Cereblon: A molecular target of immunomodulatory drugs

(1)

Praca poglądowa/Review

Cereblon: molekularny cel leków immunomoduluj ących

Cereblon: A molecular target of immunomodulatory drugs

Anna St ępień

¹

, Krzysztof Jamroziak

^2,

*

1PracowniaImmunologiiKlinicznej,TransplantacyjnejiGenetykiWSSim.KopernikawŁodzi,Polska

2KlinikaiKatedraHematologiiUniwersytetuMedycznegowŁodzi,Polska

Leki immunomodulujące

Mianem leków immunomodulujących (immunomodulatory drugs; IMiDs) określa się grupę podobnych pod względem

struktury,ale częściowoodmiennychfunkcjonalnie,cząste- czek, którychprekursorem był talidomid.Oprócz tego leku do IMiDs stosowanych w praktyce klinicznej zalicza się obecnie lenalidomidoraz pomalidomid,ostatniozarejestro- wany przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków informacje o artykule

Historiaartykułu:

Otrzymano:06.08.2013 Zaakceptowano:08.08.2013 Dostępneonline:13.08.2013

Słowakluczowe:

cereblon

CRBN

talidomid

lenalidomid

pomalidomid

szpiczakplazmocytowy

Keywords:

Cereblon

CRBN

Thalidomide

Lenalidomide

Pomalidomide

Multiplemyeloma

abstract

Molecularbackgroundofcomplexbiologicaleffectsofimmunomodulatorydrugs(IMiDs) thalidomide,lenalidomideandpomalidomidehasbeenlargelyunknown.Recently,arole ofcereblon(CRBN)asacommonmoleculartargetforIMiDsandproteincrucialfortera- togenicityofthalidomide,aswellasanti-proliferative,anti-angiogenicandimmunomo- dulatory effectsofIMiDs,has been elucidated. In thispaper wereviewpublished pre- clinicalandclinical dataonthe signiﬁcanceofCRBNexpression. Moreover,wediscuss perspectivesonclinicalapplicationofevaluationofCRBNforindividualizationandmoni- toringofIMiDs-basedtherapy.

*Adresdokorespondencji:KlinikaiKatedraHematologiiUniwersytetuMedycznego,ul.Ciołkowskiego2,93-510Łódź,Polska.

Tel.:+48426895191;fax:+48426895192.

Adresemail:krzysztof.jamroziak@wp.pl(K.Jamroziak).

ContentslistsavailableatSciVerseScienceDirect

Acta Haematologica Polonica

journal homepage:www.elsevier.com/locate/achaem

http://dx.doi.org/10.1016/j.achaem.2013.08.001

(2)

(FoodandDrugAdministration; FDA). Różnicei podobieństwa budowychemicznejpomiędzyposzczególnymiIMiDsprzed- stawiarycina1.

Talidomid,pierwszyprzedstawicielIMiDs,zostałzsyntety- zowanywewczesnychlatach pięćdziesiątych XX wieku.Lek tenzostałwprowadzony do sprzedaży jako środek nasenny iuspokajający, szczególniezalecany kobietom ciężarnym ze względu na dodatkowe działanie antyemetogenne [1]. Nie- stety,wkrótcepojawiły siędoniesieniaowystępowaniuwro- dzonychanomaliiudziecimatek, którestosowały talidomid wpierwszymtrymestrzeciąży.Teratogennedziałanietalido- miduobjawiałosięzespołemróżnychwadwrodzonych,wśród których najbardziej charakterystyczne były zniekształcenia kończyn o typie fokomelii i amelii, chociaż obserwowano szereg innych zaburzeń [1]. Konsekwencją powszechnego stosowania talidomidu przez kobiety ciężarne w ponad 40 krajachwokresie1957–1962r.byłaprawdopodobnienajwięk- szatragediawhistorii farmakologii,któradla wieluspośród urodzonych co najmniej 10 000 tzw. dzieci talidomidowych trwadodzisiaj[1].Chociażwnastępnychdekadachzjawisku temu poświęcono setki prac badawczych i opracowano

dziesiątki teorii naukowych, aż do niedawna mechanizm molekularny indukowania wad płodu przez talidomidpozo- stawałcałkowicieniewyjaśniony.

Pomimowycofaniatalidomiduzrynkuwlatach1961–62, badania nad tym lekiem były kontynuowane. Już w 1965 roku przypadkowo stwierdzono wybitną aktywność talido- miduwleczeniutrądowegorumieniaguzowategostanowią- cego powikłanie trądu (erythema nodosum leprosum) [2].

Następnie, w latach dziewięćdziesiątych XXwieku, lek był również stosowany w zespole przewlekłego zmęczenia w przebiegunabytego zespołu niedoboruodporności(AIDS).

Jednakprawdziwy renesanstalidomidu nastąpiłw związku zestwierdzeniemjegoskutecznościuchorychnaszpiczaka plazmocytowego (SzP) opornego na inne terapie [3].

W następstwie tego odkrycia talidomid, a następnie także lenalidomid,stałysięjednymzgłównychﬁlarównowoczes- nej terapii SzP oraz przyczyniły się do znacznej poprawy rokowania chorych z tym rozpoznaniem. Aktualnie terapia SzP ipokrewnychchoróbrozrostowychplazmocytów (amy- loidozaAL,zespółPOEMS)jestwciążdominującymwskaza- niem dla IMiDs, jednak leki z tej grupy są również testo- wanewwieluinnychchorobach[4].

