1
Al. Piastów 45, 71-311 Szczecin
prof. dr hab. inż. Mirosława El Fray
tel: (+48) 91 499 48 28 fax: (+48) 91 499 40 98
Email: mirfray@zut.edu.pl
Ocena pracy doktorskiej Pani mgr inż. Sary Metwally pt.: „ Projektowanie własności powierzchniowych elektroprzędzionych włókien i ich wpływ na odpowiedzi
komórkowe do zastosowań biomedycznych
”przedstawionej do obrony przed Radą Dyscypliny Inżynieria Materiałowa Akademii Górniczo-Hutniczej im. Stanisława Staszica w Krakowie
Promotor: dr hab. inż. Urszula Stacheiwcz, prof. AGH Promotor pomocniczy: dr inż. Joanna Karbowniczek
Przedstawiona do recenzji praca doktorska została opracowana w postaci krótkiego przewodnika do zbioru 5 opublikowanych i powiązanych tematycznie artykułów naukowych zgodnie z art. 187 Ustawy Prawo o szkolnictwie wyższym i nauce z dnia 20 lipca 2018 r.
Przewodnik zawiera 10 krótkich rozdziałów mieszczących się sumarycznie na 23 stronach maszynopisu wraz z wykazem 59 pozycji literaturowych oraz dołączonych kopii 5 publikacji opublikowanych w czasopismach o międzynarodowej cyrkulacji i posiadających Impact factor, gdzie spośród 5 prac, Doktorantka jest pierwszym współautorem w 4 publikacjach. Ocenę merytoryczną i naukową pracy doktorskiej pragnę przedstawić w następujących punktach.
1. Aktualność tematu
2. Elementy nowości w pracy
3. Analiza doboru technik eksperymentalnych i metodyk badawczych 4. Uwagi dyskusyjne
5. Wnioski końcowe
2 Aktualność tematu pracy
Wytwarzanie polimerowych obiektów o rozmiarach nanometrycznych i ich stosowanie w medycynie stanowi ważny kierunek rozwoju m.in. w inżynierii tkankowej ukierunkowanej na wytwarzanie substytutów tkankowych z wykorzystaniem najczęściej biodegradowalnych polimerów syntetycznych lub naturalnego pochodzenia oraz komórek własnych pacjenta i czynników wzrostu. Kluczową rolę w opracowaniu nowych materiałów dla inżynierii tkankowej, a tym samym skutecznych rozwiązań przekładających się na praktykę kliniczną, odgrywają oddziaływania na granicy materiał-komórka. Z jednej strony są to właściwości (i) materiału polimerowego tworzącego rusztowanie (skafold), ulegającego z czasem degradacji pod wpływem płynów ustrojowych i zastępowanych namnażającymi się komórkami oraz (ii) właściwości komórek wraz z inherentnymi cechami błony komórkowej wrażliwej na bodźce chemiczne i fizyczne. Doktorantka, na podstawie dokonanego przeglądu literatury przedstawionego we wprowadzeniu i podsumowanego w rozdziale 8.1 (skrót publikacji w Mater. Sci Eng – C (2019)) wskazuje na biozgodność, podatność materiałów na biodegradację oraz odpowiednią architekturę i właściwości wytworzonych z nich podłoży jako kluczowe czynniki decydujące o ich przydatności jako rusztowań do wzrostu komórek. Te dwa ostatnie czynniki najczęściej reguluje się poprzez zastosowanie odpowiedniej metody wytwarzania rusztowań, z których najbardziej popularną jest technika elektroprzędzenia pozwalająca na rozciąganie włókien polimerowych do rozmiarów nanometrycznych w wytwarzanym polu elektrostatycznym. Co więcej, zmiana polaryzacji ładunków poprzez przykładanie dodatniego albo ujemnego napięcia wpływa na właściwości powierzchniowe włókien. Jako obiekt swoich badań Doktorantka wybrała dwa polimery, biodegradowalny poli(e-kaprolakton)(PCL) oraz nie ulegający biodegradacji poli(fluorek winylidenu)(PVDF) o właściwościach piezoelektrycznych ale stosowany głównie w biosensorach czy w innych wyrobach medyczny, gdyż jego postulowane w nielicznych pracach możliwe stosowanie w inżynierii tkankowej jest dosyć ograniczone ze względu na brak podatności na biodegradację. Dobór materiałów wydaje się być uzasadniony, ale zbyt mało wyartykułowany w opisie omawiającym założenia pracy, zwłaszcza w świetle postawionej hipotezy badawczej. Analiza literatury przeprowadzona przez Doktorantkę wykazała również, że oddziaływania na granicy materiał-komórka silnie zależą od ładunku powierzchniowego, zwilżalności powierzchni i porowatości w skali nanometrycznej.
