Mikroskopy świetlnewykorzystują widzialne pasmo fal elektromagnetycznychZespół optyczny:•

 Wybrane metody badań

struktury i funkcji komórek

 Materiał do badań biologii komórek

 Organizmy modelowe

Metody „biologii komórki”

•

Współczesne badania mikroskopowe

• Barwienia cytochemiczne

Badania biochemiczne, biofizyczne i molekularne w poznawaniu biologii komórek

• Wizualizacja cząsteczek w żywej komórce

• badania genomu, transkryptomu i proteomu

• krystalografia rentgenowska

struktura przestrzenna białek,

nieinwazyjne obrazowanie wnętrza organizmów żywych

BADANIA MIKROSKOPOWE

gr. mikros = mały; gr. skopein = patrzeć przyrządy do obserwacji pod dużym powiększeniem

przedmiotów blisko umieszczonych

MIKROSKOPY

• świetlne

• elektronowe

• nieoptyczne np. AFM

Mikroskopy świetlne

wykorzystują widzialne pasmo fal elektromagnetycznych Zespół optyczny:

• źródło światła

• przesłona oświetlacz

• kondensor

• obiektyw

• pośrednie układy optyczne

• okular

obraz mikroskopowy:

pozorny, silnie powiększony, odwrócony

Mikroskopy świetlne

Zdolność rozdzielcza mikroskopu λ

d = κ --- 2 A A = n x sin α

A = apertura numeryczna

λ = długość fali światła tworzącego obraz κ = współczynnik zależny od stosunku

A kondensora do A obiektywu α = kąt między osią optyczną a skrajnym

promieniem wpadającym do obiektywu n = współczynnik załamania fali

w środowisku

gdy A = 1,4 i λ = 0,45μm d = 0,2 μm (0,15 μm)

http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/

java/nuaperture/index.html

Kontrastowanie komórek:

• barwienia

• odmiany mikroskopów:

Wizualizacja komórek przejrzystych

kontrastowo-fazowe polaryzacyjno-interferencyjne (np. DIC lub z układem optycznym Nomarskiego)

Mikroskop kontrastowo-fazowy

Fizyk holenderski

Frits Zernike

1953 - nagroda Nobla

bezpośrednie przekształcenie zmian fazowych fali świetlnej w badanym preparacie na zmiany natężenia światła w obrazie mikroskopowym tego preparatu

• przesłona pierścieniowa kondensora

• płytka fazowa w obiektywie

Układ optyczny, który przesuniecie fazy fali świetlnej przekształca w zmianę amplitudy

Mikroskop kontrastowo-fazowy

bezpośrednie przekształcenie zmian fazowych fali świetlnej w badanym preparacie na zmiany natężenia światła w obrazie mikroskopowym tego preparatu

• przesłona pierścieniowa kondensora

• płytka fazowa w obiektywie

Układ optyczny, który przesuniecie fazy fali świetlnej przekształca w zmianę amplitudy

Żywe komórki zwierzęce: zdjęcie spod mikroskopu:

a) jasnego pola, b) kontrastu-faz,

Żywe komórki zwierzęce: zdjęcie spod mikroskopu:

z kontrastem-faz DIC (kontrastu Nomarskiego)

komórki epitelialne

ludzkie erytrocyty

Mikroskop fluorescencyjny

wykorzystuje zjawisko fluorescencji substancji :

•obecnych w komórce:

chlorofil, witamina A, porfiryny, lipofuscyny

• wprowadzonych (znaczniki fluorescencyjne):

fluoresceina, rodamina, oranż akrydyny, DAPI, Hoechst, bromek etydyny, Alexa, Cyto...

Mikroskop fluorescencyjny

oświetlenie epi

Mikroskop fluorescencyjny- zdolność rozpoznawcza

Wrzeciona mitotyczne w metafazie u embriona muszki owocowej Drosophila (DNA wybarwione na zielono;

mikrotubule wrzeciona na czerwono).

Mitoza w komórkach płuc traszkiw hodowli (DNA wybarwione na niebiesko;

mikrotubule wrzeciona na zielono).

http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/virtual/fluorescence/index.html

„uniwersalny mikroskop badawczy”

wykorzystanie różnych odmian mikroskopii świetlnej przy użyciu

1 przyrządu

wizualizacja i analiza procesów biologicznych z wykorzystaniem zautomatyzowanych systemów mikroskopowych (chłodzone kamery CCD);

możliwości poklatkowej rejestracji obrazów;

cyfrowy zapis obrazów i analiza.