Mechanizm działania IMiDs

Po analiziewielokierunkowych efektówbiologicznychIMiDs, któreobejmująaktywnośćantyproliferacyjną,antyangiogenną i immunomodulacyjną, mechanizm działania tych leków wydajesiębyćbardzozłożony.Ponadtospektrumobserwowa- nychefektówróżnisięczęściowopomiędzyposzczególnymi lekami z tejgrupy.Jak wykazanow wielubadaniach przedklinicznych, podstawą skutecznego działania przeciwnowotworowego IMiDs jest regulacja wydzielania przez komórki nowotworu, komórki mikrośrodowiska oraz komórki efekto- roweukładuimmunologicznegowielucytokin,cząstekadhe- zyjnychorazreceptorówpowierzchniowych[5].

Początkowo najwięcejbadańna tematdziałaniaprzeciw- nowotworowego u chorychnaSzP dotyczyłotalidomidu. Co interesujące, lek ten jestmieszaniną dwóch enancjomerów, które mogą różnić się właściwościami terapeutycznymi i toksycznością, jednak ulegają szybkiej racemizacji w wa- runkach in vivo [1]. Wykazano, że głównym czynnikiem odpowiedzialnym za działania przeciwnowotworowei prze- ciwzapalne talidomidu jest zdolność do inhibicji czynnika martwicy nowotworów(TumourNecrosisFactor; TNF).Produk- cja TNF jest hamowana poprzez zwiększoną degradację mRNA dla TNF oraz aktywację a-glikoprotein [6, 7]. Oprócz aktywności anty-TNF talidomid hamuje również produkcję interleukin:IL-6,IL-10iIL-12,natomiastzwiększawydzielanie IL-4 i IL-5 [5]. Dodatkowo, talidomid moduluje aktywność limfocytów T poprzez łączenie się z cząsteczką CD28, co bezpośredniowpływanaichaktywację.Zjawiskotostymuluje proliferację limfocytów T oraz powoduje zwiększenie ilości uwalnianych cytokin, w szczególności interferonu gamma (INF-g).StymulacjawydzielaniaIL-2przeztalidomidaktywuje cytotoksycznelimfocytyTCD8+orazlimfocytyNK[8].Dodat- kowo, działanie przeciwnowotworowe w SzP objawia się poprzez hamowanie ekspresji międzykomórkowychi naczy- niowych cząsteczek adhezyjnych ICAM i VCAM [9] oraz Ryc.1–Strukturachemicznazarejestrowanychleków

immunomodulujących:a)talidomidu,b)lenalidomidui c)pomalidomidu

Fig.1–Thechemicalstructureofregistered

immunomodulatorydrugs:a)thalidomide,b)lenalidomideand c)pomalidomide

(3)

toksyczne działanie na DNA komórek nowotworowych poprzez uwalnianiereaktywnychformtlenu(ReactiveOxygen Species;ROS)[10].

Celemsyntezynowychanalogówtalidomidubyłozwięk- szenie aktywnościprzeciwszpiczakowej orazredukcja dzia- łańniepożądanych.Pierwszaztychcząsteczek,lenalidomid, charakteryzuje się 50 tysięcy razy silniejszą zdolnością do inhibicjiTNFw porównaniu z talidomidem[5]. Wpływaon nazwiększeniecytotoksycznościlimfocytów,atakże działa przeciwzapalniepoprzezstymulacjęprodukcjiIL-10ihamo- waniewydzielaniaIL-1,IL-6orazIL-12[5].Ponadto,odmien- nie od talidomidu, lenalidomid bezpośrednio powoduje apoptozękomórekSzP nadrodzeaktywacji kaspazy8oraz uwrażliwianaindukcjęapoptozyzależnąodszlakuzwiąza- nego z receptorem FAS [5, 11]. Lenalidomid charakteryzuje się zdolnością do zatrzymywania cyklu komórkowego poprzezindukcjęekspresjigenówsupresorowych,takichjak p21,p27orazEGR[11].Stwierdzonotakżehamującywpływ lenalidomidu na ekspresję białek z rodziny inhibitorów apoptozy:cIAP orazFLIP. Efekt ten jestosiąganypośrednio przez zahamowanie ekspresji czynnika transkrypcyjnego NFkB,działającegoantyapoptotycznie[12].Pomalidomidjest trzecimzarejestrowanymlekiemzgrupyIMiDs.Zakończone oraz nadal trwające badania kliniczne pomalidomidu uchorychnaSzPpokazują,żejestonzdolnydowywołania głębokich i długotrwałych odpowiedzi u ciężko przeleczo- nychpacjentów,równieżopornych natalidomidlublenali- domid[13].Należypodkreślić,żechociażstosunkowodobrze scharakteryzowano powyższe efekty biologiczne związane ze stosowaniem IMiDs, szczegółowy mechanizm molekularny zachodzący w komórce docelowej pozostawał do niedawnacałkowicienieznany.

Odkrycie roli cereblonu

Pomimopoczątkowegowycofaniatalidomiduzterapii,nadal intensywnie prowadzono badania nad jegowłaściwościami.

