Diagnostic utility of RHD-gene detection in maternal plasma in the prophylaxis of feto-maternal Rh-incompatibility

Pełen tekst

(1)

(2) .

(3)

(4) po ł o ż n i c t wo. Diagnostyczna przydatność detekcji genu RHD w osoczu ciężarnych w profilaktyce konfliktu matczyno-płodowego na tle antygenu D z układu Rh Diagnostic utility of RHD-gene detection in maternal plasma in the prophylaxis of feto-maternal Rh-incompatibility Agnieszka Sapa1, Anna Jonkisz2, Mariusz Zimmer3,4

(5) 4

(6) 1 1 2 3 4. Zakład Chemii Klinicznej, Katedra Analityki Medycznej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Polska Zakład Technik Molekularnych, Katedra Medycyny Sądowej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Polska II Katedra i Klinika Ginekologii i Położnictwa, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Polska Klinika Ginekologii i Położnictwa Uniwersyteckiego Szpitala Klinicznego we Wrocławiu, Polska. Streszczenie Cel pracy: Celem badań była walidacja oraz wstępna ocena przydatności testu do prenatalnego określania genu RHD pochodzenia płodowego w osoczu ciężarnej w rutynowej praktyce laboratoryjnej i klinicznej. Wprowadzenie do diagnostyki nieinwazyjnych badań prenatalnych ma na celu bardziej racjonalne i bezpieczne stosowanie immunoprofilaktyki. Materiał i metody: Badanie genu RHD w osoczu ciężarnych wykonano techniką real-time PCR z zastosowaniem starterów i sond specyficznych do sekwencji eksonów 7 i 10 genu RHD. Wyniki ujemne badania na obecność genu RHD weryfikowano dodatkowymi testami, które miały na celu potwierdzenie udanej izolacji i obecności DNA płodowego w próbce. W pierwszej kolejności wykonywano oznaczenie markera płci męskiej (genu SRY), które potwierdzało obecność płodowego DNA w przypadku płodów płci męskiej. Badanie wykonywano testem Quantifiler® Duo. Próbki z ujemnym wynikiem poddawano dalszej analizie poprzez oznaczanie polimorfizmów typu STR (ang. short tandem repeat) metodą mini SGM, różnicując DNA pochodzenia matczynego i płodowego. Wyniki: Dokładność diagnostyczna testu do oznaczania genu RHD w osoczu wynosiła 96,82%. Wartość diagnostyczna oznaczania genu SRY była niższa i wynosiła 87,50%. Testem mini SGM udało się znaleźć marker różnicujący w 77% przypadków. Wnioski: Opracowany algorytm badania DNA płodowego metodami biologii molekularnej ma wysoką wartość diagnostyczną przy wykrywaniu genu RHD w osoczu i potwierdzaniu obecności DNA płodowego oraz umożliwia weryfikację wyników ujemnych, pod warunkiem zastosowania właściwych badań kontrolnych.. Słowa kluczowe: /

(7) /

(8) / /

(9) / Adres do korespondencji: Agnieszka Sapa Katedra Analityki Medycznej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu ul. Borowska 211a, 50-556 Wrocław, Polska Tel. 71 784 0624, Fax. 71 784 0054 e-mail: agnieszka.sapa@umed.wroc.pl. 570. © Polskie Towarzystwo Ginekologiczne. Otrzymano: 15.10.2013 Zaakceptowano do druku: 02.03.2014. Nr 8/2014.

(10)

