PRACE-ARTYKUŁY-DYSKUSJE
WIADOMOSCI PARAZYTOLOGICZNE T. VII, Nr 3, 1961
MECHANIZMY INWAZJI I WĘDRÓWKI PASOŻYTÓW
W ORGANIZMIE ŻYWICIELA
ZBIGNIEW KOZAR
Katedra Parazytologii i Chorób Inwazyjnych WSR, Wrocław
Na czoło zainteresowań parazytologii coraz wyrazmeJ wysuwają się
problemy inwazjologiczne, będące wyrazem zależności i antagonizmów
występujących między pasożytem a żywicielem. Ich poznanie przy po- mocy współczesnych metod biochemicznych, cytochemicznych, immuno- logicznych i innych przyczynia się nie tylko do zrozumienia skompliko- wanych procesów biologicznych, lecz również do poznania patogenezy chorób inwazyjnych, a co za tym idzie, właściwej terapii i profilaktyki.
Może najbardziej interesującymi zjawiskami są tu same. inwazje paso-
żytów i mechanizmy ich działania. Naturalnie pojęcie inwazji sugeruje prócz wtargnięcia do żywiciela również zdolność pasożyta do przeżycia
i rozmnażania się. Inwazje przenajmniej niektórych pasożytów są zjawi- skami bardzo skomplikowanymi. Wiążą się one z długą wędrówką paso-
żyta poprzez tkanki i narządy żywiciela, zanim zostanie osiągnięte. miej- sce, w którym pasożyt może utrzymać się i rozwinąć do dojrzałości płcio
wej. Mówiąc o inwazji pasożytów nie wolno zapominać o ściśle wiążących się przeciwdziałających czynnikach żywiciela, a więc zmierzających do zahamowania procesów inwazji. Obok zmian zapalnych i innych obser- wuj~ się tu nieraz zadziwiający brak reakcji ze strony żywiciela, prze- nikanie. dużych nawet robaków przez pozornie nie uszkodzone tkanki.
Musimy już na wstępie przyznać, że nasze wiadomości co do inwazyj-
ności pasożytów są dość skąpe w porównaniu z bakteriologią, gdzie poznano liczne mechanizmy działania i zrozumiano różnice w stopniu
inwazyjności poszczególnych bakterii, a nawet szczepów, zależne od
542 Z. KOZAR
- - - - -- - --· -----· - - - obecności toksyn lub enzymów, od występowania ciał unieczynniających
~ny
obronne żywiciela itd. Wydaje się jednak, że sprawy te w parazyto- logii są bardziej skomplikowane i różnorodne, a tym samym godnewiększego niż dotąd zainteresowania.
Celem niniejszego artykułu jest podsumowanie dotychczasowych wy- ników badania inwazyjności niektórych przynajmniej pasożytów w opar- ciu o dostępną literaturę i częściowo własne doświadczenia autora. Po-
minę tu mechaniczne działanie pasożytów, które niekiedy odgrywa dość dużą rolę w inwazji pewnych gatunków. Główną ·natomiast uwagę zwró- cimy na procesy biochemiczne, szczególnie na działanie enzymów, czyli fermentów, które występując we wszystkich żywych komórkach pełnią
niezwykle ważną rolę katalizatorów różnorodnych przemian chemicznych.
Wprawdzie obecność enzymów proteolityczuych stwierdzano też u pew- nych stawonogów pasożytniczych, np. kolagenazę w larwach Hypoderma hov{.c; (Lieniert i Thorsell, 1955), u Lucilia sericata (Hobson, 1931) i Lucilia cuprina (Waterhouse i Irzykiewicz, 195~), to jednak zatrzymamy się tu
głównie na pierwotniakach i robakach, i to niektórych tylko gatunkach,
częściej dotąd badanych.
Spośród pierwotniaków pasożytniczych najwięcej uwagi poświęcano dotąd pełzakowi czerwonki, Entamoeba histolytica. Już sama nazwa ga- tunkowa sugeruje procesy histolityczne. Niezrozumiałe jest właściwie dotąd zachowanie się pierwotniaka w organizmie człowieka. Podczas gdy w jednych przypadkach drąży on do błony śluzowej jelita i do głębiej Lżących warstw, przebija nawet naczynia włosowate i tą drogą prze- nosi się na wątrobę i inne narządy, gdzie również wywołuje poważne
zmiany, w innych zachowuje się jakby komensal bytujący tylko w świe
tle jelita. Wprawdzie opisywane i nieraz znajdowane w preparatach histo- patologicznych skupione wokół pasożytów ogniska lizy są według nie- których autorów (np. Torpy i Maegreith, 1957) tylko artefaktami, to jednak sam proces drążenia do tkanki i inne towarzyszące mu zjawiska silnie przemawiają za obecnością u tego pierwotniaka fermentów proteo- litycznych. Jak trudno je wykrywać, a tym bardziej określać ich istotę działania, świadczą przytoczone niżej doświadczenia.
Stwierdzana u licznych gatunków bakterii kazeaza, enzym proteo- lityczny hydrolizujący kazeinę, był poszukiwany również u E. histolytica.
Pierwsze próby wypadły jednak ujemnie (Nakamura, 1947). Dopiero po
użyciu mniejszego stężenia kazeiny (0,20/o) w testowych płytkach agaro- wych udało się Nakamurze i Edwardsowi (1959) stwierdzić wyraźną reakcję (jasne pola na opalizującym tle) pod wpływem płynów z ho- dowli 2 szczepów E. histolytica. Brak reakcji w płynie z towarzyszącej
flory bakteryjnej przemawia za obecnością enzymu w pierwotniakach, który jest czynny w dość szerokich granicach pH (między 5,0 a 8,0), na-
INWAZYJNOSC PASOŻYTÓW i'i43
wet po ogrzaniu w 55°C przez 5 min., bo dopiero w temperatun:e 65°C przez 5 min. tracił on swe właściwości.
Zarówno Hallman i współpracownicy (1950) i Rees i współpracownicy
(1953), jak i Kaneko (1956) hodowali pełzaki czerwonki w roztworze że
latyny i stwierdzając właściwość rozpuszczania podłoża, dowodzili obec-
n0ści enzymów proteolitycznych. Nieco inną metodą, bo polegającą na urnieszc:rnniu żywych pełzaków na emulsji żelatynowej błon fotograficz- nych, posługiwali się Harinasuta i Maegreith (1958). Badali oni 2 szczepy E. histolytica, jeden z mieszaną florą bakteryjną, drugi z Escherichia coli.
