan te m e r -ken.

Problemen die zich bij de REMA-methode kunnen voordoen zijn het gevolg van de in hoofdstuk 1.1 aangegeven nevenreacties d i s p r o p o r tionering en koppeling aan de ongewenste kant van het gemengde a n -hydride.

De disproportionering van het gemengde anhydride kan worden v o o r -komen door bij lage t e m p e r a t u r e n te werken (11). Van Asn, Gin en Gly die nevenreacties kunnen opleveren (22-26) konden Z-Gln en Boc-Gly, blijkens het in hoofdstuk 3 van dit proefschrift beschreven onder-zoek, zonder enig probleem in de peptideketen worden ingebouwd.

Een nevenreactie die moeilijk te voorspellen en lastig te vermijden IS, IS de koppeling aan de ongewenste kant de nietammozuur kant van het gemengde anhydride, hierna v e r d e r te noemen 'anomale k o p -peling'. In tegenstelling tot de disproportionering is deze anomale

* Voor een voorbeeld van een stapsgewijze (sequentiele) synthese r e s -pectievelijk van een fragmentsynthese zij verwezen naar figuur 3.2 en figuur 2 . 5 .

koppeling nauwelijks temperatuurafhankelijk, de reactie hangt m hoofd-zaak af van s t e r i s c h e factoren. Een gedeeltelijk anomale koppeling zal leiden tot een partieel ketengetermmeerd produkt, hetgeen voor s o m -mige auteurs (53, 64, 65) aanleiding is de gemengd anhydride metho-de ongeschikt te v e r k l a r e n voor repetitieve toepassing. Gebleken is echter dat deze anomale koppeling slechts in weinige gevallen o p t i e e d t . Zij t r e e d t onder andere in m e e r of mmdere mate op bij k o p -peling aan prolylpeptiden. De mate van anomale kop-peling lijkt daar afhankelijk van de s t e r i s c h e eigenschappen van het te koppelen a m i n o zuur. Zo trad bij koppeling van isoleucine aan een prolylpeptide v o l -ledige urethaanvormmg op, terwijl aanhechtmg van phenylalanine en nitroarginine slechts voor respectievelijk 20% en 407o tot u r e t h a a n -vormmg aanleiding gaf (30, 66). Bij vergelijkmg van deze resultaten moet worden opgemerkt dat aan verschiUende prolylpeptiden is g e -koppeld. Als oorzaak voor de hier vermelde verschiUen moet dus ook het mogelijke verschil in conformatie van de prolylpeptiden in a a n -merking worden genomen.

De bovengeschetste nevenreactie kon in Delft worden vermeden door over te gaan op koppeling van prolmedipeptiden (29, 30) Zou bij een bepaalde stap echter in geringe mate (< 10%) anomale koppeling o p -treden dan blijft het hierbij ontstane urethaan, isobutyloxycarbonyl-peptide, tot aan het emd van de sequentiele synthese onaangetast. Het getermineerde produkt zal daarbij steeds s t e r k e r gaan verschiUen van de groeiende peptideketen, waardoor zuivering in het eindstadium m o gelijk lijkt. Indien anomale koppeling m een zeker stadium grote p r o -p e r t i e s gaat aannemen, hetgeen na deblokkering is te constateren, dan zal deze koppeling moeten worden omzeild, zoals dat ook gedaan is bi] koppeling aan prolylpeptiden.

Aangezien bij de REMAmethode gebruik wordt gemaakt van een o v e r maat acylerend agens lijkt volledige zijketen beschermmg een v e r e i s t e . Deze tactiek is ook door mij toegepast bij de later t e r sprake k o -mende synthese van secretine (hoofdstukken 3 en 4)

De beperkingen van de REMA-methode met betrekkmg tot bepaalde beschermende groepen zijn r e e d s behandeld in hoofdstuk 1 . 1 .

1.3 BESTURING VAN DE REMA-SYNTHESE MET FLUORESCAMINE 1.3.1 Inleiding

Bij een stapsgewijze synthese van een lang peptide i s het een dwmgen-de eis dat elke koppeling nagenoeg kwantitatief verloopt. Wanneer dit met het geval i s , zullen foute sequenties ontstaan (58, 59) (vgl. hoofdstuk 3.1 tabel 3.1 en fig. 3 1). Derhalve is het van belang te b e -schikken over een detectiemethode w a a r m e e de kwantitatieve vorming van de peptidebindmg kan worden waargenomen Aangezien dit m o e i -lijk IS te verwezen-lijken, wordt bij synthesen, waarbij een overmaat acylerend agens wordt gebruikt, het verdwijnen van de

aminocomponent bepaald. Daartoe dient men te beschikken over een voldoende g e -voelige indicator. Fluorescamine, een reagens op p r i m a i r e aminen dat werkzaam is m het picomol (pmol) gebied, bleek voor het gestelde doel geschikt.

1.3.2 Fluorescamine

Door Samejima et al. (67, 68) werd gevonden dat fenylaceetaldehyde m combinatie met ninhydrine en een p r i m a i r amine aanleiding geeft tot sterk fluorescerende produkten (fig. 1.12). De structuur van deze fluorofoor werd opgehelderd door Weigele et al. (69). Deze auteurs bereidden een reagens dat als indicator nog gevoeliger was dan de ninhydrine-fenylaceetaldehyde fluorescentiereactie (70-72), Wanneer dit reagens 4-fenylspiro[furan-2(3H), l ' - f t a l a a n 1 - 3 , 3'-dion (fluores-camine), met een p r i m a i r amine r e a g e e r t , wordt dezelfde fluorofoor gevormd als bij de ninhydrine-fenylaceetaldehyde r e a c t i e .

OH OH 0 N I N H Y D R I N E ( 0,1 7o) -f R-NH2 5,5 I S m i n ( 1 0 0 ° C ; OH 0 0 A B S MAX " ^ 570 n m ( b t a u w ) OH OH FLUORESCAMINE ( 0,015 % ) CHO I CH, + [ O j + R-NH2 -I-R-NH2 H,0 pH ' ^ 8,5 2 m i n ( 2 0 ° C ) t l _V2 5 s e c R-N

^^^ Co

if OH CO2H EXC MAX ' V ^ 390 n m FLUORESC MAX ' ^ 4 9 0 n m NIET FLUORESCERENDE PRODUKTEN

Fig, 1,12 Reactie van p r i m a i r e aminen met ninhydrine, ninhydrine/ fenylaceetaldehyde en fluorescamine.