(11) . P R A C E. O R Y G I N A L N E po ł o ż n i c t wo. Agnieszka Sapa et al. Diagnostyczna przydatność detekcji genu RHD w osoczu ciężarnych w profilaktyce konfliktu matczyno-płodowego.... Abstract Objectives: The aim of the study was analytical validation of prenatal noninvasive fetal RHD detection in maternal plasma and the preliminary assessment of its clinical utility. Introduction of this noninvasive test into routine diagnostic use is important for more rational and safe immunoprophylaxis. Material and methods: RHD gene was detected using real-time PCR. Primers and probes complementary to sequence on exons 7 and 10 were chosen. Samples with RHD-negative results were examined with additional tests to confirm the proper isolation of cell-free fetal DNA (cffDNA). For male fetuses, the presence of fetal DNA was confirmed by detection of the male genetic marker (SRY gene) using Quantifiler Duo® kit. In the case of SRY-negative result we used mini SGM test, which is based on the detection of short-tandem repeat polymorphism differences between maternal and fetal DNA. Results: Diagnostic accuracy of RHD test was 96.82%, while diagnostic value of SRY determination was lower (87.50%). Mini SGM test was able to confirm the presence of fetal DNA in 77% of the cases. Conclusions: Effectiveness of the proposed procedure of prenatal noninvasive RHD determination and cffDNA confirmation is high, on condition proper control samples and suitable verifying tests are used.. Key words: /

(12) / / / !!

(13) /. Wstęp

(14) ! "#$%&'

(15) ()*

(16)

(17) (

(18)

(19) ( (

(20) + - * (

(21)

(22)

(23) . /

(24) ' 0(

(25) -+56'578

(26) 0 ' 0**. 9) *:** 6;'<8

(27)

(28) 9

(29) 9

(30) 0 0

(31) 0*. 9 *

(32)

(33) =6<>/ ?('+0

(34)

(35) 0

(36)

(37)

(38)

(39)

(40) @ (/B

(41)

(42)

(43)

(44)

(45) #CD#D#?D0

(46)

(47)

(48) 0

(49)

(50) @

(51)

(52)

(53)

(54) ' "/ C6E&

(55) :

(56) ' F

(57) 0

(58) /$' ('+:

(59) G

(60) (

(61)

(62) G

(63) 09. *=7'H>/ $

(64) 0

(65) 9

(66)

(67) (

(68) . 9'

(69) 0

(70) 09(

(71)

(72) /?

(73) 0*0

(74)

(75) (

(76) *: 0

(77) ( 0)G

(78) ''

(79) (=IKL>/$. 9) *:* 0

(80) 9' G 0*

(81) 0 G

(82)

(83) 9

(84)

(85)

(86) / 0 ) :

(87) 0

(88) 0

(89)

(90)

(91) '

(92) ( 0

(93)

(94) .

(95) : <L (*:

(96) *

(97)

(98)

(99) ' 0

(100)

(101) )(

(102) RHD

(103)

(104) (

(105) 9:

(106) 0

(107)

(108)

(109) (: #$%=6E'6<>/ +% "(/cell-free fetal DNANFF+%& 6EEK 9:

(110) O / :

(111)

(112) @

(113) 0

(114) @ 0*

(115) ()G (

(116) * 9 *

(117)

(118) 00

(119)

(120)

(121) 9

(122) 0

(123) 0 ' @

(124)

(125) 0(

(126) 0

(127) 0*

(128) 0. Nr 8/2014.

(129)

(130) 9:=67>/%

(131) :0

(132) 9G :

(133) 0

(134)

(135) (0/ $:

(136) FF+%

(137) 9

(138)

(139)

(140)

(141)

(142) (

(143) @

(144) . 0 0

(145) 0

(146)

(147)

(148) :

(149)

(150) ()' 0@0=6I'6K>/ C

(151) 0

(152) (

(153) RHD

(154) *$

(155) '

(156) G(*

(157) )G

(158)

(159) )/

(160) @('+) *:

(161) ( G *

(162)

(163) -+'

(164) (

(165) :

(166) / 7L8 9: 0

(167) -+'0

(168) / P(

(169) 0 0*

(170) 9 *

(171)

(172) @' 0 0

(173) *

(174) 0 -+'0

(175) *

(176)

(177)

(178) =6L>/. Cel pracy

(179)

(180) 0

(181) ' nia genu RHD

(182)

(183) (9:-+'0

(184) ' /$09

(185) : 9

(186) ((' :0*

(187) ((*

(188) . 09 0

(189) 9

(190)

(191) 0

(192) (:

(193) )G */. Materiały i metody

(194)

(195) @

(196)

(197) 09) IE Q+R'2 :

(198)

(199) H7 0

(200)

(201) ??