Głównywysiłekbadaczybyłskupiony napróbachwyjaśnie- nia mechanizmu działania teratogennego leku. Podczas ponad50latbadańopracowanoponad30hipoteztłumaczą- cychzwiązektalidomiduzwystępowaniemzaburzeńformo- waniasięzawiązkówkończyn[1]. Wczesneteoriedotyczyły, między innymi, uszkodzeń komórkowych szlaków sygnało- wychpoprzezinterkalacjętalidomidupomiędzyzasadyazo- toweDNA,udziałwacetylacjidużychcząsteczeklubwpływ nazaburzeniametabolizmuglutaminianuikwasufoliowego.

Jednakżadnaztychhipotezniezostałapotwierdzonawba- daniachdoświadczalnych.

Duże znaczenie uzyskały natomiast teorie działania antyangiogennegoorazstresuoksydacyjnegowywoływanych przeztalidomid.W1999rokuParmaniwsp.[10]zasugerowali, żezmianyteratogenneindukowaneprzeztalidomidsąspowo- dowaneprzez stresoksydacyjny. Doświadczeniaprzeprowa- dzonenakrólikachujawniły,żetalidomidjestodpowiedzialny za produkcję ROS powodujących oksydację nici DNA oraz akumulację 8-hydroksy-2-deoksyguanozyny. Inne badanie wykazało,żeROS powstającew komórcepopodaniu talido- miduwywołująapoptozę,działającprawdopodobniepoprzez hamowanie ścieżek sygnałowych kinazy Akt, wybranych

czynnikówwzrostuﬁbroblastów(FibroblastGrowthFactor;FGF) ibiałekzrodzinyWnt[14].Zasugerowano,żetemechanizmy prowadządozahamowaniaproliferacjioraznadmiernejapop- tozy komórek, co skutkuje zaburzeniamiwzrostu i rozwoju kończyn o typie fokomelii i amelii [14]. Hipoteza stresu oksydacyjnego nie tłumaczyła jednak lokalizacji defektów rozwojowychwkończynach.Równieistotnateoriaprzypisała powstawaniewadwrodzonychwłaściwościomantyangiogen- nymtalidomidu.D'Amatoiwsp.[15]stwierdzili,żetalidomid hamujeprocestworzenianowychnaczyńkrwionośnych,które sąniezbędnedoprawidłowegorozwojukończynpłodu.Wyka- zanodoświadczalnie,żetalidomidjestzdolnydozahamowa- nia neowaskularyzacji indukowanejprzezzasadowyczynnik wzrostu ﬁbroblastów (bFGF) oraz śródbłonkowy czynnik wzrostu(VEGF)[16].Teorietenietłumaczyłyjednak,jakiejest molekularnepodłożeefektówwywoływanychprzeztalidomid.

Przełomem w poznawaniu mechanizmu powstawania wadwrodzonychzależnychodtalidomidubyływynikibadań zespołu japońskichnaukowcówpodkierownictwemTakumi Ito [17]. Dzięki zastosowaniu nowoczesnych technik oczy- szczania białek badaczom tym udało się scharakteryzować molekularny cel talidomidu, czyli białko, do którego lek przyłączasięwkomórkachdocelowych.Eksperymentpolegał na inkubacji specjalnie zaprojektowanych kulek opłaszczo- nychtalidomidemzekstraktemkomórekliniiHe-La.Następ- niebiałka,któreprzyłączyłysiędotalidomidu,zostały odse- parowane magnetycznie, oczyszczone i poddane analizie spektrometrii mas. W ten sposób odkryto, że cząsteczką, z którą talidomid łączy się bezpośrednio, jest stosunkowo małoznane białkoo nazwie cereblon (CRBN).Co niezwykle ważne,dziękibadaniomnamodeluzwierzęcym(rybadanio pręgowany–Danioreiro)potwierdzono,żewiązanieCRBNjest niezbędnymetapemdowywołaniazmian teratogennych po podaniutalidomidu [17].Wtymceluwykorzystanooligonu- kleotydową technikęwyciszania genów, dzięki którejosiąg- nięto znaczny spadek ekspresji rybiego genu kodującego zCrbn, białko, które jest w około 70% homologiczne do ludzkiego CRBN i również wiąże talidomid. Wynikiem tego eksperymentubyłopotwierdzenie,żewyciszeniegenukodu- jącego CRBN powoduje tożsame efekty z podaniem talidomidu, czyli hamuje rozwój płetw piersiowych i naczyń w obrębie uszu oraz powoduje spadek ekspresji czynnika wzrostu ﬁbroblastów-8 (FGF-8) w zawiązkach płetw u ryb Danio reiro. Talidomid powoduje wiec pośrednio spadek ekspresji FGF-8,który, wrazz czynnikiem FGF-10pozostają- cymznimwdodatnimsprzężeniuregulacyjnym,jestkluczo- wymczynnikiemwzrostowymkończyn[17].