Obydwa prawie całkowicie rozpuszczały żelatynę w ciągu 1 ½ godz., naturalnie tylko przy odpowiednim zagęszczeniu pasożytów (100 OOO w O, 1 ml). Przy mniejszej ilości pasożytów (1250) zjawisko hydrolizy nie występowało. W podobny sposób działały (w ciągu 2 godz.) również wyciągi sporządzone w płynie fizjologicznym z większych ilości pełza
ków (w granicach pH 6-8)., poddawanych zamrożeniu i odtajaniu. Ani wwiesina z towarzyszącej flory bakteryjnej, ani sama pożywka, w której w ciągu 2 godz. przebywały pełzaki, nie rozpuszczały żelatyny.
Rola towarzyszącej pełzakom flory bakteryjnej w zachodzących pro- cesach enzymatycznych nie jest jeszcze całkowicie wyjaśniona. Podkreślał
to m. in. Neal (1960), posługując się w swych badaniach krążkami żela
tynowymi, zawierającymi węgiel (wg Kohna, 1953). Ponieważ jednak wy- ciagi sporządzane z samych bakterii nie hydrolizują ani kazeiny, arii
żelatyny, można przypisywać obserwowane właściwości enzymatyczne ra- czej pierwotniakowi.
Jeszcze inną metodą badania niż wymienieni dotąd autorzy posłu
giwał się Neal (1956, 1960). Sporządzał on z hodowli E. histolytica jałowe
lub prawie jałowe wyciągi, z małą tylko domieszką osadu i martwych hakterii. Ogrzewał je następnie (w 37°C) z roztworem kazeiny i odpowied- nim buforem, a po pewnym czasie zatrzymywał reakcję przez dodanie kvrnrn trójchlorooctowego. Hydrolizę kazeiny określano odczynnikiem Folina-Ciocalteau, a stopień jej intensywności odczytywano w spektro- fotometrze. Metoda ta pozwala na jakościowe i ilościowe oznaczenie. ak-
tywności enzymatycznej.
W 2 z 5 badanych inwazyjnych i świeżo wyosobnionych szczepach E. histolytica oraz w 1 szczepie dwukrotnie pasażowanym przez zwierzęta
stwierdzono silne działanie proteolityczne. W pozostałych szczepach było
ono znacznie słabsze. Rozpuszczeniu ulegały zarówno kazeina, jak i żela
tyna, najlepiej w 37°C, przy pH 7,5 do 7,9. Reakcja odbywała się nawet ,_.,, szerszych granicach pH (między 5,8 a 8,5). Zarówno wrażliwość na odpowiednie stężenie jonów wodorowych, jak i cie.płochwiejność oraz
obniżanie się aktywności wraz z rozcieńczaniem pasożyta świadczą, że działanie wyciągów z E. histolytica zależy od obecności enzymów. Wpły-
544 Z. KOZAR
- - - --- - - ----- --~ ~ - - -·- - · --- -- -· -
wają one zarówno na kazeinę, jak i żelatynę, ale nie mają tej właściwości
in vitro w stosunku do hemoglobiny. Jest to częściowo niezro2umiałe,
bo - jak wiemy - pełzaki chętnie odżywiają się czerwonymi krwin- kami, a więc trawią je. Ponieważ aktywność enzymatyczna nie była sil- niejsza pod wpływem cysteiny ani słabsza pod wpływem octanu jodowego, wydaje się, że grupy sulfhydrylowe nie są potrzebne. do jej u~zynnienia.
Naturalnie problem enzymów proteolitycznych u E. histolytica jest znacznie bardziej skomplikowany. Niejasny jest np. czynnik hamujący,
stwierdzany w wyciągach pewnych szczepów, który działa dopiero po l godz. ogrzewania. Nie. znamy też bliżej inhibitorów zawartych w su- rowicy ludzi i różnych zwierząt, czynnych nawet po ogrzewaniu w 56°C przez 30 min. Ich poziom nie zależy od wrażliwości zwierząt na inwazję
E. hi.stolytica. Pewne inhibitory znajdują się również w jaju kurzym, ra- czej w żółtku niż w białku. Prawdopodobnie inhibitory z surowicy, może
podobne do inhibitora trypsyny, są białkiem. Natomiast inhibitor z jaja jest raczej ciałem o mniejszej strukturze molekularnej. Widzimy więc, że rodzaj użytej pożywki z dodatkiem jaja kurzego lub surowicy wpływa
do pewnego stopnia na proteolityczną aktywność pierwotniaków, a może również i na inwazyjność szczepów.
Wspomniane wyżej wyniki doświadczeń Harinasuty i Maegreitha mogą sugerować, że enzymy wydzielają się z żywych pasożytów do podłoża.
,,1ak wynika jednak z pracy Neala, proteinaza E. histolytica jest fermen- tem endogennym i dostaje się do środowiska tylko po śmierci pasożyta.
Neal zaobserwował w 2 szczepach E. histolytica wzrost wirulencji po
pasażach przez wątrobę chomików i równocześnie zwiększenie. wskaźnika
proteolitycznego. Wynik trzeciego doświadcz~nia nie potwierdzał tego.
W świeżo wyosobnionych szczepach od osób z ostrą postacią czerwonki wykrywano różnego stopnia aktywność enzymatyczną. Prawdopodobnie wysoka aktywność proteolityczna tylko towarzyszy jakimś innym czyn- nikom nie.zbędnym i odpowiedzialnym za inwazyjność pasożyta.
Wprawdzie przytoczone badania świadczą o aktywności enzymatycznej C. histolytica. i to nawet aktywności proteolitycznej, nie tłumaczą jednak jeszcze, jak widzimy, inwazyjności pasożyta i jego pełnego wpływu na tkanki żywiciela. Możemy sądzić, że pierwotniaki te zawierają peptydazę
i proteinazę, odpowiednik zaś tyrozyny jest dopiero końcowym wynikiem
łańcucha reakcji rozpoczętej przez proteinazę. Poszukiwania niektórych innych enzymów u E. histolytica, jak np. lecytynazy i kolagenazy, wy-
padły dotąd ujemnie. (Nakamura i Klein, 1957; Neal, 1960).