De opbrengst is m het e e r s t e geval echter vele malen g r o t e r (fig, 1,12), Het excitatiemaximum van de gevormde f l u o r e s c e rende verbindingen ligt bij 390 nm, tei'wijl bij 475 nm g e e m i t -teerd wordt,

De r e a c t i e tussen fluorescamine en een p r i m a i r amine verloopt r e e d s bij k a m e r t e m p e r a t u u r bij pH 9 in een fractie van een seconde, terwijl de ontledingsreactie van fluorescamine, die n i e t f l u o r e s c e -rende produkten oplevert, onder genoemde omstandigheden een half-waardetijd van 5-10 seconden heeft. Met aceton als oplosmiddel heeft de r e a c t i e een hoog rendement (85-90%) bij equimolaire toepassing,

Een nadeel van de bepalingsmethode is dat immozuren zoals p r o l i n e en hydroxyprolme met direct met fluorescamine bepaald kunnen w o r -den; deze immozuren dienen e e r s t te worden omgezet m verbindmgen met een p r i m a i r e aminogroep (73), Voorts is een nadeel dat de b e -palmg van peptiden, met eigen-fluorescentie, b , v , tryptofaanhouden-de peptitryptofaanhouden-den, wordt gestoord,

Er IS geconstateerd dat de intensiteit van fluorescentie van met fluorescamine behandelde peptiden g r o t e r is dan die van op o v e r e e n -komstige wijze behandelde ammozuren. De laagste detectiegrens bij dunnelaagchromatografie ligt voor peptiden op 10-20 pmol, terwijl

ZIJ voor ammozuren op ca. 100 pmol ligt (74). Belangrijke toepassingen van fluorescamine zijn:

1. de detectie van proteinen en peptiden, o. a. als hulpmiddel bij z u i v e r m g s p r o c e d u r e s en als hulpmiddel bij analytische c h r o m a t o g r a -fie van brokstukken van peptiden en proteinen, 'peptide mapping'; 2, het bepalen van de hoeveelheid vrije aminogroepen tijdens een k o p

pelingsreactie bij synthesen aan een vaste drager (75) of m o p l o s -smg (76-79),

De voordelen van fluorescamine ten opzichte van ninhydrine zijn-1, de onderste detectiegrens, zowel in oplossmg als op DLC, ligt 10

tot 100 maal l a g e r dan die van ninhydrine, daardoor is slechts een geringe hoeveelheid monster vereist;

2, de eenvoud van uitvoering van een vlek of spottest; e r is geen t e m -peratuurverhogmg v e r e i s t , derhalve geen ontleding van b e s c h e r m d e peptiden;

3, fluorescentie met ammomak is zwak,

4, Ntbutyloxycarbonylpeptiden zijn aantoonbaar na kortstondige v e r -hitting,

1,3,3 Besturing van de REMA-synthese

Met behulp van fluorescamine kan de hoeveelheid aminocomponent t i j dens een koppelingsreactie worden bepaald. Daartoe wordt de m t e n -siteit van fluorescentie van een met fluorescamine behandeld m o n s t e r uit het reactiemengsel vergeleken met die van bekende concentraties van de aminocomponent. De praktische uitvoering van deze test zal l a t e r t e r sprake komen (hoofdstuk 3.4), Zoals reeds gesteld, ligt de onderste detectiegrens voor het aantonen van peptiden met

fluorescamine bij 1020 pmol, Bij de in de peptidesynthese gebruikelijke c o n -c e n t r a t i e s kan het verdwijnen van 99, 8-99, 9% van de amino-component worden waargenomen,

Wanneer bij een koppeling de fluorescamine-test positief blijft, kan men mgrijpen en e6n van de volgende stappen ondernemen

1, verhoging van de concentratie van het gemengde anhydride, 2 permanente blokkermg van de r e s t e r e n d e aminocomponent, 3, afscheiding van de aminocomponent met behulp van b , v ,

lonenwis-selingschromatograf le,

Bij de REMA-synthese van s e c r e t i n e (hoofdstukken3 en 4), bleek flu-orescamine van onschatbare waarde,

2. Het gastro-intestinale hormoon

secretine

2 , 1 NATUURLIJK SECRETINE

Secretine werd al m 1902 door Bayliss en Starling (80) ontdekt in de slijmvliezen van de twaalfvmgerige d a r m , duodenum, m a a r het d u u r de tot 1961 voor J o r p e s en Mutt het hormoon m zuivere toestand v e r -kregen, Voor de isolering van 10 mg secretine met een activiteit van 4, 000 klinische eenheden per mg hadden deze onderzoekers 10. 000

varkens nodig. Hierbij gmg men te werk volgens het schema in tabel 2 . 1 (81-85).

Uiteindelijk werd van v a r k e n s s e c r e t i n e in 1966 de p r i m a i r e s t r u c -tuur, de sequentie, opgehelderd eveneens door J o r p e s en Mutt (83, 86-88). Het hormoon bleek uit 27 a m m o z u u r r e s t e n te bestaan. De sequentie is als volgt (fig, 2,1):

H H i s S e r A s p G l y Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser A r g Leu A r g -1 2 3 ^ 5 G 7 8 9 -10 -1-1 -12 -13 K - A s p - S e r - A l a - A r g - L e u - G t n - A r g - L e u - L e u - G l n - G l y - L e u - V a l - N H 2

15 16 17 18 19 20 21 22 23 lU 25 26 27

Fig, 2 , 1 Sequentie van v a r k e n s - s e c r e t i n e ,

De sequentie werd opgehelderd met behulp van tryptische afbraak, Dit leidde tot een vijftal peptiden

1, H i s - S e r - A s p - G l y - T h r - P h e - T h r - S e r - G l u - L e u - S e r - A r g 2, Leu-Arg