Czynniki te regulują bowiem adsorpcję protein (tzw. efekt Vromana) i finalną odpowiedź komórkową na dany materiał. Na podstawie dokonanego przeglądu literatury, Doktoranta sformułowała hipotezę badawczą, że zmiana polaryzacji napięcia podczas elektroprzędzenia
3 zwiększy potencjał powierzchniowy rusztowań włóknistych promując adhezję i proliferację komórek, ponieważ błona komórkowa jest naładowana ujemnie. Dodatkowo, założyła że optymalizacja parametrów elektroprzędzenia, tj. rozpuszczalników, wilgotności i rodzaju kolektora, pozwoli na wytworzenie włókien o pożądanej orientacji, morfologii i o dobrych właściwościach mechanicznych w celu wyprodukowania membran z włókien PCL do zastosowania w plastrach/materiałach opatrunkowych.
Aby udowodnić tak postawione tezy badawcze, Doktorantka wyznaczyła sobie cztery cele do zrealizowania. Po pierwsze założyła zastosowanie dodatniej i ujemnej polaryzacji napięcia na dyszy w układzie do elektroprzędzenia w celu kontroli budowy chemicznej powierzchni i potencjału wytwarzanych włókien z PCL i PVDF. Kolejnym celem było wytwarzanie włókien PCL o kontrolowanej topografii i potencjale zeta w celu zwiększenia adhezji komórek osteogennych i tworzenia kolagenu, a następnie zbadanie adhezji komórek, proliferacji i tworzenia kolagenu w odniesieniu do właściwości powierzchniowych formowanych włókien z PCL i PVDF do potencjalnych zastosowań w inżynierii tkanki kostnej.
Te cele o charakterze poznawczym zostały rozszerzone o cel utylitarny, jakim było zbadanie właściwości mechanicznych i długotrwałego uwalniania oleju z membran PCL wytwarzanych metodą elektroprzędzenia o różnej orientacji włókien i morfologii. Aktualność tematyki pracy, ze względu na wartości poznawcze i potencjalne wykorzystanie wytworzonych materiałów w medycynie, jest bezdyskusyjna.
Elementy nowości w pracy
W literaturze można znaleźć przykłady różnych metod wytwarzania skafoldów, gdzie oprócz tradycyjnych metod, takich jak wymywanie porogenu czy usuwanie rozpuszczalnika, metoda elektroprzędzenia, wykorzystująca oddziaływanie strugi cieczy (roztworu polimeru) z polem elektrycznym–znana już na początku XX wieku i na nowo odkryta pod koniec ubiegłego stulecia–zyskuje wciąż na znaczeniu. Wykorzystując klasyczny zestaw do elektroprzędzenia, Doktorantka zastosowała oryginalne, niezbyt szeroko opisane w literaturze podejście polegające na przykładaniu napięcia o dodatniej i ujemnej polaryzacji do dyszy systemu dozującego roztwór polimeru podczas elektroprzędzenia. Innymi badanymi zmiennymi była wilgotność oraz rodzaj rozpuszczalnika. Poprzez zastosowanie hydrofobowego poli(e- kaprolaktonu)(PCL) udało się Doktorantce wytworzyć porowate skafoldy, a zastosowanie napięcia o ujemnej polaryzacji nieznacznie obniżyło kąt zwilżania czyniąc włókna bardziej hydrofilowymi. Zmiany w budowie chemicznej na powierzchni włókien Doktorantka osiągnęła poprzez zastosowanie dodatniej polaryzacji napięcia. Badania odziaływań nanowłókna-błona komórkowa Doktorantka przeprowadziła na komórkach osteogennych stwierdzając istotny
4 wpływ polaryzacji napięcia na morfologię i proliferację komórek oraz ekspresję kolagenu.
Analogiczne badania oraz obserwacje zostały przeprowadzone dla poli(fluorku winylidenu)(PVDF) jako polimeru o właściwościach piezoelektrycznych. Doktorantka dodatkowo wykazała wpływ zmiennej polaryzacji napięcia na mineralizację skafoldów i produkcję kolagenu przez komórki osteogenne (linia MG-63), którym to procesom sprzyjało dodatkowe zwiększenie gęstości nagromadzonego ładunku na powierzchni włókien.
Zastosowanie zmiennej polaryzacji napięcia wpłynęło również na wartości potencjału zeta (z), a tym samym na porowatość włókien i folii wytworzonych z PCL, która sprzyjała adhezji komórek, formowaniu się dobrze wykształconych filopodiów i produkcji kolagenu przez komórki MG-63. Autorka wykazała ponadto, że wykorzystanie opracowanej metody formowania nanowłókien do wytwarzania włóknin o porowatych lub gładkich włóknach z PCL i dobrych właściwościach mechanicznych stanowi doskonały nośnik oleju konopnego wychodząc poza postulowany obszar zastosowań nie tylko w inżynierii tkankowej, ale również wyrobów medycznych w postaci plastrów na skórę.
