JANINA PIECHOCKA
ROCZNIKI PZH 1960, t. XI, nr 2
BADANIA NAD OZNACZENIEM AKTYWNOŚCI PEPSYNY NA BIAŁKU JAJA
Z Zakładu Badania Żywności i Przedmiotów Użytku PZH
WSTĘP
W związku z coraz większym zainteresowaniem rolą enzymów oraz nowym zastosowaniem ich do badań toksykologicznych (1) zachodzi po- trzeba opracowywania metod badania aktywności enzymów związanych
ze specyfiką tych biokatalizatorów. Metoda oznaczania aktywności pep- syny na ściętym białku jaja podana przez Farmakopeę Polską III jest
mało czuła i w przypadku badań wpływu czynników hamujących lub
pobudzających na ten enzym niezadowalająca. Przeniesienie procesów
zachodzących in vivo na badania in vitro wymaga więc uwzględnienia różnych czynników, związanych z biochemicznymi przemianami tych procesów enzymatycznych.
PRZEGLĄD PIŚMIENNICTWA
Spotkane metody oznaczania aktywności pepsyny oparte są na hydro- lizowaniu białek w środowisku kwasu solnego. Zakres stosowanych war-
tości pH leży w granicy 0,8-2,5. Rozpiętość stosowanych przy tym temperatur jest dość duża. Chociaż większość autorów stosuje tempera-
turę 37° (1-6), można się również spotkać z pracami, w których proces trawienia odbywa się w temp. 20° (7), 25° (8), 40° (9) i innych. Wessel- man i Hilty (10) trawią białko w temp. 52°, a Halmi (11) w temp. 54°.
Wśród dużej różnorodności substratów białkowych, stosowanych do
badań trawienia pepsyną, wielu autorów stosuje białko jaja kurzego.
Jedni używają go w postaci ściętej gotowaniem (1, 4, 5, 11), inni auto- rzy (6) zalecają roztwór albuminy. Matsuyama i Nakamura (3) używa
ją w tym celu wysuszonego białka jaja. Titov (12) do badań surowej pepsyny w fabryce używa mleko, biorąc pod uwagę czas potrzebny do
ścięcia próby mleka przez badaną pepsynę. Weinberg (13) w tym celu
zastosował „mleko syntetyczne", które otrzymał przez działanie wody wapiennej na kazein~. Inne prace opierają się na takich substratach, jak edestyna (14), kazeina (9), hem'.:lglobina (15), agar (16), żelatyna (17) i inne.
Ocena aktywności enzymatycznej oparta jest na określeniu ubytku substratu lub oznaczeniu jego pozostałości. Do pierwszego sposobu
należy zaliczyć większość oznaczeń kolorymetrycznych, gdzie barwnik
związany z białkiem pod wpływem działania pepsyny zostaje uwolniony i oznaczony w kolorymetrze. Tc·marelli i ,współpracownicy (18) związali białko z dwuazowanym sulfanilamidem i otrzymali azoalbuminowy
..I.JO J. ł'Jecnocka Nr 2
substrat, który pod wpływem enzymu proteolitycznego wytwarzał
barwne produkty reakcji rozpuszczalne w kwasie trój-chlorooctowym.
Intensywność otrzymanego zabarwienia była funkcją proteolitycznej
aktywności. Anson i Mirski (15) zastosowali do swych oznaczeń hemo-
globinę, która strawiona reagowała z odczynnikiem fenolowym, dają{'
niebieskie zabarwienie. Intensywność otrzymanej barwy była proporcjo- nalna do ilości enzymu i czasu trawienia. Orringer i współpr. (8) uproś
cili później tę metodę, używając gotowy preparat wysuszonej hemo- globiny. Adova i Smorodinzew (17) badali zależność między aktywnością enzymatyczną pepsyny a napięciem powierzchniowym i stwierdzili, że
preparaty bardziej aktywne obniżają silniej napięcie powierz-chniowe wody niż preparaty mniej aktywne. Ci sami autorzy w innej pracy (19) badali aktywność różnych preparatów pepsynowych na kazeinie, żela
tynie, białku jaja i edestynie stwierdzając, że ze wzrostem aktywności
preparatu oprócz zwiększenia obniżenia napięcia powierzchniowego,
rośnie przewodnictwo, wzrasta w wyniku trawienia procent otrzymanego azotu, zwiększa się stosunek polipeptydów do aminokwasów oraz grup NH2 do COOH. Autorzy przeprowadzali badania w stałym pH i stałej
temperaturze.