3, A s p - S e r - A l a - A r g 4, Leu-Gln-Arg

5, Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2

Voorts was gebleken dat het N-terminale aminozuur histidine was, terwijl op de C - t e r m m u s valine als amide aanwezig bleek, Na een tryptische hydrolyse gedurende korte tijd bleef de Arg-Asp binding intact en van een nieuw peptide L e u - A r g - A s p - S e r - A l a - A r g (2+ 3) werd de structuur opgehelderd Vervolgens bleek thrombme bij secretine slechts de Arg-Asp binding te splitsen zodat 2 peptiden resulteerden waarvan e r 66n bleek te bestaan uit de ammozuren voorkomend in

Tabel 2 , 1 I s o l e r i r ^ van v a r k e n s - s e c r e t i n e door J o r p e s en Mutt Bewerkmgen Gewicht Activiteit * 1, 10,000 stukken v a r k e n s d a r m (eerste

m e t e r na maaguitgang) invriezen en

malen 700 kg 2, a. Extractie met 0, 5 N azijnzuur

b, Adsorptie van de actieve stof op algienzuur

c, Elutie van algienzuur met 0, 2 N zout-zuur

d, Precipitatie door verzadiging met

natriumchloride 1 k g 1,5-3 3, a Fractionering van een waterige o p

-lossmg met ethanol

b Actieve stof opnemen in water c, Precipitatie met natriumchloride

d, Opnieuw neerslaan bij pH 4 150 g 5-15 4, Extractie in methanol 4 g 150-300 5, Chromatografie op

carboxymethvl-cellulose 100 mg 1 000 6, Gefractioneerde tegenstroomverdeling

in het systeem b u t a n o l / 0 , 1 M fosfaat

buffer, pH 7,0 10 mg 4.000 * Klinische eenheden/mg (83)

(1+2). Aangezien peptide 2 (Leu-Arg) zowel met peptide 1 als met peptide 3 gebonden is, is h i e r m e e de volgorde van de vijf tryptische peptiden vastgesteld. De tryptische afbraak is zo eenduidig dat de chromatografische scheiding van de r e s u l t e r e n d e peptidefragmenten

(peptide map) kan dienen als zuiverheidscriterium van het hormoon. Aan natuurlijk secretine worden de volgende biologische werkmgen toegeschreven (83, 89, 90):

1. de afscheiding van bicarbonaat uit de p a n c r e a s wordt sterk g e s t i -muleerd,

2. de hoeveelheid enzymen, die m de p a n c r e a s worden vrijgemaakt, wordt verhoogd,

3. de secretie vanuit de klieren van Brunner neemt toe,

4. de m a a g z u u r s e c r e t i e , gestimuleerd door g a s t r i n e , wordt afge-remd;

6. de s e c r e t i e van galsappen wordt gestimuleerd, 7. de s e c r e t i e van insulme wordt gestimuleerd, 8. de afscheiding van pepsine wordt sterk verhoogd;

9. de motorische activiteit van maag en d a r m wordt verkleind; 10, de opname van zouten en water vanuit de kronkeldarm (ileum) en

de galblaas wordt af geremd,

11, de snelheid en slag van het h a r t (bloeddebiet) wordt verhoogd; als gevolg van deze cardiovasculaire activiteit van secretine t r e e d t een verhoging van de bloedstroom m de p a n c r e a s en de d a r m op, terwijl die m de lever wordt verlaagd;

12, de lipolyse in vetweefsel wordt gestimuleerd door middel van a c -tivering van adenylcyclase.

Een aantal van bovenvermelde werkmgen kan afkomstig zijn van h o r -monen die natuurlijk secretine verontremigen. In verband met de moeilijke toegankelijkheid van zuiver natuurlijk secretine zal e e n -duidige toekennmg van de verschiUende fysiologische activiteiten e e r s t kunnen geschieden, wanneer de werkingsproeven worden h e r -haald met zuiver synthetisch s e c r e t i n e ,

De biologische activiteit van s e c r e t i n e wordt bepaald door meting van het volume en het alkaligehalte van het p a n c r e a s s a p dat na m t r a -veneuse toediening van het hormoon wordt afgescheiden (83, 91), Als proefdieren voor deze bepalmg worden vooral honden en katten g e bruikt (83), Ook m de mens werd het effect van natuurlijk en s y n t h e -tisch v a r k e n s - s e c r e t i n e op de p a n c r e a s bestudeerd (92),

Het IS opvallend dat secretine uit het duodenum een zo hoge mate van homologie bezit met vasoactive intestinal peptide (VIP), met g a s t r o -inhibitory peptide (GIP) en ook met het p a n c r e a s hormoon glucagon (93-95) (fig, 2,2), Niet minder dan 14 ammozuurresten van s e c r e t i n e komen voor op de overeenkomstige plaatsen m glucagon, Zowel m VIP als m GIP blijken 9 a m m o z u u r r e s t e n van secretine op dezelfde posities (gerekend vanaf N-terminus) voor te komen, Deze plaatsen zijn m figuur 2,2 door een s t r e e p aangegeven; met aangegeven zijn de posities waar de a m m o z u u r r e s t e n overeenkomst vertonen (b, v, Glu, . , Asp, Arg, , . Lys), De grote mate van homologie, die wijst op gelijke evolutionaire oorsprong, komt met tot uiting in de v e r s c h i l -lende werkmgen en het orgaan van herkomst van de hormonen (tabel 2,2) (96).

Anders dan bij bijvoorbeeld gastrine hebben grote brokstukken van zowel secretine als glucagon weinig of geen biologische activiteit. Het weglaten van het Nterminale aminozuur histidme of de v e r v a n gmg van de a s p a r a g m e z u u r r e s t op plaats 3 door een i s o a s p a r a g i n e z u u r r e s t r e s u l t e r e n bij secretine in een sterke dating van de b i o l o -gische activiteit (83, 97). Waarschijnlijk is de gehele keten v e r e i s t om contact met de receptor mogelijk te kunnen maken.