(202) ' T

(203) ( $ : U

(204)

(205)

(206)

(207) (

(208) -+' "I

(209)

(210) 9:

(211) <9:&-+'0

(212) "7 '

(213)

(214) 9:

(215) <9:&/-

(216) )

(217)

(218)

(219) 00

(220)

(221) (

(222) 0 :

(223) '

(224) 0

(225) *( ' *"

(226)

(227) VQW

(228)

(229) &/C

(230)

(231)

(232)

(233)

(234) 9 /B 0

(235)

(236) )' *(9

(237)

(238) @/$

(239) 9

(240) @ (9 0C

(241)

(242) 0

(243)

(244) '

(245) 0

(246) C';5I!<55L

(247)

(248)

(249) /. © Polskie Towarzystwo Ginekologiczne. 571.

(250)

(251) . P R A C E O R Y G I N A L N E poł ożn i ct wo. Agnieszka Sapa et al. Diagnostyczna przydatność detekcji genu RHD w osoczu ciężarnych w profilaktyce konfliktu matczyno-płodowego....

(252) 0

(253)

(254)

(255) 6L'I<"

(256) ' 75&96II6(

(257) *:"

(258) 7H&/ (

(259)

(260) 0 <K

(261)

(262) 7H

(263)

(264) / *:

(265) .0(

(266) 75<8 *:

(267) :' HEL8/ $

(268)

(269) 0

(270)

(271)

(272)

(273) <'LX 9

(274)

(275)

(276) 65<;55Y g

(277)

(278) '

(279) IX/ B

(280)

(281)

(282)

(283)

(284) 65 6H555Yg

(285)

(286)

(287) IX/[

(288) :

(289)

(290)

(291) :

(292) 0'<5X*( (

(293) '

(294)

(295) ' 0+%/

(296) <

(297)

(298)

(299)

(300) /%' 9

(301)

(302)

(303)

(304)

(305) 6L'<;X 0+%/ Izolacja DNA z osocza ?09

(306) \?®+% "\(

(307) &

(308) ( 0

(309) /

(310) 9 '

(311) 0) 0 . 09

(312) ' (0**9

(313) 09) I55]/$:

(314) F

(315) %+6555"R

(316) [

(317) .& 9:

(318)

(319) +%

(320) 0

(321) ( )G/$

(322)

(323) (

(324) '

(325)

(326)

(327)

(328)

(329) '<5X

(330)

(331)

(332)

(333) 0/ Izolacja DNA z wymazów policzkowych ?09

(334) : :

(335) \?®+%/ Oznaczanie genu RHD (

(336) RHD

(337) RW

(338)

(339)

(340) genu RHDN9

(341)

(342) K65"

(343) C

(344)

(345)

(346) OF

(347) R

(348) (

(349) &/+

(350)

(351) (

(352) 00 „housekeeping gene^ (

(353) _'( "GLO&/

(354) ?

(355)

(356)

(357) 0

(358) /

(359)

(360) . 0

(361) ' *

(362) '

(363) $- U`

(364) $-

(365) Y "

(366) C

(367)

(368)

(369) OF

(370) R

(371) (

(372) &/R

(373) 9

(374) ' '

(375) $- (

(376)

(377)

(378)

(379) @)/ Real-Time PCR – Quantifiler® Duo 0

(380)

(381) (9'

(382) (

(383) RHD

(384) 0*

(385)

(386) )G

(387) (+%

(388)

(389)

(390) /

(391)

(392) ('

(393) ( +% :

(394) +% :

(395) @

(396) ( \.

(397) ®+\."

(398) C

(399)

(400) '

(401) OF

(402) R

(403) (

(404) &/ R

(405)

(406) : 9:

(407) +%

(408) ( " (

(409) 0* #6 '

(410) $NRPPH1& 9:

(411) +% '

(412) (9

(413) N(

(414) SRY"(/sex-determining region Y&/ B

(415)

(416)

(417) KE55 #R b -

(418) 'R

(419) $-[

(420) .