W kolejnej, niezwykle ważnej pracy dokonano kluczo- wegoodkryciaz punktuwidzeniaterapeutycznegozastoso- waniaIMiDs[18].Wykazanomianowicie,żewiązanieCRBN jest niezbędnym warunkiem nie tylko dla teratogenności talidomidu,aletakżedlabezpośredniejaktywnościprzeciw- nowotworowej lenalidomidu i pomalidomidu[18]. Ponadto, wykazano również, że jednym z białek biorących udział w szlakumolekularnyminicjowanymprzezwiązanie IMiDs z CRBN jest czynnik regulatorowy interferonu-4, (Interferon Regulatory Factor-4;IRF4), któryjest niezbędny dlaprzeżycia komórek SzP i którego rola prognostyczna w SzP była już wcześniej sugerowana [18]. Co istotne, w innym badaniu stwierdzono, żewiązanieCRBNjest koniecznenie tylko do

(4)

aktywności antyproliferacyjnej, ale również do działania immunomodulujacegoIMiDs[19].

Fizjologiczne funkcje cereblonu

Przed publikacją pracy Ito i wsp. [17] CRBN nie budził zainteresowania onkologów, jednak wcześniej znana już byłapewnarolategobiałkawpatologiiczłowieka.Dotyczyła onazwiązku mutacjigenuCRBNz występowaniemautoso- malnej recesywnej formy łagodnego upośledzenia umysło- wego[20].Mutacjata poleganapojawieniusięw sekwencji kodonu,,stop’’iprzedwczesnego zakończeniatranslacji,co powodujepowstanienieprawidłowegobiałkaCRBN.Efektem tegojestwystąpieniezaburzeńpamięci izdolnościuczenia sięokreślanejakoupośledzenieumysłowe[20].

Cereblon jest białkiem o masie cząsteczkowej około 51 kDazbudowanymz442aminokwasów.Białkotojestkodo- wane uczłowieka przez gen CRBN zlokalizowany na chro- mosomie 3 (locus3p26.2), zawierający 11 eksonów, które stanowiąodcinekodługościponad30tysięcyparzasad[21].

CechącharakterystycznąCRBNsądomenyzlokalizowanena końcu N-terminalnym, w tym ATP-zależna domena Lon odpowiedzialnazainterakcjezinnymibiałkamiorazspecy- ﬁczne miejscafosforylacji kinazykazeinowej II, fosforylacji kinazy C, glikozylacji N-końcowejoraz mirystylacji. Region C-terminalny jest najbardziej konserwatywnym miejscem białka CRBN, jednak nie stwierdzono homologii pomiędzy jego sekwencją, a innymi znanymi domenami czynnościo- wymi. Ekspresja CRBN jest wykrywana głównie w cyto- plazmie i jądrze komórek śledziony, wątroby, trzustki, nerek,jelit,mózguorazwleukocytachobwodowych[22].Co interesujące,wykazano, że istniejeprzynajmniej 6 izoform składania mRNA (splicing) dla CRBN. Transkrypty CRBN-002, CRBN-003 i CRBN-005 zawierają w swej sekwencji otwarte ramki odczytu (Open Reading Frames; ORFs), czyli mogą kodowaćróżnewariantybiałka[23].

Fizjologiczna rola CRBN została tylko częściowo wyjaś- niona. Ze względu na związek mutacji CRBN z wystę- powaniemłagodnejformyupośledzeniaumysłowegoposzu- kiwano, miedzy innymi, czynnościowego związku CRBN zprocesamiuczeniasięipamięci[21].Stwierdzono,żeCRBN łączysięz podjednostkąabiałkawiążącegokanałpotasowy aktywowanyjonami wapnia (Large-conductance Ca²⁺ activated potassium channel alpha-subunit binding protein) [24]. CRBN kontrolujeilośćtychkanałówwbłoniepoprzezzapobieganie formowaniusiętetrameróworazutrzymywanieichwretiku- lum endoplazmatycznym, co może wpływać na procesy nerwowe [24]. CRBN odgrywa również rolęw kontroli ilości kanałówchlorkowych,którebiorąudziałwregulacjiobjętości komórekorazzachowaniupotencjałuczynnościowegoneuro- nów[25].

Opróczznaczącej roliodgrywanejw tkanceneuronalnej, CRBN bierze również udział w kontroli ilości energii wkomórcepoprzez łączeniesięzkinaząbiałkowąaktywo- waną AMP (AMP-activated protein kinase; AMPK), której jest inhibitorem[26].AMPKjestbiałkiemwrażliwymnazmiany w równowadze energetycznej komórki: podczas dużego wysiłku i spadku poziomu ATP w komórce spowalnia procesyanaboliczne,tj.syntezęcholesteroluczyuwalnianie

insuliny z komórek beta trzustki, oraz przyśpiesza procesy kataboliczne,tj.oksydacjękwasówtłuszczowychwwątrobie czy mięśniach szkieletowych, co pozwala na przywrócenie prawidłowego poziomuATP.Negatywnywpływregulacyjny CRBNnaAMPKudowodniono,analizujączachowaniemyszy pozbawionych genu CRBN w mechanizmie knock-out geno- wego w zależności od zawartości kwasów tłuszczowych w diecie. Badania te sugerują, że CRBN może również odgrywaćpewnąrolęwchorobachmetabolicznych[27].

Jednak obecnie najbardziej udokumentowana i inte- resującawydajesięrolaCRBNwregulacjiprocesówdegrada- cji białek w komórce, w tym szczególnie ubikwitynacji i aktywności proteasomów. Z punktu widzenia molekular- nego mechanizmu działania IMiDs najważniejszejest funk- cjonowanieCRBNjako częścikompleksuE3ligazyubikwity- nowej, który tworzy wraz z białkami DDB1 (Damaged DNA Binding protein 1), Cullin-4 (CUL4) oraz Roc1 [28] (Ryc. 2).