Inny sposób pomiaru aktywności będzie polegał na oznaczeniu pozo-
stałości substratu, otrzymanej po trawieniu w określonym czasie. Ma- tsuyama i Nakamura (3) trawili wysuszone białko, a następnie niestra- wiony substrat po przesączeniu suszyli i ważyli określając w ten spo- sób ilość niestrawioną. Halmi (11) ścięte białko trawił w termosach w temp. 54°, a następnie niestrawione odwirowywał w naczyniach z po-
działką, za pomocą której została odczytana objętość niestrawionego
białka. Abelin i Pflister (6) wytrącali roztwór niestrawionego białka za
pomocą roztworu mydeł inwertowych. Na podstawie różnicy otrzyma- nej z miareczkowań przed i po trawieniu określali aktywność pepsyny.
Metodę miareczkową stosuje też praca Greenberga (9), który zmodyfi-
kował metodę Sorensena, polegającą na zablokowaniu uwolnionych pod- czas trawienia grup NH2 i miareczkował wolne grupy karboksyl-owe, natomiast metodę Kjeldahla wykorzystują inni autorzy do oznaczenia azotu w płynie strawionego obiektu. Arkel (20) badał pepsynę metodą nefelometryczną, obserwując zmiany intensywności zmętnienia (otrzy- manego wskutek działania kwasu sulfosalicylowego na rozcieńczoną surowicę), zachodzące pod wpływem hydrolizy, wykreślając następnie zależność wpływu czasu przy stałym pH oraz wpływu pH w określo
nym czasie. Herzf eld (21) opracował czulą metodę dla badania pepsyny.
wykorzystując zjawisko Tyndalla.
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
W pracy tej metodę oznaczania aktywności pepsyny oparto na trawie- niu roztworem enzymu o pH 1,2 białka jaja kurzego ściętego gotowa- niem i oznaczeniu procentu azotu metodą mikro-Kjeld.ahla w roztworze otrzymanym po określonym czasie trawienia. Drogą doświadczeń stwier- dzono, że białka różnych jaj kurzych różnią się między sobą pod wzglę
dem zawartości azotu. Dla zobraz,owania tych różnic wykonano szereg
ilościowych oznaczeń azotu w białku różnych sztnk jaj. Białko do tych
oznaczeń przygotowano w sposób identyczny jaki stosowano do oznaczeń
Nr 2 Oznaczanie aktywności pepsyny 159-
80
10
40
JO
1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 2,1 J,2
% zawartości azotu w b:"atku
Ryc. 1. Pepsyna - 0,05 g, białko - 5,00 g, czas - 2,5 godz.
aktywności pepsyny. Wykonano 50 oznaczeń i otrzymano procentową za-
wartość azotu leżącą w granicach 1,46-2,150/o. Stwierdzono, że procent
zawartości azotu w ściętym białku wpływa na jego konsystencję. Szcze- gólnie wyraźnie daj,e się to zauważyć podczas przygotowania próby do
oznaczeń, a mianowicie w czasie przecierania przez sito. Białka zawie-
rające większy procent azotu są twarde i spoiste, natomiast białka
o niskim procencie są miękkie i posiadają rozluźnioną konsystencję.