Analiza doboru technik eksperymentalnych i metodyk badawczych
Doktorantka zastosowała szereg nowoczesnych metod badawczych i analitycznych do scharakteryzowania struktury i właściwości wytworzonych nanowłókien, m.in. pomiary kąta zwilżania powierzchni, profilometrię, rentgenowską spektroskopię fotoelektronów, spektroskopię rentgenowską z dyspersją energetyczną oraz szereg technik mikroskopowych:
mikroskopię optyczną z kontrastem fazowym, fluorescencyjną, konfokalną, mikroskopię siłową z sondą Kelvina, skaningową mikroskopię elektronową i tomografię przestrzenną.
Zastosowane metody badawcze pozwoliły Doktorantce scharakteryzować włókna, ocenić ich właściwości powierzchniowe, takie jak kąt zwilżania, gęstość ładunku, obecność grup funkcyjnych na powierzchni włókien oraz ich topografię i morfologię, co stanowiło jeden z kluczowych elementów bardzo szerokiego planu badawczego nad otrzymywaniem struktur o określonych i kontrolowanych właściwościach. Skuteczność opracowanej metody modyfikacji właściwości fizycznych i budowy chemicznej nanowłókien otrzymywanych metodą elektroprzedzenia, której efektem miały być polepszone właściwości biologiczne została potwierdzona w testach komórkowych z wykorzystaniem ludzkich komórek osteogennych (linia MG-63).
Podsumowując, należy stwierdzić, że zastosowane techniki eksperymentalne i metody badawcze zostały dobrane w sposób trafny i odzwierciedlający eksperymentatorski charakter pracy doktorskiej.
5 Uwagi dyskusyjne
Praca doktorska została przedstawiona w postaci zbioru 4 opublikowanych i powiązanych tematycznie artykułów naukowych zgodnie z art. 187 Ustawy Prawo o szkolnictwie wyższym i nauce z dnia 20 lipca 2018 r. Piąta praca zawarta w opracowaniu w postaci manuskryptu, została opublikowana w trakcie wykonywania recenzji. Analiza opracowania – przewodnika po publikacjach skłania mnie do refleksji, że jest ona bardzo spłycona i nie odzwierciedla bogactwa materiału doświadczalnego zgromadzonego w pracach naukowych, w których Doktorantka jest współautorem. Przeglądowy artykuł opublikowany w Mater. Sci Eng – C (2019) stanowi aktualny przegląd literatury na temat wpływu potencjału powierzchniowego i ładunków na odpowiedź komórkową na granicy z biomateriałami.
Doktoranta w posumowaniu tego przeglądu stwierdziła, że ładunek powierzchniowy jest niezwykle ważny w początkowych etapach przyłączania komórek do powierzchni biomateriałów, ponieważ kontroluje tworzenie się miejsc przylegania (ognisk adhezji) będących agregatami białek i integryn, odpowiedzialnych za łączenie się komórek z powierzchnią biomateriałów. Z przeglądu tego wynikało również, że ładunek powierzchniowy, nawet bez żadnych komponentów macierzy pozakomórkowej (ang. extracellular matrix, ECM), może kontrolować adhezję komórek i wzmagać mineralizację kolagenu w regeneracji tkanki kostnej. Ponadto, informacja o potencjale powierzchniowym na biomateriałach jest kluczowa i powinna być skorelowana z potencjałem zeta (z) i innymi właściwościami powierzchni, w tym geometrią i chropowatością powierzchni. Podsumowanie tego artykułu mogłoby więc stanowić zbiór hipotez badawczych, które doktorantka powinna udowodnić w wyniku przeprowadzonych badań. Istotnie, takie poszukiwania i badania zostały wykonane i pokazane w kolejnych publikacjach w Adv. Mater. Interfaces. (2018), ACS Biomater. Sci. Eng.
(2019) i w Mater. Des. (2020), jednak trudno doszukać się jasno sformułowanej tezy badawczej postawionej w opisie do zbioru publikacji, w odniesieniu chociażby do wytypowanych polimerów czy rodzaju badanych komórek; zamiast tego została postawiona bardzo ogólnikowa teza badawcza, że „zmiana polaryzacji napięcia podczas elektrospinningu zwiększa potencjał powierzchniowy rusztowań włóknistych, co sprzyja adhezji i proliferacji komórek, ponieważ błona komórkowa jest naładowana ujemnie”. Dlatego proszę o wyjaśnienie czy zmiana polaryzacji napięcia pozwala w takim samym stopniu wpływać na właściwości chemiczne i fizyczne testowanych polimerów, czyli PCL i PVDF? Co jest przyczyną ewentualnych różnic?