Kompleks ten jest odpowiedzialny za regulację procesów degradacji białek, naprawy uszkodzonego DNA, replikacji itranskrypcji.Napodstawiedotychczasowychbadańwydaje się, że CRBN może funkcjonować jako czynnik rekrutujący białka do procesu ubikwitynacji. Wykazano, że talidomid, wiążąc się z CRBN, powoduje zahamowanie kompleksu E3 ligazy ubikwitynowej (Ryc. 3). W konsekwencjidochodzi do gromadzenia się jego nieznanych substratów białkowych, którepowinnyulecubikwitynacjiinastępniedegradacjiprzez proteasom [14, 18]. Wydaje się więc,że spektrumdziałania IMiDs, zarówno przeciwnowotworowego, immunomodulują- cego jak i teratogennego, wynika z nagromadzenia nieznanych substratów białkowych w komórce, które następnie aktywująróżneszlaki sygnałowe [18]. Zapewneza poszcze- gólne efekty biologiczne odpowiedzialne są inne substraty, jednak wymaga to dalszych badań. Ponadto, nie można wykluczyć,żeposzczególneIMiDsmajądodatkowereceptory pozaCRBN,któreodpowiedzialnesązaichróżnewłaściwości [29].Ostatniowdoświadczeniachnakomórkachludzkiejlinii komórkowej nerwiaka płodowego wykazano również, że ekspresja CRBN hamuje aktywność proteasomów [30]. Pod- jednostkab7kompleksu20Sbędącaczęściąskładowąprotea- somowejpodjednostkibPSMB4,zostałazidentyﬁkowanajako białko łączące się bezpośrednio z CRBN [30]. To odkrycie wskazuje, że CRBN bierze udział w bezpośredniej regulacji aktywnościproteasomów[30].

Znaczenie cereblonu w terapii IMiDs

Odkrycie roli, jaką pełni CRBN, pozwala przypuszczać, że poziom jego ekspresji może mieć kluczowe znaczenie w odpowiedzi na leczenie IMiDs. Uważa się, że niska ekspresja tego białka jest przyczyną występowania opor- ności na talidomid, lenalidomid i pomalidomid. Przykła- dowo, badaniaprowadzoneprzezZhu iwsp.[18]wykazały, że ludzkieliniekomórkoweSzP oporne nalenalidomid lub pomalidomid mają mniejszy poziom ekspresji CRBN niż wrażliwenaIMiDsliniekomórkoweOPM2czyMM1.S[19].

Podobne wyniki sugerują więc, że ekspresja CRBNmoże być potencjalnym markerem prognostycznym w trakcie terapii IMiDs. Ten problem oceniono następnie w retro- spektywnych badaniach klinicznych. Heintel i wsp. [31]

(5)

zaobserwowali istotny związek pomiędzy ekspresją genu CRBN i odpowiedzią na leczenie lenalidomidem i deksametazonem(Len-Dex).EkspresjaCRBNokazałasiętrzykrotnie wyższaupacjentów,którzyreagowalinaleczeniewporów- naniu z chorymi, którzy nie uzyskali odpowiedzi, jednak współczynnik korelacji ekspresji CRBN z odpowiedzią był w całej grupie stosunkowo niski (r=0,48) [31]. W innym badaniu,Schusteriwsp.[32]przeanalizowaliekspresjęCRBN w grupie 148 pacjentów ze rozpoznaniem SzP leczonych kombinacją pomalidomidu z deksametazonem [32]. Wyka- zano, że wysoka ekspresja CRBN jest statystycznie istotnie związanaz odsetkiem odpowiedzi, czasem wolnymodpro- gresjioraz,conajistotniejsze,zczasemprzeżyciawSzP[32].

Autorzy sugerują, że ocena ekspresji CRBNprzed podaniem pomalidomidu może stać się czynnikiem predykcyjnym odpowiedzi na leczenie [32]. Zgodnie z tymi obserwacjami, Broyliwsp.[33]orazKlimowicziwsp.[34]stwierdzilizwiązek wysokiejekspresjiCRBNzrokowaniempacjentówleczonych odpowiedniotalidomidem ilenalidomidem.Cointeresujące, w jednym z badań stwierdzono również, że zmniejszona ekspresja CRBN koreluje z zaburzeniami cytogenetycznymi wiążącymi się z gorszym rokowaniem (obecność del17p13 i1q21)[35].Pewnedanenatematroli CRBNsąjużrównież dostępne dla innych chorób, w których stosuje się IMiDs.

Przykładowo wykazano, że odpowiedź na lenalidomid linii komórkowejchłoniakaDLBCLjestzależnaodekspresjiCRBN iIRF4[36].