De secundaire structuur van s e c r e t i n e werd nagegaan met behulp van optische rotatie d i s p e r s i e (ORD), c i r c u l a i r dichroisme (CD) en k e r n

-H 1 His Ser Asp A l a Vol Phe Thr A s p A s n Tyr Thr A r g Leu A r g L y s G i n Met A l a V a l Lys Lys Tyr Leo A s n S e r H e Leu 28 A s n NH2 VIP - i — i ^ H 1 His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser A r g Leu A r g A s p Ser A l a Arg Leu G i n A r g Leu Leu Gin G l y Leu 27 Val NH2 — ^ — ^ — • ^ — — H 1 His Ser G i n Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr L e u Asp Ser A r g A r g A l a G i n A s p Phe V a l G i n T r p Leu Met A s n 29 Thr S e c r e t i n e G l OH u c a g ^ ^ ^ ^ ^ — i ^ ^ — ^ — • ^ on H 1 Tyr A l a Glu Gly Thr Phe l i e Ser Asp Tyr Ser H e A l a Met Asp Lys l i e A r g G i n G i n Asp Phe V a l A s n T r p Leu Leu A l a G i n 30 G i n 31 Lys Gly Lys L y s Ser A s p T r p Lys His Asn l i e Thr 43 G i n OH GIP

Fig, 2.2 De p r i m a i r e structuren van Vasoactive Intestinal Peptide (VIP), Secretine, Glucagon en Gastric Inhibitory Peptide (GIP),

Tabel 2,2 Biologische werkmgen van s e c r e t i n e en daarop gelijkende peptidehormonen (90, 102-109)

Secretine Glucagon VIP GIP MAAG

Afscheiding van zuur - - - _ _ _ Afscheiding van pepsine + + x Motorische activiteit x -ALVLEESKLIER

Afscheiding base

Afscheiding van enzymen DUNNE DARM Sapafscheiding Motorische activiteit + + + -1-0 -1-X 0 0 + X GALBLAAS Spiercontractie HART Bloeddebiet

+ stimuleert; + + stimuleert sterk; werking; x werking met bekend,

r e m t ; - - remt sterk; 0 geen magnetische resonantie (NMR) (98-101). De ORD-spectra gaven Bo-danszky e t a l . aanleidmg tot de voorlopige conclusie dat secretine een peptide IS, waarvan slechts een klein gedeelte de cy-helix-structuur

(10-30%) aanneemt; zowel het N - t e r m m a l e als het C - t e r m m a l e deel van het molecuul zou geen a - h e l i x - s t r u c t u u r aannemen, Verondersteld wordt dat het hydrofobe C t e r m m a l e deel van secretine een b e -langrijke rol speelt bij stabilisering van de secundaire structuur van het molecuul,

De enig bekende r e l e a s e r van s e c r e t i n e i s het hydromumion (110) Secretine wordt vrijgemaakt wanneer de zure spijsbrij vanuit de maag in het duodenum wordt gestort, Beneden de drempelwaarde van pH 4, 5 wordt het peptidehormoon vrijgemaakt,

Het IS waarschijnlijk dat wanneer voortdurend teveel secretine wordt afgescheiden een ziektebeeld ontstaat, dat vergelijkbaar is met choler a , Vanwege deze gelijkems wocholerdt dit ziektebeeld panccholereatische c h o -l e r a genoemd, Een chromsch tekort aan s e c r e t i n e zou aan-leiding kun-nen geven tot z w e e r v o r m i n g i n h e t duodenum als gevolg van de voort-durend te lage pH (111)

Men heeft therapeutische toepassing van secretine gesuggereerd bij zweervorminginhet duodenum en bij hartaandoenmgen, Toediening als snuifpoeder zou tot de mogelijkheden behoren (112, 113).

2.2 SYNTHETISCH SECRETINE

De sequentie van v a r k e n s - s e c r e t i n e , zoals voorgesteld door J o r p e s en Mutt, werd bevestigd door een tweetal synthesen van Bodanszky, Ondetti et al. (55, 56, 62, 114) en m e e r recent door de synthese van Wiinsch et al. (115-123) en de hiervan afgeleide synthese van Kbnig en Geiger et al. (124). In de figuren 2. 3, 2 . 4 , 2. 5 en 2. 6 worden deze synthesen schematisch weergegeven. Bij de vier synthesen b l i j ken de ruwe produkten ongeveer een kwart tot een derde van de b i o -logische activiteit van het zuiverste natuurlijke s e c r e t i n e te bezitten,

Z - H i s ( Z ) - 5 e r ( B z l ) - A s p ( B z l ) - G l y - Thr - PheThrSerCBzl)Glu(Bzl) L e u PheThrSerCBzl)Glu(Bzl) S e r ( B z l ) PheThrSerCBzl)Glu(Bzl) A r g ( N 0 j ) PheThrSerCBzl)Glu(Bzl) L e u PheThrSerCBzl)Glu(Bzl) A r g ( N 0 2 ) PheThrSerCBzl)Glu(Bzl) A s p ( B z l ) PheThrSerCBzl)Glu(Bzl) S e r ( B z l ) PheThrSerCBzl)Glu(Bzl) A l a PheThrSerCBzl)Glu(Bzl) -- Arg ( N O j ) -- L e u -- G i n -- A r g (NO2)--Leu--Leu--Gin--Gly--Leu--Vol--NH2

Hj/Pd

H - [ T - 27 l - N H ,

Fig. 2 . 3 Sequentiele synthese van s e c r e t i n e via de actieve e s t e r m e -thode (ONp; ODnp) (Bodanszky et a l . , 1967).

H - I U - 27 l - N H , H - A r g ( N O , ) - A s p ( B z l ) - S e r ( B z l ) - A l a - A r g ( N O ! ) - L e u - G l n - A r g ( N O ! ) - L e u - L e u - G l n - G l y - L e u - V a l - N H !

Boc - 1 9 - 13 I - NH - N H , 80c - Glu - Leu - S e r - A r g - L e u - NH - NH,

Z - I 5 - 8 l - N H - N H , 2 - T h r - P h e - T h r - Ser - N H - N H i B o e - I 1 - " « ~ | - N H - N H , Boc - H i s - S e r - A s p - G l y - N H - N H ,

S e q u e n t i e e l via de actieve ester m e t h o d e ( O N p , ODnp) opgebouwde I r a g m e n t e n

Boc - I 9 - l 3 ~ l - N H - N H , H - I u - 2 7 " 1 - N H , I I 1 a z i d e 2 TFA 3 H i / P d Z - I 5 - 6 j - N H - N H , H - l 9 - 27~| - NH; I . I 1 Gzide 2 H i / P d B o c - I 1 - ~ r | - N H - N H , H - l 5 - 2 7 ~ | - N H ; 2 TFA H - I 1 - 2 7 l - N H ,