(421) C

(422) "

(423)

(424) OF

(425) R

(426) (

(427) &(

(428) [+[</</</. 572. Badanie polimorfizmów typu STR (test mini SGM) + * 9

(429) )+%

(430) ( 0

(431) (

(432) RHD

(433) 9:

(434)

(435) [T/ R

(436)

(437) 0*

(438) . [R-"(/short tandem repeat& P

(439) R

(440)

(441)

(442)

(443) [*

(444) 0U

(445) '

(446)

(447)

(448) (

(449)

(450) '

(451) (

(452) (

(453) (

(454)

(455) (=<I<;>/$

(456) 0

(457)

(458) 0. 0

(459) ' c

(460)

(461) 0

(462)

(463)

(464) ' *

(465)

(466) F

(467)

(468) 0 : 7675 T

(469)

(470)

(471) "

(472) C

(473)

(474)

(475) OF

(476) R

(477) (

(478) &/+ :(T

(479)

(480)

(481) ®?+`/7/</R

(482) [T

(483) 00

(484) 9G

(485) [R-*

(486)

(487) 0

(488) 0* (

(489) (

(490)

(491) (

(492) 0

(493) /

(494)

(495)

(496) 0

(497) *

(498)

(499) * :*I

(500) / C

(501) . +%

(502) ( *

(503) 9 ' 0* +%

(504) ('

(505)

(506)

(507)

(508) '

(509)

(510) :0*. /. Wyniki G

(511) .)G

(512)

(513) genu RHD:

(514)

(515) +%

(516) (

(517) -+' -+ '0

(518)

(519) 9:/

(520) '

(521) (

(522) RHD i SRY (

(523) F

(524)

(525) -+ */ (

(526)

(527) 0 ;<I8 IKH8 0

(528)

(529) )G (

(530) RHD/

(531)

(532) (9

(533) (

(534)

(535) ( _'(' "GLO&< 0

(536) RHD '

(537) GLO *)G+%/ P :

(538) ( 9

(539) '

(540) :

(541) 0

(542) (

(543) RHD 0 )/

(544)

(545) . 0

(546) *:

(547) (

(548) RHD @ (

(549)

(550)

(551)

(552) ' +( O0

(553) 0

(554)

(555) ( [ '

(556) (/C

(557) 0<67

(558) / *: ( 0 0

(559) ) 0'

(560) 00

(561)

(562) -+'/ +

(563) \.

(564) ® + . +%

(565) (

(566) RHD/C

(567) '

(568)

(569)

(570)

(571) )

(572) FF+%

(573) ' . 0

(574)

(575) F

(576) 0

(577)

(578) RHD/ * :

(579)

(580) 0

(581) )

(582)

(583) *

(584) 0

(585) ) HHK8'

(586)

(587) 9:

(588) @ 9:

(589) +%

(590) \.

(591) ®+ '

(592) 0 )/+

(593)

(594)

(595)

(596) )+%

(597) (/ 9

(598) ((

(599) SRY 67 ) 7<

(600) "I5H<8&/ @

(601)

(602) \.

(603) ® + F *. © Polskie Towarzystwo Ginekologiczne. Nr 8/2014.

(604)

(605) . P R A C E. O R Y G I N A L N E po ł o ż n i c t wo. Agnieszka Sapa et al. Diagnostyczna przydatność detekcji genu RHD w osoczu ciężarnych w profilaktyce konfliktu matczyno-płodowego.... F i g ure 1 . Opracowany algorytm oznaczania genu RHD w osoczu ciężarnej wraz z badaniami potwierdzającymi i propozycjami postępowania w przypadkach wątpliwych.. Tab e la I . Zastosowane w badaniach startery (ang. primer) i sondy typu TaqMan®. 5’Primer3’ F (forward). 5’Primer3’ R (reverse). 5’Sonda TaqMan® 3’. RHD ekson 7 [19, 20]. CTCCATCATGGGCTACAA. CCGGCTCCGACGGTATC. FAM-AGCAGCACAATGTAGATGATCTCTCCA -TAMRA. RHD ekson 10 [19, 21]. CCTCTCACTGTTGCCTGCATT. AGTGCCTGCGCGAACATT. FAM-TACGTGAGAAACGCTCATGACAGCAAAGCTT -TAMRA.