Różnice te nie pozostają bez wpływu na proces trawienia. Białko twarde ulega wolniejszemu trawieniu przez pepsynę niż białko miękkie. Wy- nika stąd duży procent błędu w przypadku wykonywania prób równo-
ległych na białkach niepochodzących z jednego i tego samego jaja. We wszystkich badaniach stosowano tę samą pepsynę, ilość substratu i enzy- mu oraz czas trawienia. Temperatura i pH roztworu były zawsze nie- zmienne. Podany wykres przedstawia te różnice graficznie (ryc. 1 ).
W oparciu o uzyskane wyniki z powyższych badań przeprowadzono oznaczenie aktywności pepsyny w następujący sposób.
OPIS METODY
Swieże jajko gotuje się 10 minut, licząc od złożenia go do wrzącej
wody, a następnie studzi przez 0,5 godz. w zimnej bieżącej wodzie. Po tym czasie jajko obiera się ze skorupy i po dokładnym oddzieleniu od
loU . J. Piechocka Nr 2
żółtka, błonek i halazy, białko przeciera się przez sito o 0 0,75 mm.
Pierwszą niewielką porcję należy odrzucić. Przetarte białko należy
· trzymać w naczyniu zamkniętym. Po przetarciu (bez zwłoki) białko od-
waża się do naczynek wagowych ściśle po 5 g i dokładnie zamyka przy-
krywką. Z pozostałego białka odważa się jeszcze dwie próby po ok.
0,12 g (też na wadze analitycznej) do maleńkich naczynek, w celu oznaczenia w nim procentowej zawartości azotu.
SPOSÓB PRZYGOTOWANIA PRÓBY DO OZNACZENIA
Do parowniczki szklanej o 0 6 cm odważa się ściśle 0,05 g pepsyny,
którą po rozpuszczeniu w 5 ml wody przenosi ,ilościowo do kolby stoż
kowej na 200 ml, z zaznaczoną objętością 45 i 50 ml. Parowniczkę spłu
kuje się wodą i uzupełnia do 45 ml. Tak otrzymany roztwór nastawia
się 250/o-owym kwasem solnym (ok. 0,2 ml) na pH 1,2 za pomocą peha- metru. Drogą doświadczeń ustalono, że w roztworze enzymu o pH 1,2
białko było najlepiej strawione.
Do tak przygotowanego roztworu dodaje się odważ,oną 5 g próbkę białka w sposób następujący: Do zlewki o poj. 50 ml odlewa się większą część płynu o oznaczonej już wartości pH 1,2 i stąd wlewa około 3 ml
płynu do naczynka wagowego z odważoną próbą białka. Po dokładnym
wymieszaniu bagietką, dodaje się jeszcze parę ml tego płynu i całość
przenosi się ilościowo przez lejek (z krótką szeroką nóżką) do kolby, w której znajduje się pozostały roztwór enzymu. Pozostały płyn w zlew- ce należy wlać również do kolby, spłukując nim naczynko i lejek. Tak
przygotowaną próbę wynoszącą ok. 50 ml po zakorkowaniu watą wsta- wia się do cieplarki o temp. 37° na 2,5 godz. notując dokładnie czas.
Należy ostrożnie przenosić kolbę do cieplarki, żeby przy gwałtownym
poruszaniu nie spowodować osiadania na ścianie kolbki cząstek białka,
które muszą być wszystkie zanurzone w roztworze enzymu.
Oznaczanie procentu zawartości azotu wg metody mikro-Kjeldahla:
a) W badanym białku.
Odważone uprzednio 2 próbki białka po 0,12 g umieszcza się w kol- bach do spalań Kjeldahla na 100 ml, dodaje 2 ml stężonego kwasu siar- kowego, 0,54 g katalizatora Clarka (0,5 g K2S04
+
0,04 g HgO) i spala na małym płomieniu wg wskazań podanych przez Rzymowską i współpracowników (22). Otrzymany w wyniku spalenia płyn, po rozcieńcze
niu 5 ml wody przenosi się ilościowo do kolby destylacyjnej aparatu Parnas-Wagnera i po spłukaniu dokładnym kolby do spalań niewielką ilością wody i wlaniu do kolby destylacyjnej, płyn alkalizuje się 6 ml 500/o-owego roztworu NaOH i całość destyluje. W odbieralniku znajduje
się roztwór 40/o-owego kwasu borowego, do którego dodano wskaźnik
Ma i Zuazaga. Otrzymany destylat miareczkuje się z mikrobiurety 0,04-n roztworem kwasu solnego.