Większą nadzieję pokładano w wykryciu enzymu hialuronidazy,
określanego jako czynnik rozprzestrzeniania się (,,spreading factor") i stwierdzanego już często w licznych tkankach ssaków, w jadzie wę
żów i pszczół. w ślinie pijawek, w wielu bakteriach chorobotwórczych
INWAZYJNOSC PASOZYTOW 545
itd. Hialuronidaza ułatwia, jak wiemy, dostanie się plemników do jaja, szerzenie się infekcji bakteryjnej, wchłanianie leków przez organizm i wiele innych procesów. Jest ona fermentem katalizującym rozkład kwa- su hialuronowego na acetyloglukozaminę i kwas glukoronowy. Kwas hialuronowy natomiast, wielkocząsteczkowy polimer, jest podstawowym
składnikiem kolagenu, a więc bezkomórkowej substancji zespalającej tkankę łączną, uszczelniającej przestrzenie międzykomórkowe, a tym sa- mym utrudniającej wędrówkę płynów. Hialuronidaza może więc torować dr()gĘ i ułatwiać rozprzestrzenianie się bakterii, prawdopodobnie również i. pasożytów.
Niestety, dotychczasowe wyniki stwierdzania hialuronidazy u E. histo- lytica są sprzeczne. Wymienimy tu 3 prace z wynikiem dodatnim i 3 dal-
~ze z ujemnym. Do pierwszych należą doświadczenia Bradina (1953), który posługując się metodą turbidymetryczną usiłował wykryć aktyw-
ność hialuronidazy w 5 szczepach E. histolytica, hodowanych z mieszaną, meokreśloną bliżej florą bakteryjną. Ponieważ już na wstępie okazało się,
ze same bakterie są zdolne do wytworzenia enzymu, autor posługiwał się
dalej podłożem Schaffera, które w znacznym stopniu hamowało rozwój flory. We wszystkich 5 szczepach ogrzewanych z substratem przez 48 godz.
ani. też w próbach kontrolnych nie stwierdzono hialuronidazy. Wystąpiła
ona dopiero po przepasażowaniu 4 szczepów przez wątroby chomików i jej
wpływ był tym silniejszy, im większe było zagęszczenie pierwotniaków.
Następną pracę, również z dodatnim wynikiem, podali Jarumilinta i Maegreith (1960). Autorzy przyznają we wstępie, że przed kilku laty niP mogli wykryć działania hialuronidazy w szczepach E. histolytica, Etrzymywanych na podłożu L.E.S. Dopi~ro ostatnio, powtarzając swe do-
świadczenia z 3 szczepami od osób chorych na amebozę, udało się im z łatwością stwierdzić enzym hialuronidazę, i to zarówno w przepłukanych
z kultury trofozoitach, jak też w zamrażanych i odtajanych wyciągach
:~ pierwotniaków. Posługiwano się metodami turbidymetryczną i obniżania lepkości wg McCleana i Hale (1941). Wszystkie badane szczepy były chorobotwórcze, co stwierdzono po wprowadzeniu pierwotniaków do je- lita ślepego świnek morskich. Nie badano jednak zależności między ak-
tywnością enzymatyczną szczepów a ich chorobotwórczością.
O jeszcze innym dodatnim doświadczeniu, jeśli chodzi o hialuronidazę
u E. histolytica, doniósł Lincicome (1953). Opisuje on właściwie metodę
badania aktywności enzymu, polegającą na dekapsalacji paciorkowców hemolitycznych grupy A. Ze względu na łatwość wykonania i minimalną ilość wymaganego materiału autor zaleca metodę do badań parazyto- lc,gicznych. Tylko marginesowo wspomina, że wykrywał hialuronidazę
7:;irówno u E. histolytica, jak i u Ancylostoma caninum; zapowiedziana
dokładniejsza praca na ten temat nie ukazała się dotąd.
546 Z. KOZAR
- - -- - - - - - - - - - -- - - -- - - -·-- -·----··--· ····· - -- -
Brak hialuronidazy u E. histolytica. stwierdzili Townshend (1949), De Lamater i współpre.cownicy (1954) oraz Neal (1960). Ostatni z wy-
mier,ionych poświęcił tej sprawie stosunkowo mało uwagi, zajmując
si.ę raczej wykrywaniem innych enzymów, o których była wyże.j mowa.
Wspomina on tylko, że wyciągi z inwazyjnego szczepu MHIV ogrzewał
w obecności substratu i stwierdzał pewien jego ubytek. Ponieważ depo- limeryzacja substratu nie była silniejsza, aniżeli przy badaniu samych bakterii z podłoża, autor doszedł do wniosku, że same pełzaki nie wy-
twarzają hialuronidazy.
Znacznie dokładniej badali to zagadnienie De Lamater i współpracow
nicy. Nie stwierdzili oni również aktywności enzymatycznej ani w pod-
łożu, ani w samych pasożytach hodowanych w warunkach tlenowych i beztlenowych, ani nawet w szczepach świeżo wyosobnionych z owrzo- dze11 wątroby zarażonych chomików.
Trudno w tej sytuacji o właściwą ocenę sprzecznych ze sobą wyników.
Dopóki spór nie zostanie rozstrzygnięty, możemy snuć tylko teoretyczne
1 ozważania i wypowiadać co najwyżej ogólne uwagi. Wprawdzie sam ,,,. nielicznych, co prawda, próbach nie zdołałem dotąd wykryć metodą
Me Cleana (1943) hialuronidazy w laboratoryjnych szczepach E. histoly- tica i E. moshkovskii, nie jestem bynajmniej przekonany, że przynajmniej E. histolytica nie wytwarza wcale enzymu w różnych warunkach swego bytowania. Muszę tu jednak podkreślić duże trudności techniczne i nie-
doskonałość stosowanych metod, co może mnie. jako niespecjalistę bio-:
chemika szczególnie uderzyło. Bardzo ważnym elementem próby jest substrat, czyli kwas hialuronowy, produkowany w poszczególnych la- boratoriach przeważnie ze świeżych zbieranych do acetonu pępowin
ludzkich. Końcowy produkt dość licznych zabiegów na pewno różni się w poszczególnych pracowniach i może być mniej lub więcej oczysz- czony. Określenie hialuronidazy wydaje mi się dość szerokim pojęciem,
nie sprecyzowanym jeszcze biochemicznie. Wchodzą tu może w grę róż
ne zbliżone do siebie enzymy, które z kolei działają na różne składniki
substratu. Nie jest też wykluczone, że hialuronidaza produkowana przez bakterie posiada nieco odmienne cechy aniżeli hialuronidaza wytwarzana przez pasożyty.