(606) GLO [19, 22, 23]. GTGCACCTGACTCCTGAGGAG. CCTTGATACCAACCTGCCCAG. FAM-AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG -VIC.

(607)

(608) *

(609) / *:(

(610)

(611) 0

(612) 0

(613) ) 0'

(614) 00

(615)

(616)

(617) 9

(618) 0/

(619) ) genu SRY I F

(620) 0

(621)

(622) /$

(623)

(624) 0

(625)

(626) <L<E777;(*:

(627) :)

(628)

(629) 0/

(630) ??"&

(631)

(632) (

(633)

(634) 0

(635)

(636) ' F

(637) (

(638)

(639) (

(640)

(641) ???

(642)

(643)

(644) 0*

(645) ' ()G( *

(646)

(647) / C

(648) . [R-

(649)

(650) [T ' 6E 0

(651)

(652)

(653) (

(654) RHD i SRY 0

(655)

(656) / .(

(657)

(658) . Nr 8/2014. 9:

(659) 0

(660) (

(661) *+%

(662) * /R

(663)

(664) [T

(665) ' 7L

(666) "6E &/ d

(667) . 9

(668)

(669) 9

(670) * *

(671)

(672) )

(673) :0*/ . 0

(674) +% 90*

(675) 0 6< ' 0

(676)

(677)

(678) :0*6

(679)

(680)

(681)

(682) <

(683)

(684)

(685) :0*

(686) ' 9 /I

(687) 9

(688) Glocus :0*

(689) ' (*

(690) 09

(691) /

(692) genu SRY

(693)

(694) \.

(695) ®+

(696)

(697) [T

(698) 9

(699)

(700) :

(701) . 09 F

(702) 0

(703) /. © Polskie Towarzystwo Ginekologiczne. 573.

(704)

(705) . P R A C E O R Y G I N A L N E poł ożn i ct wo. Agnieszka Sapa et al. Diagnostyczna przydatność detekcji genu RHD w osoczu ciężarnych w profilaktyce konfliktu matczyno-płodowego.... )G(

(706)

(707) ((' 9

(708) EHL<8/. Dyskusja. a..

(709)

(710) ) (

(711) 0 ' 0

(712) (

(713)

(714) G

(715) 0* 0

(716)

(717) (

(718)

(719)

(720)

(721)

(722) ' 0

(723) /

(724) 0

(725)

(726) 0

(727)

(728) /

(729) 0

(730) 009 9

(731)

(732) (

(733) 0

(734)

(735) -+'0

(736) :

(737)

(738) :*:.0(

(739)

(740) (

(741) 9

(742) 0

(743)

(744) 00

(745)

(746)

(747)

(748) ' =6L<H<K>/ $

(749) 0)

(750)

(751) (

(752)

(753) ' @+%0

(754) 0

(755) (0

(756) 0/FF+%

(757) (

(758) 0

(759) (0 0

(760)

(761)

(762)

(763) *F 09 '

(764) (

(765) (+%:f

(766) ^+%'

(767) (/

(768) 0

(769) 0 9

(770) ('

(771)

(772)

(773)

(774) /

(775) 0+%\?+%C0

(776)

(777) 09)

(778) 0

(779)

(780) =6I6E<H<L'7H>/ +RHD

(781)

(782)

(783) '

(784)

(785) 65 K

(786)

(787) O / O

(788) (

(789) /

(790) :

(791)

(792) # `* /=6E'<7>/$ :

(793)

(794) 0 '

(795)

(796)

(797) 0 )G ( *

(798) **EHL<8/?