H - l 21 - 27 1 Z - 1 1 8 - 2 0 1 Z - | U - 17 1 Z - 1 1 2 - 131 N P S - / Z - I 7 - 11 1 A d o c - I 1 - 6 1 -NH2 H - A r g ( H * ) - L e u - L e u - G i n - G l y - L e u - V a l - N H j -OH Z - Arg( Z,Z ) - L e u - G l n - O H -OH Z - Arg( Z,Z ) - A s p ( t - B u ) - S e r ( l - B u ) - A l a - O H -OH Z - Arg( Z,Z ) - L e u - O H

-OH N p s - / Z - T h r ( l - B u ) - S e r ( t - B u ) - G l u ( t - B u ) -Leu - S e r ( t - B u )-OH -OH Adoc - H i s ( A d o c ) - S e r { t - B u ) - A s p ( t - B u ) - G l y - T h r ( t - B u ) - P h e - O H Overwegend sequentieel via de actieve ester methode opgebouwde f r a g m e n l e n

Z - I 18 - 20"1-OH H- I 21 - 27 | - N H ; 1 DCCI/HOBt 2 H;/Pd/W HBr K - 17 -OH H - l 18 - 27 l - N H ; I 1 DCCl/HOSu 2 H i / P d / N HBr 12 - 13 -OH H - 14 - 27 1 DCCl/HOBt 2 Hj/Pd/W HBr Z - 7 - 11 -OH H - l 12 - 27 l - N H ; Nps-_J L_ 11 - OH 1 D C C I / H O S U / 1 DCCl/HOSu 2 H;/Pd / 2 0,1 W HBr Adoc- 1 - 6 -OH H - l 7 - 27 | - NH; 1 DCCl/HOSu (HOBt) 2 TFA H 1 - 2 7 l NH;

Fig. 2 . 5 Synthese van secretine (Wunsch et a l . , 1972),

terwijl na zuivering in alle vier gevallen een produkt met een a c t i v i -teit gelijk aan die van het zuivere natuurlijke produkt kon worden ver-kregen,

gesyn-thetiseerd met niet nader gespecificeerde biologische activiteit^ Pogingen om met behulp van de v a s t e - f a s e methode s e c r e t i n e te bereiden zijn beschreven door de groep van Bayer (126-128) en door Trpin (129), Laatstgenoemde auteur v e r k r e e g een produkt, dat na zuivering homogeen was en de juiste aminozuursamenstelling bezat, doch geen biologische activiteit bleek te bezitten.

H-l 21 - m - N H , Z-l 18 -lOl-OH Z - f K ^ n r i - O H z - n ~ n 3 ~ i - 0 H

B o c - I 1 - 6 I - O H

H - Arg( H* ) - Ltu - Leu - Gin - Gly - Leu - Vol - NH; Z -Arg( Z,Z)-Leu - Gin- OH

Z - Arg( Z.Z)-A»p(t-Bu) - Ser(l-Bu)-Ala -OH

Z -Thr(t-Bu)-Ser(t-Bu) -Glu(l-Bu)-Leu-Ser(l-Bu) - Arg(H») -Leu -OH Boc -His - S e r ( t - B u ) - A s p ( l - B u ) - Gly-Thr(t-Bu ) - Phe -OH

Overwegend sequentieel via DCCl/HOBt methode opgebouwde fragmenten

h - 6 1 -OH H- z-[W--z-n^ 7 -' 20 l-OH H-l 21 1 DCCI/HOOBt 2 H,/Pd 17 l-OH H-l 18 131-OH H-114 H-rr 1 OCCl/HOBI 2 TFA 27 l-NHj 1 DCCI/HOBI 2 Hi/Pd 27 | - N H , 1 DCCI/HOOBt 2 H,/Pd 27 |-NHi 27 l-NH: - 2 7 1 J

3. Synthese van het C-terminale

hexadecapeptide van secretine (S 12-27)

3,1 INLEIDING

De beschrijving van de REMA-synthese van secretine wordt gedeeld in twee hoofdstukken; de synthese van het C-terminale hexadecapep-tide van secretine (S 12-27) en de synthese van het r e s t e r e n d e deel van s e c r e t i n e , alsmede de zuivering, De redenen hiervoor zijn de volgende:

1, bij een peptide g r o t e r dan een hexadecapeptide (mol, gew, > 2500) neemt de waarde van de analytische technieken, die als z u i v e r -h e i d s c r i t e r i a dienst doen, zoals elementanalyse en analytisc-he gelfiltratie, in betekenis sterk af;

2, met de synthese van een hexadecapeptide wordt de g r e n s met b e trekking tot de peptidelengte, bereikbaar met de vastefase m e -thode geevenaard of overschreden (130, 131).

Tot en met het hexadecapeptide werden alle tussenprodukten g e k a r a k -t e r i s e e r d me-t C, H, N - en soms - O analyse, smel-tpun-t, op-tische draaiing, dunnelaagchromatografie (DLC), aminozuuranalyse, terwijl daarna uitsluitend DLC en aminozuuranalyse als zuiverheidscriteria werden toegepast,

Om vast te kunnen stellen aan welke eisen de omzettingsgraad p e r stap moet voldoen bij een sequentiele synthese van een heptacosapep-tide werd de in hoofdstuk 1,2 r e e d s t e r sprake gekomen benadering toegepast op de synthese van s e c r e t i n e . Het mol, -percentage van het heptacosapeptide en van alle mogelijke hexacosapeptiden, pentacosa-peptiden, enz, werd berekend als functie van een constante koppelingsopbrengst (p) volgens Baas et al, (59). De resultaten van deze b e r e -kening zijn weergegeven in figuur 3,1 en tabel 3 . 1 , *

De stabiliteit van gemengde anhydriden onder koppelingscondities ( - 1 5 ° , cone, 0,1 m m o l / m l DMF of THE) werd onderzocht, Uit dit onderzoek, dat i s beschreven in hoofdstuk 5, volgt dat gemengde a n -hydriden van volledig beschermde aminozuren met isobutylcarbonaat in zowel DMF als THE bij -15° gedurende lange tijd (enige malen de gebruikelijke koppelingstijd) stable! zijn, De v r e e s op nevenprodukten, als gevolg van de instabiliteit van de gemengde anhydriden (11, 37), lijkt ongegrond, De enige nevenprodukten die naast eventueel g e r a c e

-* Ik ben Dr, i r , J . M, A. Baas zeer erkentelijk voor het uitvoeren van deze berekening,

m i s e e r d e verbindingen bij de REMAsynthese zouden kunnen o p t r e -den, zijn het gevolg van anomale koppeling,

100-80 60-Mol % AO 20-n \ \ v 2 7 \ .