Poszczególne próby wykrywania hialuronidazy są w różnym stopniu c„ule. Nawet minimalne odchylenia mogą decydująco wpływać na wynik.
N'..e bez znaczenia jest ilość pierwotniaków w badanej je.dnostce objętoś
ciowej i czas działania ewentualnego enzymu na substrat. Warunki te były różne w poszczególnych pracach. De Lamater i współpracownicy poszu- kiwali hialuronidazy w wyciągach pierwotniaków przefiltrowanych nprzE.dnio przez sączek Seitza. Szczegół ten podkreślili J arumilinta i Mae- greith, stwierdzając, że swych dodatnich wyników nie mogli potwierdzić
INWAZYJNOSC PASOŻYTÓW 547
--- -~------ - - -- - - - -- -- -- - -- - -- - -
po prze:o.ączeniu wyciągów przez filtr Seitza. Może właśnie to zadecydo-
'Nało o tak krańcowo różnych wynikach.
Dotychczasowe badania sugerują, że aktywność enzymatyczna pier- wotniaków może do pewnego stopnia zależeć od rodzaju badanego szczepu i warunków jego hodowli. Kto wie, czy nie prowadzi to do wyjaśnienia różnic w chorobotwórczości poszczególnych szczepów, choć :tjawiska obserwowane in vivo są na pewno znacznie więcej skomplikowane w po- równaniu z bardzo uproszczonymi i chyba dość prymitywnymi próbami, jakie prowadzimy in vitro.
Wiadomo, że szereg ciał działa hamująco na czynność enzymu. Należą
tu m. in. surowice.. Może właśnie dodatek zarodkowego kurzeg0 płynu
embrionalnego do podłoża, którym posługiwał się Bradin (1953), był przy-
c7:vną jego pierwszych niepowodzeń. Wydaje się również, że świeżo wy- osobnione lub przepasażowane przez organizm wrażliwego żywiciela szcze- py mają nieco inne właściwości enzymatyczne aniżeli stare szczepy labo- ratoryjne, utrzymywane w licznych pasażach na podłożach sztucznych, do których adaptują się z czasem, a jak wiemy z doświadczenia, nie za- wsze łatwo i szybko.
Niemniej ważną sprawą wydaje się towarzysząca pełzakom czerwonki flora bakteryjna. Wspominają o niej wszyscy autorzy prac i jedni do-
strzegają w niej wpływy enzymatyczne, drudzy nie. Jest to przeważnie
mies;,:anina nieokreślonej bliżej flory, a tylko czasem pojedynczy gatunek bakterii. Mimo że często wyciągi z samych bakterii nie wykazują działal
ności enzymatycznej, to jednak nie możemy wykluczyć ich wpływu 1 współdziałania łącznie z pierwotniakami. Właśnie autorzy prac z ujem- nvm wynikiem starali się jak najdokładniej pozbyć flory bakteryjnej lub
używali szczepów pierwotniaka z jednym tylko gatunkiem bakterii.
Pr7ychodzą tu na myśl znane doświadczenia nad chorobotwórczością E.
iiistol,ytica u tzw. zwierząt sterylnych. Wiemy, ze tylko w obecności pew- nych bakterii pierwotniaki zdolne są do drążenia w błonę śluzową jelita i wywoływania procesów chorobowych. Może i aktywność enzymatyczna
pełzaków hodowanych in vitro zależy od jakichś czynników znajdujących się w bakteriach, bez których procesy katalizy są niemożliwe. Trudno też przyjąć, aby obecność tylko hialuronidazy tłumaczyła już w pełni prze- bijanie się pierwotniaków przez błonę śluzową jelita. Jej (ewentualna)
obecność może się przejawiać raczej w mezenchymatycznej tkance pod-
ślnzówkowej, samo zaś przebijanie nabłonka w jelicie związane jest może
bardziej z obecnością innych enzymów proteolitycznych, o których była już wyżej mowa.
Dość szczegółowo omówiony przykład E. histolytica świadczy o olbrzy- mich trudnościach, na jakie napotykamy jeszcze w zrozumieniu mecha- nizmu inwazji. Znajdujemy się dopiero na początkowym etapie badań
548 Z. KOZAR
- ------ -- ---. - --
może nawet na właściwym tropie, który dopiero w przyszłości doprowa- dzi nas do rozwikłania tak ważnych problemów biologicznych.
Nasze wiadomości o właściwościach enzymatycznych innych pierwot- niaków pasożytniczych są jeszcze uboższe. Tempelis i Lysenku (1957) stwierdzili wyraźne działanie hialuronidazy w szczepach Balantidi-um coli,
świeżo wyosobnionych z jelita ślepego świń. Posługiwali się oni zarówno
met0dą dekapsulacji paciorkowców, jak i metodą MCP (,,mucin clot pre- vention") opisaną przez Me Cleana i współpracowników (1934).
Sprawą tą zajęliśmy się nieco bliżej przed 2 laty. Posługiwaliśmy się
metodami turbidymetryczną oraz opisaną przez Me Cleana (1943), która wydała nam się bardziej czuła od pierwszej, jakkolwiek nie po-
zwalała na dokładne ilościowe określanie. Pierwsze próby wykonywano z laboratoryjnym szczepem B. coli utrzymywanym od wielu lat na pod-
łożu Pawłowej. Dość liczne pierwotniaki, pochodzące z 48 godz. hodowli,
zagęr.zczone. w 1 ml, ogrzewano (37°C) przez dalsze 24 godz. z 1 ml roz- tworu substratu (kwasu hialuronowego, produkowanego z pępowin ludz- kich). Podobnie postępowano z towarzyszącą florą bakteryjną oraz z sa- mym podłożem. Określany fotokolorymetrem Pulfricha stopień ekstynk- cji wyraźnie obniżał się w obecności pierwotniaków, co świadczyło o re- dukcji substratu, czyli obecności enzymu hialuronidazy. W dość licznych dalszych próbach ustalono wyraźny wzrost aktywności hialuronidazy wraz ze zwiększaniem się ilości pasożytów. Te ostatnie. dokładnie liczono pod binokularem, przenosząc je pipetą pasteurowską do innego naczynia.