(799) 0*

(800)

(801)

(802) : * )G

(803) "EE; 6558&

(804)

(805) 0+%! ' 9 *9

(806) @"

(807) K :

(808) (

(809) & =6E<7>/B

(810)

(811)

(812) F

(813)

(814) '

(815)

(816)

(817)

(818) *

(819)

(820)

(821) -=E75>/

(822) *

(823)

(824) 0

(825)

(826) 0=6L<K7L> *

(827) (

(828) 0 0*

(829) ( +%

(830) =I6>/P(

(831)

(832)

(833) [R-+"[ F-

(834) (F+( & )G' (

(835) 0

(836) G

(837) : (9

(838)

(839)

(840) :

(841) ' =7EI<>/U

(842)

(843) 0

(844) 0

(845) (

(846) RHD

(847)

(848) (0*

(849)

(850)

(851) 0

(852) T

(853) F'# / )G ( * *

(854)

(855) ' 9)

(856)

(857) )G

(858) EH;80

(859)

(860) ' : E6L8=I7>/ P

(861)

(862)

(863)

(864)

(865) (

(866)

(867) 0*

(868) (

(869) ' )G

(870) (+%0

(871) 09

(872)

(873) (

(874)

(875) 0 0* 9'

(876) 0 0

(877)

(878) /B

(879) FF+%

(880) O / :

(881) 9

(882)

(883)

(884)

(885) 9: 9'

(886) (

(887) / C

(888)

(889) .*

(890) '

(891) 09

(892) * +h[6I (

(893) TSPY

(894) (

(895) h:

(896)

(897) :0*. ' 090

(898)

(899) 0

(900)

(901) 0

(902)

(903) )6EL =67>/

(904)

(905) 0 0

(906)

(907) ' )+%9

(908) (:(

(909) [-h"(/sex-determining. 574. Ta bel a II. Weryfikacja wyników uzyskanych dla genu RHD (a) i SRY (b) po urodzeniu dziecka.. RhD po porodzie.

(910). .

(911) RHD)

(912)

(913)

(914). 31.

(915) . 2.

(916)

(917) . 30.

(918)

(919). 0. 33. 30. b. dziecka. Liczba. ® Duo – SRY dodatni. ® Duo – SRY ujemny. . 17. 13. 4. !". 15. 0. 15. #

(920) . 32. 13. 19. Ta bel a III. Parametry opisujące wartość diagnostyczną testu w kierunku obecności genu RHD i SRY w osoczu ciężarnych. RHD Parametr $ %&

(921) '. SRY. 93,94. 76,47. (

(922) %&

(923) '. 100. 100. # %&) '

(924)

(925) . 100. 100. # %&) '

(926) . 93,75. 78,95. %&

(927) '. 96,82. 87,50. region Y& 0

(928)

(929) ' h 0

(930) R+b "

(931)

(932) 0* 0* (/testis determining factor&=6L6E<K'7<7I>/

(933) 0

(934) 0

(935)

(936)

(937) )

(938) 9

(939) (

(940) '

(941) (

(942) 0

(943) \.

(944) ® + \."

(945) C

(946)

(947)

(948) OF

(949) R

(950) ' (

(951) &/

(952) (

(953)

(954)

(955)

(956) :

(957) +% :

(958)

(959) 9:

(960)

(961) 9

(962) (

(963) ) 6555'

(964) ( +% :

(965) @

(966) (/B

(967) (

(968) SRY

(969)

(970) 0 0

(971) * )G ( *

(972) : :

(973)

(974) F

(975) 0

(976) / )G

(977) KHIK8 * )G (

(978) LK;58/?

(979) 0*

(980)

(981)

(982)

(983) 0 )(

(984) SRY+%

(985) ( ' 9 (

(986)

(987) 0

(988) F

(989) 0

(990)

(991) =<H7I>/%

(992) 9

(993) : (G 9:

(994) +% 9

(995) ( :

(996) ( 9

(997) 0

(998) ' :

(999) (

(1000)

(1001) ) HHK58/ 0

(1002) 0

(1003) ( 9:

(1004) +%

(1005) 0

(1006) *

(1007) :

(1008) 0

(1009) (

(1010) (0/$

(1011)

(1012) 0

(1013) *

(1014) (

(1015) SRY0

(1016) (. © Polskie Towarzystwo Ginekologiczne. Nr 8/2014.

(1017)

(1018) . P R A C E. O R Y G I N A L N E po ł o ż n i c t wo. Agnieszka Sapa et al. Diagnostyczna przydatność detekcji genu RHD w osoczu ciężarnych w profilaktyce konfliktu matczyno-płodowego.... ) 9:

(1019)

(1020) ( +% P

(1021) /=II> *

(1022) 0

(1023)