/C<:

\ 26 ^ ^ ^ 25 2A ~- -~ 23

3

100 98 96 KOPPELINGSOPBRENGST p in % 9A

Fig, 3,1 Relatieve statistische verdeling van peptiden na 26 koppe-lingsstappen als functie van een constante koppelingsopbrengst (p), De krommen aangeduid met 26, 25, 24 en 23 geven elk het totale mol-% aan van alle mogelijke peptiden, die respectievelijk 26, 25, 24 en 23 aminozuurresten bevatten,

Tabel 3,1 Relatieve statistische verdeling van peptiden na 26 koppe-lingsstappen (b,v, bij synthese van secretine) als functie van een constante koppelingsopbrengst (p) p 99,99 99,95 99,90 99,80 99,70 99,60 99,50 2 7-peptide (secretine) 99,74 98,71 97,43 94,93 92,49 90,10 87,78 Mol mengsel van 2 6-peptiden 0,26 1,28 2,54 4 , 9 5 7,24 9,41 11,47 - % me 25 ngsel van -peptiden 0,03 0,12 0,27 0,47 0,72 mengsel van 24-peptiden 0,02 0,03

3.2 SYNTHESE VOLGENS DE REMA-METHODE

Bij de REMAsynthese van het Cterminale hexadecapeptide van s e -cretine (se-cretine 12-27) werd zowel de benzyloxycarbonylgroep (Z) als de t-butyloxycarbonylgroep (Boc) gebruikt als N-beschermende groep. De Z-groep werd verwijderd met behulp van broomwaterstof in azijnzuur en de Bocgroep met behulp van trifluorazijnzuur. A a n -gezien de Z-groep met selectief ten opzichte van een benzylgroep kan worden afgesplitst, werd vanaf plaats 17, waar Ser (Bzl) werd inge-voerd, de Boc-groep als N-bescherming gebruikt. Voorts was de keuze van Z - en Boc-groepen zodanig dat een vergelijkmg van de fysische constanten van de tussenprodukten met die, welke zijn g e -publiceerd door Bodanszky (55, 56) en Wiinsch (115), mogelijk w e r d . Hetzelfde argument gold voor de keuze van de zijketen-beschermende groepen, Arg(N02) werd viermaal en Ser(Bzl) en Asp(Bzl) werden elk eenmaal gebruikt (fig. 3 2). Alle aminozuren die voorkomen m het fragment 1227, inclusief ZGln, waarbij imidevorming of d e h y d r a tering zou kunnen optreden en BocGly*, waar diacylermg tot de m o -gelijkheden behoorde, konden worden gekoppeld m hoge opbrengst zonder enige moeilijkheid. Slechts bij koppeling van Z-Arg(N02) en BocArg(N03) werden bijprodukten gevormd, waarschijnlijk als g e -volg van lactamvorming, die echter bij opwerking konden worden verwijderd, zonder de opbrengst aanmerkelijk te doen dalen. Bij alle koppelingen ligt de opbrengst aan geisoleerd produkt ongeveer bij 95%. Slechts bij koppeling aan glutaminylpeptiden waarbij pyrogluta-minezuurvorming mogelijk is en bij koppeling van Boc-Asp(Bzl) aan het dodecapeptide liggen de opbrengsten enige procenten lager (tabel 3.2).

De wijze van koppelen die in het experimentele deel i s beschreven, verschilt slechts in een opzicht van een methode die r e e d s is b e s c h r e -ven (30). De koppelingen werden nu vervolgd door gebruik te maken van het nieuwe zeer gevoelige r e a g e n s fluorescamine. F l u o r e s c a m i n e IS bij het aantonen van peptiden tien tot honderd maal gevoeliger dan het tot nu toe gebruikelijke ninhydrine (vgl. hiertoe hoofdstuk 1.3). Als regel werden koppelingen voortgezet totdat > 99, 9% van de a m i n o -component was verdwenen. Dit hoeft geenszins te betekenen dat de koppeling in een zodanig hoog percentage is verlopen, aangezien a n o -male koppeling ook aminocomponent consumeert. De uit ano-male koppeling ontstane urethanen zijn echter bestendig onder de condities van deprotectie en volgende koppelingen, zodat deze stoffen met m e e r deelnemen aan de synthese (30, 132), wat tot gevolg heeft dat zij geen oorzaak kunnen zijn van z g. foute sequenties. Daarvoor komt s l e c h t s een gering percentage (< 0,1%) in aanmerking. De 'koppelingstijden', zoals die werden waargenomen bij een synthese van het hexadecapep-tide, zijn weergegeven in figuur 3. 3.

* Tilak wijst op moeilijkheden die zich zouden kunnen voordoen bij koppeling van benzyloxycarbonylglycine (50), volgens mijn gegevens is het t-butyloxycarbonylderivaat zonder enig probleem te koppelen.

20 Gin 22 d Leu Boc-NO2 Boc-rt)HBoc. Boc^^OH Boc N02 Bzl - ' ' O H Boc Boc-^OH Z-NO2 -^OH Z-Z--OH 1-Y— OH Z N02 2-^OH 1- Boc-b OH Boc Vol a Z-I-OH Z--NH2 1 •NH2 12 NH2 13 NH2 U NH; 15

a Z-groepen werden verwijderd door acidolyse ( 2N HBr/HOAc ) b Deprotectie met behulp van trifluoraz<)nzuur

c Gly werd ook gekoppeld als Z-Gly-ONP

d Leu werd ook gekoppeld als Boc-dertvaat

Fig. 3,2 REMA-synthese van het beschermde C-terminale hexadeca-peptide van s e c r e t i n e (S 12-27),

Het is opmerkelijk dat Arg(N02) in d r i e gevallen aan een leucylpep-tide moest worden gekoppeld: aan een hexapepleucylpep-tide, een nonapepleucylpep-tide, en een pentadecapeptide, Er werd geen geleidelijke toename van de reactietijd waargenomen, Blijkbaar i s voor de reactietijd de onbe-kende conformatie van de aminocomponent van g r o t e r belang dan de ketenlengte,