Podczas gdy 100 pierwotniaków w objętości 0,1 ml, ogrzewanych przez 2 godz. z 1 ml 0,20/o roztworu kwasu hialuronowego nie wywoływało
jeszcze zmian w porównaniu z kontrolami, to już dawka 400, :t tym bar- dziej 800 pierwotniaków w tych samych objętościach powodowała wy-
raźną depolimeryzację substratu. Nie bez znaczenia był również czas dzia-
łania; 2 godz. ogrzewania dawało znacznie wyraźniejszy wynik niż 1 godz.
me
udało nam się jednak ustalić, czy enzym wydziela się do środowiska za życia pasożytów, czy też znajduje się tylko w nich samych. Kon- trolne badania pod miskrokopem wszystkich wykonanych prób wykazy-
wały mniejsze lub większe ilości martwych pasożytów. Mimo bardzo ostroznego postępowania B. coli okazał\) się wrażliwe na zabiegi, nawet ns. prze.noszenie pipetą pasteurowską ze szkiełka zegarkowego do pro- bówki w celu policzenia. świeżo wyosobnione ze świń szczepy B. coli nie
wykazywały w naszych doświadczeniach silniejszych właściwośd enzy- matycznych aniżeli wspomniany szczep laboratoryjny.
Prowadziliśmy również wstępne próby wykrywania hialuronidazy w Trichcmonas vaginalis (szczep laboratoryjny utrzymywany na podłożu Pawłowej) i w To:x:oplasma gondii (szczep RH). Wyniki były ujemne. Na szczególne trudności napotkaliśmy w badaniu toksoplazm, bo wysięki
INWAZYJNOSC PASOŻYTÓW 549
zarażonych myszy nie nadawały się do oznaczeń metodą Kassa i Seastone i już same wytwarzały silne strąty. Próbowaliśmy więc otrzymywać względnie oczyszczone z wysięku toksoplazmy i przechowywać je w ply-
r> ie odżywczym dla hodowli tkanek. Dopiero wtedy oznaczano ich aktyw-
ność enzymatyczną. Naturalnie próby te nie upoważniają nas jeszcze do wykluczenia obecności hialuronidazy-w badanych pasożytach. Może w in- nych niż nasze warunkach ich aktywność zostanie kiedyś wykazana.
Problem inwazyjności larw robaków jest może jeszcze bardziej skom- plikowany niż pierwotniaków. Mimo dużych wymiarów pasożytów wy-
stępują poważne trudności w badaniu mechanizmu inwazji. Nic ulega
wątpliwości, że ruch pasożyta lub nawet specjalne narządy przebijające ułatwiają wielu gatunkom pokonywanie przeszkód podczas wędrówki.
Tym niemniej również i w tych wypadkach współdziałają zapewne czyn- niki chemiczne. Istnieją też pewne gatunki robaków pasożytniczych, np.
z rodzajów Schistosoma, Strongyloides i Ancylostoma, które mimo sła
bego przystosowania do działalności mechanicznej z zadziwiającą łat
wcścią przenikają przez nieuszkodzony naskórek i w ciągu kilka minut
mogą dostać się do skóry właściwej oraz głębiej leżących tkanek żywi
ciela. Od lat kojarzono te zdolności pasożytów z obecnością gruczołów
wydzielniczych; mówiono o ich proteolitycznym działaniu, jakkolwiek nie było na to konkretnych dowodów chemicznych.
Pierwszym i może najczęstszym dotąd obiektem badań spośród roba- ków były cerkarie przywr, odznaczające się niekiedy dużą aktywnością
w przebijaniu skóry żywiciela i w dalszej wędrówce przez tkanki. Do-
kładne obserwacje nad penetracją wywołujących dermatitis cerkarii Di- plostomum flexicaudatum (Strigeidae) opisał Davis (1936). Normalnie prze-
bijają się one do Catastomus commersonii, u którego w soczewce oka
przekształcają się w stadium diplostomulum. Autor śledził jednak media- nizm ich przebijania się do żywicieli nienormalnych, do żab i kijanek.
Zarówno w tej pracy, jak i w wcześniej ogłoszonym komunikacie wy- kazano obecność w cerkariach substancji zdolnych do trawienia tkanek
żywiciela. W wyciągach z większej ilości oczyszczonych cerkarii umiesz- czano drobne (2-3 mm) skrawki mięśni, skóry lub ogona kijanek żab. Po
~{ godz. badane tkanki stawały się bardziej przejrzyste, lekko obrzękłe
i miały postrzępione brzegi. Włókienka mięśni były skurczone i łatwo oddzielały się. Wykrywano też kariolizę i karioreksję, szczególnie na brze- gach tkanki. Opisane zjawiska występowały nawet po uprzednim podgrza- niu wyciągu cerkarii w 60-80°C przez pól godziny.
Podobne doświadczenie opisali w rok później Hunter i Hunter (1937).
Umies,;czali oni fragmenty płetw różnych gatunków ryb w wyciągach
z cerkarii Cryptocotyle lingua i po 3-5½ godz. obserwowali kariolizę lub inne zmiany świadczące o aktywności enzymów histolitycznych. Godny
550 Z. KOZAR
p0dkreślEnia jest tu szczegół, że płetwy poszczególnych ryb różniły się
w swej wrażliwości na działanie wyciągów z cerkarii.
Następne podobne badania pochodzą już z ostatnich lat i uwzględniają
metody cytoc_hemiczne oraz biochemiczne. Podczas przechodzenia przez
nieuszkodzoną skórę larwy robaków muszą najpierw przebić warstwę ro-
gpwą naskórka, później kilka warstw komórkowych, bezkomórkową ba-
rierę błony podstawowej, wreszcie war:,twy skóry właściwej. Zajmijmy
się na początku aktywnością larw skierowaną może bardziej przeciw war- stwom bezkomórkowym i substancjom cementowym komórek. Cytoliza :nie jest bowiem jakimś częstym bezpośrednim wyrazem inwazJi (Gordon i Griffiths 195i). Zwykle ulegają lizie tylko 1 lub 2 komórki w bezpośred
nim sąsiedztwie larwy, w obrębie zaś kilku komórek obserwuje się roz- lufoienie i przemieszczenia. Głównym składnikiem przestrzeni międzyko
mórkowych jest białko związane z wielocukrem, które będziemy tu dalej
nazywać, podobnie jak Lewert (1958), glukoproteidem. Na podobną ba-
rierę glukoproteidową napotykają pasożyty niemal w całej wędrówce
przez żywiciela, czy to przebijając się przez nabłonki, czy też dostając się do naczyń krwionośnych itd.
Stosowane w badaniach cytochemicznych metody Hotchkissa oraz bar- wienia wg Evansa wykazują stopień polimeryzacji lub nagromadzenia glnkoproteidów w substancjach bezkomórkowych. Można więc wykryć
zmiany zachodzące w gęstości elementów glukoproteidowych występujące
czy to z wiekiem, czy z dojrzewaniem lub podczas procesów chorobowych.