Należy podkreślić, że niektóre obserwacje z badań klinicznych nad niepełnym związkiem poziomu CRBN ze skutecznościąIMiDs budzą jednakpewne wątpliwości [31– 35]. Jak wskazują wyniki badań na liniach komórkowych, istniejązpewnościąinne uwarunkowaniaodpowiedzipoza całkowitą ekspresją CRBNw komórkachnowotworu, szcze- gólnie jeśli jest ona badana na poziomie mRNA. Przykła- dowo, stwierdzono, że niektóre oporne linie komórkowe charakteryzują się wysoką ekspresją CRBN [18]. Ponadto izoformaCRBN-002jestpozbawionaeksonu10,któryzawie- raczęśćdomenyzapewniającej wiązanieIMiDs,aekspresja tej izoformy może stanowić nawet 50% transkryptu CRBN [23]. Analiza pierwotniewrażliwych iopornych na leczenie analogami talidomidu linii komórkowych SzP wykazała, że ekspresja CRBN jest regulowana na poziomie transkrypcji oraz posttranskrypcyjnie [37]. Natomiast nabyte mutacje części kodującej genuCRBNpowodująceoporność sąpraw- dopodobnierzadkim zjawiskiem.Gandhiiwsp.[38]wykryli jedynie 5zmian pojedynczegonukleotyduw genie kodują- cym CRBN:trzyw pozycji 735(Y245Y),jednąw pozycji219 (H73H) i kolejną w 939(C313C) w analizowanych próbkach Ryc.2–MechanizmdziałaniakompleksuligazyubikwitynowejE3wwarunkachfizjologicznych.Cereblonpełniwtym kompleksierolęczynnikarekrutującegookreślonesubstratybiałkowedoprocesuubikwitynacjiinastępniedegradacjiprzez proteasom

Fig.2–ThemechanismofE3ubiquitinligasecomplexunderphysiologicalconditions.Cereblon,inthiscomplex,actsasafactorthat recruitscertainproteinsubstratesfortheprocessofubiquitinationandsubsequentdegradationbytheproteasome

(6)

odpacjentówzeSzP iw liniach komórkowych[38]. Należy również podkreślić,żeprzypuszczalnie istniejąinne, nieza- leżne od CRBN białka wiążące IMiDs, które również mogą mieć pewien udziałw odpowiedzi i oporności na poszcze- gólnelekiztejgrupy[29].

Perspektywy kliniczne badań nad cereblonem

Wyniki omówionych badań przedklinicznych i klinicznych niewątpliwie wskazują na ważną rolę, jaką odkrycie CRBN możeodegraćwrozwojuterapiichorób,wktórychstosujesię IMiDs. Najbardziej oczywistym zastosowaniem klinicznym byłaby ocena ekspresji CRBN jako biomarkera służącego do indywidualizacji terapii za pomocą IMiDs. Teoretycznie, leczeniezwykorzystaniemIMiDsmanajwiększeuzasadnie- nie u pacjentów wysoką ekspresją CRBN, natomiast chorzy zbardzoniskimpoziomemCRBNpowinnibyćprawdopodob- nie leczeni w inny sposób. Wydaje się również, że ocena ekspresjiCRBNpowinnabyćdokonywananietylkowchwili rozpoznania,alerównież przykażdymnawrociechoroby,ze względu na możliwość indukcji oporności oraz zjawisko ewolucji klonalnej. W mniejszym stopniu rozważa się rów- nież wykorzystanietakiego testu w diagnostyceróżnicowej,

ponieważekspresjaCRBNwnowotworachhematologicznych jest typowo wyższa niż w MGUS i większości guzów litych [17,18,23].

Należyjednak podkreślić, żedotychczas nie opracowano standardowej metody oceny ekspresji CRBN [39]. W szcze- gólności nie ustalono, czy ekspresja CRBN powinna być mierzonanapoziomiemRNA(RT-PCR,Q-PCR,GEP)czybiałka (cytometriaprzepływowa,Westernblot,immunohistochemia).

Oprócz samej ekspresji, warte analizy wydają się również warianty składania CRBN, a także wrodzone warianty poli- morﬁczne oraz nabyte mutacje tegogenu. Niejest również pewne,wjakichkomórkachpowinnabyćocenianaekspresja CRBN.Chociaż, w przypadkuSzP, najwłaściwszewydająsię sortowane komórki CD138+,nie należy zapominać,że duża część aktywności IMiDs zależy od mikrośrodowiska szpiku i komórek efektorowych układu immunologicznego. Z tych względów, chociaż opracowanie optymalnego testu i jego standaryzacja,szczególniewramachdużychprospektywnych prób klinicznych, miałoby istotne znaczenie dla codziennej praktyki klinicznej, można przypuszczać, że nie nastąpi to szybkoibędzietotestraczejzłożony[39].

Innym perspektywicznym kierunkiem badań nad CRBN sąpróby opracowanianowych,bardziejefektywnychleków i strategii terapeutycznych. W pierwszym rzędzie należy Ryc.3–Talidomid,podobniejakinnelekiimmunomodulujące,łaczysięzcereblonem,któryjestskładnikiemkompleksuE3 ligazyubikwitynowej.Wiązaniecereblonupowodujeinhibicjęubikwitynacjiiwnastępstwienagromadzeniesię

nieznanychsubstratówbiałkowych,którebezpośredniolubpośrednioodpowiadajązaefektybiologiczneleków immunomodulujacych

Fig.3–Thalidomide,likeotherimmunomodulatorydrugs,connectstothecereblon,acomponentofE3ubiquitinligasecomplex.