Bij isolering van de tussenprodukten door n e e r s l a a n met behulp van water of een keukenzoutoplossing, m a a r zonder v e r d e r e zuiveringen, kon het C-terminale hexadecapeptide van s e c r e t i n e (S 12-27) worden verkregen met een opbrengst van 31%, Dit betekent een gemiddelde opbrengst van 93% (berekend op Z-Val-OH en aannemende dat de deblokkeringsstappen steeds kwantitatief verliepen), Alle t u s s e n p r o dukten gaven een c o r r e c t e aminozuuranalyse, na eenmaal k r i s t a l l i -s e r e n een goede elementanaly-se en waren eenduidig bij dunnelaag-chromatografie, De optische draaiingen en de smeltpunten kwamen goed overeen met de waarden die opgegeven zijn door Bodanszky et al, (55, 56) en door Wunsch et al, (115) (tabel 3,2), De synthese werd op g r o t e r e schaal (10 mmol) herhaald; de resultaten hiervan verschilden niet wezenlijk van die van de proefsynthese.

Tabel 3,2 Vergelijking van de fysische eigenschappen van s e c r e t i n e - s e q u e n t i e s

° Optische draaiing (c 2, HOAc) Smeltpunt (ontl,) Opbrengst (%) Sequentie* REMA Bodanszky Wiinsch REMA (55, 56) (115) REMA (55, 56)

(55, 56) (115) 1 lA* 2 3 3* 4 5 5* 6 6* 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 +22 = +21 » -24 -29,5 -32,5 -26,5 -34,5 -19 = -45,5 -30,5 = -38 - 3 0 ' -43 -35 -37,5 6 -31" -26 -34 -32 -29,5 +27 = +25 » -29 -36 -39,5 -32 -41,5 -23 = -55 -36,5= -45 -35,5' -51,5 -42,5 -46 « -36" -32 -41 -77' -36,5 +22 = -28 -30 -27 -35 -A7 -40 -32' -41 -36 -38 6 -33*' -27 -39 -32-76^ -30 +22 +22 -24 -24 -19 -31 6 = 4» 4 6 8 = 5 = +26, +24, -29, -29, -23 -37, 9 = 2« 7 7 5 = 8 = 205-8 241-3 230-1 185-6 199-200 239-40 260-1 231-3 259-61 252-4 239-40 249-50 266-8 257-9 272-4 ~ 300 ~ 300 ~ 320 ~ 250 ~ 230 206-8 248-53 235-6 186-7 239-41 270-2 264-7 252 250 267-9 255-64 258-64 300 300 305 245 240 212 242 231-239, 233-255 -2 5-40,5 -5 totale opbrengst 90 99 97 98 98 89 91 93 98 87 94 93 89 85 99 93 97 31 77,5 90 86 95 93 100 92 100 99 88 95 75 94 70 98

a Voor symbolen zij verwezen n a a r figuur 3 , 2 en tabel 3 , 5 , '' Alle t e m p e r a t u r e n t u s s e n 20 en 30°, volgens de l i t e r a t u u r .

(mm)

9 10 11 12 13 U 15 16

ketenlengte

Fig, 3,3 Reactietijden van REMA-koppelingen (> 99, 9% omzetting) (1,4-voudige overmaat; cone, 10 ^ m o l / m l ) ,

Een monster van het hexadecapeptide werd na zure hydrolyse o m g e zet met Laminozuuroxidase, Hierbij kon geen significante r a c e m i -satie (< 2%) worden aangetoond,

3,3 VERWIJDERING VAN BESCHERMENDE GROEPEN EN ZUIVERING Van het beschermde hexadecapeptide werd de Boc-groep verwijderd met behulp van trifluorazijnzuur, waarna door hydrogenolyse de z i j ketenbeschermende groepen (NOg, Bzl) werden verwijderd, Na z u i -vering met behulp van ionenwisselingschromatografie kon een hoofd-fractie worden geisoleerd die een c o r r e c t e aminozuursamenstelling had en zich bij dunnelaagchromatografie eenduidig gedroeg,

De experimentele omstandigheden van de hydrogenolyse en de z u i -vering waren gelijk aan die welke in hoofdstuk 4 , 7 t e r sprake zullen komen,

3,4 EXPERIMENTEEL GEDEELTE Algemene gegevens

Smeltpunten werden bepaald met AnschUtz t h e r m o m e t e r s , De m o n -s t e r -s werden verwarmd in een glazen capillair in een koperen blok,

Leeuwen, M, A, Hoefnagel en H,M, A, Buurmans van dit L a b o r a t o -rium,

Aminozuuranalyses werden uitgevoerd door de heren H, A, Billiet en C, Warnaar van het Laboratorium voor Analytische Scheikunde en door de heer A, van Estrik van dit Laboratorium, Monsters w e r d e n gehydrolyseerd in 6 N HCl of in een mengsel van geconcentreerd zoutzuur en ijsazijn 1:1 bij 110° gedurende 24 uur, De a m i n o z u u r s a m e n -stelling werd bepaald met een Locarte (bench model) automatische aminozuuranalysator, Bij bepaling van het peptidegehalte werd n o r -leucine als interne standaard gebruikt,

Optische draaiingen werden gemeten met een P e r k i n - E l m e r P - 1 4 1 foto-elektrische polarimeter in een 1-dm eel,

Optische rotatie d i s p e r s i e krommen werden opgenomen door de h e e r J , C , Steeneveld met een FICA Spectropol I spectropolarimeter.