Substancja glukoproteidowa ulega wtedy depolimeryzacji, pojawia się więcej składników rozpuszczalnych w wodzie. Podobne zjawiska można też wywclać enzymem kolagenazą.
Tego rodzaju zmiany w błonie podstawowej i tkance podstawowej stwierdzali Lewert i Lee (1954) podczas przebijania skóry przez cerkarie Schistosoma mansoni i Sch. douthitti oraz larwy Strongyloides ratti. Frag- menty tkanki ulegały rozmiękczeniu lub depolimeryzacji. Przed wtargnię
ciem cerkarii do skóry błony podstawowe zanikają, substancja ~aś pod- stawowa koło cerkarii była blada. W miejscu penetracji wiązał się błę
kit Evansa. Podobne, choć mniej intensywne, zmiany w substancji glu- koproteidowej zauważono kolo przesuwających się przez tkankę jaj Schistosoma oraz w miejscu penetracji miracidiów Schistosoma do śli
maka. Również Silverman i Maneely (1955) zauważyli wpływ larw Taenia saginata na międzykomórkową glukoproteidową część tkanki. Lewert i Lee (1955) opisali podobną aktywność u l;:.rw Taenia taeniaeformis w pierwszych dniach ich rozwoju w wątrobie szczura, a więc w okresie
cechującym się szybkim wzrostem pasożyta i przemieszczeniem komórek
wątroby. Rozwijający się strobilocercus powodował rozmiękczenie błon
podstawowych oraz sąsiadującej tkanki międzykomórkowej. Podczas wę-
INWAZYJNOSC PASOŻYTÓW 551
drówki pasożytów spostrzegano też zmienioną srebrochłonność włókien
retikularnych i kolagenowych, w skórze zaś obniżenie poziomu grup sulfhydrylowych związanych z białkiem.
Wiadomo skądinąd, że podstawowym składnikiem czynnych podczas iriwazji gruczołów wydzielniczych takich pasożytów, jak Schistosoma lub tasiemców są ciała wielocukrowo-białkowe. Mają one przed wydziele- niem się wygląd ziarnisty, po wydzieleniu zaś układają się w smugi i pa- semka na powierzchni naskórka żywiciela lub mogą być wleczone przez
przebijające się larwy. Wypowiadano różne koncepcje co do ich składu
i znaczenia. Lewert i Lee (1954) oraz Silverman i Maneely (1955) uważali
wydzieliny gruczołów za enzymatyczne kompleksy wielocukrowe. Sądzono, zp dzięki lepkości ułatwiają one lokalizację aktywności enzymu. Kruide- nier (1953) oraz Kruidenier i Stirewalt (1954) utrzymywali, że te śluzowe
substancje chronią pasożyty przed czynnikami obrony żywiciela. Stwier- dzano je na zewnętrznej powierzchni żywych jaj Schistosoma (Katz i Car- rera, 1957) oraz w gruczołach penetracyjnych miracidiów.
Niezależnie od przedstawionych koncepcji godna podkreślenia jest
(1becność wielocukrów w wydzielinie pasożytów. Wiemy, że otoczki wie- locukrowe chronią bakterie przed fagocytozą i jednocześnie sprzyjają ich
inwazyjności. Pewne gatunki bakterii stają się niechorobotwórcze po po- zbawieniu otoczek. Analogiczną może rolę odgrywają te ciała u pasożytów.
Wspomniane tu badania cytochemiczne rzucają tylko pewne światło
na rolę gruczołów wydzielniczych robaków. Bliższych danych dostarczają
badania biochemiczne przeprowadzone przez Lewerta i Lee w 1956 r.
Stwierdzili oni w S. mansoni i S. ratti, zarówno w wydzielinie żywych
lc1rw, jak i w wyciągach homogenizowanych pasożytów, ferment kolage-
nazę. Kolagenaza jest podstawowym enzymem pewnych toksyn bakteryj- nych szczególnie Clostridium welchii szczepu A. Stwierdzona u robaków
aktywność enzymatyczna była wprost proporcjonalna do liczby badanych pasoi-.ytów lub suchej masy pasożytów, z których sporządzano badane
wyciągi. Stawała się ona coraz wyraźniejsza przy ogrzewaniu w 37°C;
dopiero temperatura 60°C hamowała proces. Stwierdzono, że enzymy
·cerkarii S. mansoni posiadają wyraźne optimum działania przy pH 7,5, z S. ratti natomiast w pobliżu pH 7,0. Kolagenaza z toksyny Cl. welchii jPst - jak wiadomo - czynną w dość szerokich granicach pH. Dalsze róż
mee występują też w stopniu wrażliwości na jony różnych metali, chociaż
wszystkie badane enzymy były hamowane. przez rtęć i miedź; lekko zaś
~ktywowane w obecności wapnia i magnezu. Czynniki wiążące grupy sulf- hydrolowe hamowały aktywność enzymu z S. mansoni, a tylko nieznacznie
działały na podobny enzym z S. ratii. Z tych i innych jeszcze wykona- rych testów wynika, że enzymy wytwarzane przez S. mansoni i S. ratti
różni,1 się nie tylko w porównaniu z kolagenazą bakteryjną i trypsyną,
552 Z. KOZAR
~-- - · -- -- - ~ -- --~ - -- -- ·- - -- - -- - - ··- ·- -- - ~-·-•-- -
ale również między sobą. Trudno je nazwać kolagenazą, jakkolwiek po-
siadają wiele cech tego enzymu. Wykrywano je tylko u tych robaków
pasożytniczych, u których wykazano metodami cytochemicznymi wpływ
na glukoproteidy żywiciela. Nie znajdowano więc rzekomej kolagenazy ani u Nippostrongylus muris lub Trichinella spirali.s, ani w wyciągach
z ksifidiocerkarii lub cerkarii Strigeata. Jedynie słabą działalność enzy-
matyczną tego typu opisano w wyciągach z filariopodobnych larvv Ancy- lost,oma caninum.