Cereblonbindinginhibitsubiquitinationandsubsequentaccumulationofunknownproteinsubstratesthataredirectlyorindirectly responsibleforthebiologicaleffectsofimmunomodulatorydrugs

(7)

tutaj myśleć o cząsteczkach, które bezpośrednio wiążą sięzCRBNwsilniejszyitrwalszysposóbniżobecneIMiDs.

Przykładowo, nadzieje budzi nowy związek o właściwo- ściachimmunomodulujących CC-220,któryrównież działa poprzez przyłączenie się do CRBN [40]. Wykazano, że w porównaniu z analogami talidomidu, lek ten ma 30-krotnie większe powinowactwo do CRBN, a także hamuje autoubikwitynację tego białka 110-krotnie silniej niż pomalidomid [40]. Udowodniono również, ze CC-220 silniej stymuluje produkcję IL-2 przez limfocyty T oraz hamuje produkcję immunoglobulin [40]. Patrząc jednak z szerszej perspektywy, wszelkie badania nad mechaniz- mamiinhibicji ligazyubikwitynowej E3, znaczeniempart- nerów CRBN w kompleksie enzymatycznym i szlakami sygnałowymi leżącymi ,,poniżej’’ CRBN oraz identyﬁkacją substratów ubikwitynacji mogą zaowocować powstaniem nowych,skutecznymmetodterapii.

Wkład autorów/Authors' contributions

Wedługkolejności.

Konﬂikt interesu/Conﬂict of interest

Niewystępuje.

Finansowanie/Financial support

Niewystępuje.

Etyka/Ethics

Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami DeklaracjiHelsińskiej,dyrektywamiEUorazujednoliconymi wymaganiamidlaczasopismbiomedycznych.

pi smiennictwo/references

[1] FranksME,MacphersonGR,FiggWD.Thalidomide.Lancet 2004;363:1802–1811.

[2] SheskinJ.Thalidomideinthetreatmentofleprareactions.

ClinPharmacolTher1965;6:303–306.

[3] SinghalS,MehtaJ,DesikanR,etal.Antitumoractivityof thalidomideinrefractorymultiplemyeloma.NEnglJMed 1999;341:1565–1571.

[4] PiechnikA,GiannopoulosK.Mechanizmydziałanialeków immunomodulującychwszpiczakuplazmocytowym.

Hematologia2011;2:105–115.

[5] BartlettJB,DredgeK,DalgleishAG.Theevaluationof thalidomideanditsIMiDderivativesasanticanceragents.

NatRevCancer2004;4:314–322.

[6] MoreiraAL,SampaioEP,ZmuidzinasA,FrindtP,SmithKA, KaplanG.Thalidomideexertsitsinhibitoryactionontumor necrosisfactoralphabyenhancingmRNAdegradation.

JExpMed1993;177:1675–1680.

[7] TurkiBE,JiangH,LiuJO.Bindingofthalidomidetoalpha I-acidglycoproteinmaybeinvolvedinitsinhibitionof

tumornecrosisfactoralphaproduction.ProcNatlAcadSci USA1996;93:7552–7556.

[8] CorralLG,KaplanG.Immunomodulationbythalidomide andthalidomideanalogues.AnnRheumDis1999;58:107.

[9] HideshimaT,ChauhanD,ShimaY,etal.Thalidomideand itsanalogsovercomedrugresistanceofhumanmultiple myelomacellstoconventionaltherapy.Blood2000;96:

2943–2950.

[10] ParmanT,WileyMJ,WellsPG.Freeradical-mediated oxidativeDNAdamageinthemechanismofthalidomide teratogenicity.NatMed1995;582–585.

[11] GandhiAK,KangJ,NaziruddinS,PartonA,SchaferPH, StirlingDI.LenalidomideinhibitsproliferationofNamalwa CSN.70cellsandinterfereswithGab1phosphorylation andadaptorproteincomplexassembly.LeukRes 2006;30:849–858.

[12] MitsiadesN,MitsiadesCS,PoulakiV,etal.Apoptotic signalinginducedbyimmunomodulatorythalidomidein humanmultiplemyelomacells:therapeuticimplications.

Blood2002;99:4525–4530.

[13] LacyMQ,HaymanSR,GertzMA,etal.Pomalidomide (CC4047)PlusLow-DoseDexamethasoneAsTherapyfor RelapsedMultipleMyeloma.JCO2009;27:5008–5014.

[14] ItoT,AndoH,HandaH.Teratogeniceffectsofthalidomide:

molecularmechanisms.CellMolLifeSci2011;68:1569–1579.

[15] D'AmatoRJ,LoughnanMS,FlynnE,FolkmanJ.Thalidomide isaninhibitorofangiogenesis.ProcNatlAcadSciUSA 1994;91:4082–4085.

[16] KenyonBM,BrowneF,D'AmantoRJ.Effectsofthalidomide andrelatedmetabolitesinamousecornealmodelof neovascularization.ExpEyeRes1997;64:971–978.

[17]ItoT,AndoH,SuzukiT,etal.Identiﬁcationofaprimary targetofthalidomideteratogenicity.Science2010;327:

1345–1350.

[18] ZhuYX,BraggioE,ShiCX,etal.Cereblonexpressionis requiredfortheantimyelomaactivityoflenalidomideand pomalidomide.Blood2011;118:4771–4779.