•b) W roztworze str a w i o n ego białka.
Po 2,5 godz. stania próbę z cieplarki wyjmuje się, chłodzi w zimnej wodzie do temp. 20°, a następnie przelewa ilościowo do kolby na 100 ml
Nr 2 Oznaczanie aktywności pepsyny 161
i uzupełnia wodą do kreski. Po dokładnym wymieszaniu zawartości, płyn zawierający niestrawione części białka sączy się przez sączek z bi-
buły. Z przesączu pobiera się pipetą ściśle 5 ml płynu, wlewa do kolby Kjeldahla, dodaje 2 ml stęż. H2SO4, ,0,54 g katalizatora i postępuje dalej tak, jak podano przy oznaczeniu zawartości azotu w białku. Zawartość
azotu oblicza się wiedząc, że 1 ml 0,04-n HCl odpowiada 0,56032 mg N.
Procent strawionego białka przez pepsynę obliczono w stosunku do pro- centowej zawartości azotu w badanym białku. Aktywność badanej pe- psyny określano procentem strawionych 5 g białka (średnia z równo-
ległych oznaczeń) przez 0,05 g pepsyny w czasie 2,5 godz. w tempera- turze 37°, podając przy tym procentową zawartość azotu w danym sub-
stracie białkowym. W przypadku oceny aktywności enzymatycznej nie-
:znanego preparatu pepsynowego, wykonuje się równolegle 2 oznaczenia z pepsyną znaną i 2 z preparatem badanym, na białku tego samego jaja. Stwierdzono, że wyniki przeprowadzanych równolegle oznaczeń
były prawie identyczne. Wykonano również badania nad określeniem przydatności do powyższych oznaczeń metody Kjeldahla w skali makro (22) oraz metody refraktometrycznej, stosując refraktometr nurkowy Zeissa. Z otrzymanych wyników przeprowadzonych badań oceniono te metody, jako mało czułe i nie nadające się do badań dokładnych i sub- telnych różnic zmian aktywności pepsyny.
WNIOSKI
1. Opisana metoda oznaczenia aktywności pepsyny na białku jaja kurzego ściętego gotowaniem spełnia warunki wymaganej dokładności
i czułości oznaczenia.
2. Stwierdzono konieczność wykonywania prób równoległych na biał
ku jednego i tego samego jaja o znanej procentowej zawartości azotu.
3. Podana metoda pozwala wykonać badania wpływu różnych związ
ków na aktywność enzymatyczną pepsyny, otrzymując porównywalne i dokładne wyniki.
'.>T n cxonKa
v!CCJTE/lOBAilvl$1 HAJl onPE,UEJIEHHEM AKTl1BHOCTl1 nEnCHHA I !A 5EJIKE 51v!UA
Co;i:ep,KaHHe
ffr(Jte.noua11HH 11a;i: onpen:eJJeHHeM 3113HMaTH'!eCKOH aKTHBH0CTH nencuna BeJIHCb Ha Ky'[HHłOM uaperMIOM 6e,1K{' Hiiua. npe;].L'i,l'BJie'l! cnoco6 H YCJIOLHIH ncc.r1e,'l.OllaI-Illii Y'll!Tbl'Il3H CTOHMOCTb pH, TeMnepaTyTy H o,pe~rn. 3H3HMaTH'leCKYIO aKTH'BH0CTb .nenCH'!la onpeJJ:eJIHJIOCb Ha 0C,II0Bal!HH orrpc,rr:eJieHHH npoue11THoro K0JIH'!eCTna a30Ta MeTO,!l0M Kjeldahla B pacrnope roJiyqeHHI,lM H0CJie 31Bl-!MaT,H'l€CK0ro nepena.p:HBaHUll. OoHOBbIBaHCb Ha np0}leJiaHHblX H•CCJ1e.-':(0B9-HHHX YA0Cl'0Be-peHO Heo6xo;J;HMOCTb CJJ:eJiaTb rrapaJJJieJib.Hble onpe,!leJie'llHll na
5eJIKe 0;].HOro H roro )KC KypHH0ro HHUa H TaKHM o6pa30M Il0JIY'IHTb T0'IHble II cpaBHH- reJib·Hble pe3yJibTaTbl.