Wydaje się, że aktywność enzymatyczna robaków pasożytniczych zmie- nia się wraz z rozwojem pasożytów. Wprawdzie wyciągi z dojrzałych
przywr Schistosoma posiadają jakąś aktywność enzymatyczną, to jednak nie hamują jej wpływu te same substancje, które działają na enzymy z cerkarii. Możliwe jest natomiast, że enzymy zapłodnionych jaj i mira- cidiów Sc-histosoma przypominają w większym stopniu enzymy, którymi
posługują się cerkarie podczas przebijania się do żywiciela. Podobnie u Taenia taeniaeformis aktywność rzekomej kolagenazy ogranicza się
tylko do wczesnych stadiów strobilocercus i nie dostrzega się jej już
w starszych formach rozwojowych ani w dojrzałych tasiemcach.
Naturalnie kolagenaza czy też enzym zbliżony do kolagenazy, o któ- rym była mowa, nie może jeszcze, wyjaśnić pełnego mechanizmu pene- tracji i wędrówki pasożytów. Biorą tu jerzcze udział inne enzymy, o któ- rych istnieniu nie wiemy zbyt wiele. Thorson (1953) opisywał w wydzie- lim:ch i wyciągach z larw inwazyjnych Nipµostrongylus muris enzym
lipazę. Przypisywał mu dość ważną rolę w procesie inwazji. Nieco ostroż
niej interpretują znaczenie tego fermentu Lewert i· Mandlowitz (wg Le- wert, 1958), choć stwierdzali go w wyciągach nie tylko N. mnris, ale
również larw S. ratii. oraz cerkarii S. mansoni. Lipaza działała tu na trój-
palmitynę.
Podobnie jak przy pierwotniakach, tak i przy robakach wielu auto- rów poszukiwało mukopolisacharydazy, znanej lepiej pod nazwą hialu- ronidazy. Można by tu wyliczyć przynajmniej 12 prac, z których prze-
ważnjąca większość potwierdza obecność enzymu. U cerkarii Schistosoma mansoni pierwsi Lewine i współpracownicy (1948) wykryli hialuronidażę,
chc,f nie dostrzegali jeszcze zależności jej działania od liczby pasożytów.
Zawiesinę z cerkarii trzymano przez 18 godz. z substratem (sól sodowa kwc:.rn hialuronowego) w temp. 25°C, po czym określano specjalnym wi- skmymetrem stopień redukcji lepkości.
Kuntz (1953) doszedł do podobnych i nawet bardziej prawidłowych
wyników, posługując się metodą śródskórnego wstrzykiwania królikom zawiesin cerkarii z błękitem metylenowym Evansa. Podobnie zresztą
badali czynnik rozprzestrzeniania się Lewert i Lee (1954). Wykrywali go u larw S. mansoni, S. ratti, S. simiae, A. caninum i N. muris, ale nawet
INWAZYJNOśC PASOŻYTÓW 553
i w wyciągach nieinwazyjnych robaków Rhabditis pellio. Dopatrują się
oni pewnych różnic w obserwowanych w skórze zjawiskach w porów- naniu z czystą hialuronidazą. Stirewalt i Evans (1952), a następnie Evans (1953) posługiwali się metodą dekapsulacji paciorkowców. Również i ci autorzy dostrzegali nieco odmienne działanie wyciągów z S. mansoni vv porównaniu z hialuronidazą pochodzącą z jąder bydlęcych. Reakcja
występowała przy najniższym stężeniu 10 OOO cerkarii w 1 ml, ale ule-
gała zahamowaniu przy stężeniu 85 OOO cerkarii w 1 ml lub wyższym.
W badaniach Lee i Lewerta (1957) wyciągi z S. mansoni działały na otocz- ki paciorkowców silniej aniżeli wyciągi filariopodobnych larw S. ratti,
A. caninum i N. muris. Tylko Gordon i Griffiths (1951) donieśli o ujem- nym wyniku redukcji lepkości pod wpływem cerkarii S. mansoni. Nato- miast Gine<:inska (1950) opisała aktywność enzymatyczną u Cercaria ocel- lata i Cercaria pseudarmata.
Inne robaki pasożytnicze poza cerkariami przywr były rzadziej bada- ne pod kątem wytwarzania hialuronidazy. Wspomnieliśmy już o takich nicieniach, jak A. caninum, N. muris i S. ratti. Należy tu jeszcze wymie-
nić badania Bruni (1939) oraz Bruni i Passalacqua (1954), którzy wykryli
hialuronidazę u Anc. duodenale i usiłowali zlokalizować jej wytwarzanie
się w gru<:zolach głowowych i szyjnych. Inny włoski badacz, Deiana (1957),
1pisał hialuronidazę w słupkowcach Strongylus equinus i S. edentatus.
Stwierdził on, że enzym wytwarzany jest w gruczołach przełyku. W na-
c,zych doświadczeniach prowadzonych metodami turbidymetryczną
i Me Cleana nie zdołaliśmy dotąd wykryć hialuronidazy u Trichinella spiralis ani w wytrawionych larwach mięśniowych, ani u włośni jelito- wych, badanych oddzielnie samców i samic. Może właśnie te stadia pa-
sożyta nie produkują enzymu, a ewentualnie wytwarzają go młode larwy
wędrujące, co naturalnie należałoby potwierdzić. Wypowiedziane przy omawianiu E. histolytica uwagi co do metod wykrywania hialuronidazy i znaczenia tego enzymu odnoszą się w tym samym stopniu do opisanych bada1'"1 nad robakami.
Przynajmniej 3 różne enzymy proteolityczne, tj. mukopolisacharydazę, lipazę i kolagenazę, wykrywano dotąd u robaków pasożytniczych, szcze- gólnie u cerkarii Schistosoma. Ich znaczenie i współdziałanie w proce- sach penetracji tkanek nie zostało jeszcze. wyjaśnione. Lewert i współ
pracownicy przywiązują mniejszą wagę do dwóch pierwszych enzymów,
p0dkreślając jednocześnie rolę kolagenazy.
Możemy sądzić, że mukopolisacharydaza cerkarii nie jest identyczną
z hiciluronidazą stwierdzaną np. u bakterii. Działa ona też znacznie słabiej
na otoczki paciorkowców w porównaniu z innymi enzymami, nie działa
na owomucynę i chondroitynę, wyraźny jej wpływ obserwowano jedynie na heparynę. Lewert nie przypisuje też większej wagi lipazie, która uwal-
554 Z. KOZAR
nia kwasy tłuszczowe z trójpalmityny, mimo że ostatnia jest normalnym
składnikiem skóry. Kolagenaza natomiast, zdaniem Lewerta, jest naj- c:;;ynniejszym enzymem, ułatwiającym cerkariom przebijanie się przez
skórę, zwłaszcza przez warstwy zbudowane z wielocukrów zawierają
cych proteinę. Kolagenaza cerkarii różni się od trypsyny. Jest czynna ,~.' stosunku do tkanki chrzęstnej, czego nie hamują inhibitory swo.iste dla trypsyny. Różni się też od kolagenazy z Clostridium welchii typu A, wy-
karując słabszy wpływ na chrząstkę bydlęcą in vitro, ale za to znacznie silniejszy in vivo na tkankę kolagenową. Uwalnia ona tyrozynę z hemoglo- hiny, czego znów nie hamują inhibitory swoiste dla trypsyny.