Proton magnetische resonantie s p e c t r a werden opgenomen met een Varian T-60 of een Varian XL-100 s p e c t r o m e t e r door de heren J . M, van d e r Toorn en I r , A, Smnema,

P a p i e r - e l e c t r o f o r e t i s c h e bepalingen werden uitgevoerd met een Pherograph, Type Mini 65,

Dunnelaagchromatografie werd uitgevoerd op s i l i c a g e l - (Merck F 254) en op celluloseplaten (Schleicher & Schiill) m de volgende s y s t e -men (volumesa-menstelling), A, Chloroform/azijnzuur . 9, 1 B, Chloroform/methanol " 4 : 1 C, Chloroform/methanol/azijnzuur 85-10, 5 D, Chloroform/methanol/17% ammonia - 2: 2 : 1 E, Butanol/pyridme/azijnzuur/water 30:20: 6:24 F , Isopropylalkohol/ethylacetaat/water - ' 4: 3 : 3 G, t-Amylalkohol/isopropylalkohol/water 32:32:36 H, Butanol/azijnzuur/water 4: 1: 1

De vlekken werden zichtbaar gemaakt door belichten met UV-licht (254 nm) of door bespuiten met ninhydrine (0,1%), fluorescamine (detectie 360 nm), het Reindel-Hoppe-reagens na chlorering, het P a u l y - r e a g e n s of het Sakaguchi-reagens (133),

Ammozuurderivaten, behalve die welke in de tabel 33 zijn w e e r -gegeven, werden gekocht van de Protein Research Fomdation, Osaka, Japan; E, Merck A, G,, Darmstadt, West-Duitsland e n F l u k a A . G , Buchs, Zwitserland, De zuiverheid van deze produkten werd n a g e -gaan, Smeltpunten, optische draaiing en DLC gedrag bleken overeen te stemmen met de literatuurgegevens (tabel 3.4),

Synthese volgens de REMA-methode

De synthese van het beschermde C - t e r m i n a t e hexadecapeptide van s e c r e t i n e Boc-Arg(N02)-Leu-Arg(N0 2)-Asp(Bzl)-Ser(Bzl)-Ala-Arg (N02)LeuGlnArg(N0s)LeuLeuGlnGlyLeuValNH2 werd b e reikt door toepassing van de REMAmethode, De koppelingen, w a a r -van de gegevens zijn vermeld in tabel 3, 5 werden uitgevoerd volgens

Tabel 3 , 3 L i t e r a t u u r p r e p a r a t e n Verbinding Z-Arg(N03) Z-Gly-ONp Z-His(Z) Z-His(Z)ONp Smeltpunt 130-2 (132-4) 127-9 (127,5-8,5) ~ 90 (87-90) (103-5) 93-96 (111-112,5) [c^lo -3 (-3,5) +35 (+29,1) (+34) -14 (-15) Opbrengst (%) 50 (60-95) 80 (84) 58 (76) (81) 77 (84) Auteur Gibian et al, (134) Bodanszky (135) Inouye et al, (136) S a k i y a m a e t a l , (137) Inouye (138)

De in de l i t e r a t u u r gevonden waarden zijn tussen haakjes aangegeven. De optische draaiingen werden gemeten bij 2025° in dezelfde o p l o s middelen en nagenoeg dezelfde concentraties als in de l i t e r a t u u r a a n -gegeven.

de hierna volgende Algemene werkwijze, De fysische eigenschappen en de analytische gegevens van de tussenprodukten zijn samengevat in de tabellen 3, 6 en 3, 7,

Algemene werkwijze ,

Een 1,4-voudige overmaat gemengd anhydride werd v e r k r e g e n door 1.4 eq, isobutylchloorcarbonaat toe te voegen aan een oplossing van 1.5 eq, N-beschermd aminozuur en 1,5 eq, N-methylmorfoline (NMM) in tetrahydrofuran (THF) of in dimethylformamide (DMF) bij een t e m p e r a t u u r van 1 5 ° , De activpringstijd bedroeg 2 min. , waarna de a m i -nocomponent (1 eq.) werd toegevoegd, De r e a c t i e werd uitgevoerd bij -15° 1° in een mechanisch geroerd dubbelwandig reactievat, dat met behulp van een c r y o s t a a t op constante t e m p e r a t u u r werd gehou-den, De pH van het reactiemengsel werd steeds op pH 7-8 gehand-haafd,

Tijdens de koppeling werden e r l \il m o n s t e r s genomen en op een s i l i c a -gel plaat gebracht. Na r e a c t i e met fluorescamine werd de intensiteit van de vlakken bij belichting met langgolvig UV-licht (360 nm) vergeleken met de intensiteiten van bekende hoeveelheden aminocomponent. Op deze wijze kon de hoeveelheid aminocomponent die op een bepaald tijdstip in het r e a c -tiemengsel aanwezig was, worden geschat. De koppelingen werden in het algemeen nog 1 uur voortgezet, nadat de hoeveelheid aminocomponent op minderdanO, l%werd geschat. Na een reactietijd van hoogstens 3 uur werd

Tabel 3,4 Handelspreparaten Verbinding Z-Val Z-Leu,DCHA B o c - L e u , H 3 0 Boc-Gly Z-Gln Z-Ala Boc-Ser (Bzl) Boc-Asp(Bzl) Boc-Arg(N02) Boc-Glu(Bzl), DCHA Boc-Thr (Bzl) Boc-Phe Smeltpunt 57-9 (59-61) 152-3 (151,5-2) 72-5 (67-72) 88-9 (88,5-9) 135-7 (139-41) 84-6 (87) 57-9 (56-8) 102-3 (95-7) 120-3 (123-5) 139-41 (138-40) 116-7 (115-6) 84-5 (83,5-5,5) M p 0 (0) - 7 (- 7,86) -25 (-24) - 6,5 (- 5,7) -15 (-13,9) +20 (+19,8) + 8,5 (+ 7,1) - 6,5 (- 5,6) +13,5 (+14,6) +16,5 (+15,8) +26 (+23,85) Auteur Vaughan et al, (139) Klieger et al, (140) Anderson e t a l , (141) Anderson e t a l , (141) Beacham et al, (142) Hunt et al, (143) Hruby et al, (144) Schnabel et al, (145) Schnabel (146) Anderson et al, (147) Mizoguchietal, (148) Wunsch et al, (149) De in de l i t e r a t u u r gevonden fysische eigenschappen zijn tussen haak-jes aangegeven, De optische draaiingen werden gemeten bij 20-25° in dezelfde oplosmiddelen en bij nagenoeg dezelfde concentraties als in de l i t e r a t u u r aangegeven,

de t e m p e r a t u u r op 0° gebracht enwerd een 2 M oplossing van kaliumhydro-geencarbonaat (~ 3 eq,) toegevoegd tot een basische reactie (pH 8) werd verkregen, Het reactiemengsel werd gedurende 30 min, heftig g e