"Roczniki PZH - G
J. Piechocka
J. Piechocka
Nr 2
l
·lSTUDIES ON THE DETERMINATION OF ACTIVITY OF PEPSIN ON EGG WHITE
Summary
Studies were carried out on the determination of enzymatic activity of pepsin on chicken egg white coagulated by boiling. The method and the conditions of carrying out determinations are presented along with pH range, temperature and time. Enzymatic activity of pepsin was estimated on the basis of nitrogen content in percentage by means of Kjeldahl's micro-method in the liquid obtained after digestion of egg white. On the basis of the carried out experiments it was proved that it is necessary to perform parallel determinations on the same egg white thus obtaining accurate results which can be compared.
PISMIENNICTWO
l. Piechocka J., Nikonorow M.: Ac. Pol. Pharm. 6, 4:l7, 1959. - 2. Sweatichin T-:
Compt. rend. soc. biol., 109, 945, 1932.- 3. Matsuyama M., Nakamura H.: Bull. Agr.
Chem. Soc. Jap., 4, 16,1928. ref.CA, 24, 3808, 1930. - 4. Clerg A., Hauwaert M.: J. pharm.
Belg., 17, 59, 1935. - 5. Farmakopea Polska III, 483, 1954. - 6. Abelin J., Pflister H.:
Klin. Wochschr., 30, 1036, 1952. - 7. Barowsky H., Tauber H., Kleiner J. S.: Am.
J. Dig. Diseases. Nutrition, 4, 229, 1937.· - 8. Orringer D., Lauber F. U., Hollan- der F.: Science, 111, 88, 1950. - 9. Greenberg H. L.: J. Am. Pharm. Assoc, 20, 1032, 1931. - 10. Wesselman H. J., Hilty W. W.: J. Am. Pharm. Assoc. Sci, 37, 357, 1948.
il. Halmi P.: Mag. Guogr: Fars. Ertes., 11, 568, 1935. ref. CA. 29, 8230, 1935. - 12. Titov W.: Mjasnaja Ind., 20, 4, 38, 1949. - 13. Weinberg G., Sliosberg A.: Mja- snaja Ind., 24, 3, 84, 1953. - 14. Petersen S.: Mikrochemie, 12, 215, 1952. - 15. Anson M. L., Mirsky A. E.: J. Gen. Physiol., 16, 59, 1932. - 16. Krówczyń
ski L., Smajkiewicz A.: Acta Pol. Pharm.; 14, 1, 41, 1959. - 17. Adova A. W., Smorodinzew I. A.: Bull. soc. chim. biol., 12, 449, 1930. - 18. Tomarelli M. R., Charmey J., Harding M. L.: J. Lab. Clin. Med., 34, 1, 428, 1949. - 19. Smorodin- zew I. A., Adova A. N.: Z. physiol. chem., 189, 165, 1930. - 20. Arkel C. G.: Pharm.
Weekb., 66, 857, 1929.
21. Herzfeld E.: Bioch. Z., 251, 384, 1932. - 22. Rzymowska C., Bernstein 1.., Grochowska J.: Roczniki PZH, 1, 1, 1953.
·~-