[19] Lopez-GironaA,MendyD,ItoT,etal.Cereblonisadirect proteintargetforimmunomodulatoryandantiproliferative activitiesoflenalidomideandpomalidomide.Leukemia 2012;1–10.

[20] HigginsJJ,TalAL,SunX,etal.Temporalandspatial mousebrainexpressionofcereblon,anionicchannel regulatorinvolvedinhumanintelligence.JNeurogenet 2010;24:18–26.

[21] DijkhuizenT,vanEssenT,vanderVliesP,etal.FISHand array-CGHanalysisofacomplexchromosome3aberration suggeststhatlossofCNTN4andCRBNcontributesto mentalretardationin3pterdeletions.AmJMedGenetA 2006;140:2482–2487.

[22] ChangXB,StewartAK.Whatisthefunctionalroleofthe thalidomidebindingproteincereblon?IntJBiochemMol Biol2011;2:287–294.

[23] GandhiAK,Avet-LoiseauH,WaldmanM,etal.Detection andquantiﬁcationofcereblonproteinandmRNAin multiplemyelomacelllinesandprimaryCD138+multiple myelomacells.ASH54thAnnualMeeting2012;120:2963.

[24] JoS,LeeKH,SongS,JungYK,ParkCS.Identiﬁcationand functionalcharacterizationofcereblonasabindingprotein forlargeconductancecalcium-activatedpotassium channelinratbrain.JNeurochem2005;94:1212–1224.

[25] HohbergerB,EnzR.Cereblonisexpressedintheretinaand bindstovoltage-gatedchloridechannels.FEBSLett 2009;583:633–637.

[26] LeeKM,JoS,KimH,LeeJ,ParkCS.Functionalmodulationof AMP-activatedproteinkinasebycereblon.Biochem BiophysActa2011;1813:448–455.

[27] LeeKM,YangSJ,KimYD,etal.Disruptionofthecereblon geneenhanceshepaticAMPKactivityandpreventshighfat

(8)

diet-inducedobesityandinsulinresistanceinmice.

Diabetes2013Jan24.

[28] AngersS,LiT,YiX,etal.Moleculararchitectureand assemblyoftheDDB1-CUL4Aubiquitinligasemachinery.

Nature2006;443:590–593.

[29] PiechnikA,DmoszynskaA,GiannopoulosK,etal.TheVEGF receptor,neuropilin-1,representsapromisingnoveltarget forchroniclymphocyticleukemiapatients.IntJCancer 2013;133:1489–1496.

[30] LeeKM,LeeJ,ParkChS.Cerebloninhibitsproteasome activitybybindingtothe20Scoreproteasomesubunitbeta type4.BiochemicalandBiophysicalResearch

Communications2012;427:618–622.

[31] HeintelD,BolomskyA,SchrederM,etal.Highexpressionof thethalidomide-bindingproteincereblon(CRBN)is associatedwithimprovedclinicalresponseinpatientswith multiplemyelomatreatedwithlenalidomideand

dexamethasone.Blood2011;118:2879.

[32] SchusterSR,KortuemKM,ZhuYX,etal.Cereblon expressionpredictsresponse,progressionfreeandoverall survivalafterpomalidomideanddexamethasonetherapy inmultiplemyeloma.ASH54thAnnualMeeting

2012;120:194.

[33] BroylA,KuiperR,vanDuinM,etal.Relationbetween cereblonexpressionandsurvivalinpatientswithnewly diagnosedmultiplemyelomatreatedwiththalidomide.

Blood2013;121:624–627.

[34] KlimowiczA,NeriP,BelchA,etal.Highcereblonprotein expressioncorrelateswithimprovedresponseandsurvival inmyelomapatientstreatedwithlenalidomide.ASH54th AnnualMeeting2012;120:931.

[35] KuchenbauerF,BloehdornJ,KullM,etal.Expressionof Cereblonisassociatedwithdiseasestage,genetic subgroupsandspeciﬁcmicro-RNAsinmultiplemyeloma.

ASH54thAnnualMeeting2012;120:1820.

[36] ZhangLH,KosekJ,WangM,HeiseC,SchaferPH,ChopraR.

LenalidomideefﬁcacyinactivatedB-cell-likesubtype diffuselargeB-celllymphomaisdependentuponIRF4and cereblonexpression.BrJHaematol2013;160:487–502.

[37] NeriP,BelchAR,JohnsonJ,etal.AmiRNAriskscoreforthe predictionofresponsetolenalidomidenmultiplemyeloma patients.Blood2011;118:987.

[38] GandhiAK,LentzschS,ScheySA,etal.ExonMutationsin Cereblon(CRBN)andDNADamageBindingProtein1(DDB1) GenesareRareinMyelomaCellsandPatients.Presentation atInternalionalMyelomaWorkshop,Tokyo,Japan;2013.

[39] LodéL,AmiotM,MaigaS,TouzeauC,etal.Cereblon expressioninmultiplemyeloma:notreadyforprime time.BrJHaematol2013Jul17.http://dx.doi.org/10.1111/

bjh.12477.

[40] SchaferPH,RychakE,MendyD,etal.Targetingcereblon withhighafﬁnityimmunomodulatorycompoundCC-220:

anoveltherapeuticagentforBcelldyscrasias.ASH54th AnnualMeeting2012;120:1055.