Mikroskopy elektronowe

transmisyjny mikroskop elektronowy (TME)

Ruska Ernst fizyk i elektronik niemiecki i wsp.

skonstruowanie mikroskopu elektronowego transmisyjnego (1931) Laureat Nagrody Nobla w 1986 (obok H. Rohrera i G. Binniga) cewki

magnetyczne

TME dla preparatów biologicznych:

d- 2nm, pow. do 1mln razy

cewki magnetyczne

wiązka elektronów

próżnia

Mikroskopy elektronowe

transmisyjny mikroskop elektronowy

Mikroskopy elektronowe skaningowy mikroskop elektronowy

d - SME dla preparatów biologicznych: od 3 do 20 nm

pokryty warstwą metalu

Mikroskopy elektronowe skaningowy mikroskop elektronowy

10µm

Mikrografia szczurzych fibroblastów z hodowli in vitro ( na podłożu plastikowym)

10µm

Mikrografia komórek drożdży piekarskich

Mikroskopy elektronowe

przygotowanie materiału do mikroskopii

2. Osmowanie (utrwalanie wtórne) 3. Odwadnianie

4. Zatapianie

- żywice epoksydowe; żywice akrylowe 5. Krojenie skrawków i nakładanie na siatki

grubość: 20 -60 nm (noże szklane lub diamentowe) 6. Kontrastowanie skrawków

- octan uranylu (białka, kwasy nukleinowe) cytrynian ołowiu (lipidy, wielocukry)

Mikroskopy skaningowe nieoptyczne Mikroskop sił atomowych

do obrazowania powierzchni wykorzystuje się siły oddziaływania międzyatomowego

Mikroskop sił atomowych

 „sonda” przesuwa się nad powierzchnią próbki

 podczas przesuwania ostrza pojawiają się oddziaływania zależne od odległości i rodzaju powierzchni próbki (van der Waalsa, jonowe, chemiczne, hydrodynamiczne itp.)

 detekcja - metodami optycznymi

pomiar ugięcia dźwigni bada się rejestrując zmiany położenia wiązki lasera odbitej od końcówki dźwigni

Mikroskop sił atomowych

Główne udoskonalenia AFM powodujące jego wysoką rozdzielczość:

• wysokorozdzielcze pozycjonowanie próbki- ceramika piezoelektryczna

• sprężyste „dźwigienki”,

• ostre końce sond

rozdzielczość)

Mikroskop sił atomowych

Zalety AFM :

• łatwo osiągalna wysoka rozdzielczość

• niski koszt eksperymentu

• łatwość przygotowania próbki

• możliwe obserwacje in situ ,

• trójwymiarowa informacja w przestrzeni rzeczywistej

Mikroskop sił atomowych

czynnik transkrypcyjny/DNA DNA () komórka glejowa

HBF

(75μm) 252 nm 155 nm

Wizualizacja struktury komórki

• Klasyczne barwienia cytologiczne (histologiczne)

• Metody immunocytochemiczne

oparte na wysokiej swoistości wiązania antygenu z przeciwciałem

Barwienia cytologiczne (histologiczne)

Komórki zbiorczego kanalika moczowego nerki Hematoksylina (jądra)

powinowactwo do struktur

zasadochłonnych, ujemnie naładowanych (DNA, RNA, kwaśne białka)

Eozyna (substancja międzykomórkowa) powinowactwo do cząsteczek kwasochłonnych

Immunocytochemia

• antygen

- każda substancja w komórce, która ma właściwości immunogenne

• przeciwciało

- immunoglobulina skierowana przeciw danemu antygenowi

różnorodność

swoistość przeciwciał Film Ab

Immunocytochemia

Znaczniki:

• fluorochromy

• enzymy

• metale cięzkie

1974 –Elias Lazarides i Klaus Weber –

wyizolowali aktynę z komórek 3T3, uzyskali Ab przeciwko aktynie, wykorzystali do pośredniej immunocytofluorescencji

(filamenty aktynowe w komórkach niemięśniowych)

Immunofluorescencja

anti-b-tubulin; ab-Alexa Fluor 568

3T3 mouse anti-histones and rabbit anti-PMP;

abs- Texas Red and Alexa Fluor 488

http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/gallery/cells/cef/cefsb2.html

UMNSAH/DF-1 Line

Ab40890 ; human breast carcinoma

Immunofluorescencja

http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/gallery/cells/cef/cefsb2.html

Metody wizualizacji cząsteczek w żywej komórce

2008 r. Nagroda Nobla z chemii:

Osamu Shimomura(odkrywca ,1962 ) Martin Chalfie(gen GFP jako gen reporterowy)

Roger Tsien (badacz GFP)

Aequorea victoria

238 aa

GFP (green fluorescent protein) - zielono białko fluoryzujące fluorofor -cykliczny trójpeptyd

ser-tyr-glic

GFP -cząsteczka reporterowa metodami inżynierii genetycznej można tworzyć białka fuzyjne złożone z GFP i badanego białka;

gen reporterowy (wizualizujący)

białka fluorescencyjne

GFP zostało zmodyfikowane na wiele sposobów: przez wprowadzanie przypadkowych mutacji:

EGFP (ang. enhanced green fluorescent protein – białko wzmocnionej zielonej fluorescencji

RFP(red) BFP (blue), CFP (cyan), YFP (yellow)

Genetyczne znakowanie białek

•wprowadzanie genu kodującego GFP do komórki i łączenie z genem kodującym badane białko

(technika rekombinacji DNA)

• śledzenie znakowanych białek w żywych komórkach (białka fuzyjne)