Zastanawiano się dalej, o ile enzymy proteolityczne robaków mogą być
antygenami w ustroju żywiciela i czy surowice odpornościowe hamują ich
działanie. Również i tu nie mamy jednoznacznych wyników. Surowice
odpornościowe hamowały działanie lipazy wyosobnionej z Nippostrongy- lvs muris, podczas gdy normalne surowice nie wywierały tego wpływu
(Thorson, 1953). Również enzymy proteolityczne z Ancylostoma caninum
okazały się dobrymi antygenami pobudzając organizm żywiciela do pro- dukcji przeciwciał, które hamowały z kolei wpływ enzymów, a tym sa- mym przeciwdziałały inwazji (Thorson, 1956).
Inaczej przedstawiają się te sprawy odnośnie do kolagenazy cerkarii.
·Olrnzało się, że nawet normalne surowice posiadają, co prawda niezbyt
siln€, inhibitory hamujące działanie kolagenazy. Nie niszczy ich ogrze- wanie w 56°C przez 20 min. W surowicach zaś 55 osób zarażonych Schi- stosoma mansoni podobne inhibitory były 2,5 do 5 razy silniejsze. Nie stwierdzono jednak zależności między poziomem inhibitorów a wiekiem,
płcią, przebytą terapią lub stanem klinicznym osób zarażonych. Po pod- daniu kilku surowic odpornościowych analizie. elektroforetycznej prze- konano się, że inhibitory enzymu znajduJą się w paśmie ,a-globuliny i ich granice są wyraźniej zaznaczone, aniżeli dla inhibitora trypsyny. Prze-
ciwciała zaś wiązania dopełniacza mieszczą się w pasmie y 2-globulin, aglutyniny i w pasmie y-globulin. Na podstawie tych i innych jeszcze bc.ida11. autorzy doszli do wniosku, że inhibitory kolagenazy są ciałem
nieswoistym, ich poziom w surowicy jest stosunkowo niski, jego zwięk
szenie u osób zarażonych zależy raczej od procesów uszkadzania i na- prawy tkanek.
Przyjęcie teorii o wpływie kolagenazy pasożytniczej na inwnję ro- baków może prowadzić do wytłumaczenia wielu niezrozumiałych dotąd
procesów.
Skóra, a zwłaszcza warstwa rogowa naskórka, jako pierwsza bariera w penetracji pasożytów podlega różnym zmianbm zależnym od wieku i stanu fizjologicznego żywiciela. Podobnie i błony podstawowe orc<z tkan- k1 właściwa, podatne u młodszych zwierząt na szybką i łatwą penetrację,
INWAZYJNOSC PASOŻYTÓW 555
stają się z wiekiem bardziej oporne na procesy enzymatyczne. Może właś
nie w tych zjawiskach bardziej niż w humoralnych tkwi istota oporności
wieku. Podobne do starczych zmiany skóry, polegające na spolimeryzowa- niu błony podstawowej, można też wywołać przez usunięcie przysadki mÓ7gowej. Również u takich zwierząt pasożyty dłużej przedostawały się
przez skórę lub w ogóle nie były w stanie jej przebić.
Od tych samych czynników może zależeć oporność gatunkowa żywi
cieli, tak często obserwowana przy różnych inwazjach. Nawet małe róż
nice w chemicznej budowie bariery glukoproteidowej mogą się okazać
istotne i tłumaczyć częściową lub pełną oporność naturalną.
Niezbyt zrozumiale dotąd wyniki doświadczeń z hormonami stają się jaśniejsze po przyjęciu powyższej koncepcji. Zmianą w gęstości błon pod- stawowych można dziś, choć częściowo, tłumaczyć obserwowane po ka- stracji zwiększenie oporności żywiciela (np. na inwazję Taenia l:aeniae- forrnis - Campbell i Melcher, 1940) lub obniżoną oporność u ciężarnych
samic (np. Whitlock, 1937). Prawdopodobnie pod wpływem małych da- wek testosteronu, alfaestradiolu i dwuetylostilboestrolu następowało wcześniejsze dojrzewanie bariery tkanki łącznej u kurcząt, przez co sta-
wały się one bardziej oporne na inwazję Ascaridia (Sadun, 1948, 1951;
Ac-kert i Dewhirst, 1950). Natomiast duże dawki testosteronu obniżały za-
wartość glukoproteidów w warstwie podnablonkowej i prawie 4-krotnie
zwiększały wrażliwość kurcząt na inwazję (Sadun 1948).
Powyższe koncepcje są naturalnie tylko hipotezami. Świadczą jednak o szerokich możliwościach wykorzystywania badań nad enzymatyczną a}-tywncścią pasożytów. Naturalnie i tu obowiązuje zasada nie uprasz- czania zbytnio zjawisk biologicznych. Wprawdzie dostępne dziś metody biochemiczne są jeszcze zbyt „grube" jak na wymagania biologa, to jednak pozwalają już na częściową chociaż orientację w sprawie inwa-
zyjności pasożytów. Wybitna rola enzymów w mechanizmach drążenia pasożytów w tkankę i dalszych wędrówkach została właściwie dowie- d7:ona. Trudność polega na odpowiednim dobraniu substratów oraz naj- czulszych metod, które pozwoliłyby na bliższe sprecyzowanie aktywności
enzymatycznej. Istnieje naturalnie jeszcze wiele innych trudności, pole-
gających choćby tylko na utrzymywaniu pasożytów in vitro, ale nie po- winny one nikogo zrażać w podejmowaniu tematyki tak interesującej
i istotnej dla zrozumienia stosunków występujących między pasożytem
a żywicielem. Właśnie zachęta do tego rodzaju badań była celem niniej- szego artykułu.
Ot-rzymano 5 IV 1961 Adres autora:
Wrocław, C. Norwida 29
W'iadomości Parazytologiczne z. 3 2