6 Czy i w jakim stopnia zjawiska mineralizacji kolagenu tylko pod wpływem ładunku powierzchniowego (bez dodatku składników ECM, co podkreślono w artykule przeglądowym) dla testowanych przez Doktorantkę materiałów różnią się od wiedzy znanej z literatury?
Doktorantka we wnioskach z przeprowadzonych badań stwierdziła, że właściwości włókien zależą od ich orientacji i porowatości. Jakie zatem zjawiska na poziomie molekularnym zachodzą podczas orientacji włókien PCL i czy obserwowane zależności są typowe czy nietypowe dla tej grupy materiałów? Czy takiego samego zjawiska można spodziewać się w przypadku PVDF?
Przedstawione na str. 25-27 podsumowanie i wnioski są bardzo ogólne i zupełnie nie odzwierciedlają rangi osiągnięć przedstawionych przez Doktorantkę w trzech pracach, w których badania dotyczyły aspektów oddziaływań materiał-komórki osteogenne nakierowanych na możliwości zastosowania rusztowań wytwarzanych zastosowaną metodą w inżynierii tkanki kostnej. Doktorantka natomiast podkreśla na podstawie jednej opublikowanej pracy przydatność opracowanych materiałów jako nośników oleju konopnego do potencjalnego wykorzystania jako materiał opatrunkowy, odnosząc się tym samym do udowodnienia drugiej hipotezy badawczej, że „optymalizacja parametrów elektroprzędzenia, tj. rodzaju rozpuszczalnika, wilgotności i rodzaju kolektora pozwoli na wytworzenie włókien o pożądanej orientacji, morfologii i właściwościach mechanicznych, co umożliwia produkcję membran z włókien PCL do zastosowania jako plastrów na skórę”.
Podsumowując stwierdzam, że sposób przedstawienia osiągnięć w postaci zwięzłego opracowania odnoszącego się do zbioru opublikowanych i powiązanych tematycznie artykułów naukowych był znacznie trudniejszy dla Doktorantki niż wykonanie obszernego planu badawczego i opublikowanie wyników w renomowanych czasopismach i w wieloautorskich zespołach. Przedstawione uwagi o charakterze dyskusyjnym nie umniejszają w sposób znaczący wartości osiągnięć Doktorantki, gdyż trudno mieć uwagi do interpretacji opublikowanych, czyli już poddanych recenzji, wyników i w pełni się zgadzam z ich poprawnością.
Wnioski końcowe
Doktorantka zrealizowała bardzo obszerny program badań eksperymentalnych, uzyskując interesujące wyniki o niepodważalnych znamionach nowości naukowej. Praca wnosi cenny wkład w aspekty poznawcze i utylitarne dotyczące zagadnień inżynierii materiałowej, a zwłaszcza nanowłókien polimerowych wytwarzanych w innowacyjny sposób, opracowany
7 przez Doktorantkę na drodze elektroprzędzenia, w warunkach zmiennej polaryzacji napięcia.
Doktorantka wykazała, że zmiana polaryzacji napięcia podczas elektroprzędzenia pozwala kontrolować budowę chemiczną i potencjał powierzchniowy włókien, co ma związek z reorientacją łańcuchów polimerowych. Wykazała również, że początkowa adhezja komórek zależy zarówno od potencjału powierzchniowego, jak i od topografii włókien, zwiększających adhezję komórek, głównie dzięki chropowatości powierzchni. Doktorantka znacząco poszerzyła wiedzę na temat wpływu parametrów wytwarzania nanowłókien z poli(e- kaprolaktonu)(PCL) i poli(fluorku winylidwnu)(PVDF) na ich morfologię i właściwości biologiczne w warunkach in vitro.
Biorąc pod uwagę osiągnięte wyniki, stwierdzam iż przedłożona do recenzji praca doktorska mgr inż. Sary Mettwaly spełnia warunki przewidziane ustawą z dnia 20 lipca 2018 r. Prawo o szkolnictwie wyższym i nauce (art. 192 ust. 2, Dz.U. poz. 1668, z późn. zm.) oraz art. 180 ustawy z dnia 3 lipca 2018 r. Przepisy wprowadzające ustawę – Prawo o szkolnictwie wyższym i nauce (Dz.U. poz. 1669, z późn. zm.). Dlatego wnoszę o przyjęcie rozprawy i dopuszczenie Pani mgr inż. Sary Metwally do dalszych etapów przewodu doktorskiego oraz publicznej obrony.
Ponadto, biorąc pod uwagę jakość 5 publikacji, w których Doktorantka opublikowała wyniki przeprowadzonych badań (IF czasopism od 3,094 do 6,289), wnoszę o wyróżnienie pracy doktorskiej Pani mgr inż. Sary Metwally.
Szczecin, 5.02.2021 r.