ZAGADKA

MATERIAŁ DO BADAŃ KOMÓREK

 Badania in situ

- na skrawkach

 Izolacja komórek

- izolacja komórek z zawiesiny

- izolacja komórek z fragmentów tkanki (skrawków)

 Hodowle in vitro - hodowla komórek - hodowla tkanek - hodowla organotypowa

Hodowla komórek i tkanek

utrzymanie przy życiu oddzielonych od organizmu komórek (w warunkach sztucznych), in vitro  hodowla

A. Carell ( początek XX w)

• dostarczenie wszystkich składników i odpowiednich warunków niezbędnych do wzrostu i rozwoju

- pożywki: odpowiedni skład, pH, osmolarność - temperatura, %CO_2, %O₂

• zachowanie jałowości

- naczynia hodowlane - antybiotyki

Hodowla komórek

Zdjęcie fibroblastów w hodowli Zdjęcie mioblastów w hodowli

Zdjęcie komórek prekursorowych oligodendrocytów w hodowli

Organizmy modelowe w badaniach

Jedność organizmów

– wiedza z badań jednego organizmu – zrozumienie funkcjonowania innych

Wielu badaczy

– badania różnych aspektów biologii kilku wybranych gatunków – lepsze poznanie funkcjonowania tych organizmów modelowych

Organizmy modelowe w badaniach

Cecha Zalety

małe rozmiary i proste pożywienie

hodowla nie wymaga dużo miejsca, jest łatwa i tania w utrzymaniu duża liczba potomstwa pozwala na wiarygodną analizę

statystyczną wzorów dziedziczenia krótki cykl życiowy umożliwia obserwację wzorów

dziedziczenia w kolejnych pokoleniach mały genom

duże chromosomy

mała ilość DNA do analizy;

łatwiej badać chromosomy w mikroskopie świetlnym

dostępność informacji i technik badawczych

wiele genetycznych mutantów jest dostępnych do analiz

Organizmy modelowe -Bakterie

Escherichia coli (pałaczka okrężnicy)

2mm; 0,8mm

1 kolista cząsteczka DNA 4,6 mln par zasad; 4300 białek od 15 tys. do 30 tys. rybosomów

Poznanie mechanizmów replikacji, transkrypcji i

translacji Gram-ujemna bakteria

flora bakteryjna jelita grubego symbiont

(Enterobacteriaceae)

podział co 20min

(jednokomórkowe)

Poznanie mechanizmów replikacji, transkrypcji, translacji oraz podziału komórki eukariotycznej DNA 12,1 mln par zasad (2,5 x więcej)

6 275 genów (5800 funkcjonalnych) 23% genomu drożdży - jak u ludzi

kompletna sekwencja genomu (1-szy eukariont)

Organizmy modelowe -Eukarionty

Rośliny modelowe

Arabidopis thaliana - rzodkiewnik pospolity

z 300 000 gatunków bliskie pokrewieństwo ewolucyjne roślin kwiatowych (200mln lat)

Genom -110 mln par zasad, znana sekwencja

5-30 cm Łatwość hodowli

w szklarniach;

hydroponiczna

Badania mechanizmów rozwoju i różnicowania roślin kwiatowych

Zwierzęta modelowe

959 komórek

Genom 97 mln par zasad 19 000 genów sekwencja znana

Poznanie mechanizmów rozwoju embrionalnego i działania

wielu genów (apoptozy) 70% białek człowieka ma

odpowiedniki u C. elegans

Drosophila melanogaster - muszka owocowa

Poznanie podstaw genetyki klasycznej i mechanizmów rozwoju zarodkowego i larwalnego genom (4 chromosomy) 185 mln par zasad 13 000 białek Samiec i samica

Kręgowce modelowe Danio rerio – Danio pręgowany (ryby)

Genom

1,527,000,581par zasad 17 330 genów białek sekwencja znana

Poznanie mechanizmów rozwoju embrionalnego i działania

wielu genów kręgowców Szybki rozwój

Łatwość uzyskiwania mutantów

Mus musculus – Mysz domowa (ssaki)

Poznanie mechanizmów działania wielu genów na

poziomie komórki i całego organizmu Prosta i tania hodowla Duża liczba potomstwa

Zarodki myszy można łatwo hodować in vitro Zarodki hodowane in vitro można poddawać licznym manipulacjom np. nokauty genowe Uzyskiwanie myszy transgenicznych (z ekspresją obcego genu)

Linie myszy z mutacjami genowymi lub skonstruowanymi genami

Izolacja i hodowla in vitro komórek ES

Genom: sekwencja poznana mysz ma 2,7 mld par zasad, człowiek ok. 3,1 mld par zasad, mysz ma 20 par chromosomów, człowiek - 23 pary

( defekt w genie kit - komórki barwnikowe)

Ponieważ geny człowieka mają ścisłe odpowiedniki u organizmów prostszych , to badania tych organizmów (modelowych) mogą być kluczem do zrozumienia jak skonstruowane są i jak funkcjonują

organizmy zwierzęce i organizm człowieka.

Homo sapiens – człowiek (ssaki)

Badania na różnorodnych komórkach ludzkich w

hodowlach in vitro